Tóm tắt luận án Tiến sĩ Công nghệ thực phẩm: Ứng dụng các kỹ thuật lên men, xử lý nhiệt và nano trong chế biến và nâng cao giá trị các chất có hoạt tính sinh học trong tỏi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Chuyên ngành: Công nghệ Thực phẩm
Mã ngành: 62540101

NGUYỄN ÁI THẠCH

ỨNG DỤNG CÁC KỸ THUẬT LÊN MEN,
XỬ LÝ NHIỆT VÀ NANO TRONG
CHẾ BIẾN VÀ NÂNG CAO GIÁ TRỊ CÁC
CHẤT CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC TRONG
TỎI

Cần Thơ, 2020


CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

Người hướng dẫn chính: PGS.TS. Nguyễn Minh Thủy
Người hướng dẫn phụ: TS. Hà Phương Thư

Luận án được bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp
cơ sở
Họp tại: ………………………………., Trường Đại học Cần Thơ.
Vào lúc ….. giờ ….. ngày ….. tháng ….. năm …..

Phản biện 1:
Phản biện 2:

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:
Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ.
Thư viện Quốc gia Việt Nam.


DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ
1. Nguyễn Ái Thạch, Nguyễn Minh Thủy, Nguyễn Thị Mỹ
Tuyền và Võ Thị Diệu. 2016. Thay đổi đặc tính lý hóa của củ
tỏi trong q trình thuần thục và tồn trữ. Tạp chí Khoa học
Trường Đại học Cần Thơ. 45b: 16-24. ISSN 1859-2333.
2. Nguyễn Ái Thạch, Lê Thái Anh Thư và Nguyễn Minh
Thủy. 2016. Ảnh hưởng của quá trình chần, mật độ
Lactobacillus platarum và nồng độ muối đến các hoạt chất sinh
học trong sản phẩm tỏi lên men muối chua. Tạp chí Nơng
nghiệp và phát triển nông thôn. Chuyên đề: Nông nghiệp xanh:
161-166. ISSN 1859–4581.
3. Nguyễn Ái Thạch, Nguyễn Minh Thủy. 2017. Ảnh hưởng
của nhiệt độ lão hóa đến các đặc tính lý hóa của sản phẩm tỏi
đen. Tạp chí Hóa học. 55(4E23): 130-134. ISSN: 0866-7144.
4. Nguyễn Ái Thạch, Nguyễn Minh Thủy. 2017. Ảnh hưởng
của nhiệt độ lão hóa đến hàm lượng các hợp chất sinh học trong
tỏi đen. Tạp chí Hóa học. 55(4E23): 135-139. ISSN: 08667144.
5. Nguyen Ai Thach and Nguyen Minh Thuy. 2017. Effect of
extraction conditions on polyphenols, flavonoids, S-Allyl
cysteine content and antioxidant activity of black garlic extract.
Vietnam Journal of Science and Technology, 55(5A), 18-25.
ISSN: 0866-708X.
6. Nguyễn Ái Thạch và Nguyễn Minh Thủy. 2018. Ảnh hưởng
của nhiệt độ và thời gian sấy đến các hợp chất có hoạt tính sinh

học và khả năng chống oxy hóa của sản phẩm tỏi đen. Tạp chí
Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam, 1(86): 59-63.
ISSN: 1859-1558.


7. Nguyen Ai Thach and Nguyen Minh Thuy. 2019. Study of
synthesis and characteristics of total polyphenols, total
flavonoids and S-allyl cysteine-loaded alginate nanoparticles
with various black garlic extracts and alginate ratios.
International Journal of Engineering Sciences and Reasearch
Technology, 8(6): 261-272. ISSN: 2277-9655.
8. Nguyen Ai Thach, Ha Phuong Thu and Nguyen Minh Thuy.
2019. In-vitro evaluation of cytotoxicity, antimicrobial, and
enzyme inhibition activity of black garlic and its nanoparticles.
International Journal of Engineering Sciences and Reasearch
Technology, 8(10): 59-63. ISSN: 2277-9655.


Chương 1: GIỚI THIỆU
1.1 Tính cấp thiết của luận án
Ở Việt Nam, tỏi được trồng nhiều tại các vùng Hải
Dương, Hà Nội, Bắc Giang, Phan Rang, Lý Sơn, Đà Lạt,…
Tỏi Phan Rang có đặc điểm củ nhỏ, vỏ lụa trắng, tinh dầu rất
thơm. Nhiều nơng hộ áp dụng quy trình VIETGAP vào sản
xuất, cung cấp cho người tiêu dùng sản phẩm tỏi bảo đảm
chất lượng an toàn.
Bảo quản tỏi rất quan trọng để cung cấp sản phẩm cho
thị trường rau củ tươi và cho q trình chế biến. Tỏi có thể
được lưu trữ khoảng 1-2 tháng trong điều kiện tốt ở nhiệt độ
môi trường xung quanh với RH thấp (< 75%). Tuy nhiên,

trong những điều kiện này, củ tỏi sẽ dần dần trở nên mềm,
xốp và nhăn nheo do mất nước. Khảo sát độ thuần thục và
phương pháp tồn trữ giúp duy trì ổn định nguồn nguyên liệu
cho quá trình chế biến và mua bán.
Việc tiêu thụ tỏi tươi chưa qua chế biến bị hạn chế do
có mùi hăng, vị cay đặc trưng và có xu hướng gây khó chịu
cho dạ dày. Trong những năm gần đây, các phương pháp chế
biến khác nhau như xử lý nhiệt, lão hóa (aging) và lên men
đã được sử dụng để loại bỏ mùi khó chịu và cải thiện vị của
tỏi (Bae et al., 2014). Tỏi đen có vị ngọt dịu và độc đáo, cấu
trúc mềm dẻo như trái cây sấy, không gây mùi vị khó chịu
như tỏi tươi (Wang et al., 2010). Hơn nữa, q trình chế biến
tỏi đen cịn liên quan đến sự hình thành các hợp chất
phenolic, S-allyl-L-cysteine (SAC) và các hợp chất hồ tan
trong nước có tác dụng chống oxy hoá mạnh (CorzoMartinez et al., 2007; Imai et al., 1994). Vì vậy đây là thực
phẩm lý tưởng trong phịng ngừa và điều trị bệnh tim,
Alzheimer, viêm khớp và các bệnh mãn tính như bệnh tiểu
đường, đặc biệt là bệnh ung thư. Ngồi ra, q trình lên men,
ngồi việc là một phương pháp để bảo quản nguyên liệu tươi
trong thời gian ngắn trước khi tiếp tục chế biến, nó có thể
1


