Nghiên cứu phân lập tuyển chọn và định tên chủng bacillus có đặc tính probiotic địnhh hướng ứng dụng tạo chế phẩm vi sinh bổ sung vào thức ăn chăn nuôi

LỜI CẢM ƠN
Đƣợc sự đồng ý của Ban giám hiệu Trƣờng Đại học Lâm nghiệp, lãnh đạo
Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp và giáo viên hƣớng dẫn tôi tiến hành
nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn và định tên chủng
Bacillus có đặc tính probiotic định hƣớng ứng dụng tạo chế phẩm vi sinh bổ
sung vào thức ăn chăn nuôi’’.
Sau thời gian làm việc với tinh thần nghiêm túc và tích cực đến nay đề tài
về cơ bản đã hồn thành. Để có đƣợc kết quả này trƣớc hết tơi xin chân thành
bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Bùi Văn Thắng Bộ môn Công nghệ Gen và
Th.S Nguyễn Thị Hồng Nhung thuộc bộ môn Cơng nghệ Vi sinh- Hóa sinh – Viện
Cơng nghệ sinh học Lâm nghiệp – Trƣờng Đại học Lâm nghiệp những ngƣời đã tận
tình hƣớng dẫn trong suốt q trình tơi thực hiện đề tài này.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trƣờng Đại học Lâm nghiệp,
ban lãnh đạo và cán bộ nhân viên Viện Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp đã tạo
điều kiện thuận lợi để tôi thực hiện đề tài này.
Mặc dù đã cố gắng để hoàn thành đề tài song do hạn chế về mặt thời gian,
kinh nghiệm bản thân và điều kiện nghiên cứu nên khơng thể tránh khỏi những
thiếu sót và tồn tại nhất định. Tơi kính mong nhận đƣợc những lời nhận xét,
đóng góp ý kiến của các thầy cơ.
Tơi xin chân thành cảm ơn.
Hà Nội, ngày 01 tháng 05 năm 2018
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Thảo

i


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................ i
MỤC LỤC ............................................................................................................. ii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ..................................................................... iv
DANH MỤC CÁC BẢNG.................................................................................... v
DANH MỤC CÁC HÌNH .................................................................................... vi
ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... 1
PHẦN I. T NG QU N ........................................................................................ 3
1.1. Tổng quan về Bacillus ................................................................................... 3
1.1.1. Lịch sử nghiên cứu về Bacillus ................................................................... 3
1.1.2 . Đặc điểm sinh học của vi khuẩn Baccillus ................................................ 3
1.1.3. Cơ sở khoa học để lựa chọn chủng Bacillus trong sản xuất probiotic ........ 7
1.1.4. Ứng dụng của Bacillus trong chăn nuôi .................................................... 11
1.2. Tổng quan về Probiotic ................................................................................ 12
1.2.1. Lịch sử nghiên cứu , khái niệm và phân loại ............................................ 12
1.2.2. Vai trò của Probiotic ................................................................................. 13
1.2.3. Cơ chế kháng khuẩn của vi sinh vật probiotic: ......................................... 15
1.3. Tình hình nghiên cứu ứng dụng chế phẩm vi sinh trong chăn nuôi ............ 16
1.3.1. Trên thế giới .............................................................................................. 16
1.3.2 . Ở Việt Nam .............................................................................................. 18
PHẦN 2. MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU .................................................................................................................... 20
2.1. Mục tiêu nghiên cứu ..................................................................................... 20
2.2. Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 20
2.3 Vật liệu, dụng cụ hóa chất ............................................................................. 20
2.4. Mơi trƣờng nghiên cứu................................................................................. 21
2.5. Các phƣơng pháp nghiên cứu....................................................................... 21
2.5.1. Phân lập ..................................................................................................... 21
2.5.2. Phƣơng pháp bảo quản giống .................................................................... 22
ii


2.5.3. Tuyển chọn các chủng có đặc tính Probiotic ............................................ 23

2.5.4. Xác định mật độ tế bào bằng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc ...................... 29
2.5.5. Xác định đặc tính sinh lý sinh hóa của các chủng vi sinh vật................... 29
2.5.6. Định danh vi khuẩn bằng phƣơng pháp sinh học phân tử ....................... 31
PHẦN 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 33
3.1. Phân lập các chủng vi khuẩn ........................................................................ 33
3.2. Sàng lọc và tuyển chọn các chủng vi sinh vật có đặc tính làm probiotic .... 34
3.2.1. Khảo sát hoạt tính đối kháng với vi sinh vật kiểm định ........................... 34
3.2.2. Xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào ............................................... 36
3.2.3. Khảo sát khả năng chịu pH dạ dày ............................................................ 38
3.2.4. Khảo sát khả năng chịu muối mật ............................................................. 39
3.2.5 . Khả năng đề kháng chất kháng sinh của các chủng vi sinh ..................... 41
3.2.6. Xác định khả năng bám dính vào màng nhầy niêm mạc ruột ................... 43
3.3. Đặc tính sinh lý sinh hóa của các chủng Probiotic ...................................... 43
3.3.1. Định danh vi khuẩn bằng phƣơng pháp sinh học phân tử......................... 45
3.3.2. Tổng hợp một số đặc tính probiotic của chủng B.BP ............................... 48
PHẦN 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................. 49
4.1. Kết luận ........................................................................................................ 49
4.2. Kiến nghị ...................................................................................................... 49
TÀI LIỆU TH M KHẢO

iii


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Kí hiệu

Chú thích

CFU

Colony-Forming Unit

CMC

Carboxymethiylcellulose

ĐC
FAO

Đối chứng
Food and agriculture Organization of the United Nations
Tổ chức Lƣơng thực và Nông nghiệp Liên hiệp quốc

MPA

Meat-Peptone Agar

TSA

Trypcase Soya Agar

TSB

Trypton Soya Broth

SDS

Sodium dodecyl sulfate

TB

Tế bào

VSV

Vi sinh vật

TE

Tris EDTA

PBS

Phosphate Buffered Saline

Ge

Gentamycin

TT

Tetracycline

St

Streptomycin

NCBI
BLAST

National Center for Biotechnology Information
Basic Local Alignment Search Tool

iv


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và một số đặc điểm sinh học các chủng
vi khuẩn ............................................................................................................... 33
Bảng 3.2. Kết quả vòng kháng vi sinh vật kiểm định ......................................... 35
Bảng 3.3. Hoạt tính enzyme ngoại bào của các chủng vi sinh vật ...................... 36
Bảng 3.4. Tỉ lệ TB sống sót (%) của các chủng theo thời gian ở các mức pH ... 38
Bảng 3.5. Tỉ lệ tế bào (%) của các chủng theo thời gian ở các nồng độ muối mật
khác nhau ............................................................................................................. 40
Bảng 3.6. Kết quả kháng kháng sinh của các chủng ........................................... 41
Bảng 3.7. Khả năng bám dính trên màng nhầy niêm mạc ruột của các chủng vi
sinh vật ................................................................................................................ 43
Bảng 3.8. Khả năng lên men các loại đƣờng của các chủng............................... 44
Bảng 3.9. Các đặc tính probiotic của chủng B.BP .............................................. 48

v


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Phản ứng sinh hóa của vi khuẩn Bacillus ............................................. 4
Hình 3.1. Khả năng đối kháng với vi khuẩn kiểm định của các chủng Bacillus 36
Hình 3.2. Khả năng sinh enzyme ngoại bào phân giải cơ chất của các chủng
Bacillus ................................................................................................................ 37
Hình 3.3. Khả năng kháng kháng sinh của chủng Bacillus ................................ 42

