Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống in vitro cây sa nhân tím amomum longiligulare t l wu

LỜI CẢM ƠN
Khoảng thời gian đƣợc học tập và làm việc tại Viện Công nghệ sinh họcTrƣờng Đại học Lâm nghiệp Việt Nam đã mang đến cho tôi sự hào hứng và là
hành trang giúp tôi chuẩn bị tốt nhất cho công việc trong tƣơng lai. Tôi xin chân
thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp- Trƣờng Đại
học Lâm nghiệp đã tạo điều kiện cho tơi tham gia thực hiện đề tài khóa luận tốt
nghiệp tại Viện.
Trong q trình nghiên cứu và tìm hiểu tơi đã quyết định lựa chọn đề tài
“Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống in vitro cây Sa nhân tím (Amomum
longiligulare T.L.Wu)” làm khóa luận tốt nghiệp.
Để hồn thành đƣợc báo cáo khóa luận tốt nghiệp này, tơi xin bày tỏ lịng
biết ơn sâu sắc nhất đến TS. Nguyễn Thị Hồng Gấm - Bộ môn Công nghệ tế bào
- Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp đã tạo điều kiện hết mức, luôn sát sao và
trực tiếp hƣớng dẫn tôi trong suốt q trình thực hiện và hồn thiện khóa luận tốt
nghiệp.
Tơi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo thuộc Bộ môn Công nghệ tế bào
cùng các thầy cô trong Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp đã quan tâm, giúp đỡ
và tạo điều kiện trong q trình tơi thực hiện đề tài.
Hà Nội, ngày 22 tháng 5 năm 2019
Sinh viên thực hiện

Đỗ Thanh Hằng

i


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................................i
MỤC LỤC ...................................................................................................................... ii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................................................iv
DANH MỤC BẢNG .......................................................................................................v
DANH MỤC HÌNH .......................................................................................................vi

ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................................1
PHẦN 1. .......................................................................................................................... 2
TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU .......................................................................2
1.1. Đặc điểm hình thái và phân bố Sa nhân tím ............................................................. 2
1.1.1. Đặc điểm hình thái.................................................................................................2
1.1.2. Phân bố ..................................................................................................................3
1.2. Đặc điểm sinh thái, sinh học.....................................................................................3
1.3. Giá trị kinh tế, dƣợc học và bảo tồn .........................................................................4
1.3.1.Giá trị kinh tế ..........................................................................................................5
1.3.2.Giá trị dƣợc học ......................................................................................................6
1.3.3.Giá trị môi trƣờng và bảo tồn .................................................................................6
1.4. Tình hình nghiên cứu Sa nhân tím bằng nuôi cấy mô ở Việt Nam và trên thế giới .7
1.4.1. Một số kết quả nghiên cứu invitro loài Sa nhân tím tại Việt Nam ........................ 7
1.4.2. Một số kết quả nghiên cứu in vitro lồi Sa nhân tím trên thế giới ........................ 9
1.5. Một số nghiên cứu nhân giống in vitro trên Họ Gừng ở Việt Nam và trên thế giới.
.........................................................................................................................................9
PHẦN 2. ........................................................................................................................ 12
MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 12
2.1. Đối tƣợng, vật liệu và địa điểm nghiên cứu ........................................................... 12
2.2. Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................................... 12
2.3. Nội dung nghiên cứu .............................................................................................. 12
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................................ 13
2.4.1.

Phƣơng pháp luận ............................................................................................ 13

2.4.2. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm cụ thể .................................................................13
2.4.3. Phƣơng pháp thu thập và xử lí số liệu .................................................................16
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN............................................................. 17
ii

3.1. Tạo mẫu sạch in vitro ............................................................................................. 17
3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng đến khả năng nhân
nhanh chồi in vitro. ........................................................................................................19
3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của NAA đến khả năng ra rễ in vitro của Sa nhân
tím ..................................................................................................................................22
PHẦN 4. ........................................................................................................................ 28
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................................... 28
4.1. Kết luận...................................................................................................................28
4.2. Kiến nghị ................................................................................................................28
TÀI LIỆU THAM KHẢO

iii


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Viết đầy đủ

Từ viết tắt
BAP

Benzylamino purine-6

IBA

Indole-3- butyric acid

Ki

Furfuryamino purine-6

NAA

Naphthylacetic acid

ĐHST

Điều hịa sinh trƣởng

MS

Murashige&Skoog, 1962

CTTN

Cơng thức thí nghiệm

TB

Trung bình

Cs

Cộng sự

Sig

Mức ý nghĩa (Significant)

IAA

Acid Indolacetic

iv


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1: Bố trí thí nghiệm ảnh hƣởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1% đến
khả năng tạo mẫu sạch ...................................................................................................14
Bảng 2.2: Bố trí thí nghiệm ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng đến khả năng
nhân nhanh chồi Sa nhân tím......................................................................................... 14
Bảng 2.3: Bố trí thí nghiệm ảnh hƣởng của nồng độ NAA đến sự phát triển của rễ Sa
nhân tím ......................................................................................................................... 15
Bảng 2.4: Bố trí thí nghiệm ảnh hƣởng của tỷ lệ phối trộn các nguyên liệu đến sự phát
triển của cây con ............................................................................................................15
Bảng 3.1: Ảnh hƣởng của thời gian khử trùng HgCl2 0,1% đến khả năng tạo mẫu sạch
.......................................................................................................................................17
Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của BAP và NAA đến khả năng nhân nhanh chồi Sa nhân tím. 19
Bảng 3.3: Ảnh hƣởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ Sa nhân tím ...................22
Bảng 3.4: Ảnh hƣởng của tỷ lệ phối trộn các nguyên liệu đến sự phát triển của cây con
.......................................................................................................................................25

v


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cây Sa nhân tím (A) và Quả Sa nhân tím (B) .................................................3
Hình 3.1a: Mẫu sạch ban đầu ........................................................................................ 18
Hình 3.1b: Các kết quả mẫu sạch từ Sa nhân tím đƣa vào mơi trƣờng ni cấy khởi