mang lại một vài thuận lợi (cải thiện mùi, làm giàu các chất
chuyển hóa mong muốn được tạo ra bởi các vi sinh vật và
tăng độ an toàn) như đã được báo cáo trong các sản phẩm len
men thực vật khác (Buckenhuskes et al., 1990). Hiện nay,
các nghiên cứu chuyên sâu về quy trình chế biến và các biến
đổi chất lượng sản phẩm tỏi đen và tỏi lên men lactic đã bắt
đầu được quan tâm tại Việt Nam. Tuy nhiên, các nghiên cứu

chỉ dừng lại ở việc tạo ra sản phẩm mới (tỏi đen), chưa quan
tâm nhiều đến hoạt chất sinh học trong sản phẩm. Do đó,
việc nghiên cứu, thiết lập và kiểm sốt các thơng số kỹ thuật
trong chế biến là điều cần thiết và cấp bách nhằm tạo ra sản
phẩm có giá trị sinh học và khả năng phòng ngừa bệnh cao
tại Việt Nam.
Khả năng hấp thu các dược chất quý trong tỏi vào cơ
thể đến nay công bố vẫn cịn hạn chế, tuy nhiên có thể khẳng
định rằng khi nano hóa các hoạt chất trên thì khả năng hấp
thu sẽ tăng lên gấp hàng chục lần (Shaikh et al., 2009). Quy
trình chế tạo hạt nano tỏi đen khá phức tạp bởi chúng chỉ
được hình thành khi đáp ứng các tiêu chí về tính chất vật lý
và hóa học đặc trưng. Hạt nano tỏi đen cũng chưa được chế
tạo và công bố ở các nghiên cứu trong nước và quốc tế. Vì
vậy, nghiên cứu chế biến các sản phẩm từ tỏi với hàm lượng
cao các hoạt chất sinh học, đồng thời cùng với việc trích ly
hiệu quả các hoạt chất này và ứng dụng công nghệ nano để
tăng cường hoạt tính của chúng là cấp thiết.
1.2 Mục tiêu nghiên cứu
Nâng cao và cải thiện sinh khả dụng của các chất có
hoạt tính sinh học trong tỏi thơng qua quy trình chế biến sản
phẩm tỏi (tỏi đen và tỏi len men lactic) và công nghệ nano.
1.3 Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Khảo sát sự thay đổi đặc tính lý học và
hợp chất có hoạt tính sinh học của củ tỏi (Allium sativum L.)
trong quá trình thuần thục và tồn trữ.
2


Nội dung 2: Nâng cao các chất có hoạt tính sinh học

trong củ tỏi thơng qua quy trình chế biến sản phẩm tỏi đen và
tỏi lên men lactic.
Nội dung 3: Ứng dụng công nghệ nano nhằm cải thiện
sinh khả dụng của các hợp chất sinh học từ sản phẩm tỏi đen.
1.4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
Nguyên liệu tỏi tươi cổ mềm, giống địa phương được
thu hoạch và chọn lựa vào thời điểm mùa vụ năm 2014,
2015, 2016 và 2017 tại phường Văn Hải, thành phố Phan
Rang - Tháp Chàm, tỉnh Ninh Thuận.
Sản phẩm tỏi đen và tỏi lên men lactic được chế biến
và nghiên cứu tại Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Khoa
Nông nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ.
Hạt nano tỏi đen được chế tạo bằng cách sử dụng
polymer alginate mạch ngắn và thử nghiệm hoạt tính kháng
sinh, gây độc tế bào ung thư, ức chế enzyme -glucosidase
và AChE, khả năng hạ đường huyết trên chuột nhắt trắng bị
tiểu đường tại Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam.
1.5 Ý nghĩa của luận án
1.5.1 Ý nghĩa khoa học
Luận án đã cung cấp nhiều kết quả nghiên cứu về độ
thuần thục, thời gian thu hoạch và điều kiện bảo quản tỏi
tươi. Ngồi ra, cơ chế hình thành tỏi đen và tỏi lên men lactic
trong suốt quá trình chế biến cũng được làm rõ. Các mơ hình
đề xuất và các thiết lập liên quan đến các giá trị tham số
động học được đánh giá nhằm có các hiểu hiết chính xác về
sự thay đổi của các hợp chất có hoạt tính sinh học trong sản
phẩm thực phẩm trong quá trình chế biến. Hạt nano tỏi đen
được chế tạo và thử nghiệm thành cơng ở kỹ thuật in-vitro và
in-vivo góp phần làm đa dạng cơ sở dữ liệu thuốc phục vụ hỗ

trợ và điều trị bệnh.
1.5.2 Ý nghĩa thực tế
3


Thơng qua quy trình chế biến tỏi đen và tỏi lên men
lactic sẽ làm tăng lượng tiêu thụ tỏi cho người nơng dân.
Nghiên cứu đồng thời quy trình sản xuất hai dạng sản phẩm
này cũng nhằm tạo ra nguồn thực phẩm mới có giá trị sinh
học cao và là cơng việc có ý nghĩa khoa học và thực tiễn. Tỏi
đen và tỏi lên men lactic trải qua quá trình chế biến có hàm
lượng các chất có hoạt tính sinh học (S-allyl cysteine,
polyphenol, flavonoid,…) và hoạt động chống oxy hóa cao
hơn so với tỏi tươi. Đặc biệt, các hợp chất này có khả năng
ứng dụng cao trong việc bảo vệ sức khỏe và là một liệu pháp
phòng ngừa bệnh ung thư cho người tiêu thụ chúng.
Tỏi đen và tỏi lên men lactic cũng góp phần làm đa
dạng hơn các sản phẩm từ tỏi ngoài thị trường và cung cấp
nguồn thực phẩm giàu “giá trị dược liệu” trong bữa ăn hàng
ngày.
Công nghệ nano được áp dụng đồng thời sẽ tăng giá
trị sinh học của sản phẩm và mở hướng mới cho việc sử dụng
các sản phẩm của tỏi Việt Nam ở mức độ cao và hiệu quả
hơn. Ngoài ra, sự ra đời của hệ nano tỏi đen sẽ là niềm hy
vọng mới cho các bệnh nhân ung thư, tiểu đường và một số
loại bệnh khác.
1.6 Những điểm mới của luận án
Luận án cung cấp thông tin thời điểm thuần thục và
điều kiện bảo quản tỏi tươi liên quan đến đặc tính lý học và
các hợp chất có hoạt tính sinh học trong suốt quá trình tồn