Hình 3.4. Hình thái tế bào và khuẩn lạc của chủng Bacillus B.BP..................... 44
Hình 3.5. Khả năng lên men đƣờng của chủng B.BP ........................................ 44
Hình 3.6 Kết quả điện di tách chiết DN tổng số ............................................. 45
Hình 3.7 Kết quả điện di sản phẩm PCR của chủng B.BP ................................ 45

vi


ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay, công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi từ chế phẩm sinh học
đang rất phát triển và áp dụng rộng rãi, một trong số đó là sử dụng trực khuẩn
Bacillus trong thức ăn chăn nuôi.
Hằng năm, trên thế giới có hàng triệu gia súc, gia cầm chết do các bệnh về
đƣờng tiêu hóa nhƣ: bệnh tiêu chảy gặp nhiều ở lợn bò, bệnh phân trắng ở gà, và
các bệnh đƣờng ruột khác. Nguyên nhân chủ yếu là do các vi sinh vật có hại
xâm nhập vào cơ thể vật chủ làm suy giảm miễn dịch giảm các chức năng đƣờng
ruột một phần khác là do vi khuẩn gây bệnh nhƣ Ecoli, Salmonela làm suy yếu
các sinh vật có lợi trong đƣờng ruột, làm tổn thƣơng dẫn đến các bệnh nhƣ tiêu
chảy, nhiễm trùng đƣờng ruột. Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh việc bổ sung
các vi khuẩn có lợi cho đƣờng ruột là rất cần thiết và từ đó nghành cơng nghiệp
tạo men vi sinh ứng dụng vào trong thức ăn chăn nuôi càng đƣợc phát triển và chú
trọng.
Các vi sinh vật có ích hỗ trợ khơi phục lại sự cân bằng trong đƣờng ruột.
Chính vì vậy, các chế phẩm sinh học chứa lợi khuẩn probiotic có vai trị quan
trọng đối với sức khỏe. Nó có thể duy trì trạng thái cân bằng vi khuẩn đƣờng
ruột, tăng cƣờng sức khỏe đƣờng ruột, nhƣng cũng có thể tăng cƣờng hệ thống
miễn dịch.Không những vậy, chế phẩm sử dụng trong thức ăn chăn ni cịn có
khả năng cải thiện sức khỏe vật nuôi, tăng chất lƣợng vật nuôi. Bên cạnh đó, chế
phẩm probiotic cịn góp phần mang lại các sản phẩm chất lƣợng của nghành
chăn nuôi, mang lại nguồn thu không nhỏ cho nền kinh tế quốc dân. Ngoài ra tác

dụng của probiotic là cung cấp các chất quan trọng cho cơ thể nhƣ folic acid,
niacin, riboflavin, vitamin B6 và B12.
Hiện nay, các dạng chế phẩm sinh học từ Bacillus đang đƣợc sử dụng
ngày càng phổ biến đối với bệnh đƣờng ruột trên gia súc do những ƣu điểm
thuận lợi cho việc sản xuất probiotic. Từ những lí do này, đƣợc sự đồng ý của
Bộ môn Vi sinh – Hóa sinh, Viện Cơng nghệ sinh học, trƣờng Đại học Lâm
nghiệp, dƣới sự hƣớng dẫn của PGS. TS Bùi Văn Thắng và Ths. Nguyễn Thị
1


Hồng Nhung tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn và định
tên chủng Bacillus có đặc tính probiotic định hƣớng ứng dụng tạo chế phẩm
vi sinh bổ sung vào thức ăn chăn nuôi’’.

2


N

PHẦN I.
1.1. Tổng quan về Bacillus

Q

N

1.1.1. Lịch sử nghiên cứu về Bacillus
Bacillus đƣợc phát hiện đầu tiên vào năm 1835 do Christion Erenberg và
tên loài vi khuẩn lúc bấy giờ là “Vibio subtilis”. Năm 1872, Cohn đặt tên lại là
Bacillus subtilis (Gordon, 1981). Họ Bacillaceae đƣợc chia làm 5 chi gồm:

Bacillus, Sporolactobacillus, Clostridium, Sporosarcina, Desulfortomaculum,
đặc trƣng của họ này là hình thành nội bào tử [1; 2].
1.1.2. Đặc điểm sinh học của vi khuẩn Baccillus
1.1.2.1. Đặc điểm phân loại
Theo khóa phân loại của Bergey (2004) [20], Bacillus thuộc:
Giới: Bacteria
Ngành:
Firmicutes
Lớp: Bacilli
Bộ: Bacillales
Họ: Bacillaceae
Chi: Bacillus
1.1.2.2. Đặc điểm phân bố
Nhờ khả năng sinh bào tử nên Bacillus có thể tồn tại trong thời gian dài
và ở các điều kiện khác nhau.Chúng rất phổ biến trong tự nhiên nên có thể phân
lập từ nhiều nguồn khác nhau nhƣ đất, nƣớc, khơng khí, phân, trầm tích biển,
thức ăn, sữa, lớp mùn,...[1,4].
1.1.2.3. Đặc điểm hình thái và đặc điểm nuôi cấy
- Điều kiện phát triển ở nhiệt độ tối ƣu là 370C
- Nhu cầu CO2: là vi khuẩn hiếu khí nhƣng lại có khả năng phát triển
trong môi trƣờng thiếu oxy.
- Độ pH: 7,0- 7,4.
- Bacillus là TB hình que, thẳng hoặc gần thẳng, kích thƣớc 0,3 - 2,2 x
1,2 -7 µm. Các TB thƣờng xếp thành cặp hay chuỗi, đầu trịn hoặc hơi vng. Là
3


vi khuẩn bắt màu Gram dƣơng, hầu hết có catalase dƣơng tính. Chúng thƣờng di
động nhờ roi. Một TB chỉ có thể hình thành duy nhất một nội bào tử, nội bào tử
có hình oval hoặc hình trụ. Bào tử có khả năng chịu nhiệt, axit, sự hình thành

nội bào tử không bị ngăn cản bởi sự tiếp xúc không khí. Các lồi thuộc chi
Bacillus đặc trƣng cho trực khuẩn sinh bào tử mà vẫn giữ nguyên hình que khi
mang bào tử, trong một số trƣờng hợp chỉ hơi phình to lên một chút [24]. Tùy
theo lồi, bào tử có thể nằm giữa, gần cuối, hoặc ở cuối [4; 5].
- Hình dạng của vi khuẩn trên mơi trƣờng TSA (Trypcase Soya Agar) là
khuẩn lạc dạng trịn, rìa răng cƣa khơng đều, đƣờng kính 3-5 nm màu vàng xám,
tâm sẫm màu. Sau 4 ngày bề mặt nhăn nheo, màu hơi ngả nâu.
- Hình dạng của vi khuẩn trên mơi trƣờng TSB (Trypton Soya Broth)
Bacillus subtilis phát triển làm đục môi trƣờng, tạo màng nhăn, lắng cặn kết lại
nhƣ vẩn mây ở đáy, khó tan khi lắc đều.
1.1.2.4. Đặc điểm sinh hóa
- Lên men không sinh hơi các loại đƣờng nhƣ: glucose, maltose, manitol,
saccharose, xylose và arabinose.
- Thử nghiệm indol (-), VP (+), nitrate (+), H2S (-), NH3 (+), catalase
(+), amylase (+), casein, (+), citrate (+), có khả năng di động (+) và hiếu khí (+).

