(Luận văn thạc sĩ) nghiên cứu sự ảnh hưởng của salicylic acid và aspirin trong tăng trưởng và phát triển lan thạch hộc thiết bì (dendrobium officinale kimura et migo) trong điều kiện in vitro
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.92 MB, 87 trang )
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP.HCM
VIỆN KHOA HỌC ỨNG DỤNG HUTECH
−−
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
ẢNH HƯỞNG CỦA ACID SALICYLIC, ASPIRIN
TRONG TĂNG TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CÂY LAN
THẠCH HỘC THIẾT BÌ (Dendrobium officinale Kimura et Migo)
TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Giảng viên hướng dẫn: TS Đ Ỗ Đ Ă N G G I Á P
Sinh viên: LÊ NGUYỄN HOÀNG KIM NGÂN
MSSV: 1411100072
TP Hồ Chí Minh, năm 2018
Lớp: 14DSH01
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP.HCM
VIỆN KHOA HỌC ỨNG DỤNG HUTECH
−−
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
ẢNH HƯỞNG CỦA ACID SALICYLIC, ASPIRIN
TRONG TĂNG TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CÂY LAN
THẠCH HỘC THIẾT BÌ (Dendrobium officinale Kimura et Migo)
TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Giảng viên hướng dẫn:
Sinh viên: LÊ NGUYỄN
TS Đ Ỗ Đ Ă N G G I Á P
HOÀNG KIM NGÂN
MSSV: 1411100072
Lớp: 14DSH01
TP Hồ Chí Minh, năm 2018
Đồ án tốt nghiệp
MỤC LỤC
MỤC LỤC ................................................................................................................. i
LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................... iii
LỜI CÁM ƠN ......................................................................................................... iv
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .......................................................................v
DANH SÁCH BẢNG ............................................................................................. vi
DANH SÁCH BIỂU ĐỒ ....................................................................................... vii
DANH SÁCH HÌNH............................................................................................. viii
Chương 1 MỞ ĐẦU ..................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề .........................................................................................................1
1.2. Mục đích nghiên cứu ........................................................................................3
1.3. Nội dung thực hiện ...........................................................................................3
1.4. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................3
1.5. Yêu cầu của đề tài.............................................................................................3
1.6. Kết cấu của đề tài .............................................................................................4
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................5
2.1. Tổng quan về lan thạch hộc thiết bì .................................................................5
2.2. Các chất điều hịa sinh trưởng thực vật ............................................................13
2.3. Kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật .......................................................................22
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .........................................................30
3.1. Thời gian và địa điểm .....................................................................................30
iii
Đồ án tốt nghiệp
3.2. Vật liệu và hoá chất ........................................................................................30
3.3. Điều kiện nuôi cấy .........................................................................................31
3.4. Nội dung nghiên cứu ......................................................................................32
3.5. Phương pháp thu chỉ tiêu theo dõi ..................................................................40
3.6. Phương pháp xử lý số liệu ................................................................................42
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...............................................................43
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................56
5.1. Kết luận ..........................................................................................................56
5.2. Kiến nghị ........................................................................................................56
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................58
PHỤ LỤC ..................................................................................................................1
iv
Đồ án tốt nghiệp
LỜI CAM ĐOAN
Em xin cam đoan đồ án tốt nghiệp “Ảnh hưởng của Acid Salicylic và Aspirin trong
tăng trưởng và phát triển cây lan thạch hộc thiết bì trong điều kiện in vitro” là chuyên đề
nghiên cứu của em trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của thầy T.S Đỗ Đăng Giáp.
Tất cả các số liệu, kết quả trình bày trong đồ án tốt nghiệp là khách quan và khơng sao
chép số liệu của bất kì cơng trình nghiên cứu nào trước đây.
Em hồn tồn chịu trách nhiệm trước nhà trường và hội đồng về sự cam đoan này.
Tp. Hồ Chí Minh, ngày
tháng
năm 2018
Sinh viên thực hiện
Lê Nguyễn Hoàng Kim Ngân
v
Đồ án tốt nghiệp
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành đồ án tốt nghiệp này, em xin chân thành cảm ơn Trường Đại học
Cơng nghệ Thành phố Hồ Chí Minh và ban giám hiệu đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho
sinh viên chúng em được học tập, sinh hoạt và nghiên cứu thêm nhiều điều hay và bổ
ích.
Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trong Viện Khoa học Ứng dụng
HUTECH, ngành Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Mơi trường, trường Đại học Cơng
nghệ Thành phố Hồ Chí Minh đã giảng dạy và truyền đạt cho em những kiến thức rất
quý báu, những kinh nghiệm quý báu về học và làm trong suốt 4 năm học vừa qua.
Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy T.S Đỗ Đăng Giáp đã tận
tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong quá trình học tập cũng như làm đồ án tốt nghiệp.
Em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã đồng hành và giúp đỡ chúng em
trong quá trình học tập và nghiên cứu.