động thu đƣợc sau 4 tuần ............................................................................................... 18
Hình 3.2a: Các cơng thức nhân nhanh chồi Sa nhân tím sau 8 tuần ni .....................21
Hình 3.2c. Chồi phát triển tốt để có thể đƣa ra rễ ......................................................... 21
Hình 3.3a: Cây con Sa nhân tím ra rễ trên các mơi trƣờng khác nhau .......................... 23
Hình 3.3b: Cây con Sa nhân tím hồn chỉnh .................................................................24
Hình 3.5a: Cây con bắt đầu cấy vào giá thể ..................................................................26
Hình 3.5b: Cây con Sa nhân tím in vitro trồng trên các giá thể khác nhau sau 6 tuần. 26

vi


ĐẶT VẤN ĐỀ
Sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu) thuộc chi Sa nhân
(Amomum), họ gừng (Zingiberaceae). Đây là một cây thuốc quý, có trong danh
mục thực vật rừng quý hiếm ban hành kèm theo nghị định số 18-HĐBT ngày
17/01/1992 (Hội đồng Bộ trƣởng, 1992) [5].
Quả Sa nhân chứa tinh dầu với nhiều hợp chất hóa học giá trị nhƣ:
camphen, β-pinen, limonen, camphor; borneol, saponin (Nguyễn Đức Minh et
al.,1994). Tinh dầu Sa nhân có tác dụng kháng khuẩn và nấm (Đỗ Thị Hoa Viên
et al., 1994; Sabulal et al., 2006; Aneja, Joshi 2009; Li et al., 2011). Sa nhân
đƣợc sử dụng trong nhiều bài thuốc đơng y nhƣ: Chữa có thai bị lạnh bụng, đầy
hơi, tiểu tiện không thông; chữa tiêu chảy; chữa ăn không tiêu, nôn mửa, đau
bụng; chữa đau nhức răng; chữa tê thấp…(Đỗ Tất Lợi, 2003). Ngoài ra, Sa nhân
đƣợc biết đến là loại gia vị đắt thứ ba trên thế giới sau Saffron và vanilla (Đỗ
Năng Vịnh et al., 2006).
Hiện nay, rừng tự nhiên đang bị tàn phá nghiêm trọng. Cây dƣợc liệu bị
khai thác tự do nên diện tích và sản lƣợng ngày càng suy giảm, trong khi nhu
cầu sử dụng thuốc đơng dƣợc để chăm sóc và bảo vệ sức khỏe ngày càng cao.
Để giải quyết vấn đề phát triển cây dƣợc liệu trong đó có Sa nhân tím, khắc phục
những khó khăn trên địi hỏi phải có một hệ thống giải pháp tồn diện về quản

lý, quy hoạch vùng ngun liệu, quy trình cơng nghệ.... Nhân giống in vitro nhờ
có ƣu điểm cho hệ số nhân giống cao, đã thực sự trở thành giải pháp cần thiết
trong cơng tác giống cây trồng, góp phần phát triển nguồn cây dƣợc liệu.
Chính vì vậy mà tơi quyết định chọn đề tài “Nghiên cứu kỹ thuật nhân
giống in vitro cây Sa nhân tím(Amomum longiligulare T.L.Wu)” nhằm góp
phần bảo tồn tài nguyên di truyền thực vật và làm cơ sở cho việc nhân nhanh
loài cây dƣợc liệu này, cung cấp nguồn cây giống chất lƣợng cao để mở rộng
vùng dƣợc liệu Sa nhân trong nƣớc.

1


PHẦN 1.
TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. Đặc điểm hình thái và phân bố Sa nhân tím
1.1.1. Đặc điểm hình thái
Nhắc đến Sa nhân tím cịn có một số tên khác nhƣ: Mè tré bà, co nẻnh
(Thái), mác nẻnh (Tày), Sa ngần (Dao), pa dóoc (K’Dong), la vê (Ba Na), Sa
nhân lƣỡi dài, Hải nam Sa nhân [1,2].
Sa nhân tím là cây thân thảo, sống lâu năm, cao 1,5- 2,5 m. Lá mọc so le
thành hai dãy, hình mác, dài 23- 30 cm, rộng 5- 6 cm, gốc hình nêm, đầu nhọn,
mép nguyên, hai mặt nhẵn, mặt trên bóng, lƣỡi bẹ mỏng, xẻ đôi; cuống lá dài 510 mm [1,2].
Cụm hoa mọc từ thân rễ thành bơng, có 5- 7 hoa màu trắng; lá bắc ngồi
hình bầu dục, màu nâu, lá bắc trong dạng ống; đài dài 1,5 cm, có 3 răng nhọn;
tràng hình ống dài 1,3- 1,5 cm, chia 3 thùy, mặt ngồi có lơng thƣa, thùy giƣa
hình trứng ngƣợc, hai thùy bên hẹp; cánh mơi gần trịn, đƣờng kính 2- 2,6 cm,
lõm, mép màu vàng, giữa có sọc đỏ, đầu cánh môi xẻ hai thùy nhỏ gập ra phía
sau, khơng có nhị lép, chỉ nhị dài hơn bao phấn; bầu hình trụ trịn, hơi phình ở
giữa, có lơng trắng [1].
Quả hình cầu, khi chín có màu nâu đen, đƣờng kính 1,3- 2 cm, mặt ngồi

có gai ngắn, chia 3 ơ; hạt có áo, đa dạng, đƣờng kính 3- 4 mm [1].
Nhiều loài khác cũng mang tên Sa nhân và đƣợc dùng nhƣ Amomum
vespertilis Gagnep (Sa nhân thầu dầu), A. mengtzense Tsai Chen (Sa nhân khế),
A. pavieanum Gagnep (Sa nhân sung), A. aurantiacum H.T. Tsai (Sa nhân đỏ),
A. schmidtii Gagnep (Sa nhân hồi), A. biflorum Jack (Sa nhân hai hoa), A.
repens Sonn (Sa nhân trúc sa), A. repoense Pierre (Sa nhân cánh) [1].

2


A

B

Hình 1.1. Cây Sa nhân tím (A) và Quả Sa nhân tím (B)
(Nguồn ảnh: Sa nhân tím xuất xứ Sơn Long do Trung tâm Nghiên cứu Lâm sản ngoài gỗ, Viện
Khoa học lâm nghiệp Việt Nam nghiên cứu chọn tạo).

1.1.2. Phân bố
Chi Amomum Roxb có khoảng 250 lồi trên thế giới, phân bố chủ yếu ở
vùng nhiệt đới, đặc biệt là khu vực nhiệt đới Đông Nam và Nam Á. Ở Việt Nam,
có khoảng 30 lồi; Borneo 30 lồi, Java 13 lồi, Malaysia 18 lồi....
Sa nhân tím có vùng phân bố từ đảo Hải Nam- Trung Quốc, đến vùng
Trung Lào và Việt Nam. Ở Việt Nam, Sa nhân tím phân bố tập trung nhất ở các
tỉnh Tây Nguyên. Những địa điểm có nhiều Sa nhân tím nhất là huyện M’Đrắc
(Đắc Lắc); An Khê và K’Bang (Gia Lai); Vĩnh Thạch (Bình Định); Sông Hinh
(Phú Yên); Ba Tơ (Quảng Ngãi)… Ở đây Sa nhân tím mọc tƣơng đối tập trung
xen lẫn với lồi Sa nhân trắng, trên diện tích hàng ngàn hecta rừng. Trong khi đó
ở các tỉnh phía Bắc nhƣ Phú Thọ, Thái Bình, Hịa Bình, Hải Dƣơng, Sa nhân tím
mọc với trữ lƣợng ít ở trạng thái hoang dại hoặc trồng ở vƣờn [1].