trữ.
Xây dựng được quy trình chế biến tỏi đen và tỏi lên
men lactic nhằm tạo ra sản phẩm tỏi có chất lượng cao vượt
trội so với tỏi tươi (tăng cường hàm lượng các hoạt chất sinh
học và khả năng chống oxy hóa trong tỏi đen).
Xây dựng quy trình trích ly các hợp chất sinh học từ
tỏi đen và ứng dụng công nghệ nano chế tạo thành công hạt
nano tỏi đen mang các chất có hoạt tính sinh học với kích
4


thước 100 nm, hình dạng gần với hình cầu và độ ổn định
cao. Hiệu quả thu nhận được từ thử nghiệm hoạt tính của hệ
nano tỏi đen ở kỹ thuật in-vitro và in-vivo cũng được xác
định.
1.7 Kết cấu của luận án
Luận án gồm 5 chương: Chương 1-Giới thiệu (trang
1-5); Chương 2-Tổng quan tài liệu (trang 6-30); Chương 3Phương tiện và phương pháp (trang 31-47); Chương 4-Kết
quả và thảo luận (trang 48-135); Chương 5-Kết luận và đề
nghị (trang 136-137). Trong nội dung chính có 36 bảng và 84
hình. Trong bài viết sử dụng 282 tài liệu tham khảo (263 tài
liệu tiếng Anh và 19 tài liệu tiếng Việt).
Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Tổng quát về tỏi
Tỏi (Allium sativum L.), một trong những loại thực
vật lâu đời nhất được sử dụng trong y học, đã trở thành một
phần quan trọng trong của sống của con người qua nhiều thế
kỷ. Tỏi được sử dụng như gia vị thực phẩm, tăng cường sức
khỏe cho người lính trong chiến tranh, chữa cảm lạnh, nhiễm
trùng và điều trị nhiều loại bệnh khác nhau, từ bệnh tim

mạch đến ung thư và thậm chí cả bệnh dịch hạch (Amagase,
2006). Thành phần của tỏi rất phức tạp, với hơn 200 hợp chất
khác nhau góp phần vào hiệu quả có lợi của tỏi. Những tính
năng quan trọng và độc đáo nhất của tỏi là hàm lượng hợp
chất lưu huỳnh hữu cơ cao. Tỏi có chứa nhiều lưu huỳnh hơn
(ít nhất gấp 4 lần) so với nhiều loại rau chứa lưu huỳnh cao
khác: hành tây, bông cải xanh và súp lơ. Tỏi cũng chứa nhiều
carbohydrate chứa fructose, protein, xơ, saponin, phospho,
kali, kẽm, lượng selen vừa phải và vitamin C, steroid
glycoside, lectin, prostaglandin, tinh dầu, adenosine,
vitamins B1, B2, B6, và E, biotin, acid nicotinic, acid béo,
glycolipid, phospholipid, anthocyanin, flavonoid, phenol, và
5


acid amin thiết yếu (Borek, 2001; Imai et al., 1994; Amagase
et al., 2001; Ide et al., 1999; Borek, 2006; Rahman, 2003).
2.2 Các nghiên cứu liên quan đến điều kiện thu hoạch và
tồn trữ củ tỏi sau thu hoạch
Tại Thổ Nhĩ Kỳ, tỏi có thể được bảo quản tại 0-5oC,
60-70% RH trong ít nhất 3-4 tuần trong kho. Đến năm 2012,
chưa có phương pháp xử lý nào được thực hiện ở trước và
sau thu hoạch tỏi bảo quản tại Thổ Nhĩ Kỳ. Bảo quản tỏi
trong điều kiện kiểm sốt khí quyển và điều chỉnh khí quyển
được sử dụng phổ biến với phương pháp chiếu xạ, hóa chất
và gia nhiệt khác nhau ở nước ngoài (Selen and Nilgün,
2012).
Geraldine et al. (2008) đánh giá tính chất vật lý của
agar-agar (1%) dựa trên lớp màng phủ kết hợp với 0,2%
chitosan và 0,2% acid acetic, cũng như ảnh hưởng của chúng

đến lớp màng phủ của tỏi chế biến. Tổn thất ẩm trung bình
của tỏi phủ màng thấp hơn 3 lần so với mẫu đối chứng
(không phủ màng). Có sự gia tăng đáng kể sự khác biệt về
màu sắc (DE*) của mẫu đối chứng so với cách xử lý khác.
Tỏi bao màng có cường độ hơ hấp (30 mg CO2/kg.giờ) giảm
một nửa so với tỏi đối chứng.
Hiện nay, ở Việt Nam, củ tỏi sau khi thu hoạch từ
ruộng tỏi sẽ được nông dân xử lý, phơi nắng nhiều ngày và
lưu kho. Quy trình đơn giản này sẽ làm tỏi dễ bị thối hỏng,
mất nước và dẫn đến giảm giá trị kinh tế. Ngoài ra, các
nghiên cứu sau thu hoạch củ tỏi vẫn chưa được công bố
nhiều ở nước ta.
2.3 Các nghiên cứu nâng cao hoạt chất sinh học trong tỏi
liên quan đến chế biến tỏi đen và tỏi lên men lactic
Ở Việt Nam trước đó, tỏi đen chỉ được nghiên cứu tại
Học viện Quân y ở quy mô cấp Nhà nước mã số
KC10.TN05/11-15. Theo chủ nhiệm đề tài “Nghiên cứu lên
men tỏi đen từ tỏi Lý Sơn và đánh giá tác động sinh học của
6


sản phẩm tạo ra” cho biết quá trình lên men, các hoạt tính
sinh học của tỏi Lý Sơn tăng đáng kể, trong đó hàm lượng
đường tổng tăng khoảng 13 lần, fructose tăng khoảng 52 lần
và SAC tăng gấp 6 lần.
Tỏi đen được chế biến từ tỏi tươi thu hoạch ở xã
Quảng Hịa, huyện Quảng Trạch, tỉnh Quảng Bình để ủ và
lên men tỏi đen sau 35-55 ngày.Nồi ủ sử dụng có phần nắp
trong là viền cao su giữ kín nhiệt, lỗ thông hơi gắn với một
nhiệt kế 100oC để theo dõi nhiệt độ trong nồi (Nguyễn Đức