Xin chân thành cảm ơn!
Tp. Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2018
Sinh viên thực hiện
Lê Nguyễn Hoàng Kim Ngân
vi
Đồ án tốt nghiệp
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
ASA
Acetylsalicylic acid (Aspirin)
BA
Benzyladenine
BAP
6 – benzylaminopurine
cs
Cộng sự
ĐC
Đối chứng
IFN – gamma
Interferon – gramma
g
Gram
mcg/g
Microgram/gram
MS
Môi trường Murashige – Skoog
NAA
α - Naphthaleneacetic acid
ND
Nước dừa
NT
Nghiệm thức
SA
Salicylic Acid
TLK
Trọng lượng khô
TLT
Trọng lương tươi
vii
Đồ án tốt nghiệp
DANH SÁCH BẢNG
Bảng 3.1. Bảng thiết bị
Bảng 3.2. Bảng dụng cụ
Bảng 3.3. Bảng hóa chất
Bảng 3.4. Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của SA sử dụng trong thí nghiệm
1.1
Bảng 3.5. Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của SA sử dụng trong thí nghiệm
1.2
Bảng 3.6. Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của ASA sử dụng trong thí nghiệm
2.1
Bảng 3.7. Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của ASA sử dụng trong thí nghiệm
2.2
Bảng 4.1. Bảng khảo sát ảnh hưởng của SA ở nồng độ lớn lên cây lan thạch hộc
thiết bì sau 4 tuần quan sát.
Bảng 4.2. Bảng khảo sát ảnh hưởng của ASA ở nồng độ lớn lên cây lan thạch hộc
thiết bì sau 4 tuần quan sát.
Bảng 4.3. Bảng khảo sát ảnh hưởng của SA ở nồng độ nhỏ lên cây lan thạch hộc
thiết bì sau 4 tuần quan sát.
Bảng 4.4. Bảng khảo sát ảnh hưởng của ASA ở nồng độ nhỏ lên cây lan thạch hộc
thiết bì sau 4 tuần quan sát.
viii
Đồ án tốt nghiệp
DANH SÁCH BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 4.1. Ảnh hưởng của SA (dãy nồng độ lớn) lên chiều cao của cây lan thạch
hộc thiết bì
Biểu đồ 4.2. Ảnh hưởng của SA (dãy nồng độ lớn) lên tổng số chồi của cây lan
thạch hộc thiết bì
Biểu đồ 4.3. Ảnh hưởng của ASA (dãy nồng độ lớn) lên chiều TLT và TLK của
cây lan thạch hộc thiết bì
Biểu đồ 4.4. Ảnh hưởng của ASA (dãy nồng độ lớn) lên chiều cao của cây lan
thạch hộc thiết bì
Biểu đồ 4.5. Ảnh hưởng của ASA (dãy nồng độ lớn) lên tổng hàm lượng
Chlorophyll của cây lan thạch hộc thiết bì
Biểu đồ 4.6. Ảnh hưởng của SA (dãy nồng độ nhỏ) lên tổng số chồi của cây lan
thạch hộc thiết bì
Biểu đồ 4.7. Ảnh hưởng của ASA (dãy nồng độ nhỏ) lên tổng số chồi của cây lan
thạch hộc thiết bì
ix
Đồ án tốt nghiệp
DANH SÁCH HÌNH
Hình 2.1. Lan thạch hộc thiết bì
Hình 2.2. Thân và hoa của lan thạch hộc thiết bì
Hình 2.3. Lan thạch hộc thiết bì
Hình 2.4. Thân khí sinh của lan thạch hộc
Hình 2.5. Thân và lá của lan thạch hộc thiết bì
Hình 2.6. Hoa của lan thạch hộc thiết bì
Hình 2.7. a) Cơng thức cấu tạo; b) Cấu trúc khơng gian; c) Salicylic acid
Hình 2.8. Sơ đồ các con đường tổng hợp salicylic acid trong cây
Hình 2.9. Các ảnh hưởng của SA lên thực vật
Hình 2.10. a) Công thức cấu tạo; b) Cấu trúc không gian; c) Aspirin
Hình 2.11. Dẫn xuất Aspirin từ Salicylic acid
Hình 2.12. Quy trình ni cấy sinh khối cây lan gấm bằng kỹ thuật bioreactor. a: mẫu
cấy ban đầu. b, b1: mẫu cấy sau 8 tuần nuôi cấy. c, c1: khối lượng sinh khối thu nhận.
Hình 3.1. Mẫu ni cấy ban đầu
Hình 3.2. Mẫu lan thạch hộc sử dụng để tiến hành thí nghiệm SA và ASA
Hình 3.3. Lan thạch hộc thiết bì khi sấy khơ
Hình 4.1. Sự hình thành và phát triển chồi của lan Thạch hộc trên môi trường MS + SA
(nồng độ lớn)
Hình 4.2. Sự hình thành và phát triển chồi của lan Thạch hộc thiết bì trên mơi trường
MS + AS (nồng độ lớn)
Hình 4.3. Sự hình thành và phát triển chồi của lan Thạch hộc trên môi trường MS + SA
(nồng độ nhỏ)
Hình 4.4. Sự hình thành và phát triển chồi của lan Thạch hộc trên môi trường MS + AS
(nồng độ nhỏ)
x
Đồ án tốt nghiệp
Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1.