1.2. Đặc điểm sinh thái in

c

Sa nhân tím là cây ƣa ẩm, chịu bóng (20- 50%) dƣới tán rừng; và chịu
sáng trong trƣờng hợp mọc thành những quần thể lớn thuần loài trên đất sau
nƣơng rẫy. Cây thƣờng mọc thành đám ở ven rừng kín thƣờng xanh, rừng thứ
sinh dọc theo hành lang ven suối; sinh chồi gốc khỏe vào 2 vụ xuân- hè và hèthu. Số nhánh con đƣợc sinh ra trong các thế hệ tăng theo cấp số nhân với công
bội là 1- nghĩa là, số nhánh con sinh ra ở một thế hệ này luôn gấp đôi số nhánh
3


đã có ở thế hệ trƣớc cộng thêm 1 (đó là cây mẹ ban đầu). Do đó qua nghiên cứu
trồng Sa nhân tím ở Vĩnh Trạch (Bình Định), Tân Lạc (Hịa Bình), n Lập (Phú
Thọ)… thấy từ 1 nhánh con ban đầu, sau 16- 20 tháng tuổi đã tạo thành khóm Sa
nhân trung bình từ 5- 9 cây. Ở những khóm cực đại có đến 15- 17 cây [1].
Sa nhân tím có hoa quả gần nhƣ quanh năm.Tuy nhiên, ở nhiều nơi cây có
2 vụ hoa quả trong năm. Ở vụ xuân- hè, hoa bắt đầu từ giữa tháng 3, quả già vào
khoảng tháng 6- 7, đây là vụ hoa quả chính. Vụ hoa quả phụ bắt đầu khoảng
tháng 7, quả già vào tháng 11. Hoa quả chỉ sinh ra từ gốc những cây sau 1 năm
tuổi. Cây trồng đƣợc 16- 20 tháng tuổi, có 28,2- 40% số nhánh có hoa quả.
Trong quần thể Sa nhân tím trồng lâu năm (3- 5 năm) hay trong quần thể tự
nhiên, tỷ lệ số nhánh có hoa quả có thể là 70%. So với một vài loài Sa nhân đã
đƣợc nghiên cứu ở Việt Nam (ví dụ lồi A. villosum Lour), lồi Sa nhân tím ra
hoa quả tƣơng đối đều hàng năm; tỷ lệ đậu quả trên các cụm hoa cũng cao hơn.
Bởi lẽ, vụ hoa chính của Sa nhân tím ra sớm hơn các lồi Sa nhân khác. Vào
thời điểm đó, thời tiết ít mƣa (ở miền nam đang là mùa khơ) nên sự thụ phấn của
hoa có hiệu quả hơn [1].
Việt Nam là nƣớc có nguồn Sa nhân mọc tự nhiên phong phú nhất trong
khu vực. Theo những con số thống kê chƣa đầy đủ, hằng năm, có thể khai thác

từ vài trăm tấn đến 1000 tấn quả Sa nhân khô và chủ yếu dành cho xuất khẩu.
Tuy nhiên, với cách khai thác thiếu hƣớng dẫn nhƣ hiện nay, phần lớn quả còn
non chƣa đủ tiêu chuẩn thƣơng phẩm. Kết hợp với chủ trƣơng giao đất giao rừng
cho nông dân, cần có kế hoạch phát triển trồng thêm Sa nhân nhất là cây Sa
nhân tím. Lào, Thái Lan và Trung Quốc là những nƣớc đang đi đầu trong việc
trồng Sa nhân bán tự nhiên. Riêng tỉnh Vân Nam (Trung Quốc), vài năm gần
đây đã trồng đƣợc trên 13.000 hecta Sa nhân trên đất rừng, góp phần phủ xanh
và chống xói mịn có hiệu quả [1].
1.3. Giá trị kinh tế, dƣợc h c và bảo tồn
Việt Nam là một trong số ít quốc gia có nguồn Sa nhân mọc tự nhiên
phong phú. Dƣợc liệu Sa nhân ở nƣớc ta trên thực tế đã và đang đƣợc thu hái từ
4


một nhóm lồi, trong đó có 4 lồi Amomum villosum Lour, A. longiligulare T.
L. Wu, A. ovoideum Pierre ex Gagnep. Và A.thyrsoideum Gagnep. Quan sát về
hình thái quả khơ (già), cũng nhƣ các khối hạt của chúng thấy tƣơng đối giống
nhau, khó phân biệt. Những kết quả nghiên cứu sâu về mặt dƣợc học và hoá học
gần đây của Đào Lan Phƣơng (1995) và Nguyễn Thị Phƣơng Lan (2004) đã
khẳng định, hàm lƣợng tinh dầu cũng nhƣ thành phần hoá học của tinh dầu cả 4
loài gần giống nhau và đều đạt tiêu chuẩn trong Dƣợc điển Việt Nam quy định.
Vì thế, trên thực tế quả của các lồi Sa nhân kể trên từ nhiều năm nay vẫn đƣợc
thị trƣờng chấp nhận.
1.3.1.Giá trị kinh tế
Là loại cây có giá trị kinh tế cao, giúp nâng cao đời sống cho ngƣời dân
sống ven rừng, phục vụ cho sản xuất nông nghiệp và đời sống. Cây Sa nhân tím
khơng tranh chấp đất với một số loại cây trồng khác mà chỉ tận dụng đất dƣới
tán rừng để tăng nguồn thu nhập trên một đơn vị diện tích. Sau khi trồng 2- 3
năm, cây bắt đầu cho quả và có thể thu hoạch 5- 6 năm liền, bình qn 1 hecta
Sa nhân tím có thể cho thu từ 150- 250 kg quả khơ/năm, với giá bán khoảng

100.000 - 150.000 đ/kg thì mỗi năm thu nhập từ 15 đến 30 triệu đồng/ha.
Theo thống kê chƣa đầy đủ, chỉ tính riêng ở Miền Bắc, từ năm 19561970, ngành Ngoại thƣơng đã xuất khẩu mỗi năm từ vài chục tấn đến 200 tấn
(Đinh Vân Tự, 2001). Ƣớc tính cả nƣớc ta hiện nay, mỗi năm cũng khai thác
đƣợc 400- 600 tấn. Do ngƣời dân tự đi khai thác trong tự nhiên, nên Sa nhân của
Việt Nam trên thị trƣờng chỉ đạt loại trung bình (gọi là Sa nhân xơ), nghĩa là
trong đó có cả quả già, quả bánh tẻ và quả non. Giá bán tại chỗ dao động từ
30.000 đến 40.000 đ/kg quả khô. Tại thị trƣờng các tỉnh biên giới phía Bắc (Cao
Bằng, Lạng Sơn, Lai Châu...) giá bán này từ 50.000 đến 80.000 đ/kg quả khô
(tuỳ năm).
Sa nhân của Việt Nam chủ yếu đƣợc xuất khẩu sang Trung Quốc, Hồng
Kông, Đài Loan.... Giá Sa nhân trên thị trƣờng thế giới từ 7 đến 10 đô la Mỹ/kg.
Nếu mỗi năm nƣớc ta xuất khẩu đƣợc khoảng 400 tấn Sa nhân, sẽ thu đƣợc từ
5


