Nhận dạng ralstonia solanacearum bằng PCR và đánh giá tính kháng bệnh héo xanh của một số giống cà chua đối với các dòng vi khuẩn ở hà nội việt nam

NHẬN DẠNG RALSTONIA SOLANACEARUM BẰNG PCR VÀ ĐÁNH GIÁ
TÍNH KHÁNG BỆNH HÉO XANH CỦA MỘT SỐ GIỐNG CÀ CHUA ĐỐI VỚI
CÁC DÒNG VI KHUẨN Ở HÀ NỘI - VIỆT NAM
PCR FOR IDENTIFICATION OF RALSTONIA SOLANACEARUM AND EVALUATION OF
RESISTANCE OF SOME TOMATO LINES TO BACTERIAL WILT IN VIETNAM
Lê Lương Tề, Chu Văn Chuông, Phạm Mỹ Linh, Hà Viết Cường
Đại học Nông nghiệp I – Hà Nội
SUMMARY
- PCR for identification of Ralstonia solanacearum in infested tomato plant and evaluation on
resistant to bacterial wilt capability of tomato lines in Hanoi – Vietnam.
-

PCR is the best method for identification of Ralstonia solanacearum from infested tomato plant.

- Some international resistant cultivars to bacterial wilt entries namely Caraibo, Caravel,
CLN1464-111-30.45. Redlander and Hawaii’s lines had showed high resistance to Vietnamese strains
(BN and others strains) of tomato bacterial wilt. Their resistant genes such as CRA66, CRA84-26-3,
UPCA1169, P1127805A,… play a decive role in resistant capability in breeding programs.
- The experiment found out that susceptible tomato VL2000 grafted onto resistant to B.W.
eggplant named EG203 gave the best result on resistant to bacterial wilt capability in the field.
MỞ ĐẦU
Bệnh héo xanh vi khuẩn do Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuchi gây ra trên cà chua và một
số cây trồng khác là một bệnh rất phổ biến, gây hại nghiêm trọng nhưng rất khó phòng trừ ở nước
ta và những vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới nóng ẩm. Việc phát hiện nhanh và chính xác để nghiên
cứu các biện pháp sử dụng giống mang gen kháng thông qua quá trình chọn lọc, lai tạo hữu tính
hoặc ghép trên các gốc ghép có tính kháng bệnh cao được coi là những biện pháp phòng chống bệnh
có triển vọng mang lại hiệu quả cao nhất đã và đang được nghiên cứu ở trong và ngoài nước.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
- Các cây bị bệnh được phân lập trên môi trường PPSA từ các isolate từ Hải Phòng, Bắc Ninh,
Hà Nội, Vónh Phúc, Hà Tây và Thanh Hóa.
- Lây nhiễm vi khuẩn bằng vi khuẩn pha trong nước vô trùng (108 CFU/ml) đem ngâm rễ sát

thương cây con 3-4 tuần tuổi và tưới thêm 5 ml dịch vi khuẩn vào vùng rễ sau khi trồng. Theo dõi tỷ
lệ cây chết héo và cây sống sót (Winstead, 1952).
- Nhận diện vi khuẩn Ralstonia solanacearum bằng kỹ thuật PCR. DNA vi khuẩn được chiết từ
dịch vi khuẩn trên cây bệnh thu thấp tại 6 tỉnh miền Bắc là Hà Nội, Hà Tây, Thanh Hóa, Hải
Phòng, Bắc Ninh, Vónh Phúc và đất vùng rễ cây bệnh. Cặp mồi sử dụng là DivlR và DivlF tổng hợp
đoạn DNA đặc hiệu vi khuẩn Ralstonia solanacearum nằm trong vùng mã hóa riboxom 16S.
KẾT QUẢ
Nhận diện vi khuẩn Ralstonia solanacearum bằng kỹ thuật PCR
Phản ứng PCR đã tổng hợp đoạn DNA đặc hiệu vi khuẩn Ralstonia solanacearum phân lập trực
tiếp từ dịch vi khuẩn cây cà chua có triệu chứng héo xanh điển hình thu thập tại 6 tỉnh miền Bắc.
Tuy nhiên, chúng tôi không thể phát hiện được sự có mặt của vi khuẩn gây bệnh khi chiết DNA từ
đất lấy tại vùng rễ cây bệnh có lẽ do mật độ vi khuẩn tại đây quá thấp. Chúng tôi cũng thử cắt sản
phẩm PCR thu được với 2 enzym cắt giới hạn là RsaI và AluI nhưng kết quả cho thấy 2 enzym này
không tạo ra sự khác nhau giữa các mẫu thử.
Thử phản ứng độc tính của các dòng isolate Ralstonia solanacearum trên các giống cà
chua và cà tím


Các giống cà chua VL.2000, Ba Lan và giống cà tím EG203, EG195 được lây nhiễm nhân tạo bởi
các dòng vi khuẩn khác nhau Bắc Ninh, Hà Nội, Hải Phòng, Thanh Hóa. Kiểm tra tỷ lệ cây bệnh bị
chết héo và cây sống sót sau 4 tuần lây nhiễm. Kết quả đánh giá thu được ở bảng 1.