Đặt vấn đề
Bên cạnh những loài thực vật đa dạng làm nguồn thực phẩm hay làm đồ trang trí
thì cịn có một số loại thực vật quý được sử dụng với mục đích bồi bổ cơ thể và rất có
giá trị dược liệu như sâm ngọc linh, ngải cứu, đông trùng hạ thảo,...
Thêm vào đó cịn có một số lồi thực vật khơng những được trồng làm cây cảnh
mà cịn có thể dùng để trị đau dạ dày, đau thượng vị, bồi bổ mắt, chống lão hố,... rất
hiệu quả, đó là lan thạch hộc thiết bì (Nguyễn Thanh Thuận, 2015). Ngồi ra, lan thạch
hộc thiết bì (Dendrobium officinale Kimura et Migo) cịn có nhiêu giá trị dược học như
chống ung thư, chống lão hóa, tăng sức đề kháng của cơ thể, làm dãn mạch máu và kháng
đông máu, được sử dụng rộng rãi trong lâm sàng, làm các bài thuốc và đặc biệt là chữa
bệnh tiểu đường, cao huyết áp (Kowitdamrong, 2013; Chu, 2014). Do có nhiều lợi ích
và nơi phát triển của lan thạch hộc thiết bì (Dendrobium officinale Kimura et Migo) là
những vùng núi cao gây nguy hiểm cho người thu hái nên giá cả rất đắt đỏ. Hơn nữa, lan
thạch hộc thiết bì khó sinh sản, mọc chậm, khó trồng, những cây mọc hoang dã đã được
đưa vào “Công ước buôn bán quốc tế động thực vật hoang dã có nguy cơ tuyệt chủng”
được pháp luật bảo vệ, do đó nguồn cung cấp tự nhiên đã cạn kiệt, cấm thu hái và bn
bán và cũng hiện là lồi đã được ghi trong Sách đỏ Việt Nam (1996) với cấp đánh giá
“bị đe doạ” (Bậc T) (Sách đỏ Việt Nam năm 2007 – phần thực vật – trang 448), suy giảm
nghiêm trọng do chặt phá rừng và thu hái về trồng làm cây cảnh (Gu, 2007). Vì thế, cần
phải có biện pháp giúp bảo tồn loài dược liệu quý.
Nhiều loài lan quý hiếm bị đe dọa tuyệt chủng trong tự nhiên thường được bảo tồn
nhờ phương thức nảy mầm từ hạt (Kauth, 2005). Với công nghệ nhân giống in vitro hiện
nay, hệ số nhân giống từ một quả lan là rất lớn, từ vài ngàn đến một triệu cây con (Trần
1
Đồ án tốt nghiệp
Văn Minh, 2001). Đã có các tác giả trong và ngoài nước nhân giống lan Dendrobium sp.
bằng phương pháp gieo hạt lan trên nền môi trường MS có bổ sung 0,5mg/l NAA (Luan
và cs, 2006). Nguyễn Văn Song (2011) cũng có nghiên cứu về việc nhân nhanh in vitro
lồi lan rừng có nguy cơ tuyệt chủng với nguồn nguyên liệu ban đầu là gieo hạt trên môi
trường MS + 15% đường sacarose + 2,0 mg/l BA. Trong 3 năm gần đây Viện Sinh học
Nông nghiệp đã thành công khi áp dụng công nghệ nuôi cấy mô nhân giống một số loài
lan bản địa làm dược liệu thuộc chi Hồng Thảo có nguy cơ bị tuyệt chủng (Nguyễn Thị
Sơn và cs, 2012; 2013; Vũ Ngọc Lan và cs, 2013).
Kỹ thuật nuôi cấy mô mở ra hướng mới giúp bảo tồn những lồi thực vật có nguy
cơ tuyệt chủng như lan thạch hộc thiết bì (Dendrobium officinale Kimura et Migo).
Phương pháp nuôi cấy mô đem lại giá trị kinh tế cao, tiết kiệm được thời gian chăm sóc,
tạo ra cây giống đồng đều về mặt di truyền, sạch bệnh, năng suất cao, chất lượng đảm
bảo không bị phụ thuộc vào điều kiện khí hậu bên ngồi nên ni cấy mơ ngày càng
khẳng định tính ưu việt trong việc nhân nhanh cũng như bảo tồn những lồi cây q.
Mơi trường nuôi cấy thực vật in vitro chủ yếu bao gồm muối khoáng, vitamin, các
khoáng chất, nguồn carbon và các chất điều hoà sinh trưởng khác (Bektas và cs, 2013).