2,8 đến 4 triệu USD. Việc phát triển trồng thêm và quản lý hợp lý Sa nhân mọc
tự nhiên, chắc chắn sẽ làm tăng khối lƣợng cũng nhƣ giá trị thƣơng phẩm Sa
nhân của Việt Nam trên thị trƣờng quốc tế.
Sa nhân tím là cây lâm sản ngồi gỗ cho hiệu quả kinh tế cao và bền vững
đƣợc Bộ Nông nghiệp và phát triển nơng thơn khuyến khích gây trồng.
1.3.2.Giá trị dược học
Quả Sa nhân tím chứa tinh dầu với hàm lƣợng khoảng 0,65%. Thành phần
tinh dầu gồm α pinen, camphor; β pinen, caren- 3 và limonene- borneol [2].
Tinh dầu và dịch chiết ethanol của quả Sa nhân tím có tác dụng kháng
khuẩn. Tinh dầu Sa nhân tím cịn có tác dụng giảm đau, chống viêm, chống tiêu
chảy. Zhao Jin và cộng sự đã thử nghiệm các tác dụng này trên chuột. Kết quả
nhƣ sau: tinh dầu Sa nhân dầu tím pha trong xylen (liều 2 ml/kg) có tác dụng
chống sƣng tƣơng tự với indomethacin (10 mg/kg) khi tiêm trên chuột. Tinh dầu
Sa nhân tím pha trong xylen (liều 2 ml/kg) cịn có tác dụng giảm đau khi chuột
bị đau bởi acid acetic bằng tƣơng tự với tác dụng indomethacin (10 mg/kg) khi

tiêm trên chuột. Tác dụng chống tiêu chảy của tinh dầu Sa nhân tím pha trong
xylen (liều 2 ml/kg) cũng tƣơng tự với tác dụng của smecta (5 mg/kg).
Trong y học cổ truyền, quả Sa nhân đƣợc sử dụng làm thuốc, nhằm
kích thích tiêu hóa, chữa ăn uống không tiêu, bị nôn mửa, đau dạ dày, đau bụng,
kiết lỵ, sảy thai, bệnh cao huyết áp, cao cholesterol máu. Quả Sa nhân tím
chứa tinh dầu có tác dụng kháng khuẩn và nấm. Sa nhân tím cịn đƣợc dùng làm
gia vị, hƣơng liệu, sản xuất xà phòng thơm, dầu gội,.... Chính vì thế, đây khơng
chỉ là cây dƣợc liệu q mà còn đƣợc dùng nhiều trong nƣớc và đƣợc xuất khẩu
ra nhiều nƣớc trên thế giới.
1.3.3.Giá trị môi trường và bảo tồn
Việc trồng Sa nhân tím dƣới tán rừng giải quyết tình trạng rửa trơi và xói
mịn đất, tạo nên thảm thực vật đa dạng phong phú, góp phần bảo vệ và phát
triển rừng, hạn chế xói mịn, ngăn chặn và hạn chế lũ lụt.

6


Sa nhân tím là cây dễ trồng và có thể trồng đƣợc ở nhiều vùng sinh thái
khác nhau, nhất là ở các vùng đệm của Vƣờn Quốc gia và khu bảo tồn thiên
nhiên. Việc phát triển trồng thêm cây Sa nhân ở đây cịn mang lại những lợi ích
khác về mặt môi trƣờng cũng nhƣ bảo vệ nguồn gen quý hiếm này.
1.4. Tình hình nghiên cứu Sa nhân tím bằng nuôi cấy mô ở Việt Nam và
trên thế giới
1.4.1. Một số kết quả nghiên cứu invitro lồi Sa nhân tím tại Việt Nam
Đặng Ngọc Phúc và cs (2011), đã đƣa ra quy trình nhân giống in vitro cây
Sa nhân tím. Đỉnh sinh trƣởng và đoạn thân mang chồi nách từ thân rễ của cây
tự nhiên đƣợc khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong 12 phút cho tỷ lệ mẫu sống cao
nhất, đạt 91,11% đối với đỉnh sinh trƣởng và 86,67% đối với đoạn thân. Môi
trƣờng MS bổ sung BAP (1,0 mg/l) hoặc kinetin (1,0 mg/l) thích hợp nhất cho
giai đoạn tái sinh chồi. Chồi in vitro đƣợc nhân nhanh trên môi trƣờng MS bổ

sung 1,5 mg/l BAP kết hợp với 0,25 mg/l NAA hoặc 1,5 mg/l kinetin kết hợp
với 0,25 mg/l NAA (đạt 7,40 chồi/mẫu). Rễ đƣợc cảm ứng trên môi trƣờng MS
bổ sung 0,5 mg/l NAA (18,42 rễ/chồi). Cây con in vitro đƣợc trồng trên giá thể
trộn 1 đất phù sa : 2 trấu hun : 1 mùn hữu cơ cho tỷ lệ sống cao đạt 93,14% [9].
Trƣơng Thị Bích Phƣợng và cs (2017), đã trình bày kết quả thí nghiệm
nhân giống in vitro cây Sa nhân (Amomum sp.) thu ở huyện A Lƣới, tỉnh Thừa
Thiên Huế. Đỉnh sinh trƣởng và gốc thân của cây tự nhiên đƣợc khử trùng bằng
HgCl2 0,15% trong thời gian từ 15- 18 phút, sau đó ngâm trong dung dịch nano
bạc 40 ppm trong 12 phút. Đối với đỉnh chồi, thời gian khử trùng HgCl2 16 phút
cho tỷ lệ mẫu sống cao nhất, đạt 40% và đối với gốc thân, thời gian khử trùng
HgCl2 17 phút cho tỷ lệ mẫu sống cao nhất, đạt 42,86%. Mẫu đƣợc nuôi cấy trên
môi trƣờng MS bổ sung riêng lẻ chất kích thích sinh trƣởng BAP, kinetin. Sau 4
tuần nuôi cấy, khả năng tái sinh chồi tốt nhất đạt đƣợc trên môi trƣờng bổ sung
BAP 2,0 mg/l (1,83 chồi/mẫu gốc thân và 2,75 chồi/mẫu chồi đỉnh bổ đôi) hoặc
trên môi trƣờng bổ sung kinetin 3,0 mg/l (1,60 chồi/mẫu gốc thân và 2,0
chồi/mẫu chồi đỉnh bổ đôi). Gốc thân in vitro đƣợc cấy lên môi trƣờng nhân
7