Vượng và ctv., 2015). Ngoài ra, Nguyễn Đức Vượng và ctv.
(2017) cũng đã sử dụng quy trình lên men tự nhiên bằng
nhiệt để chuyển tỏi trắng thành tỏi đen. Tiến hành lên men
trong điều kiện 70oC và thời gian lên men từ 35-45 ngày.
Hàm lượng S-allyl cysteine (SAC) tăng lên cũng là
một thay đổi quan trọng trong tiến trình chế biến tỏi đen. Tỏi
tươi chứa 20-30 g/g SAC (Kodera et al., 2002) và lượng
SAC trong tỏi đen cao gấp 5-6 lần so với tỏi tươi (Bae et al.,
2012; Wang et al., 2010). SAC được hình thành bởi quá trình
thủy phân của -glutamyl-S-allyl cysteine (GSAC) bởi glutamyl transpeptidase (-GTP, EC 2.3.2.2) (Kodera et al.,
2002). SAC là một trong những hợp chất amino acid chứa
lưu huỳnh chính và là chất có nhiều lợi ích nhất của tỏi, như
chống oxy hóa, chống ung thư, chống các bệnh lý về gan và
thần kinh (Kodera et al., 2002).
Tỏi muối chua từ năm công ty ở Tây Ban Nha được
phân tích về các đặc tính hóa lý, thành phần gần đúng, acid
ascorbic, thiamin, riboflavin, -tocopherol, và hàm lượng
acid amin. Acid chuẩn độ dao động trong khoảng 0,70 đến
2,66%, trong khi hàm lượng muối trong khoảng 2,39 đến
7,40%. Một sự khác biệt đáng kể trong hàm lượng vitamin,
cũng như các đặc điểm hóa lý. Mức độ vitamin phân tích là
thiamine (0-0,055 mg/kg), riboflavin (0,013-0,032 mg/kg),
7


-tocopherol (0,36-2,53 mg/kg), và acid ascorbic (0-47,9
mg/100 g) (Casado et al., 2004).
Tỏi được bóc vỏ, xử lý (chần và khơng chần) và tiến
hành lên men trong nước muối với sự tham gia của giống vi
khuẩn L. plantarum. Quá trình lên men diễn ra trong 7 ngày

ở nơi duy trì nhiệt độ 30oC. Theo dõi các tính chất hóa học
và vật lý của tỏi sau lên men và sau quá trình bảo quản 3
tháng. Sự phát triển của nấm men hoặc nấm mốc không được
phát hiện trong tỏi chần hoặc không chần trong 7 ngày của
quá trình lên men. Đối với tỏi chần, pH của nước muối giảm
dần, đạt giá trị 3,77 ở 7 ngày. Đối với tỏi khơng chần có một
sự khởi đầu giảm pH của môi trường (4,00), nhưng do sự
phát triển của L. Plantarum đã không diễn ra, pH tăng lên
(5,65), có lẽ do sự khuếch tán sự hình thành acid vào tỏi
trong nước muối (de Castro et al., 1998).
Tỏi tươi (đã bóc vỏ) ngâm ngập trong dung dịch acid
acetic 2% và NaCl được bảo quản ở 20oC trong 60 ngày. pH
của tỏi muối chua giảm còn khoảng 4 ở ngày thứ 20 của quá
trình tồn trữ. Số lượng allicin (thành phần vị cay nồng chính
yếu) của tỏi muối chua bởi phân tích HPLC giảm 5,9% vào
ngày thứ 40 của quá trình tồn trữ so với allicin trong tỏi tươi
(Kim et al., 1993).
Các nghiên cứu trong nước về tỏi cũng còn hạn chế.
Đặc biệt các nghiên cứu chuyên sâu về tác động trong quá
trình chế biến, tồn trữ và khả năng hấp thu của các hoạt chất
có giá trị sinh học trong các sản phẩm từ tỏi vẫn cịn rất hạn
chế, chưa thấy cơng bố trên các tài liệu khoa học trong nước
và trên thế giới.
2.4 Các nghiên cứu tạo hạt nano mang chất có hoạt tính
sinh học từ tỏi hoặc sản phẩm tỏi
Theo Lu et al. (2014) allicin, thành phần hoạt động
chính bắt nguồn từ một tác nhân mùi truyền thống trong tỏi,
tạo nên hàng loạt các tác dụng sinh học. Nhưng đáng tiếc,
8

tiềm năng lớn của tỏi trong quá trình chế biến bị hạn chế bởi
sự nhạy cảm của tỏi đối với các điều kiện nhiệt và kiềm kèm
theo mùi hăng của tỏi. Trong nghiên cứu này, nanoliposome
allicin đã được điều chế bằng cách sử dụng phương pháp bốc
hơi ngược pha nhằm khắc phục các hạn chế đã nêu.
Vũ Bình Dương và Hồ Anh Sơn (2015) đã đánh giá
được tác dụng ức chế dịng tế bào ung thư phổi khơng tế bào
nhỏ người A549 của cao khô tỏi đen bằng thử nghiệm
trypan blue và MTT. Kết quả cho thấy tại các thời điểm 24
giờ, 48 giờ và 72 giờ sau khi ủ với tỏi đen nồng độ 2,5-10
mg/mL, tỏi đen ức chế mạnh sự tăng sinh tế bào A549 với
nồng độ gây IC50 ở 24 giờ là 10,57 mg/mL.
Đến nay, vẫn chưa có nghiên cứu nào ở trong và ngồi
nước chế tạo thành công hạt nano nhỏ hơn 100 nm mang
hoạt chất từ tỏi đen đi kèm với các thử nghiệm in-vitro và invivo.
Chương 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1 Phương tiện nghiên cứu
3.1.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Các thí nghiệm được tiến hành thông qua việc lấy mẫu,
thực nghiệm, phân tích và xử lý dữ liệu tại:
Ruộng tỏi vào thời điểm mùa vụ năm 2014, 2015, 2016
và 2017 tại phường Văn Hải, thành phố Phan Rang - Tháp
Chàm, tỉnh Ninh Thuận.
Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp;
Viện Nghiên cứu và Phát triển Cơng nghệ Sinh học; Phịng
Thí nghiệm Chuyên sâu - Trường Đại học Cần Thơ.
Phòng Vật liệu Nano Y sinh, Viện Khoa học Vật liệu;
Phịng Hóa sinh Ứng dụng, Phòng Hoạt chất Sinh học,
Phòng Nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên, Viện Hóa học;

Phịng Cơng nghệ sinh học Enzyme, Viện Cơng nghệ Sinh
học; Phịng Thiết bị dùng chung, Viện Kỹ thuật Nhiệt đới;
9


Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên – Viện Hàn lâm Khoa
học và Công nghệ Việt Nam.
Thời gian thực hiện từ tháng 06/2014 đến tháng
03/2018.
3.1.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất
3.1.2.1 Thiết bị và dụng cụ
Một số thiết bị và dụng cụ cơ bản được sử dụng trong các thí
nghiệm như sau:
- Cân phân tích Ohaus, model - Tủ đông Sanyo, model SFPX224/E (Mỹ)
CR27K (Nhật Bản)
- Máy đo cấu trúc Rheotex, - Tủ sấy Amerex, model
model SD700 (Nhật Bản)
CV250 (Mỹ)
- Máy đo quang phổ, model - Hệ thống HPLC-UVD
722N (Trung Quốc)
(Shimadzu,
Shimadzu
Corporation, Nhật Bản)
- Tủ mát Alaska, model SL-8C - Cột sắc ký LiChroCART
(Trung Quốc)
(Merck, Đức)
- Tủ làm tỏi đen (80cm x - Kính hiển vi điện tử quét
71cm x 110cm, 50-100oC, RH Hitachi, model S-4800
tối đa ở các nhiệt độ tương (Singapore)
ứng) (Việt Nam)

- Máy tán xạ ánh sáng động - Cân sấy ẩm hồng ngoại,
(DLS) Zetasizer Nano, model model MX50 (Godex, Mỹ)
7.03 (Anh)
- Máy quang phổ hồng ngoại - Máy Elisa reader (Biotek,
chuyển đổi Fourier Perkin ELx800, USA)
Elmer
(Waltham,
Massachusetts, USA)
- Máy cô quay chân không - Máy Tecan Genios
Ika, model RV10 digital V Fluorescence Luminescence
(Đức)
Microplate Reader, model
A-5082 (Thụy Sĩ)
- Máy đo đường huyết Omron, - Máy khuấy từ gia nhiệt
10


model HGM-111 (Nhật Bản)

IKA, model C-MAGHS7
(Đức)
- Bể siêu âm, model Elma - Máy Elisa reader, model
P300H (Đức)
ELx800 (Biotek, Mỹ)
3.1.2.2 Hóa chất
Một số hóa chất cơ bản được sử dụng trong các thí
nghiệm như sau:
- Thuốc thử Folin-Ciocalteu - Chất chuẩn S-allyl-L(độ tinh khiết  99%) (Merck, cysteine ( 98%, Sigma,
Đức)
Mỹ)

- 1,1-diphenyl-2-picryl- Acetonitrile (độ tinh khiết
hydrazil (độ tinh khiết  99%) 99,8%) (Merck, Đức)
(Merck, Đức)
- Chất chuẩn quercetin (độ - Enzyme -glucosidase
tinh khiết  98% Sigma, Mỹ) (CAS No 9001-42-7, Sigma,
Mỹ)
- Dimethyl sulfoxide (CAS - Alloxan monohydrate
No 67-68-5, Sigma, Mỹ)
(Sigma, Mỹ)
- Acetylcholinesterase (CAS -Nitrophenyl--DNo 9002-53-8, Sigma, Mỹ)
glucopyranoside (CAS No
3767-28-0, Sigma, Mỹ)
- 4-Notrophenol (CAS No - Thuốc thử Ellman's
100-02-7, Sigma, Mỹ)
(DTNB) (Sigma, Mỹ)
- Môi trường MRS broth - Natri alginate (Sigma, Mỹ)
(Hemidia, Ấn Độ)
Các hóa chất khác đạt tiêu chuẩn để sử dụng trong phân tích.
3.1.3 Nguyên liệu
Nguyên liệu tỏi cổ mềm, giống địa phương được thu
hoạch vào buổi sáng sớm, thời tiết nắng ráo. Hình dạng bên
ngồi cho thấy cổ cây tỏi đã ngã sang một bên, đầu lá vàng
úa và trong khoảng thời gian 130 đến 140 ngày (sau khi gieo)
tại phường Văn Hải, thành phố Phan Rang - Tháp Chàm, tỉnh
Ninh Thuận. Chọn lựa củ tỏi không bị sâu, thối hoặc nhiễm
11


nấm. Củ tỏi được cho vào thùng carton và vận chuyển bằng ơ
tơ đến phịng thí nghiệm trong vịng 24 giờ.

3.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Nội dung 1: Khảo sát sự thay đổi đặc tính lý học và
hợp chất có hoạt tính sinh học của củ tỏi (Allium sativum
L.) trong quá trình thuần thục và tồn trữ
3.2.1.1 Mục tiêu
Xác định ảnh hưởng của thời điểm thuần thục và điều
kiện bảo quản đến đặc tính lý học và các hợp chất có hoạt
tính sinh học trong q trình tồn trữ. Chọn được thời điểm
thu hoạch tỏi có chất lượng tốt nhất và điều kiện tồn trữ thích
hợp để áp dụng trong chế biến các sản phẩm tỏi.
3.2.1.2 Bố trí thí nghiệm
a Chất lượng củ tỏi ở các thời điểm thu hoạch
Các củ tỏi được thu hoạch tại nhiều ruộng tỏi ở địa
bàn phường Văn Hải, thành phố Phan Rang – Tháp Chàm,
tỉnh Ninh Thuận. Ở mỗi độ tuổi thu hoạch 5 kg củ tỏi. Các củ
tỏi được tồn trữ trong túi vải dạng lưới (kích thước lỗ khoảng
0,9 mm). Củ tỏi được phân tích tại phịng thí nghiệm có nhiệt
độ phịng 28 – 30oC và RH 68 – 71%. Thí nghiệm được bố
trí một nhân tố.
Nhân tố A: độ thuần thục (ngày sau khi gieo): 120, 125,
130, 135 và 140
Số nghiệm thức: 5. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần.
b Ảnh hưởng của nhiệt độ tồn trữ đến chất lượng củ tỏi
Củ tỏi sau khi thu hoạch được xử lý sơ bộ và tách một
lớp vỏ ngoài của củ tỏi nhằm loại bỏ đất cát. Sau đó, các củ
tỏi được chứa trong túi vải lưới và tồn trữ ở các nhiệt độ khác
nhau. Thí nghiệm được bố trí một nhân tố.
Nhân tố B: nhiệt độ tồn trữ (oC): 0, 5, 20 và nhiệt độ
phòng (28-30)
Số nghiệm thức: 4. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần.