Và trong các chất điều hồ sinh trưởng thì Salicylic acid và Aspirin có thể giúp tăng
nhanh tốc độ sinh trưởng và phát triển của thực vật.
Năm 2017, Lê Thị Diễm và Võ Thị Bạch Mai đã có nghiên cứu về ảnh hưởng của
các chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên sự nhân nhanh chồi in vitro lan thạch hộc thiết
bì (Dendrobium officinale Kimura et Migo) đã tìm ra nồng độ thích hợp của các chất
điều hịa sinh trưởng thực vật an tồn khi sử dụng để kích thích phát triển chồi và cụm
chồi của lan thạch hộc thiết bì. Thêm vào đó, từ năm 2015 đến năm 2017, nghiên cứu
của Trần Ngọc Ngoạn đã xây dựng và thu được các kết quả khả quan từ mơ hình trồng
lan thạch hộc thiết bì từ cây ni cấy mơ tế bào.
2
Đồ án tốt nghiệp
Với mục đích bảo tồn nguồn dược liệu quý và tăng nhanh tốc độ sinh trưởng của
lan thạch hộc, đề tài: “Nghiên cứu sự ảnh hưởng của Salicylic acid và Aspirin trong
tăng trưởng và phát triển lan thạch hộc thiết bì (Dendrobium officinale Kimura et
Migo) trong điều kiện in vitro” nhằm tìm ra nồng độ Salicylic acid và Aspirin thích
hợp và an tồn với sự sinh trưởng và phát triển của lan thạch hộc thiết bì (Dendrobium
officinale Kimura et Migo).
1.2.
Mục đích nghiên cứu
Với mục đích nhân nhanh với năng suất cao lồi lan thạch hộc thiết bì
(Dendrobium officinale Kimura et Migo) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào, nhằm
góp phần bảo tồn nguồn dược liệu quý và tạo ra nguồn sinh khối lan lan thạch hộc thiết
bì (Dendrobium officinale Kimura et Migo) dồi dào cung cấp rộng rãi cho người sử dụng.
Tạo ra được nguồn cây giống với số lượng lớn và sạch bệnh, giá cả phù hợp, đáp
ứng nhu cầu của thị trường, tạo nguồn nguyên liệu quý cho ngành Dược.
1.3.
Nội dung thực hiện
− Khảo sát ảnh hưởng của salicylic acid lên khả năng sinh trưởng của cây lan thạch
hộc thiết bì trên hai dãy nồng độ.
− Khảo sát ảnh hưởng của aspirin lên khả năng sinh trưởng của cây lan thạch hộc
thiết bì trên hai dãy nồng độ.
− Tìm nồng độ thích hợp nhất của salicylic acid và aspirin tạo ra kết quả tối ưu nhất
cho sự tăng trưởng của cây lan thạch hộc thiết bì in vitro.
1.4.
Phương pháp nghiên cứu
Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên một yếu tố. Các nghiệm thức
được lặp lại 3 lần. Các số liệu thu được sẽ được xử lý bằng phần mềm SAS và sử dụng
các hàm trong excel.
1.5.
Yêu cầu của đề tài
3
Đồ án tốt nghiệp
Xác định được công thức tối ưu của môi trường nuôi cấy MS kết hợp salicylic
acid và aspirin thích hợp nhất cho cây lan thạch hộc thiết bì in vitro tăng trưởng tốt.
1.6.
Kết cấu của đề tài
Chương 1: Mở đầu
Chương 2: Tổng quan tài liệu
Chương 3: Vật liệu và phương pháp
Chương 4: Kết quả và thảo luận
Chương 5: Kết luận và kiến nghị
Tài liệu tham khảo
4
Đồ án tốt nghiệp
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về lan thạch hộc thiết bì (Dendrobium officinale Kimura et Migo)
2.1.1. Mơ tả về lan thạch hộc thiết bì (Dendrobium officinale Kimura et Migo)
Chi Dendrobium, bao gồm 1100 loài hoặc nhiều hơn nữa trên thế giới, là một nhóm
lớn nhất trong họ Orchidaceae. Có 76 lồi thuộc chi Dendrobium ở Trung Quốc, gồm
74 lồi và 2 loại, trong đó thân cây được sấy khô của D.officinale được liệt kê trong
Dược điển Trung Hoa dưới tên Dendrobii Officinalis Caulis (Tie-pi-shi-hu) như một
khoản mục riêng. Theo như thuyết Y khoa Cổ Truyền Trung Hoa, chức năng chính của
D.officinale là dưỡng âm và loại bỏ khí hư, “bảo vệ” dạ dày và điều hố chất lưu. Lồi
này được sử dụng với mục đích chính là “bảo vệ” dạ dày, điều hồ sản phẩm chất lưu
của cơ thể, và xoa dịu các triệu chứng như là khô họng và khô mắt với thị lực mờ trong
phịng khám, và được tìm thấy có thể kích thích miễn dịch (Sydney Tang và cs, 2011)
và tác dụng kháng u bướu (Kowitdamrong và cs, 2013).