nhanh bổ sung riêng lẻ các chất kích thích sinh trƣởng BAP và kinetin hoặc phối
hợp BAP với NAA. Sau 10 tuần nuôi cấy, môi trƣờng bổ sung BAP 1,0 mg/l
cho số chồi lớn nhất đạt 9,83 chồi/mẫu. Chồi in vitro đƣợc cảm ứng rễ trên môi
trƣờng MS bổ sung NAA hay IBA. Rễ đƣợc cảm ứng tốt nhất trên mơi trƣờng
MS có bổ sung 0,6 mg/l NAA cho số rễ cao nhất (7,17 rễ/chồi) và rễ phát triển
nhanh về chiều dài trên môi trƣờng bổ sung 0,4 mg/l IBA (3,89 cm). Cây con in
vitro đƣợc huấn luyện thích nghi và trồng trên giá thể xơ dừa với tỷ lệ sống sót
94,44% sau 1 tháng và 72,22% sau 2 tháng [12].
Nguyễn Văn Hồng và Trần Thị Tý (2013), đã nghiên cứu nhân giống cây
Sa nhân tím (Amomum longiligulare) bằng phƣơng pháp nuôi cây mô tế bào, kết
quả nghiên cứu cho thấy: khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong thời gian 15 phút

cho tỷ lệ mẫu sạch cao nhất đạt 60,33%; môi trƣờng phù hợp cho q trình nhân
nhanh chồi là mơi trƣờng MS + Đƣờng 30g/l+ Agar 5,2g/l + Inositol 100mg/l bổ
sung 4mg/l BAP kết hợp với 0,1mg/l IAA cho hệ số nhân chồi đạt 3,87 lần, chất
lƣợng chồi tốt; môi trƣờng phù hợp cho q trình ra rễ là mơi trƣờng nền MS +
Đƣờng 30g/l + Agar 5,2g/l + Inositol 100mg/l bổ sung 0,1mg IBA/l cho số rễ
trung bình 3,67 rễ/chồi, chất lƣợng rễ tốt [6].
Trần Thị Thu Hà và cs (2018), tiến hành nhân giống Sa nhân tím
(Amomun longiligulare) bằng phƣơng pháp giâm chồi đƣợc xem là phƣơng pháp
thích hợp nhất phù hợp với đặc điểm sinh học của cây Sa nhân. Bài báo này thử
nghiệm các công thức nhân chồi khác nhau nhằm tìm ra đƣợc cơng thức nhân
chồi có hệ số nhân giống từ chồi cao đáp ứng đƣợc nhu cầu cung cấp giống hiện
nay cho việc trồng xen cây Sa nhân dƣới tán rừng ở các tỉnh miền núi phía Bắc.
Nghiên cứu này đƣợc tiến hành ở vƣờn ƣơm của Trung tâm Nghiên cứu Lâm
nghiệp – Trƣờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên. Ba công thức thí nghiệm về
thành phần hỗn hợp giâm cây mẹ đƣợc tiến hành thử nghiệm đối với 3 xuất xứ
Sa nhân khác nhau (Thái Nguyên và Đắc Lắc) và theo dõi các chỉ tiêu về tỷ lệ
bật chồi, chất lƣợng cây, sâu bệnh hại,... Kết quả cho thấy công thức giâm cây
mẹ trên giá thể 40% mùn cƣa + 60% đất cho tỉ lệ bật chồi và sức sinh trƣởng của
cây chồi tốt nhất. Khả năng bật chồi và sinh trƣởng của xuất xứ Sa nhân tím Đắc
8


Lắc hạt trịn có tỉ lệ bật chồi và khả năng sinh trƣởng vƣợt trội hơn hai xuất xứ
Sa nhân cịn lại [4].
Ở Việt Nam, có rất ít cơng trình công bố kết quả nghiên cứu nuôi cấy in
vitro cây Sa nhân. Vịnh và đồng tác giả (2006) đã nghiên cứu áp dụng cơng
nghệ phơi vơ tính, hạt nhân tạo trong nhân nhanh Sa nhân. Tuy nhiên kết quả
còn hạn chế.
1.4.2. Một số kết quả nghiên cứu in vitro loài Sa nhân tím trên thế giới
Trên thế giới có một số cơng trình nghiên cứu nhân giống in vitro chi Sa

nhân(Amomum). Sajina và cs (1997) bƣớc đầu đã xây dựng quy trình nhân giống
Amomum subulatum Roxb, đây là lồi có giá trị kinh tế quan trọng nhất ở
Bengal - Ấn Độ [27]. Rao và cs (2003) đã nuôi cấy in vitro Amomum
longiligulare T.L.Wu, kết quả số chồi thu đƣợc tƣơng đối thấp, chỉ đạt 3,7
chồi/mẫu [24].
Một lồi có giá trị khác thuộc chi Sa nhân là Amomum villosum Lour cũng
đã đƣợc Ping (2004), Hong và Na (2005) nhân giống in vitro từ chồi rễ [19].
Amomum krervanh Pierre ex Gagnep là cây dƣợc liệu phổ biến ở Thái Lan và
Campuchia đã đƣợc nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu nhân giống in vitro từ
chồi nách [28].
Amomum tsao-ko Crevost et Lemaire đã đƣợc Hongdong (2006) nuôi in
vitro và nhân nhanh từ chồi đỉnh [18].
1.5. Một số nghiên cứu nhân giống in vitro trên Họ Gừng ở Việt Nam và trên
thế giới.
Nguyễn Văn Việt và cs (2018), đã ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro
trong nhân giống cây Gừng gió (Zingiber zerumbet). Kết quả nghiên cứu cho
thấy, sát khuẩn bề mặt chồi bằng cồn 70% trong 7 phút, khử trùng bằng dung
dịch HgCl2 0,1% trong 9 phút và nuôi cấy mẫu trên môi trƣờng dinh dƣỡng MS
bổ sung 0,2 mg/l BAP và 30 g/l sucrose, cho tỷ lệ mẫu sạch 76,98%, tái sinh
chồi 75,64%, chồi vƣơn cao, thân và lá xanh đậm.Cảm ứng tạo đa chồi trên mơi
trƣờng khống MS bổ sung 1,2 mg/l BAP; 0,5 mg/l Ki; 0,2 mg/l NAA và 30 g/l
9


sucrose, cho tỷ lệ tạo cụm chồi 100% với hệ số nhân đạt 4,08 lần/chu kỳ, sau 5
tuần nuôi cấy. Chồi ra rễ 100%, số rễ trung bình 5,7 rễ/cây và chiều dài rễ trung
bình 5,05 cm khi ni trên mơi trƣờng khống MS bổ sung 0,2 mg/l NAA và 30
g/l sucrose sau 5 tuần ni cấy. Cây con hồn chỉnh đƣợc huấn luyện và chuyển
ra trồng trên giá thể 50% đất, 25% trấu hun và 25% bột xơ dừa, cho tỷ lệ sống
đạt 95,78% [3].