12


c Ảnh hưởng của loại bao bì sử dụng đến sự hao hụt khối
lượng
Chọn củ tỏi ở độ tuổi và nhiệt độ bảo quản thích hợp từ
các thí nghiệm trước. Khối lượng tỏi trong bao bì là 500-550
g. Các loại bao bì được sử dụng trong thí nghiệm: PE (24 x
34 cm và dày 38 m), thùng carton (30 x 22,5 x 12,5 cm) với
tỷ lệ đục lỗ là 0,5% (đường kính lỗ 5 mm, 20 lỗ trên hai mặt
của bao bì với khoảng cách đều nhau) và vải lưới (24 x 34
cm và dày 0,21 mm, kích thước lỗ lưới khoảng 0,9 mm). Các
mẫu được tồn trữ ở nhiệt độ thích hợp đã chọn. Thí nghiệm
được bố trí một nhân tố.
Nhân tố C: loại bao bì: PE, thùng carton và vải lưới
Số nghiệm thức: 3. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần.
Các chỉ tiêu cần theo dõi: Hao hụt khối lượng (%),
hàm lượng polyphenol tổng số (TPC) (mg acid gallic tương
đương (GAE)/g d.w), hàm lượng flavonoid tổng số (TFC)
(mg quercetin tương đương (QE/g d.w), hàm lượng
thiosulfinate tổng số (mol/g d.w), hoạt động chống oxy hóa
(%), chỉ số nảy mầm bên trong, màu sắc, độ ẩm (%), cường
độ hô hấp.
3.2.2 Nội dung 2: Nâng cao các chất có hoạt tính sinh học
trong củ tỏi thơng qua quy trình chế biến sản phẩm tỏi đen
và tỏi lên men lactic
3.2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của các phương pháp tiền xử lý
nhiệt đến quy trình sản xuất sản phẩm tỏi đen.
a Mục tiêu: xác định các thông số tối ưu cho quá trình sản
xuất tỏi đen nhằm tạo ra sản phẩm tỏi đen có chất lượng cao

(tăng cường hàm lượng các hoạt chất sinh học và khả năng
chống oxy hóa của tỏi đen).
b Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của phương pháp xử lý
nhiệt nguyên liệu đến chất lượng củ tỏi tươi
13


Chọn các củ tỏi cịn ngun vỏ lụa có đường kính trong
khoảng 3,60,2 cm để tiến hành thí nghiệm
- Phương pháp 1: Chần bằng hơi nước (100oC) trong khoảng
thời gian 4, 6, 8 và 10 phút. Số nghiệm thức: 4. Mỗi nghiệm
thức được lặp lại 3 lần.
- Phương pháp 2: Lạnh đông ở nhiệt độ -18oC trong khoảng
thời gian 12, 24, 36 và 48 giờ. Số nghiệm thức: 4. Mỗi
nghiệm thức được lặp lại 3 lần.
Mẫu đối chứng: không xử lý nhiệt.
Các chỉ tiêu cần theo dõi: TPC (mg GAE/g d.w), TFC
(mg QE/g d.w), hàm lượng thiosulfinate (mol/g d.w), khả
năng loại bỏ gốc tự do DPPH (%) và đánh giá cảm quan theo
phương pháp Phân tích mơ tả định lượng (QDA).
Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian
lăo hóa đến chất lượng sản phẩm tỏi đen
Củ tỏi tươi sau khi được xử lý nhiệt sẽ tiếp tục được lão
hóa để thành tỏi đen. Chất lượng của tỏi đen được theo dõi
sau mỗi 5 hoặc 7 ngày lão hóa cho đến khi kết thúc q trình
chế biến 45 ngày. Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với hai
nhân tố.
Nhân tố D: nhiệt độ lão hóa (oC): 60, 70, 80 và 90
Số nghiệm thức: 4. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần.

Các chỉ tiêu cần theo dõi: độ ẩm (%), pH, oBrix, hàm
lượng đường khử (% d.w), hàm lượng polyphenol tổng số
(TPC), hàm lượng flavonoid tổng số (TFC), hàm lượng
thiosulfinate tổng số (mol/g d.w), hoạt động chống oxy hóa
(%), hàm lượng SAC (mg/kg d.w) bằng phương pháp HPLC.
Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian
sấy đến chất lượng sản phẩm tỏi đen
Củ tỏi sau khi lão hóa được tiến hành sấy khơ lớp vỏ
bên ngồi. Nghiên cứu được bố trí theo mơ hình BoxBehnken với 2 nhân tố:
Nhân tố F: nhiệt độ sấy (oC): 50, 60 và 70
14


Nhân tố G: thời gian (giờ): 8, 12 và 16
Số nghiệm thức: 3 x 3 = 9. Mỗi nghiệm thức được lặp
lại 3 lần.
Các chỉ tiêu cần theo dõi: hàm lượng polyphenol tổng
số (TPC), hàm lượng flavonoid tổng số (TFC) và hoạt động
chống oxy hóa (%). Đánh giá cảm quan: theo phương pháp
hồi quy logistic.
Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của quá trình tồn trữ đến
khả năng duy trì các hoạt chất sinh học trong sản phẩm tỏi
đen
Tỏi sau khi kết thúc quá trình sấy, được đem bảo quản
ở nhiệt độ môi trường (282oC) và nhiệt độ mát (5oC) với hai
loại bao bì bảo quản là PA và bao bì phức hợp (tráng nhơm).
Mỗi bao bì chứa 300 gram tỏi đen. Tiến hành theo dõi hàm
lượng các hợp chất sinh học, khả năng loại bỏ gốc tự do
DPPH của tỏi đen theo thời gian bảo quản (2 tuần/lần). Mục
đích của thí nghiệm là xác định nhiệt độ và loại bao bì bảo

quản thích hợp nhằm duy trì giá trị của sản phẩm tỏi đen với
chất lượng tốt nhất. Thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngẫu
nhiên.
Nhiệt độ tồn trữ (oC): nhiệt độ môi trường (282) và nhiệt độ
mát (5)
Loại bao bì chứa: polyamide (PA) và bao bì phức hợp
(nhơm)
Tổng số nghiệm thức: 2 x 2 = 4. Mỗi nghiệm thức được lặp
lại 3 lần.
Các chỉ tiêu cần theo dõi: Hàm lượng polyphenol tổng
số (mg GAE/g d.w), hàm lượng flavonoid tổng số (mg QE/g
d.w), khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH (%).
3.2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố (pH, nồng độ
muối, mật số vi khuẩn acid lactic) đến quy trình sản xuất sản
phẩm tỏi lên men lactic.
15