Hình 1. Phản ứng PCR phát hiện Ralstonia solanacearum trên cà chua
1: mẫu Hải Phòng, 2: mẫu Thanh Hóa, 3: mẫu Hà Tây, 4: mẫu Hà Nội
5: đất bệnh, 6: đất khỏe, 7: mẫu Thanh Hóa, 8: mẫu Bắc Ninh, 9: mẫu Vónh Phúc

Hình 2. Kết quả gây bệnh nhân tạo Ralstonia solanacearum trên cà chua
Bảng 1. Phản ứng kháng – nhiễm của giống cà chua đối với dòng vi khuẩn
Isolate
(Dòng vi khuẩn)

BN (Bắc Ninh)
HP (Hải Phòng)
HN (Hà Nội)
HT (Hà Tây)

Tỷ lệ cây bệnh chết héo (%) sau 4 tuần lây nhiễm
VL.2000
Ba Lan
EG203
EG195
69,5
83,4
10,0
33,4
53,9
63,4
3,4
23,4
57,5
80,0
16,7
20,2
43,0
60,0
0,0
40,0

Trong điều kiện lây nhiễm nhân tạo trong nhà lưới viện NCRQ – Hà Nội 2000-2001 cho thấy
isolate BN phân lập từ cà chua vùng chuyên rau Bắc Ninh có độc tính cao hơn các isolate ở vùng Hải
Phòng, Hà Nội, Hà Tây trên các giống cà chua thí nghiệm. Giống cà tím EG203 có khả năng kháng

bệnh cao, tỷ lệ cây bệnh héo chết rất thấp từ 0,0% - 16,7% và tỷ lệ cây sống rất cao từ 83,3% 100,0% tùy theo các dòng vi khuẩn.
Xác định mức độ kháng nhiễm bệnh héo xanh vi khuẩn của một số giống nhập nội mang nguồn
gen kháng trong điều kiện sinh thái vùng Hà Nội.


Bằng thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo dòng vi khuẩn BN có độc tính cao trên một số giống cà
chua nhập nội mang các gen kháng bệnh khác nhau để nhằm phát hiện các giống mang gen kháng
phù hợp làm vật liệu nguyên thủy trong chọn tạo giống kháng có năng suất cao hoặc làm gốc ghép
để phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn. Kết quả được trình bày trong bảng 2.
Bảng 2. Khảo sát mức độ kháng – nhiễm của các giống cà chua đối với bệnh héo xanh (dòng BN)
Giống
Hawaii 7996
Hawaii 7997
Caraibo
GA 1565
Caravel
CLN 1464111-30.45
Redlander
FLA 7421
GA 219
Bf – Okitsu
L 390*