Trƣơng Thị Bích Phƣợng và cs (2018), đã trình bày kết quả vi nhân giống
cây Gừng Huế. Thân củ gừng tự nhiên đƣợc khử trùng bằng dung dịch HgCl2
0,1% trong 12 phút làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm và tăng tỉ lệ mẫu sống cao nhất,
đạt 57,69%. Môi trƣờng MS bổ sung 1,0 mg/l Ki thích hợp nhất để tái sinh chồi
từ lát cắt ngang thân củ cây gừng, đạt 3,46 chồi/mẫu sau 4 tuần nuôi cấy. Chồi
in vitro đƣợc nhân nhanh tốt nhất trên môi trƣờng MS bổ sung 0,9 mg/l Ki với
hệ số nhân chồi 14,0 chồi/mẫu sau 8 tuần nuôi cấy. Môi trƣờng MS bổ sung 3,0
mg/l BAP kết hợp 3,0 mg/l NAA tạo cụm gồm 7,14 chồi/mẫu, trong khi rễ tạo
thành tốt nhất trên môi trƣờng MS bổ sung 3,0 mg/l BAP kết hợp với 2,0 mg/l
NAA với 12,80 rễ/chồi sau 4 tuần nuôi cấy. Cây in vitro đƣợc xử lý bằng dung
dịch nano bạc 6,0 ppm và trồng trên giá thể xơ dừa cho tỷ lệ cây sống cao, đạt
88,25% và cây có sức sống tốt sau 2 tuần đƣa ra vƣờn ƣơm [13].
Nguyễn Phƣơng Quý và cs (2017), chú trọng xác định điều kiện ở một số
bƣớc chính giúp nhân nhanh in vitro giống Gừng trâu qua phƣơng pháp nuôi cấy
lát cắt tế bào. Bƣớc đầu kết quả đã đạt đƣợc nhƣ sau: Ở giai đoạn khử trùng,
mẫu đƣợc khử trùng bằng NaClO (20%) trong 15 phút là công thức khử trùng
phù hợp nhất với tỉ lệ mẫu sống lên 63,3 %. Chuyển sang giai đoạn nuôi cấy cắt
lát mơi trƣờng MS có bổ sung 3mg/l BAP có tỉ lệ tạo chồi, tiền chồi tốt nhất để
tiếp tục làm vật liệu cho giai đoạn nhân nhanh. Trong giai đoạn nhân nhanh mơi
trƣờng có bổ sung vitamin B1 có ảnh hƣởng tốt hơn đến cây. Cụ thể, môi trƣờng
bổ sung có bổ sung 1,0 mg/l BAP; 0,1 mg/l Ki và 3mg/l B1 là phù hợp nhất. Các
chồi sau đó đƣợc chuyển sang môi trƣờng bổ sung 3 mg/l B1 và 0,3 mg/l NAA
sẽ cho hệ rễ phát sinh tốt nhất sau 1 tháng [14].
Krishna Lal Poudel và cs (2018), tiến hành nhân giống vơ tính in vitro và
huấn luyện cây ni cấy mơ của lồi thảo quả lớn đã đƣợc thực hiện tại Trạm
10


nghiên cứu nông nghiệp Pakhribas, Dhankuta, Nepal. Các chồi thân rễ đƣợc thu
và nuôi cấy trong môi trƣờng Murashige và Skoog (MS) đƣợc làm giàu với 9

nồng độ BAP khác nhau (0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l) và IBA: môi trƣờng riêng lẻ
0,5- 2,0 mg/l BAP; 1,0 mg/l IBA và môi trƣờng kết hợp BAP + IBA theo nồng
độ của BAP (0,5-2,0 mg/l) + 1,0 mg/l IBA. Nghiên cứu này cho thấy rằng môi
trƣờng MS đƣợc bổ sung 1,0 mg /l BAP + 1,0 mg/l IBA cho tỷ lệ cảm ứng rễ tối
đa. Chồi tạo rễ trong cùng một môi trƣờng. Cây con đƣợc huấn luyện, sau đó
cây đƣợc chuyển đến vƣờn ƣơm để tiếp tục trồng. Quy trình này có thể đƣợc sử
dụng để phát triển các cây thảo quả chất lƣợng cao [22].
Pradhan và cộng sự (2014) cũng báo cáo số lƣợng rễ tối đa thu đƣợc trên
môi trƣờng chứa BAP 3 mg/l + NAA 0,5 mg/l khi nhân giống cây thảo quả [30].

11


PHẦN 2.
MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng, vật liệu và địa điểm nghiên cứu
- Đối tƣợng: Giống Sa nhân tím xuất xứ Sơn Long (đƣợc công nhận Giống
tiến bộ kỹ thuật, Theo Quyết định số 89 /QĐ-BNN-TCLN ngày 10 tháng 01 năm
2018 của Bộ trƣởng Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn), do Trung tâm nghiên
cứu Lâm sản ngoài Gỗ- Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam cung cấp.
- Vật liệu nghiên cứu: Gốc thân mang chồi nách Sa nhân tím.
- Địa điểm tiến hành: phịng thí nghiệm ni cấy mơ tế bào thực vật, Viện
CNSH Lâm nghiệp, Trƣờng Đại học Lâm nghiệp.
- Thời gian: tháng 6/2018 đến tháng 5/2019.
2.2. Mục tiêu nghiên cứu
- Mục tiêu chung: Xây dựng đƣợc kỹ thuật nhân giống invitro cây Sa nhân
tím cho xuất xứ Sơn Long.
- Mục tiêu cụ thể:
+ Nghiên cứu đƣợc kỹ thuật tạo mẫu sạch
+ Nghiên cứu đƣợc kỹ thuật nhân nhanh chồi

+ Nghiên cứu đƣợc kỹ thuật ra rễ tạo cây con hoàn chỉnh
+ Nghiên cứu đƣợc giá thể cho cây con ra vƣờn ƣơm
2.3. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu ảnh hƣởng của HgCl2 0,1% đến khả năng tạo mẫu sạch.
- Nghiên cứu ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng đến khả năng nhân
nhanh chồi in vitro.
- Nghiên cứu ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng đến khả năng ra rễ
in vitro.
- Nghiên cứu ảnh hƣởng của giá thể đến khả năng sống của cây con Sa
nhân tím ở giai đoạn vƣờn ƣơm.