a Mục tiêu: xác định các thông số tối ưu cho quá trình sản
xuất lên men nhằm tạo ra sản phẩm tỏi muối chua có chất
lượng cao (tăng cường hàm lượng các hoạt chất sinh học và
khả năng chống oxy hóa trong sản phẩm).
b Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của phương pháp chần
nguyên liệu tỏi đến chất lượng sản phẩm
Chọn các tép tỏi đã bóc vỏ có chiều dài giữa 20–30
mm, chiều rộng giữa 5–10 mm, có chiều dày giữa 5–10 mm.
Thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên. Các củ tỏi
được bóc vỏ và đặt tép tỏi vào trong túi chần với hai lít nước
đã được đun nóng trước tới nhiệt độ, thời gian bố trí. Sau khi

chần, mẫu tỏi được nhanh chóng làm lạnh trong bồn nước đá
3 phút. Tỏi được để ráo nước ở nơi thoáng mát và đặt vào
các túi PA bảo quản ở nhiệt độ 5oC cho đến khi phân tích các
hoạt chất sinh học.
Nhân tố H: nhiệt độ chần (oC): 70, 80 và 90
Nhân tố I: thời gian chần (giây): 60, 90, 120, 150 và 180
- Đối chứng HoIo: không chần
Số nghiệm thức: 3 x 5 = 15. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3
lần.
Các chỉ tiêu cần theo dõi: Hàm lượng thiosulfinate
(µmol/g d.w), flavonoid tổng số (mg QE/g d.w), polyphenol
tổng số (mg GAE/g d.w), khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH
(%), độ cứng (g lực), màu sắc.
Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch
nước muối và mật số vi khuẩn thuần chủng (Lactobacillus
plantarum) đến khả năng lên men lactic tỏi
Vi khuẩn Lactobacillus plantarum thuần chủng được sử
dụng có nguồn gốc từ bộ sưu tập giống vi sinh vật của Viện
Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại
học Cần Thơ. Chủng Lactobacillus plantarum sử dụng bao
gồm dòng XK 1.4 được phân lập từ dưa leo muối chua (theo
16


công thức truyền thống) và S 1.2 được phân lập từ bồn bồn
(Typha orientalis G.A.) muối chua. Mỗi mẻ tỏi lên men có
0,5 kg tép tỏi đã bóc vỏ, chần ở nhiệt độ và thời gian thích
hợp từ thí nghiệm trước. Sau đó bổ sung 0,5 lít dung dịch
muối NaCl 0,5, 1,0, 1,5 và 2,0% và đường sucrose bổ sung
đến 5 oBrix và đem thanh trùng 100oC trong 5 phút. Chủng vi

khuẩn Lactobacillus plantarum khởi động được phát triển
khoảng 24 giờ ở nhiệt độ phịng trong mơi trường MRS
Broth với mật độ 108 CFU/mL. Sau đó pha lỗng thành 100
mL dung dịch vi khuẩn Lactobacillus plantarum có các mật
độ 105, 106 và 107 CFU/mL đến tiến hành len men muối
chua. Q trình lên men diễn ra ở nhiệt độ mơi trường và
được theo dõi thường xuyên. Thí nghiệm được bố trí hồn
tồn ngẫu nhiên.
Nhân tố J: Nồng độ dung dịch muối (w/v, %): 0,5, 1, 1,5 và 2
Nhân tố K: Mật số vi khuẩn thuần chủng (CFU/mL): 105, 106
và 107
Mẫu đối chứng không bổ sung vi khuẩn thuần chủng.
Số nghiệm thức: 4 x 3 = 12. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3
lần.
Các chỉ tiêu cần theo dõi: Hàm lượng thiosulfinate
(µmol/g d.w), flavonoid tổng số (mg QE/g d.w), polyphenol
tổng số (mg GAE/g d.w), khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH
(%), pH, đánh giá cảm quan.
Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của các tỷ lệ và loại rau
bổ sung đến chất lượng tỏi lên men
Tỏi được chần ở nhiệt độ và thời gian thích hợp được
chọn ra từ thí nghiệm trước. Bổ sung hành lá, hành tây và
hành tím với phần trăm khối lượng khác nhau (2,5; 5; 7,5;
10%) vào phần tỏi vừa chần. Sau đó tiến hành lên men thuần
chủng với mật số vi khuẩn Lactobacillus plantarum tối thích
trong dung dịch muối có nồng độ phù hợp được chọn ra từ
kết quả thí nghiệm trên. Sau khi kết thúc quá trình lên men,
17

các nguyên liệu phụ được loại bỏ, phần tỏi còn lại sau lên
men được tiến hành phân tích các chỉ tiêu. Thí nghiệm được
bố trí hồn tồn ngẫu nhiên.
Nhân tố L: Loại rau: hành tây, hành tím và hành lá
Nhân tố M: Tỷ lệ (%): 2,5, 5, 7,5 và 10 so với lượng tỏi
nguyên liệu
Số nghiệm thức: 3 x 4 = 12. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3
lần.
Các chỉ tiêu cần theo dõi: Hàm lượng thiosulfinate
(µmol/g d.w), flavonoid tổng số (mg QE/g d.w), polyphenol
tổng số (mg GAE/g d.w), khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH
(%).
Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của quá trình tồn trữ đến
khả năng duy trì các hoạt chất sinh học trong sản phẩm tỏi
lên men
Sau khi tách riêng từng tép, loại bỏ những tép nhỏ, bóc
lớp vỏ mỏng bên ngồi và rửa sạch, tỏi được chần trong nước
ở nhiệt độ và thời gian thích hợp được chọn ra từ thí nghiệm
trên. Bổ sung thêm một loại phụ liệu với phần trăm khối
lượng nhất định được chọn ra từ kết quả tốt nhất của thí
nghiệm trên. Sau đó tiến hành lên men thuần chủng với mật
số vi khuẩn Lactobacillus plantarum tối thích trong dung
dịch muối có nồng độ phù hợp được chọn ra từ kết quả thí
nghiệm trên. Sau khoảng thời gian lên men thích hợp, phụ
liệu sẽ được loại bỏ, dịch lên men được thanh trùng ở 100°C
trong thời gian 5 phút, sau đó rót nóng ở 70oC vào tỏi sau lên
men. Các mẫu được bảo quản ở hai khoảng nhiệt độ khác
nhau (30±2 và 5±1oC). Theo dõi khả năng bảo quản đến khi
sản phẩm khơng cịn được chấp nhận bởi người tiêu dùng.
Thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên với một nhân

tố.
Nhiệt độ (oC): Nhiệt độ phòng (30±2) và nhiệt độ mát (5±1)
Tổng số nghiệm thức: 2. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần.
18