Hình 1.1. Phản ứng sinh hóa của vi khuẩn Bacillus
4


1.1.2. .

i tr t c

n c

ào t

ci us su ti is n u n i u

Trong đƣờng ruột luôn luôn tồn tại cả nhóm vi khuẩn có lợi và nhóm vi
khuẩn gây bệnh. Nguyên lí tồn tại của vi khuẩn trong đƣờng ruột là sự cạnh
tranh dinh dƣỡng. Nếu bào tử Bacillus nguyên liệu hiện diện với số lƣợng lớn
trong đƣờng ruột sẽ cạnh tranh dinh dƣỡng, không gian sống với vi khuẩn khác.
Bào tử Bacillus nguyên liệu phát triển rất nhanh, vừa chiếm dinh dƣỡng
của các loài vi khuẩn khác (trong đó có các vi khuẩn gây bệnh) vừa sản sinh kháng
sinh subtilin làm ức chế sự sinh trƣởng của vi khuẩn gây bệnh và các loại nấm.
Tác dụng bào tử Bacillus có khả năng chịu acid dạ dày và dịch tiêu hóa,
đồng thời khơng chống acid nên vai trò chống lại vi khuẩn gây bệnh đƣợc đảm
bảo.
Bên cạnh bào tử Bacillus subtilis, một loài vi khuẩn khác Bacillus
clausii cùng nhóm vi khuẩn Bacillus cũng có tác dụng và vai trị tƣơng tự đối
với hệ tiêu hóa. Tác dụng lợi khuẩn bào tử Bacillus trong chăn nuôi, bào tử
Bacillus clausii lại chỉ tồn tại trong thời gian ngắn trong thành ruột nhƣng đóng
vai trị lớn trong loại bỏ các vi khuẩn gây bệnh, có khả năng phục hồi chức năng.
1.1.2.6. Một số oài

ci us phổ iến tron tự nhi n

Bacillus subtilis (trực khuẩn cỏ khô) đƣợc phát hiện đầu tiên trong phân
ngựa (1941) bởi tổ chức y học Nazi của Đức [17]. Lúc đầu, loài này đƣợc sử
dụng để phòng bệnh lỵ cho các chiến sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi. Chúng có KL
khơ, khơng màu hoặc có màu xám nhạt, trắng, hơi nhăn hay tạo ra các lớp màng
mịn, lan trên bề mặt thạch. Khuẩn lạc có mép nhăn bám vào mơi trƣờng thạch.
Trực khuẩn hình que, ngắn, nhỏ, TB đứng riêng rẽ hoặc chuỗi. Nhiệt độ tối ƣu
cho sinh trƣởng là 36-500 C, tối đa là 600 C. Bào tử chịu đƣợc nhiệt độ khá cao,
có hình bầu dục, phân bố lệch tâm. Nhờ khả năng sinh một số enzyme ngoại bào
(amylase, cellulase, protease,…) và sinh tổng hợp đƣợc nhiều loại kháng sinh
nhƣ subtilin, subtilosin

, sublancin,…mà Bacillus subtilis đƣợc ứng dụng rất

rộng rãi trong chăn nuôi, y học, thực phẩm,…[15].

5


+ Bacillus amyloliquefaciens có hình thái khuẩn lạc và tế bào tƣơng tự
Bacillus subtilis. Nhƣng khác nhau về đặc tính sinh hóa, có khả năng lên men
đƣờng lactose nhanh và lên men glucose chậm, thành phần G + C của Bacillus
subtilis khoảng 41,5% - 43,5% còn trong chủng Bacillus amyloliquefaciens là
43,5 – 44,9%.
Chúng phân bố phổ biến trong đất, nƣớc. Do có khả năng sinh tổng hợp
mạnh các enzyme nhƣ amylase, protease [18], lipase [36], phytase, xenlulase và
xylanase nên đƣợc ứng dụng nhiều trong công nghiệp sản xuất enzyme, công
nghiệp thuộc da [19; 2]. Ngồi ra, Bacillus amyloliquefaciens cịn đƣợc ứng
dụng trong các lĩnh vực khác nhƣ nông nghiệp, y học bởi khả năng sinh các chất
chuyển hóa nhƣ vitamin, nucleoside purine (inosine, guanosine) [30; 31], chất
kháng khuẩn (bacteriocin), chất kháng nấm (bacimin), hoocmon tăng trƣởng
thực vật IAA [18; 30; 31; 40]. Đặc biệt, nhiều nghiên cứu cho thấy các chế
phẩm probiotic từ Bacillus amyloliquefaciens đã góp phần cải thiện chất lƣợng
môi trƣờng nƣớc, tăng cƣờng các phản ứng miễn dịch, kiểm soát sự phát triển
quá mức của vi sinh vật gây bệnh cho tôm, cá.
+ Bacillus licheniformis là vi khuẩn hoại sinh, bào tử hình ovan, phát
tán chủ yếu trong đất, kể cả đất nghèo dinh dƣỡng nhƣ đất hoang hay sa mạc.
khuẩn lạc nhỏ, màu trắng đục, bề mặt nhăn nheo. Tế bào chuyển động nhờ tiêm
mao và lồi này kỵ khí khơng bắt buộc.
+ Bacillus pumilus phát tán rộng khắp nơi, thƣờng có mặt trong đất nhiều
hơn Bacillus subtilis. Khuẩn lạc nhỏ nhỏ, xung quanh viền mờ khơng ranh giới.
Tế bào của nó gần giống tế bào Bacillus subtilis.