Hình 2.1. Lan thạch hộc thiết bì
5
Đồ án tốt nghiệp
Hình 2.2. Thân và hoa của lan thạch hộc thiết bì
2.1.2. Nguồn gốc và phân bố
Thạch hộc thiết bì hay cịn gọi là thạch hộc rỉ sắt, hắc tiết thảo, thiết bì lan, lí thụ
thảo là cây thảo lâu năm thuộc Chi Thạch hộc –Họ Lan, thường sinh trưởng ở các vách
đá, khe đá, hoặc phụ sinh trên cây cổ thụ, ở vùng cao núi đá, nhiệt đới, Á nhiệt đới, độ
cao từ 800 – 1000m (Chu Chu và cs, 2014).
Ở Việt Nam họ Lan có nhiều loài, phân bố ở các vùng núi từ Bắc vào Nam, nhiều
loài đã bị tuyệt chủng hoặc bị đe doạ tuyệt chủng, một số loài nằm trong danh mục Sách
đỏ Việt Nam, trong đó có lồi lan Thạch hộc tía, phân bố ở vùng trung du miền núi phía
Bắc Việt Nam đang được nghiên cứu nhân giống và nuôi trồng để làm thuốc.
2.1.3. Đặc điểm sinh học
2.1.3.1. Phân loại thực vật
Cây lan Thạch hộc thiết bì thuộc:
Giới: Plantae (giới Thực vật)
Ngành: Magnoliophyta (ngành Ngọc Lan)
6
Đồ án tốt nghiệp
Lớp: Magnoliopsida (lớp Ngọc Lan)
Bộ: Asparagales (bộ Măng Tây)
Họ: Orchidaceae (họ Lan)
Chi: Dedrobium (chi Lan hoàng thảo)
Loài: Dendrobium officinale Kimura et Migo
Hình 2.3. Lan thạch hộc thiết bì
2.1.3.1. Đặc điểm của cây trưởng thành
Thạch hộc thiết bì hay thạch hộc tía là cây thảo phụ sinh lâu năm, thân mọng nước,
sống bám vào cây gỗ lớn rừng nguyên sinh có độ ẩm cao hoặc ở vách đá ẩm ướt, ưa khí
hậu ẩm và râm mát. Với đặc trưng vỏ cây có màu xanh tía và có giá trị độc đáo về dược
phẩm (Chu Chu và cs, 2014).
2.1.3.2. Đặc điểm của thân rễ
Thân rễ nằm ngang sát mặt đất, đơi khi hơi nghiêng, bị dài. Thân rễ thường có màu
xanh và khơng phủ lơng. Số lóng trên thân thay đổi tùy từng cây và dao động trong
khoảng từ 3 – 7 lóng (Chu Chu và cs, 2014).
2.1.3.3. Đặc điểm thân khí sinh
7
Đồ án tốt nghiệp
Thân khí sinh thường mọc thẳng đứng trên mặt đất, ít khi mọc nghiêng. Chiều dài
thân từ 3,5 – 8 cm, bán kính thân 0,2 – 0,4 cm. Bề mặt vỏ ngoài vàng – xanh hoặc vàng
– vàng (Chu Chu và cs, 2014).
Hình 2.4. Thân khí sinh của lan Thạch hộc
2.1.3.4. Đặc điểm của rễ
Rễ mọc ra từ các mấu trên thân. Đôi khi rễ cũng được hình thành từ rễ khí sinh. Rễ
thường đâm thẳng xuống đất, thơng thường mỗi mấu chỉ có một rễ, thỉnh thoảng có nhiều
hơn. Số lượng và khích thước rễ khác nhau cho từng cá thể. Số lượng rễ trong khoảng từ
2 – 9 (Chu Chu và cs, 2014).
2.1.3.5. Lá cây
Hình 2.5. Thân và lá của lan thạch hộc thiết bì
8
Đồ án tốt nghiệp
Lá hình thn dài, mọc so le đều hai bên thân, phía cuống tù, gần như khơng cuốn,
ở đầu hơi cuộn hình nón, dài 12 cm, rộng 2 – 3 cm trên có 5 gân dọc (Nguyễn Thanh
Thuận, 2015).
2.1.3.6. Đặc điểm hoa, quả
Cụm hoa mọc thành chùm 2 – 4 hoa ở sát nách lá, hoa nở khoảng tháng 3 – 4, và
kết quả vào khoảng tháng 5 – 6 (Nguyễn Ngọc Thuận, 2015).