12


2.4. P ƣơng p áp ng iên cứu
2.4.1. Phương pháp luận
- Các nhân tố chỉ tiêu nghiên cứu: Phải chia thành các cơng thức khác nhau,
phải có cơng thức đối chứng.
- Các nhân tố không phải chỉ tiêu nghiên cứu: Phải đảm bảo tính đồng nhất
giữa các cơng thức trong thí nghiệm.
- Số mẫu thí nghiệm phải đủ lớn.
- Thí nghiệm phải lặp lại ≥ 3 lần.
2.4.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm cụ thể
2.4.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của loại và nồng độ hóa chất đến khả năng tạo
mẫu sạch Sa nhân tím
- Khử trùng ngồi box cấy:
+ Cắt bớt lá
+ Khử trùng bằng xà phịng: dùng chổi lơng cọ nhẹ để loại bỏ hết bụi bẩn.
+ Rửa lại nhiều lần với nƣớc để loại bỏ hoàn toàn xà phòng.
+ Tráng lại bằng nƣớc cất (2-3 lần) để chuẩn bị cho bƣớc tiếp theo.

- Khử trùng trong box cấy:
+ Bƣớc 1: Lắc với nƣớc cất vơ trùng ít nhất 3 lần.
+ Bƣớc 2: Khử trùng với cồn 70% trong 1 phút  loại bỏ cồn, lắc mẫu
với nƣớc cất vô trùng (3 lần).
+ Bƣớc 3: Khử trùng với HgCl2 0,1% trong 5, 7, 10 phút  loại bỏ HgCl2
và tiếp tục tráng mẫu bằng nƣớc cất vô trùng.
+ Bƣớc 4: Khử trùng với cefotaxim 400 mg/l trong 15 phút  loại bỏ
cefotaxim, tráng mẫu cho sạch bằng nƣớc cất.
+ Bƣớc 5: Sau khi đã khử trùng sạch mẫu, cắt những phần đã bị tổn
thƣơng, cắm vào môi trƣờng nuôi cấy khởi đầu là MS + 20 g/l sucrose + 5 g/l
agar.

13


Bảng 2.1: Bố trí thí nghiệm ản ƣởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2
0,1% đến khả năng tạo mẫu sạch
HgCl2 0,1%
(phút)
7
10
5

CTTN
KT1
KT2
KT3

Số mẫu
cấy (mẫu)

Số mẫu
ạc (mẫu)

Tỷ lệ mẫu ạc
nảy c ồi (%)

- Các chỉ tiêu thu thập:
+ Số mẫu cấy ban đầu.
+ Số mẫu sạch và nảy chồi (sau 4 tuần ni cấy).
2.4.2.2.Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hịa sinh trưởng đến khả năng nhân
nhanh chồi in vitro
Trong 4 tuần nuôi và theo dõi mẫu sạch tiến hành cấy chuyển mẫu sang
mơi trƣờng mới để kích nhân nhanh chồi.
Mơi trƣờng nhân nhanh chồi gồm: MS + 20 g/l sucrose + 5,0 g/l agar +
chất ĐHST khác nhau đƣợc thiết kế nhƣ bảng 2.2:
Bảng 2.2: Bố trí thí nghiệm ản ƣởng của chất điều hòa in trƣởng đến
khả năng n ân n an c ồi Sa nhân tím.
C ất điều òa in
trƣởng( mg/l)

Hệ ố
nhân
nhanh
c ồi
(lần)

CTTN

CT1

CT2
CT3
CT4
CT5

NAA

BAP

0,25

1,5
1
1,25
1,75
2

C iều
cao TB
của
c ồi
(cm)

- Các chỉ tiêu thu thập:

+ Số mẫu cấy ban đầu
+ Số chồi thu đƣợc và chiều cao chồi sau 8 tuần nuôi cấy.
14

C ất lƣợng c ồi

2.4.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng ra
rễ in vitro của Sa nhân tím
Sau nhiều lần cấy chuyển để nhân nhanh, tiến hành cấy chồi vào môi trƣờng
ra rễ gồm: MS + 20 g/l sucrose + 5,0 g/l agar + Chất ĐHST nhƣ trong bảng 2.3:
Bảng 2.3: Bố trí thí nghiệm ản ƣởng của nồng độ NAA đến sự phát triển
của rễ Sa nhân tím

CTTN

R1
R2
R3
R4

Tỷ lệ
Nồng độ NAA
c ồi ra
(mg/l)
rễ (%)

Số lƣợng rễ
trung
bình/cây
(cái)

C iều dài
trung bình
của rễ (cm)

Đặc điểm
rễ

0,25
0,5
0,75
1,0

- Các chỉ tiêu thu thập:
+ Số mẫu cấy ban đầu
+ Số cây hoàn chỉnh thu đƣợc (sau 4 tuần nuôi cấy)
+ Số rễ/cây, chiều dài rễ.
2.4.2.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến khả năng sống của cây Sa nhân tím
Các chồi sau 4 tuần nuôi cấy đã ra đủ số rễ với chiều dài và kích thƣớc đạt
tiêu chuẩn nên có thể ra cây huấn luyện để cây sống, sinh trƣởng và phát triển.
Bảng 2.4: Bố trí thí nghiệm ản ƣởng của tỷ lệ phối trộn các nguyên liệu
đến sự phát triển của cây con
CTTN
SN1
SN2
SN3

Tỷ lệ Nguyên liệu (p ần)
Mùn Đất p ù Trấu
Cát
cƣa
sa
hun
vàng

1
2
1
1
1
1
1
1
3

Tỷ lệ cây
ống ót
(%)

- Các chỉ tiêu thu thập:
+ Số mẫu cấy ban đầu
+ Giá thể phù hợp sau 6 tuần đƣa cây vào trồng.

15

Đặc điểm của cây


2.4.3. Phương pháp thu thập và xử lí số liệu
Số liệu đƣợc thu thập sau khi mẫu tái sinh tạo chồi.
Số liệu đƣợc thu thập bằng phƣơng pháp quan sát, đo đếm trực tiếp.
Chỉ tiêu thu thập: Số mẫu sạch, số mẫu sạch tạo chồi, số cây hoàn chỉnh
cho ra giai đoạn vƣờn ƣơm.
 Tỉ lệ mẫu sạch (%) =
 Hệ số nhân nhanh chồi (lần) =

 Chỉ tiêu cho ra rễ cây:
o Chiều cao chồi
o Số lƣợng rễ
 Tỉ lệ chồi ra rễ (%) =

100

Phƣơng pháp xử lý số liệu đƣợc đƣa vào phần mềm Excel và SPSS để
tính tốn phân tích kết quả.
- So sánh giữa các cơng thức thí nghiệm bằng chỉ tiêu về tỉ lệ mẫu nảy chồi, tỉ lệ
mẫu sạch, tỷ lệ chồi ra rễ, tỷ lệ số cây sống bằng tiêu chuẩn khi bình phƣơng
(χ2).
+ Nếu Sig (xác suất của χ2) nhỏ hơn 0,05 thì các chỉ tiêu sinh trưởng có
sự sai khác giữa các cơng thức thí nghiệm.
+ Nếu Sig (xác suất của χ2) lớn hơn 0,05 thì các chỉ tiêu sinh trưởng
khơng có sự sai khác giữa các cơng thức thí nghiệm.
- So sánh giữa các cơng thức thí nghiệm về hệ số nhân chồi, chiều dài rễ, số rễ
TB/ cây bằng chỉ tiêu phân tích phƣơng sai một nhân tố.
+ Nếu Sig (xác suất của H hoặc F) nhỏ hơn 0,05 thì các chỉ tiêu sinh
trưởng có sự sai khác giữa các cơng thức thí nghiệm.
+ Nếu Sig (xác suất của H hoặc F) lớn hơn 0,05 thì các chỉ tiêu sinh
trưởng khơng có sự sai khác giữa các cơng thức thí nghiệm.