+ Bacillus megaterium có KL hình trịn đều, khơng có thùy, khơng có
nếp, mép trịn hoặc hơi lƣợn sóng, màu trắng kem, trông giống nhƣ giọt bạch lạp
(nến trắng), thƣờng có vịng hoặc các vịng đồng tâm trên mặt. TB dài, đứng
riêng rẽ hoặc xếp thành chuỗi. Bào tử hình elip, nằm lệch tâm. B. megaterium
đƣợc sử dụng trong sản xuất penicillin nhờ khả năng tổng hợp penicillin
amidase. Bên cạnh đó, chúng cịn có thể sản sinh các enzyme phân hủy sinh học,
6


sản sinh vitamin B12, oxetanocin, cytochromes P450 và một số axit amin khác.
+ Bacillus polymyxa có khuẩn lạc khơng màu, phẳng, lồi, trơn, lan dần ra
xung quanh, mép đôi khi có thùy. Tế bào đứng riêng rẽ hoặc xếp thành đơi,
chuỗi ngắn. Bào tử hình bầu dục kéo dài. Loại vi khuẩn này làm giảm pectin và
polysaccarit trong cây. Ngoài ra, chúng cịn có khả năng cố định đạm. Đây là
một vi khuẩn rất phổ biến trong đất.
+ Bacillus cereus có khuẩn lạc phẳng, khá khuếch tán, hơi lõm, trắng đục.
Tế bào đứng riêng rẽ hay xếp thành chuỗi. Bào tử có hình bầu dục, nằm lệch
tâm, tế bào chất có chứa các hạt và khơng bào nhỏ. Chúng thƣờng phát tán khắp
nơi, sinh sôi, nảy nở trên thực phẩm và có thể sinh độc tố gây ngộ độc thực
phẩm.
1.1.3. Cơ sở khoa học để lựa chọn chủng Bacillus trong sản xuất probiotic
- Các vi khuẩn đƣợc sử dụng làm probiotic phổ biến nhất là các vi khuẩn
lactic nhƣ Bifidobacterium spp, Lactobacillus acidophilus. Đây là các vi khuẩn
hiện diện bình thƣờng trong ruột ngƣời, động vật và có khá nhiều tài liệu nghiên
cứu về tính chất probiotic của chúng. Tuy nhiên, chúng là các vi khuẩn vi hiếu
khí, địi hỏi điều kiện dinh dƣỡng đặc biệt nên việc nuôi cấy gặp nhiều khó khăn
và giá thành sản phẩm cao. Bên cạnh đó, các vi khuẩn này cịn khó bảo quản và
khả năng chịu đựng thấp trong điều kiện đông khô, sấy phun…[15;7]
Ngồi đặc điểm dễ ni cấy, tốc độ phát triển nhanh, phân bố rộng rãi
trong tự nhiên, Bacillus còn có nhiều đặc tính phù hợp để tạo chế phẩm sinh học

nhƣ:
+ Khả năng sinh bào tử:
Đặc điểm quan trọng của Bacillus là khả năng sinh bào tử. Bào tử đƣợc
mô tả đầu tiên bởi Cohn (1872) khi nghiên cứu về Bacillus subtilis và sau đó
đƣợc Koch (1875) mơ tả khi nghiên cứu về Bacillus anthracis. Một số loài
Bacillus thƣờng có khả năng hình thành bào tử trong chu trình phát triển tự
nhiên hoặc khi gặp điều kiện bất lợi nhƣ: nhiệt độ cao, môi trƣờng nghèo dinh
dƣỡng, pH không thích hợp, mơi trƣờng tích lũy nhiều sản phẩm trao đổi chất
7


bất lợi,…Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử sẽ nảy mầm và phát triển thành một
tế bào mới có sức sống mạnh mẽ hơn. Vì vậy, nội bào tử đƣợc sinh ra không
phải để sinh sôi nảy nở mà là cơ chế đảm bảo cho sự sống còn củả vi khuẩn khi
trải qua các điều kiện khắc nghiệt [9].
Ở phần lớn vi khuẩn, trong 1 tế bào chỉ có 1 bào tử và sau khi trƣởng
thành bào tử đƣợc phóng thích ra khỏi tế bào. Ở bào tử trƣởng thành khơng diễn
ra q trình trao đổi chất (đƣợc xem nhƣ trạng thái tiềm sinh). Bào tử Bacillus
phát triển theo chu kì, trong trạng thái tiềm ẩn, chúng có thể tồn tại trong thời
gian rất dài, đến hàng tỷ năm. Ví dụ nhƣ bào tử của Bacillus subtilis có thể duy
trì khả năng sống đến 200-300 năm. Bên cạnh đó, bào tử Bacillus cịn có tính ổn
định cao với nhiệt độ và sự khơ hạn. Ví dụ nhƣ ở nhiệt độ 1000C, bào tử Bacillus
cereus có khả năng chịu đƣợc 2 phút, Bacillus subtilis chịu đƣợc 180 phút,
Bacillus mesentericus chịu đƣợc 380 phút (Rosovitz et al., 1998). Còn khả năng
đề kháng với tia phóng xạ của bào tử Bacillus mesentericus gấp 36 lần so với tế
bào dinh dƣỡng của Ecoli, bào tử và tinh thể của Bacillus thuringensis có độc tố
ức chế nhiều loại côn trùng và bệnh than (Todar, 2008) [41].
Các nhà vi sinh vật nhanh chóng nhận ra tầm quan trọng của bào tử nhƣ là
đặc điểm phân loại nổi bật, là cách xác định đơn giản họ Bacillaceae. Có thể
nói, đây là đặc điểm rất quan trọng và có liên quan đến việc sản xuất các chế

phẩm sinh học probiotic [14].
+ Khả năng sinh enzyme phân hủy chất hữu cơ:
Trong quá trình sống, Bacillus thƣờng sản sinh những chất có hoạt tính
sinh học cần thiết để thích ứng với nhiều hồn cảnh và điều kiện mơi trƣờng
sống.

Trong đó, khả năng sinh các loại enzyme ngoại bào nhƣ protease,

amylase, cellulase, alkaline 18 phosohatase, cyclodextran, glucanotransferase,
galactosidase, chitinase, glucose isomerase, glucanase, lipase, urease,...là một
đặc tính nổi bật của các lồi Bacillus. Protease hay peptide hydrolase là những
enzyme thuỷ phân liên kết peptide (- O – NH -) trong phân tử protein và các
polypeptide. Sản phẩm của quá trình thuỷ phân này có thể là các acid amin, các
8


peptide, các polypeptide chuỗi ngắn [10]. Có thể nói Bacillus là một trong số các
vi sinh vật có khả năng sinh protease nhiều nhất, đặc biệt là protease kiềm tính.
Nhờ khả năng bền nhiệt và bền pH nên protease kiềm từ Bacillus có tầm
quan trọng lớn trong ngành cơng nghiệp chất tẩy rửa, sản xuất bột giặt; trong
công nghiệp thuộc da; trong thủy phân protein của cá, thịt,…Điển hình là
Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, và Bacillus
majovensis [3; 6; 12]. Amylase là một trong những enzyme đƣợc quan tâm
nghiên cứu sớm và nhiều nhất. Đặc biệt, so với amylase lấy từ động vật và vi
nấm thì amylase từ Bacillus bền hơn trong mơi trƣờng acid của dạ dày. Vì thế
nên amylase từ Bacillus đƣợc sử dụng phối hợp với coenzyme A, cytocrom C,
TP, carboxylase để sản xuất thuốc điều trị bệnh tim mạch, bệnh thần kinh.
Ngồi ra, chúng cịn đƣợc ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp dệt, công
nghiệp thực phẩm (sản xuất bia, rƣợu, giấm, bột ngọt, bánh kẹo, nƣớc trái cây),…
Cellulase là enzyme xúc tác sự phân hủy cellulose thành sản phẩm trung gian là