Hình 2.6. Hoa của lan thạch hộc thiết bì
2.1.4. Giá trị dược liệu của lan thạch hộc thiết bì
Theo Dược điển Trung Quốc thì trong D.officinale Kimura et Migo có dendrobium
polysaccharides (23%), alkaloids (0,02 – 0,04%), amino – acids (135 mg/g cây khô),
nhiều kim loại như Sắt (292 mcg/g), Kẽm (12 mcg/g), Mangan (52 mcg/g), Đồng (3,6
mcg/g). Ngồi ra, thạch hộc tía cịn có những hợp chất đặc thù như phenanthryn,
bibenzyl, keton, ester và các chất nhầy, hợp chất amidon. Trong thân cây thạch hộc tía
có hàm lượng alkaloit sinh học chiếm tới 0,3%, trong đó những chất amine đã được giám
định cấu trúc gồm dendrobine, dendramine, nobilonine, dendrin, 6 – hydroxy –
dendroxine, shiunin, shihunidine và muối amoniac N – methyl – dendrobium, 8 –
epidendrobine, các chất này có vị hơi đắng. Thân cây thạch hộc tía có dầu bay hơi, trong
đó có chất manool của hợp chất ditecpen chiếm hơn 50%. Trong cổ thư đông y Trung
9
Đồ án tốt nghiệp
Quốc cách đây hơn 1000 năm đã xác định ở Trung Quốc có 9 loại tiên dược được xếp
theo thứ tự như sau: Thạch hộc, tuyết liên, nhân sâm, thủ ô, phục linh, tùng dung, linh
chi, ngọc trai, đơng trùng hạ thảo, trong đó thạch hộc tía xếp đầu bảng.
Nghiên cứu của Liu, X. F. và cs (2011) cho thấy khi cho chuột uống dịch chiết và
các Polysaccharide thô của D.officinale Kimura et Migo giúp cải thiện và tăng cường
đáng kể khả năng miễn dịch tế bào và miễn dịch không đặc hiệu ở chuột, tăng sản sinh
IFN – gamma ở lách.
Nghiên cứu tác dụng của D.officinale Kimura et Migo trên hệ tiêu hoá cho thấy
một polysaccharide (Dendronan) có tác dụng tốt, giúp điều hồ hệ vi sinh đường ruột,
tăng hàm lượng các acid béo chuỗi ngắn SCFA, giảm pH ruột kết và thời gian hình thành
phân (Zhang, G.Y., và cs, 2015).
Ngoài ra, D.officinale Kimura et Migo là một trong 5 dược thảo có chứa
chrysotoxene, erianin và confusarin là những chất có hoạt tính diệt bào khi thử (in vivo
và in vitro) trên nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau (Yao, C. và cs, 2012).
2.1.5. Giá trị thị trường của lan thạch hộc
Trên thị trường, thân cây tươi thạch hộc tía đang có giá bán khoảng 150 USD/kg.
Giá trị của nó cịn được cổ thư xếp trên nhân sâm, thủ ô, phục linh, tùng dung, linh chi,
ngọc trai, đông trùng hạ thảo.
2.1.6. Nhân giống lan thạch hộc thiết bì
2.1.6.1. Nhân giống bằng giao hạt
Năm 2014 theo Nguyễn Thị Sơn và cs quả lan sau khi được khử trùng, xẻ lấy hạt
cấy vào các môi trường nền: MS (Murashige & Shoog, 1962), VW (Vacin & Went,
1949), Hyponex. Hạt lan mới gieo sẽ rất mịn và có màu vàng chanh. Sau 8 tuần nuôi cấy
thu được kết quả các hạt đã nảy chồi 100% trên nền môi trường MS và VW. Hạt gieo
10
Đồ án tốt nghiệp
trên nền môi trường VW cho tỷ lệ hạt có màu xanh cao nhất, sau 6 tuần nuôi cấy cho tỷ
lệ mẫu phát sinh chồi cao nhất (100%). Hạt được gieo trên nền môi trường H cho tỷ lệ
mẫu có màu xanh thấp nhất sau 8 tuần ni cấy. Về hình thái, chồi tốt nhất trên mơi
trường nền VW (đồng đều màu xanh bóng, khơng bị xốp, không bị mọng nước, chồi
phát triển mạnh không bị biến dị), tiếp đến là MS. Vì vậy, mơi trường VW + 10g
sucrose/lít mơi trường + 6g agar/lít mơi trường + 10% ND là mơi trường thích hợp nhất
cho sự nảy mầm của hạt lan D. officinale Kimura et Migo.
2.1.6.2. Nhân nhanh cụm chồi
Theo Nguyễn Thị Sơn và cs, môi trường MS + 100ml ND + 20g sucrose + 6g agar
+ 60g chuối chín/lít mơi trường là tối ưu cho nhân nhanh cụm chồi loài lan nghiên cứu.
Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Vũ Ngọc Lan và cs., (2013) khi nhân
nhanh cụm chồi lan thuốc D.nobile Lindl. Kết quả nghiên cứu trên lan hài Hằng (P.
hangianum Gurss.) khi nhân nhanh chồi cho biết cần bổ sung lượng chuối cao hơn, lên
đến 100g chuối/lít mơi trường (Hồng Thị Giang và cs., 2010).