16


PHẦN 3.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tạo mẫu sạch in vitro
Họ gừng (Zingiberaceae) có thân ngầm nằm sát mặt đất và thân khí sinh

bị dƣới mặt đất. Đặc điểm này làm cho đỉnh sinh trƣởng và đoạn thân thƣờng
chứa nhiều vi khuẩn và nấm mốc gây khó khăn trong quá trình khử trùng mẫu.
Tạo mẫu sạch là bƣớc đầu tiên và quan trọng nhất trong nuôi cấy in vitro.
Mục đích là phải đảm bảo tỷ lệ mẫu nhiễm thấp hoặc khơng có, tỷ lệ mẫu sống
cao nhất, mơ tồn tại, phân hố và sinh trƣởng tốt. Trong thí nghiệm này, chúng
tôi sử dụng đoạn thân mang chồi nách từ thân rễ cây tự nhiên làm nguyên liệu
nuôi cấy ban đầu. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu khả năng khử trùng của HgCl2
0,1% với các ngƣỡng thời gian khác nhau (5- 10 phút), sau đó đƣa mẫu vào mơi
trƣờng ni cấy khởi đầu có cơng thức là MS + 5 g/l agar + 20 g/l sucrose. Kết
quả ảnh hƣởng của thời gian khử trùng đến khả năng vô trùng tạo mẫu sạch và
tái sinh chồi sau 4 tuần theo dõi đƣợc trình bày ở bảng 3.1:
Bảng 3.1: Ản

CNTN
KT1
KT2
KT3

ƣởng của thời gian khử trùng HgCl2 0 1% đến khả năng
tạo mẫu sạch
HgCl2 0,1%
(phút)
7
10
5
Sig

Số mẫu
cấy (mẫu)
90

90
90

Số mẫu
ạc (mẫu)
75
33
21

Tỷ lệ mẫu
ạc (%)
83,33
36,67
23,33
0,0001

Kết quả cho thấy, thời gian khử trùng HgCl2 0,1% khác nhau ảnh hƣởng
rõ đến khả năng tạo mẫu sạch. Sig của tỷ lệ mẫu sạch nhỏ hơn 0,05 có sự khác
biệt giữa các cơng thức thí nghiệm nên kết quả thí nghiệm có ý nghĩa. Thời gian
khử trùng ngắn (5 phút) tỷ lệ mẫu sạch thấp nhất 23,33%. Khi tăng thời gian khử
trùng đến 10 phút, tỷ lệ mẫu sạch đạt 36,67%. Và tỷ lệ mẫu sạch cao nhất thu
đƣợc ở thời gian khử trùng là 7 phút đạt 83,33%.
17


Nhƣ vậy, có thể khi thời gian khử trùng thấp thì chƣa đủ tính khử trùng để
vơ trùng mẫu, cịn thời gian khử trùng cao sẽ dễ gây độc cho mẫu, tuy mẫu
khơng nhiễm nhƣng dính độc khiến mẫu vàng và héo.
So sánh với kết quả của Đặng Ngọc Phúc và cs (2011), sử dụng đoạn thân
mang chồi nách từ thân rễ của cây tự nhiên đƣợc khử trùng bằng HgCl2 0,1%

trong 12 phút cho tỷ lệ mẫu sạch cao nhất đạt 86,67% [9]. Với Nguyễn Văn
Hồng và Trần Thị Tý (2013), khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong thời gian 15
phút cho tỷ lệ mẫu sạch cao nhất đạt 60,33% [6]. Những kết quả này với thời
gian khử trùng dài hơn và tỷ lệ mẫu sạch cũng chênh nhau.
Từ kết quả trên tôi nhận định, thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1% tốt
nhất đối với gốc thân Sa nhân tím là 7 phút và tỷ lệ mẫu sạch thu đƣợc cao đạt
83,33%.

Hình 3.1a: Mẫu sạch ban đầu

CT1

CT2

CT3

Hình 3.1b: Các kết quả mẫu sạch từ Sa nhân tím đƣa vào mơi trƣờng nuôi cấy
khởi động thu đƣợc sau 4 tuần
18


Sau 1,5 tuần, các mẫu sạch bắt đầu tái sinh chồi và các chồi ở các mẫu cấy
xanh, sạch và khỏe.
3.2. Kết quả nghiên cứu ản

ƣởng của chất điều òa in trƣởng đến khả

năng n ân n an c ồi in vitro.
Trong nuôi cấy in vitro, môi trƣờng dinh dƣỡng đóng vai trị quan trọng
trong việc thúc đẩy sự sinh trƣởng và phát triển của mẫu cấy. Tùy thuộc vào

từng lồi và mục đích mà hàm lƣợng và loại chất điều hịa sinh trƣởng đƣợc sử
dụng trong ni cấy là khác nhau. Cytokinine đƣợc biết đến là một nhóm
hoocmon thực vật làm tăng sự phân chia tế bào và biệt hóa chồi bất định, việc
tìm ra loại cytokinine và hàm lƣợng phù hợp nhất sẽ quyết định đến thành công
của q trình ni cấy.
Qua tìm hiểu các cơng trình nghiên cứu và chọn riêng lẻ loại cytokinin là
BAP để thử nghiệm cho q trình nhân nhanh chồi.
Mẫu sau khi ni qua môi trƣờng khởi đầu là MS, đƣợc cấy lên mơi
trƣờng dinh dƣỡng có bổ sung các chất điều hịa sinh trƣởng là BAP (1,0- 2,0
mg/l) kết hợp 0,25 mg/l NAA để thăm dò khả năng nhân nhanh chồi. Kết quả
(sau 8 tuần theo dõi) đƣợc trình bày ở bảng 3.2:
Bảng 3.2. Ản

ƣởng của BAP và NAA đến khả năng n ân n an c ồi Sa
nhân tím.
C ất điều òa
sinh
trƣởng(mg/l)

C iều cao
TB của c ồi
(cm)

C ất lƣợng
c ồi

BAP

Hệ ố
nhân

c ồi
(lần)

SN1

1,5

9,45

4,25

Tốt

SN2

1

5,30

3,25

Trung bình

1,25

6,21

3,85

Khá

SN4

1,75

5,39

3,50

Trung bình

SN5

2

3,96

4,25

Kém

0,001

0,001

CTTN

NAA

SN3

0,25

Sig

19