cellubiose và sản phẩm cuối cùng là đƣờng glucose. Trong tự nhiên có nhiều nhóm
vi sinh vật có khả năng phân hủy cellulose, trong đó vi nấm là nhóm có khả năng
phân giải mạnh. Nhiều lồi vi khuẩn cũng có khả năng này nhƣng số lƣợng và
thành phần các loại enzyme không đầy đủ, chủ yếu chỉ sinh endoglucanase. Riêng
Bacillus là loài sinh cellulase khá lớn, chúng chủ yếu đƣợc phân lập từ đất vƣờnnơi có nguồn xác bã hữu cơ (rơm, rạ, mụn dừa,..) dồi dào. Ví dụ nhƣ, cellulase từ
Bacillus subtilis, Bacillus pumilus (Christakopoulos), Bacillus licheniformis,
Bacillus circulans AB 16, Bacillus polymyxa, Bacillus cereus.
Tóm lại, nhờ hệ enzyme ngoại bào đa dạng, nhóm vi khuẩn này có thể
chuyển hóa các chất khó tiêu (cellulose, tinh bột, protein) thành chất dễ tiêu (axit
amin và glucose) góp phần cải thiện dinh dƣỡng, kích thích tiêu hóa thức ăn và
giúp vật ni tăng trọng nhanh, đặc biệt là heo con ở giai đoạn sau cai sữa. Do
vậy, có thể nói khả năng sinh enzyme thủy phân các hợp chất hữu cơ là một đặc
tính rất cần thiết trong việc nghiên cứu sử dụng Bacillus để tạo chế phẩm
probiotic trong chăn nuôi.
9


+ Khả năng đối kháng nhƣ đã trình bày ở phần trên, vi sinh vật probiotic
có khả năng đối kháng với vi sinh vật gây bệnh thông qua khả năng cạnh tranh
vị trí bám dính và khả năng sinh chất có hoạt tính kháng khuẩn cao. Cụ thể, một
số chủng Bacillus thƣờng cạnh tranh với vi sinh vật gây bệnh về nguồn thức ăn,
năng lƣợng, muối khống, mơi trƣờng sống,...để làm giảm mật độ vi sinh vật
gây bệnh và dần dần đẩy lùi đƣợc dịch bệnh. Ví dụ, chủng Bacillus subtilis QST
713 là vi khuẩn di động, ƣa khí đƣợc Công ty Agra Quest phát hiện và đƣợc Cục
bảo vệ mơi trƣờng Mỹ (EP ) đánh giá là có hiệu quả đáng kể trong việc phòng
chống đƣợc nhiều bệnh do vi khuẩn và nấm gây ra. Bacillus subtilis QST 713
hoạt động bằng cách chiếm bề mặt lá cây và cạnh tranh với các mầm bệnh để
giành không gian sống, nhờ đó đã ngăn cản đƣợc nhiều bệnh trên cây trà. Nhiều
dịng Bacillus subtilis đƣợc xác định là có khả năng chế ngự mầm bào tử của
nấm bệnh bằng cách cạnh tranh dinh dƣỡng và muối khoáng,… [17].

Đặc biệt, các chất này thƣờng không đƣợc dùng trong y tế nên không xảy
ra hiện tƣợng nhờn thuốc đối với vi sinh vật gây bệnh, riêng bacitraxin là chất
kháng sinh đƣợc bổ sung vào thức ăn chăn nuôi để ức chế ức vi khuẩn gây bệnh
đƣờng ruột và kích thích tiêu hóa cũng nhƣ tăng trọng của vật nuôi [24].
+ Khả năng chịu đƣợc nồng độ muối cao, chịu axit, chịu kiềm [12].
Nhiều lồi Bacillus có khả năng phát triển tốt trong mơi trƣờng có nồng độ
muối khá cao nhƣ Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis. Chúng thƣờng tồn tại ở
môi trƣờng nƣớc lợ, nƣớc mặn, trong đƣờng ruột của tôm và đƣợc coi là vi khuẩn có
lợi cho tơm. Bacillus racemilacticus và Bacillus coagulans có thể chịu đựng đƣợc
nồng độ muối mật trên 0,3%; một vài chủng khác nhƣ Bacillus pasteurii, Bacillus
seohaeanensis, Bacillus pantothenticus,…có thể sinh trƣởng ở nồng độ NaCl 10%
[41].
Đặc biệt, nhờ khả năng sinh bào tử mà rất nhiều loài Bacillus có khả năng
sinh trƣởng và sống sót trong mơi trƣờng acid cũng nhƣ trong mơi trƣờng kiềm.
Ví dụ nhƣ chủng Bacillus cereus NCTC 2599 có thể phát triển ở dải pH khá
rộng từ 4-10, chủng Bacillus laevolacticus DSM 6475 có thể PT đến tận mức pH
10


2-3 mà bình thƣờng các chủng vi khuẩn khác khơng thể phát triển đƣợc, Bacillus
coagulans, Bacillus acidocalderius, Bacillus polymyxa có thể sinh trƣởng trong
mơi trƣờng có độ pH khá thấp từ 4-5. Cịn Bacillus alcalophilus và Bacillus
pasteurii có thể sinh trƣởng tốt ở pH 8-11 [41].
Chính nhờ những đặc tính ƣu việt nêu trên cùng với khả năng dễ bảo quản
ở điều kiện thƣờng, Bacillus đƣợc đánh giá là một trong những đối tƣợng giàu
tiềm năng khai thác trong lĩnh vực sản xuất chế phẩm sinh học.
ng d ng của acillus trong chăn ni

1.1.4.

 Sản xuất men ti u hó


o ồm nhiều enz me kh c nh u

Enzyme amylase: Bào tử Bacillus subtilis và bào tử Bacillus clausii có

thể tổng hợp nên α – amylase. Đây là loại enzyme tiêu hóa các loại tinh bột. Các
thức ăn tinh bột đƣợc tiêu hóa và chuyển hóa thành đƣờng Glucose. Dƣới tác
động của bào tử nguyên liệu, enzyme amylase thúc đẩy quá trình tiêu hóa nhanh
hơn 2,5 lần.


Enzyme protease: Hệ tiêu hóa của vật ni ngồi tinh bột cịn phải tiêu

hóa một thành phần quan trọng là protein. Đây Enzyme protease xúc tác và thúc
đẩy quá trình thủy phân, phân hủy protein thành các chuỗi acid amin dễ hấp thu.


Enzyme lipase: chính là enzyme xúc tác quá trình thủy phân chất béo.

Lƣợng chất béo đƣa vào cơ thể vật nuôi đƣợc tiêu hóa có hiệu quả nhờ loại
enzyme này. Nguyên liệu bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis trong chăn nuôi đƣợc
sử dụng nhằm kích thích sự hình thành của enzyme lipase.



ào t

ci us su ti is sản xuất chế phẩm ph n

nh

Dựa vào đặc thù sinh trƣởng và nguyên lí phân bào tự nhiên, bào tử

Bacillus subtilis có khả năng chống lại và tiêu diệt vi khuẩn có hại, vi khuẩn gây
bệnh cùng nhiều loại nấm.