2.1.6.3. Nhân giống vơ tính thơng qua nuôi cấy đoạn thân in vitro mang mắt ngủ
Cây lan in vitro thân mang 2 mắt ngủ được đưa vào nuôi cấy trên môi trường nền
MS đều tái sinh chồi và cho sinh trưởng mạnh nhất, thể hiện qua chiều cao chồi, đường
kính chồi, số chồi và màu sắc lá xanh tốt hơn hẳn trên môi trường MS + 20g sucrose +
10% ND + 0,5 mg/l BA + 0,5 mg/l α – NAA + 6g agar/lít mơi trường là thích hợp cho
việc phát sinh chồi giống lan D. officinale Kimura et Migo. Tương tự với kết quả của Li
(2012) khi nghiên cứu nhân nhanh giống lan này tại Trung Quốc (Nguyễn Thị Sơn và
cs, 2014).
2.1.6.4. Tạo cây hoàn chỉnh
Theo nghiên cứu Nhân giống in vitro lan thạch hộc thiết bì của Nguyễn Thị Sơn và
cs năm 2014 môi trường RE + 10 g sucrose + 6 g agar + 0,3 g THT + 0,5 α – NAA/lít
mơi trường là tối ưu ở giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh giống lan D. officinale Kimura et
11
Đồ án tốt nghiệp
Migo. Với tỷ lệ cây ra rễ đạt 100%, số rễ trung bình là 4,51 rễ/chồi; chiều dài rễ trung
bình là 3,19 cm sau 30 ngày ni cấy.
2.1.7. Một số nghiên cứu trên lan thạch hộc thiết bì Dendrobium officinale
Nghiên cứu “Nhân giống in vitro lan Dendrobium officinale Kimura et Migo (thạch
hộc thiết bì)” của Nguyễn Thị Sơn, Từ Bích Thuỷ và cs vào năm 2014 đã chỉ rõ: Nhân
giống bằng gieo hạt trên môi trường VW + 10 g sucrose + 6 g agar + 100 ml nước dừa
(ND)/lít mơi trường, nhân nhanh cụm chồi tốt nhất trên môi trường MS + 100 ml ND +
20 g sucrose + 6 g agar + 60 g chuối chín/lít mơi trường. Nhân giống vơ tính thơng qua
ni cấy đoạn thân mang mắt ngủ sử dụng đoạn thân in vitro mang 2 mắt ngủ và nuôi
cấy trên môi trường MS + 20 g sucrose + 10% ND + 0,5 mg/l BA + 0,5 mg/l BA + 0,5
mg/l α – NAA + 6 g agar/lít mơi trường. Mơi trường tạo cây hoàn chỉnh là RE + 10 g
sucrose + 6 g agar + 0,3 g THT + 0,5 mg/l α – NAA.
Nguyễn Thanh Thuận năm 2015 đã nghiên cứu “Giá trị dược liệu của cây lan thạch
hộc tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo)” đã khẳng định giá trị dược học của
loại thảo dược này về khả năng kháng khuẩn, chống oxy hoá, tăng cường hệ miễn dịch,
ức chế tế bào ung thư, điều hoà đường huyết, cải thiện hoạt động của hệ tiêu hoá, ổn định
hệ vi sinh đường ruột,...
Năm 2017, Hanxiao Tang, Tianwen Zhao, Yunjie Sheng, Ting Zheng, Lingzhu Fu
và Yongsheg Zhang đã có nghiên cứu về dược tính của lan Thạch hộc – một loại thảo
mộc bổ dưỡng trong dược liệu Trung Quốc. Khoảng 190 hợp chất đã được phân lập từ
Dendrobium officinale Kimura et Migo trong những thập kỷ qua. Tác dụng dược lý của
Dendrobium officinale Kimura et Migo có tác dụng chống ung thư, hạ đường huyết,
chống lão hóa, bảo vệ dạ dày loét. Tuy nhiên, cịn có các thành phần phân tử nhỏ khác
cần nghiên cứu thêm.
2.1.8. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của lan thạch hộc
thiết bì Dendrobium officinale
12
Đồ án tốt nghiệp
2.1.8.1. Nhiệt độ
Do đặc tính sinh trưởng của lan Thạch hộc là nhiệt đới và á nhiệt đới trên những
vùng núi cao hay dưới tán của các cây lớn nên nhiệt độ khơng khí trung bình sẽ là 12 –
18oC (PGS.TS Phạm Đức Tuân, 2014).
2.1.8.2. Ánh sáng
Một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phát triển của lan Thạch hộc
mà không thể bỏ qua đó chính là ánh sáng. Ánh sáng cần phải được đảm bảo để có thể
quang hợp và sinh trưởng được. Lan Thạch hộc thuộc giống lan ưa nắng nên không cần
cung cấp quá nhiều ánh sáng, chỉ cần một lượng nhỏ và vừa đủ 70%.