Nguồn gen
kháng
PT.127805A
PT.127805A
CRA66
PT.1263722
CRA66

UPCA1169
CRA84-26-3
VC-9-1
H7997
PT126408
NC19-53-64N
-

Nguồn
gốc địa lý
Mỹ
Mỹ
Pháp
Pháp

Trọng lượng
quả (g)
55
50
130
60,5
135

Tỷ lệ cây héo
xanh (%)
4,17
2,08
12,92
33,33
22,50

Đài Loan

150

16,67

R

120
135
40
18
35

27,09
68,75
59,33
8,33
77,09

R
S
S
HR
HS

Mỹ
Nhật
Đài Loan

Mức kháng
HR
HR
R
MR
R

Ghi chú: * Giống nhiễm chuẩn sử dụng làm đối chứng
HR: kháng cao, R: kháng, MR: kháng trung bình, S: nhiễm, HS: nhiễm cao
Kết quả thu được chứng tỏ rằng:
- Một số giống Hawaii quả nhỏ, có nguồn gốc từ Mỹ, mang nguồn gen kháng PT127805A thuộc
nhóm giống có tính kháng cao (HR) đối với các dòng vi khuẩn BN ở phía Bắc Việt Nam vì tỷ lệ cây
sống sau lây nhiễm nhân tạo đạt tỷ lệ khá cao từ 83,3% - 97,7%, tỷ lệ cây bệnh chết héo rất thấp từ
2,08% – 17,7%.
- Một số giống cà chua quả to (trên 90 gram/quả) mang các nguồn gen kháng CRA66, CRA84-263, UPCA1169 như giống Caraibo, Caravel, CLN1464-111-30.45 có tính kháng đến kháng vừa, tỷ lệ
cây bệnh chết héo sau lây nhiễm tương đối thấp 12,9% – 16,67%. Tỷ lệ cây sống sót khá cao 83% 87%, rất có triển vọng sử dụng trong công tác chọn tạo giống kháng bệnh héo xanh vi khuẩn có giá
trị kinh tế.
- Một số giống khác tuy quả to, mang các nguồn gen kháng khác như giống GA129, FLA7421 tỏ
ra nhiễm nặng với các dòng vi khuẩn BN ở Việt Nam.
- Giống nhiễm chuẩn (đối chứng) không mang gen kháng L390 tỏ ra là giống nhiễm nặng đối
với các dòng vi khuẩn thí nghiệm ở Việt Nam.
Khả năng phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn bằng biện pháp trồng cà chua trên gốc
ghép kháng bệnh
Thí nghiệm được thực hiện trong vụ xuân hè 1999-2000 và 2001 tại khu thí nghiện viện NCRQ –
Gia Lâm – Hà Nội gồm các công thức trồng cây giống cà chua VL2000 là giống nhập nội có năng
suất cao, đặc tính nông học tốt đã được chọn lọc trồng phổ biến trong sản xuất nhưng cảm nhiễm
bệnh (đối chứng) và các công thức trồng cây giống VL2000 ghép trên gốc ghép kháng bệnh là cà tím
EG203, EG192. Lây nhiễm nhân tạo bằng nguồn vi khuẩn BN theo phương pháp đã mô tả
(Winstead, 1952). Cà chua ghép theo phương pháp ghép nối ngọn. Kết quả kiểm tra tình hình sinh

trưởng, năng suất và mức độ nhiễm bệnh (tỷ lệ cây sống và tỷ lệ cây chết héo) được trình bày ở
bảng 3.


Bảng 3. Mức độ nhiễm bệnh héo xanh vi khuẩn và yếu tố sinh trưởng, năng suất của cà ghép
vụ xuân hè 2000-2001. Khu thí nghiệm viện NCRQ – Gia Lâm
Công thức ghép
cà chua/gốc ghép
1. VL2000/EG302
2. VL2000/EG192
3. VL2000*

Tỷ lệ cây
bệnh chết
héo (%)
8,4
36,7
53,4

Tỷ lệ cây
sống (%)
91,6
63,3
46,6

Thời gian từ
trồng đến thu
quả lứa 1 (ngày)
72
75

68

Năng suất
TB/cây khỏe
(kg)
1,23
0,92
1,33

Năng suất còn
được thu hoạch
(tấn/ha)
39,9
36,9
20,5

Dựa trên cơ sở kết quả trong bảng 3, có thể bước đầu nhận xét được hiệu quả phòng chống bệnh
héo xanh vi khuẩn bằng biện pháp ghép cà chua VL2000 trên gốc ghép tốt nhất là giống cà tím
EG203 kháng bệnh ở khu vực đồng bằng sông Hồng. Cây cà chua ghép trên gốc cà tím EG203 ở thời
kỳ cây con có khả năng giảm tỷ lệ cây bệnh chết héo (8,4%) và tăng tỷ lệ cây sống cho thu hoạch
(91,6%) so với giống cà chua VL2000 không ghép có tính mẫn cảm bệnh làm tỷ lệ cây bệnh đạt khá
cao (54,3%), tỷ lệ cây sống cho thu hoạch thấp (46,6%) do đó đã làm giảm năng suất thu hoạch rõ
rệt so với cây ghép.
KẾT LUẬN
- Kỹ thuật PCR có thế nhận biết, phát hiện nhanh vi khuẩn Ralstonia solanacearum từ cây
bệnh so với những phương pháp vi sinh.
- Các dòng, giống có nguồn gen kháng CRA66, CRA-84-26-3, UPCA1169, PT127805A và nhóm
Hawaii 7997 là những giống có tính kháng cao – trung bình rất có triển vọng sử dụng trong công
tác chọn tạo giống cà chua kháng bệnh héo xanh vi khuẩn ở một số vùng thuộc miền Bắc Việt Nam,
nơi rất phổ biến các dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum thuộc Biovar3 – Race1.

- Giống cà tím EG203 có tính kháng cao đối với các dòng vi khuẩn phân lập từ các vùng phía
Bắc Việt Nam (dòng BN, HN, HP, HT, …). Ghép cà chua VL2000 trên gốc ghép là cà tím EG203
kháng bệnh có khả năng phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn, cho năng suất cao, chất lượng
không thay đổi so với cà chua VL2000 nhiễm bệnh nặng nhưng không ghép trồng vụ xuân hè vùng
Hà Nội.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
HANSON P.M., WANG J.F., and LICARDO O., 1996. Variable rection of tomato lines to Bacteral wilt
evaluated at several locations in Southest Asia. Hort. Science 31:143-146.
PRIOR P., GRIMAULT V., and J. SCHMITH, 1994. Resistance to B.W. (Pseudomonas solanacearum)
in tomato. Present status and prosfect.