Các chỉ tiêu cần theo dõi: Hàm lượng thiosulfinate
(µmol/g d.w), hàm lượng flavonoid tổng số (mg QE/g d.w),
hàm lượng polyphenol tổng số (mg GAE/g d.w), khả năng
trung hòa gốc tự do DPPH (%) và giá trị cảm quan.
3.2.3 Nội dung 3: Ứng dụng công nghệ nano nhằm cải
thiện sinh khả dụng của các hợp chất sinh học từ sản
phẩm tỏi chế biến
3.2.3.1 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến q trình trích ly
các chất có hoạt tính sinh học trong tỏi đen
a Mục tiêu: xác định được điều kiện trích ly tối ưu các chất
có hoạt tính sinh học trong tỏi đen
b Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của loại dung môi và tỷ
lệ nguyên liệu/dung mơi trích ly đến hàm lượng các chất có
hoạt tính sinh học
Nhân tố R: Loại dung mơi: nước và ethanol pha trong nước
cất (50% và 100%)
Nhân tố S: Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi: 1/5, 1/10 và 1/15
Số nghiệm thức: 3 x 3 = 9. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3
lần.
Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian
trích ly đến hàm lượng các chất có hoạt tính sinh học
Nhân tố T: Nhiệt độ (oC): 40, 50, 60, 70 và 80
Nhân tố U: Thời gian (phút): 30, 60, 90 và 120

Số nghiệm thức: 5 x 4 = 20. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3
lần.
Các chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng S-allyl cysteine
(mg/kg), polyphenol (mg/g d.w), flavonoid (mg/g d.w).
3.2.3.2 Ứng dụng cơng nghệ nano góp phần nâng cao giá trị
sinh học của sản phẩm tỏi đen
a Mục tiêu: chế tạo hạt nano tỏi đen mang các chất có hoạt
tính sinh học với kích thước  100 nm, hình dạng gần với
hình cầu và độ ổn định cao.
19


b Bố trí thí nghiệm: Tỏi đen được trích ly theo tỷ lệ nguyên
liệu/dung môi là 1/10 trong ethanol 50% ở nhiệt độ 60oC
trong khoảng 90 phút. Nhỏ từ từ dịch trích tỏi đen thu được
vào dung dịch alginate (1 mg/mL) trong máy rung siêu âm
với tần số 40 KHz theo tỷ lệ dịch trích/dung dịch alginate là
1/1, 2/1, 3/1, 1/2, 1/3. Hỗn hợp được đậy kín và đem khuấy
từ ở nhiệt độ phịng trong 48 giờ. Sau đó, tiến hành bốc hơi
ethanol trong thiết bị cô quay chân không ở nhiệt độ 35oC
trong 1 giờ với tốc độ 50 vòng/phút. Sau khi đã đuổi hết
ethanol, hỗn hợp được ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút
trong 5 phút, thu nhận phần dịch phía trên và đem trữ ở nhiệt
độ 5oC đến khi sử dụng.
Xác định tính chất và đặc trưng của vật liệu: Hiệu suất
bọc thuốc (EE%), hình thái, kích thước và điện thế zeta,
quang phổ hồng ngoại chuyển đổi Fourier (FT-IR).
3.2.3.3 Thử nghiệm hoạt tính ở kỹ thuật in-vitro và in-vivo về
khả năng hấp thu và tác dụng của các hoạt chất sinh học của
hệ nano tỏi đen

a Mục tiêu: Xác định và so sánh hiệu quả hoạt tính của hệ
nano tỏi đen và tỏi đen ở kỹ thuật in-vitro và in-vivo
b Thử nghiệm in-vitro
Thí nghiệm 1: Đánh giá tác dụng gây độc tế bào
Các dịng tế bào có nguồn gốc từ Bảo tàng giống chuẩn
của Mỹ (ATCC) gồm: ung thư biểu mơ biểu bì miệng KB
(CCL -17TM), ung thư gan Hep G2 (HB - 8065TM), ung thư
phổi LU-1 (HTB - 57TM), ung thư vú MCF-7 (HTB - 22TM),
ung thư biểu mô thận khỉ Vero và ung thư da SK-Mel 2
(HTB - 68TM).
Hoạt tính gây độc tế bào được thực hiện dựa trên
phương pháp MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5diphenyltetrazolium) được mô tả lần đầu tiên bởi Tim (1983)
và điều chỉnh bởi Cos et al. (1998) và Scudiero et al. (2006).
Đây là phương pháp đánh giá khả năng sống sót của tế bào
20


qua khả năng khử MTT (màu vàng) thành một phức hợp
formazan (màu tím đen) bởi hoạt động của enzym
dehydrogenase trong ty thể.
Thí nghiệm 2: Đánh giá hoạt tính kháng sinh
Các chủng vi khuẩn và nấm đại diện gây bệnh ở người
trong bộ sưu tập giống vi sinh vật của Viện Hóa học – Viện
Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam, bao gồm vi
khuẩn gram âm: Pseudomonas aeruginosa (Pa) ATCC
15442, E. Coli (Ec) ATCC 25922; vi khuẩn gram dương:
Staphylococcus aureus (Sa) ATCC 13709, Bacillus subtilis
(Bs) ATCC 6633, Lactobacillus fermentum N4, Enterococus
faecium B650 và nấm mốc Candida albicans (Ca) ATCC
10231. Thử hoạt tính kháng sinh theo phương pháp của

Franz and Greger (2000) và điều chỉnh bởi Paul et al. (2005).
Thí nghiệm 3: Đánh giá hoạt tính ức chế enzyme gây bệnh
tiểu đường (-glucosidase) và bệnh Alzheimer
(acetylcholinesterase)
- Khả năng ức chế enzyme -glucosidase: Hoạt tính ức chế
enzyme gây bệnh tiểu đường -glucosidase được thử nghiệm
bằng hai phương pháp:
Phương pháp (1) của Yamaki and Mori (2006)
Phương pháp (2) của Kim et al. (2004) và Haimin et al.
(2004) và được điều chỉnh bởi Hakamata et al. (2009)
- Khả năng ức chế enzyme acetylcholinesterase (AChE)
Hoạt tính ức chế AChE gây bệnh Alzheimer được thử
nghiệm bằng phương pháp thử của Ellman et al. (1961),
được điều chỉnh bởi Yueqing et al. (2013) và Karthikeyan et
al. (2015).
c Thử nghiệm in-vivo
Chuột được gây bệnh tiểu đường bằng cách tiêm
alloxan monohydrate (Sigma) 135 mg/kg trọng lượng chuột
vào dưới da ở khoang bụng.
21