2.1.8.3. Độ ẩm khơng khí
Đa số các loại lan đều có thể sống trong mơi trường nhiệt đới với độ ẩm khơng
khí đạt từ 70 – 90%, còn riêng lan Thạch hộc sẽ là 60 – 80%. Do đó trong q trình tiến
hành trồng và chăm sóc, cần đảm bảo độ ẩm khoảng 70% để lan có thể sinh trưởng tốt
và thuận lợi nhất.
2.1.8.4. Nước
Lan khá dễ ngập úng mặc dù chúng là loài ưa ẩm, chính vì vậy trong những ngày
mưa nên hạn chế việc tưới nước, điều tiết lượng nước phù hợp để tránh tình trạng ngập
úng, thối rễ. Trong giai đoạn mọc rễ, chồi và sinh trưởng, cây lan sẽ cần rất nhiều nước,
cần phải đảm bảo đủ nước để cây phát triển khỏe mạnh.
2.1.8.5. Sự thơng thống
Cần đảm bảo thống khí, thống gió để hạn chế tình trạng bệnh trên cây. Nên tránh
việc trồng lan ở nơi có nhiều bụi bẩn, khói, khơng khí ơ nhiễm sẽ cản trở q trình hơ
hấp của cây.
2.2. Các chất điều hoà sinh trưởng thực vật
2.2.1. Salicylic acid (SA)
13
Đồ án tốt nghiệp
2.2.1.1. Giới thiệu chung
2.2.1.1.1. Cấu trúc hoá học
Cơng thức hóa học: C7H6O3
Điểm sơi: 211oC
Salicylic acid (SA) là một chất giống như hormone đóng một vai trị quan trọng
trong việc điều hòa sự tăng trưởng và phát triển của thực vật (Raskin, 1992). Trong hai
thập kỷ qua, SA đã nhận được nhiều sự chú ý vì sự tham gia của nó vào các cơ chế bảo
vệ thực vật dưới áp lực sinh học và phi sinh học. Các cơ chế bảo vệ này bao gồm việc
thành lập hệ thống kháng tập nhiễm (systemic acquired resistance-SAR) (Mecroux và
cộng sự, 1990), tạo nên protein gây tính kháng bệnh ở cây chủ (pathogenesis- related
proteins-PR) (Malamy và cộng sự, 1990) cũng như là tạo ra tính "siêu mẫn cảm" ở thực
vật ("hypersensitive response") (Horváth và cộng sự, 2007). Tác dụng bảo vệ của SA đối
với các yếu tố stress phi sinh học như kim loại độc (Strobel và Kuc, 1995), stress nhiệt
(Dat và cộng sự, 1998), nhiệt độ thấp (Janda và cộng sự, 1999, Mora- Herrera và cộng
sự, 2005 ), và oxy hoá gây hại (Strobel và Kuc, 1995; Kusumi và cộng sự, 2006) đã được
chứng minh. Hơn nữa, vai trò của SA trong việc tạo ra khả năng chịu mặn đã được nghiên
cứu chi tiết ở nhiều loài thực vật. SA đã được báo cáo đã tạo ra khả năng chịu mặn trong
cà chua (Stevens và cộng sự, 2006), ngô (Gunes và cộng sự, 2007), cà rốt (Eraslan và
cộng sự, 2007) và lúa mỳ (Arfan và cộng sự, 2007). Nó cũng đã được sử dụng để tăng
cường tái tạo in vitro ở một số loài thực vật (Quiroz-Figueroa và cộng sự, 2001, Luo và
cộng sự, 2001, Hao và cộng sự, 2006). Tuy nhiên, khơng có nghiên cứu nào được thực
hiện ở các loài Hibiscus, bao gồm Hibiscus acetosella và Hibiscus moscheutos, có nguồn
gốc ở vùng nhiệt đới ở phía tây châu Phi (Menzel và Wilson, 1961) và Bắc Mỹ.
Salicylic acid là một acid monohydroxybenzoic béo, một loại acid phenolic và một
acid beta hydroxy. Acid hữu cơ kết tinh không màu, được sử dụng rộng rãi trong tổng
14
Đồ án tốt nghiệp
hợp hữu cơ và có chức năng như một hormone thực vật. Nó có nguồn gốc từ sự trao đổi
chất của salicin. Ngồi việc giữ vai trị là một chất chuyển hóa có hoạt tính quan trọng
của aspirin (acid acetylsalicylic), mà hoạt động một phần như là một tiền chất của acid
salicylic, có lẽ nó được biết đến nhiều nhất vì nó được sử dụng như là một thành phần
quan trọng trong các sản phẩm chống mụn trứng cá. (WHO, 2015)
Hình a
Hình b
Hình c
Hình 2.7. a) Cơng thức cấu tạo; b) Cấu trúc không gian; c) Salicylic acid
15