Trong quá trình sinh trƣởng, bào tử Bacillus subtilis sản sinh ra kháng

sinh tự nhiên, bảo vệ hệ tiêu hóa vật ni, phục hồi chức năng tiêu hóa.
 Chế phẩm cho ăn từ ào t

ci us su ti is n u n i u

11


Từ những ứng dụng của ào t

acillus subtilis và bào tử Bacillus clausii

trong chăn nuôi, các chế phẩm chủ yếu là sản phẩm cho ăn. Chế phẩm vi sinh
trong giai đoạn chƣa hoạt động đƣợc trộn với thức ăn đi vào hệ tiêu hóa vật
ni, trong đƣờng ruột, dạng bào tử sẽ bắt đầu hoạt động, sinh trƣởng và thực
hiện chức năng hỗ trợ tiêu hóa, tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh.
Hiện nay, các trang trại chăn nuôi sử dụng sản phẩm vi sinh nhằm nâng
cao năng suất, hạn chế rủi ro bệnh tật ngày càng nhiều. Nguyên liệu bào tử vi
khuẩn Bacillus subtilis trong chăn ni đóng vai trị quan trọng nhằm tạo ra

nguồn thực phẩm sạch, chất lƣợng cao. Thịt heo từ trang trại sử dụng sản phẩm
vi sinh có giá trị dinh dƣỡng cao, khơng chứa chất tăng trọng, khơng dƣ thừa
kháng sinh, thịt có màu đỏ tự nhiên. Bà con nông dân tại các địa phƣơng có thể
mở rộng mơ hình chăn ni sử dụng chế phẩm vi sinh từ bào tử Bacillus
subtilis và bào tử Bacillus clausii trong chăn nuôi để nâng cao hiệu quả kinh tế.
1.2 . ổng quan về Probiotic
1.2.1. Lịch sử nghiên cứu , khái niệm và phân loại
1.2.1.1. Lịch s n hi n cứu, kh i ni m
Probiotic là những vi sinh vật nhƣ vi khuẩn hay nấm men mà có thể bổ
sung vào thực phẩm với mục đích điều chỉnh quần thể sinh vật đƣờng ruột của
sinh vật chủ. Probiotic cũng có những ảnh hƣởng có lợi trên sức khỏe của sinh
vật chủ [27]. Năm 1992, Havenaar đã định nghĩa về probiotic là sự nuôi cấy
riêng lẻ hay hỗn hợp các vi sinh vật sống mà có ảnh hƣởng có lợi cho sinh vật
chủ bằng cách cải thiện những đặc tính của vi sinh vật bản địa. Theo WHO/FAO
2001, probiotic là những vi sinh vật sống khi đƣợc đƣa vào cơ thể một lƣợng
đầy đủ sẽ có lợi về sức khỏe cho ngƣời sử dụng [26]. Hầu hết các chủng
probiotic đƣợc sử dụng trong sản xuất thực phẩm thuộc nhóm vi khuẩn acid
lactic nhƣ Lactobacillus và Bifidobacteria, đều có thể đƣợc thêm vào sản phẩm
lên men sữa, góp một phần trong việc hình thành sản phẩm, hoặc đƣợc bổ sung
dƣới dạng bột đông khô. Các vi khuẩn này là phần quan trọng của hệ thống miễn
dịch, kích thích sự phát triển và hoạt động của hệ thống miễn dịch và giúp ngăn
12


ngừa nhiễm khuẩn. Trong ruột, chúng tham gia quá trình tiêu hóa các thành
phần thức ăn mà cơ thể con ngƣời khơng tiêu hóa đƣợc. Probiotic đƣợc tìm thấy
trong thực phẩm và cả các chất bổ sung (có thể là tự nhiên hoặc đƣợc thêm vào
trong giai đoạn chế biến). Các thực phẩm này gồm sữa chua, đồ uống từ sữa
chua, sữa lên men và chƣa lên men, đậu tƣơng lên men, đồ uống đậu nành và
một số nƣớc hoa quả. FAO/WHO cho rằng tiêu chuẩn quan trọng nhất để chọn

chủng probiotic sử dụng dƣới dạng thực phẩm là chúng phải có khả năng sống
sót qua đƣờng tiêu hóa và có khả năng phát triển trong ruột. Những yêu cầu đặt
ra cho một probiotic dùng cho sản xuất thực phẩm chức năng gồm : Phải tồn tại
khi đến ruột non, nghĩa là phải kháng đƣợc axít dịch vị dạ dày và dịch vị mật để
đến ruột non mà sống và phát triển đƣợc trong ruột để hỗ trợ thực hiện các chức
năng tiêu hóa và miễn dịch; phải đƣợc chứng minh là an tồn khi sử dụng,
khơng sinh độc tính và khơng có tác dụng phụ; phải có mùi vị dễ chịu hoặc
khơng mùi, khơng vị; phải có hiệu quả có lợi và đáng tin cậy; Phải đƣợc chứng
minh một cách khoa học bằng các dữ liệu lâm sàng, thử nghiệm trên động vật và
trên ngƣời.
1.2.1.2 . Phân oại
Probiotics đƣợc phân loại tùy theo vai trò của các vi khuẩn trong đƣờng
ruột sẽ đem lại các lợi ích khác nhau cho sức khỏe, gồm: Lactobacillus,
Bifidobacteria, Saccharomyces boulardii, Bacillus claussii Streptococcus
thermophilus, Enterococcus faecium, Leuconostoc [15, 14].
1.2.2. Vai trò của Probiotic
Probiotic đã đƣợc ghi nhận có những vai trị khác nhau nhƣ: Tác động
kháng khuẩn gây ức chế cả khuẩn Gram (+) và Gram (-), cạnh tranh với các
nguồn bệnh để ngăn chặn sự bám dính vào đƣờng ruột và cạnh tranh dinh dƣỡng
cần thiết cho sự sống sót của mầm bệnh [9]; Tác động trên mơ biểu bì ruột đẩy
mạnh sự liên kết chặt giữa những tế bào biểu mô. Giảm việc kích thích bài tiết
và những hậu quả do bị viêm của sự lây nhiễm vi khuẩn. Đẩy mạnh sự tạo ra các
phân tử phòng vệ nhƣ chất nhầy, vai trò miễn dịch đƣợc xem nhƣ là phƣơng tiện
13


phân phát các phân tử kháng viêm cho đƣờng ruột, cụ thể là đẩy mạnh sự báo
hiệu cho tế bào chủ để làm giảm đáp ứng viêm, tạo đáp ứng miễn dịch để làm
giảm dị ứng và cải thiện hệ vi sinh vật đƣờng ruột, ngăn ngừa tiêu chảy và táo
bón; tác động đến vi khuẩn đƣờng ruột tạo nên sự cân bằng tạm thời của hệ sinh

thái đƣờng ruột, điều hòa hoạt động trao đổi chất của sinh vật đƣờng ruột, có thể
làm giảm pH của bộ phận tiêu hóa gây cản trở cho hoạt động tiết enzyme của
sinh vật đƣờng ruột, đồng thời tăng dung nạp đƣờng lactose, giúp tránh đầy hơi,
khó tiêu, làm tăng vi khuẩn có lợi và giảm vi khuẩn gây hại. Ngồi ra, probiotic
cịn có một số vai trị khác đối với cơ thể nhƣ chống lại một số dị ứng và cung
cấp nhiều chất quan trọng cho cơ thể (nhƣ folic acid, niacin, riboflavin, vitamin
B6 và B12) ; giảm nguy cơ ung thƣ ruột kết và ung thƣ bàng quang, khử chất
độc gây ung thƣ có trong cơ thể và làm chậm phát triển của các khối u bƣớu,
đồng thời có tác dụng làm giảm nồng độ Cholesterol huyết thanh, làm giảm
huyết áp cao, giúp nhanh chóng bình phục sau khi mắc bệnh tiêu chảy và sử
dụng nhiều kháng sinh .
- Vai trò của probiotic trong thức ăn chăn nuôi [15]
+ Kháng khuẩn:


Nguyên lí chung: Tác dụng probiotic trong chăn ni là để cạnh tranh

với vi khuẩn gây bệnh làm giảm số lƣợng vi khuẩn gây bệnh và ngăn chặn mầm
bệnh.


Vi khuẩn có lợi đƣợc đƣa vào đƣờng ruột vật nuôi qua thức ăn, trong

thành ruột, probiotic cạnh tranh dinh dƣỡng với vi khuẩn gây bệnh, q trình
hoạt động này vừa có thể làm giảm sinh trƣởng của vi khuẩn gây bệnh, vừa có
thể tiêu diệt vi khuẩn [9].


Probiotic ngăn chặn sự bám dính của mầm bệnh vào thành ruột khiến

chúng khơng thể sống và tăng sinh thêm. Mơ biểu bì ruột dƣợc tăng thêm sự liên
kết nhờ những tác động của lợi khuẩn lên mơ biểu bì.


Probiotic trong thức ăn chăn ni kích thích tạo ra các chất nhầy để

phịng vệ trong trƣờng hợp hệ tiêu hóa bị vi khuẩn gây hại tấn công.
14


+ Tăng cƣờng miễn dịch:


Hệ miễn dịch của vật nuôi rất dễ bị ảnh hƣởng trong điều kiện môi

trƣờng thời tiết thay đổi. Khi có những sự thay đổi này, vật nuôi nuôi theo cách
công nghiệp thƣờng yếu ớt và sức đề kháng kém hơn, đây là cơ hội tốt cho vi
khuẩn gây hại bùng phát và gây bệnh,…


Probiotic trong thức ăn chăn ni đóng vai trị phân phát phân tử kháng

viêm trong đƣờng ruột, giảm dị ứng,…


Trong nhiều trƣờng hợp, vật nuôi đƣợc điều trị bằng kháng sinh dẫn tới

các bệnh tiêu chảy hay táo bón do kháng sinh. Kháng sinh dẫn tới hệ vi sinh vật
trong đƣờng ruột vật ni bị mất cân bằng thức ăn khó tiêu hóa dẫn tới tiêu chảy
hoặc táo bón. Probiotic trong thức ăn chăn nuôi nhằm cân bằng lại hệ vi sinh vật

này [13].
- Mục đích ứng dụng Probiotic trong chăn ni:
 Kích

thích sự thèm ăn, ăn ngon cho vật ni

 Tăng

tỉ lệ và hiệu quả tiêu hóa thức ăn, tránh lãng phí và dƣ thừ thức ăn

thải ra ngồi
 Vật ni tăng trọng nhanh không cần sử dụng chất tăng trọng gây hại và bị cấm
 Giảm

bệnh nghiêm trọng gây ra bởi Ecoli, Samonella và Clostridium,

tránh phụ thuộc và lạm dụng kháng sinh chữa bệnh
 Giảm

mùi hôi chuồng trại đỡ công vệ sinh, giải phóng sức lao động cho

ngƣời chăn ni.
1.2.3. Cơ chế kháng khuẩn của vi sinh vật probiotic:
Vi sinh vật probiotic làm giảm số lƣợng vi khuẩn gây bệnh để ngăn cản các
mầm bệnh bằng cách tiết ra các chất kháng khuẩn ức chế cả vi khuẩn Gram âm và
Gram dƣơng. Đó là các acid hữu cơ nhƣ: acid acetic và đặc biệt là Bacteriocin- nhóm
peptide hay protein đƣợc tổng hợp nhờ ribosome có hoạt tính kháng vi sinh vật.
Những hợp chất này có thể làm giảm khơng chỉ những sinh vật mang
mầm bệnh mà còn ảnh hƣởng đến sự trao đổi chất của vi khuẩn và sự tạo ra các
độc tố. Điều này đƣợc thực hiện bằng cách giảm pH khoang ruột thông qua sự

15


tạo ra các acid béo chuỗi ngắn dễ bay hơi, chủ yếu là acetae, ptopionate,… nhất
là acid lactic[15].
1.3 . ình hình nghiên cứu ứng dụng chế phẩm vi sinh trong chăn nuôi
1.3.1. Trên thế giới
Năm 1949, tại Pháp đã lƣu hành thuốc dạng lỏng chứa B. subtilis chủng
IP 5832, đến năm 1955 có thêm dạng bột và viên nang mềm. Năm 1962, Guy
Albot cịn phát hiện Bacillus subtilis có tác dụng tốt trong điều trị tiêu chảy do
lạm dụng KS và viêm đại tràng mãn tính. Cịn khi trộn thêm với vi khuẩn lactic,
Bacillus subtilis chữa chứng loạn khuẩn rất hiệu quả ở ngƣời và vật nuôi.
Tại Nhật Bản, với chế phẩm probiotic có tên gọi là E.M. (Effective
Microorganisms) trong đó có Bacillus, do GS.TS. TeRuo Higa, Trƣờng Đại học
Ryukyus, Okinawa, Nhật Bản nghiên cứu năm 1980. Chế phẩm này đƣợc sử
dụng nhiều trong chăn nuôi, trồng trọt cũng nhƣ bảo vệ MT và đã mang lại hiệu
quả khả quan. Cho đến nay, đây là chế phẩm đƣợc hơn 80 nƣớc và vùng lãnh
thổ sử dụng, đặc biệt là khu vực Châu Á, Thái bình Dƣơng trong đó có Trung
Quốc, Hàn Quốc, Thái Lan và Việt Nam.
Năm 1999, Kyriakis và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hƣởng của probiotic LSP
122 đến việc phòng ngừa bệnh tiêu chảy trên heo con giai đoạn 28 ngày tuổi. Thí
nghiệm này đƣợc tiến hành trên 4 lô: Lô 1 không dùng probiotic, lô 2 sử dụng
Bacillus toyoi với liều 106 CFU/kg thức ăn, lô 3 và 4 sử dụng B. licheniformis với
liều 106 và 107 CFU/kg thức ăn. Kết quả cho thấy các lô thí nghiệm (2, 3 và 4) đều
có tỉ lệ tiêu chảy và tình trạng tiêu chảy ít nghiêm trọng hơn so với lơ đối chứng.
Ngồi ra, sự tăng trọng và tiêu tốn thức ăn cũng cải thiện hơn so với lơ đối chứng.
Trong đó, lơ sử dụng 107 CFU B. licheniformis/kg thức ăn cho kết quả tốt nhất.
Năm 2001, Lema và cộng sự đã dùng probiotic trộn với thức ăn cho cừu
ăn liên tục trong 7 ngày với liều 6 x 106 CFU/kg thức ăn để khảo sát sự bài thải
của E.coli O157:H7. Kết quả nghiên cứu cho thấy, sự bài thải E. coli trong phân

thấp hơn so với đối chứng không sử dụng probiotic trộn với thức ăn.
16


Vi khuẩn Bacillus thuộc nhóm trực khuẩn Gram dƣơng, phân bố hầu
hết trong tự nhiên nhƣ đất, nƣớc, bụi, không khí, thực vật bị phân huỷ, hệ
tiêu hóa ngƣời và động vật…Vi khuẩn Bacillus có khả năng tiết ra nhiều
biosurfactant bản chất là lypopeptid nhƣ iturin, surfactin, fengycin, và
plispatin. Nhóm iturin gồm có: iturin A, C, D, và E, bacillomycin D, F, và
L và mycosubtilin. Trong đó, iturin A có hoạt tính ức chế rất mạnh lên sự
phát triển của các nấm mốc sinh độc tố aflatoxin và cả sản phẩm aflatoxin
của chủng. Ngƣời ta đã chứng minh rằng Iturin A có khả năng kháng 19
lồi nấm mốc và 6 lồi vi khuẩn. Thí nghiệm xác định khả năng ức chế sự
phát triển nấm mốc của Iturin

đƣợc Norio Kimura và Makoto One [32*]

tiến hành trên các lồi nấm mốc có khả năng sinh độc tố nhƣ Aspergillus
flavus, Aspergillus parasiticus,…. Các nhà khoa học Mỹ cũng nghiên cứu
để xác định khả năng kháng nấm của chất Iturin A sinh ra từ chủng vi
khuẩn Bacillus subtilis B3. Đối tƣợng nghiên cứu là ngô, lạc, hạt bông. Các
loại hạt này đƣợc xử lý với dung dịch chứa Iturin

để các hạt đƣợc bao

bọc Iturin A bên ngoài lớp vỏ. Kết quả cho thấy trên các hạt đƣợc xử lý với
dung dịch Iturin

lƣợng nấm mốc giảm đi đáng kể và hàm lƣợng Iturin

càng cao thì lƣợng nấm mốc càng giảm. Ngồi ra, Bacillomycin D có khả năng
ức chế sự sản xuất độc tố aflatoxin của nấm mốc Aspergillus flavus. Nhóm
fengycin gồm có fengicins và plipastatins. Fengycin có tác dụng ức chế sự phát
triển hệ sợi của nấm mốc và ức chế phospholipase A2. Khả năng của Bacillus ức
chế sự phát triển của nấm mốc và ức chế sản sinh độc tố aflatoxin cũng đã đƣợc
xác nhận bởi nghiên cứu của Bottone E.J. và Peluso R.W., 2003 [21],
Munimbazi C. và Bullerman L. B., 1997 [33] và Norio Kimura và Susumu
Hirano, 1988 [34]. Munnoz và ctv đã nghiên cứu khả năng ức chế sản
sinh độc tố của nấm mốc Aspergillus nomius và nhận thấy rằng
Saccharomyces cerevisiae có thể ức chế sự sản sinh độc tố của nấm mốc
này. Khi sử dụng Saccharomyces cerevisiae bổ sung vào trong thức ăn của
gia cầm nhiễm độc tố aflatoxin đã ghi nhận hiệu quả rõ rệt của
17


Saccharomyces

cerevisiae

trong

việc

làm

giảm

độc

tố

aflatoxin.

Saccharomyces cerevisiae có khả năng bắt giữ và làm giảm tác động của độc
tố zearalenone trên đƣờng ruột của thú khi sử dụng Saccharomyces
cerevisiae nhƣ là chất bổ sung vào trong thức ăn của gia súc cũng nhƣ đã ghi
nhận hiệu quả hấp phụ của -D-Glucans Saccharomyces cerevisiae đối với
aflatoxins B1 và ochratoxin A [35].
1.3.2. Ở Việt Nam
Năm 1962, yaourt và canh trùng subtilis đƣợc Đào Trọng Đạt và Vũ Đình
Hƣng dùng để phịng và trị bệnh phân trắng ở heo con, bƣớc đầu cho kết quả
khả quan [2].
Năm 1971, Trần Minh Hùng, Lê Thị Ba, Nguyễn Văn Hùng đã nghiên
cứu sản xuất chế phẩm Bacillus subtilis dạng viên, nuôi cấy trên môi trƣờng đậu
tƣơng, cua đồng,…hấp thu bằng tinh bột tan. Chế phẩm này dùng cho heo uống
với liều 0,5- 1g/kg thể trọng. Kết quả sau khi sử dụng chế phẩm, heo tăng trọng
nhanh.
Năm 1979-1984, Phan Thanh Phƣợng và cộng sự đã nghiên cứu sản xuất
chế phẩm Biolactyl để phòng và trị bệnh đƣờng ruột ở heo.
Năm 1982, Vũ Văn Ngữ và các cộng sự đã sản xuất thử nghiệm chế phẩm
Coli-subtyl (E.coli và Bacillus subtilis) đã làm giảm tỉ lệ tái phát tiêu chảy ở heo
so với phƣơng pháp điều trị bằng KS, kết quả heo tăng trọng tốt.
Năm 2003, Nguyễn Nhƣ Phong và Trần Thị Thu Thủy đã nghiên cứu sử
dụng probiotic (Oganic Green) trong việc phòng ngừa tiêu chảy do E. coli trên
heo con sau cai sữa đã cho kết quả làm giảm số lƣợng E. coli thải qua phân,
giảm tỉ lệ tiêu chảy, cải thiện tăng trọng và giảm tiêu tốn thức ăn.
Nguyễn Lan Anh và cộng tác viên (2003) đã phân lập đƣợc chủng vi
khuẩn lactic BC 5.1 từ nƣớc bắp cải muối chua và đã xác định đƣợc rằng chủng
vi khuẩn này có tính chất probiotic và có thể sử dụng trong chế biến thực phẩm
Biochie dạng dung dịch (từ vi khuẩn Bacillus và Lactobacillus) với mật độ 108

CFU/ml có tác dụng cải thiện môi trƣờng nƣớc nuôi tôm, cá [12].
18


Năm 2009, Trần Quốc Việt và cộng sự thuộc Viện Chăn nuôi Việt Nam đã
nghiên cứu sản xuất probiotic và enzyme tiêu hóa dùng trong chăn ni. Kết quả
đã tìm ra 2 quy trình sản xuất và 2 chế phẩm probiotic làm tăng sinh trƣởng vật
nuôi 10%, tăng hiệu quả sử dụng thức ăn 10%, hạn chế 15% tỉ lệ bệnh đƣờng
tiêu hóa ở vật ni.
Nguyễn Ngọc Hải và cs, 2010 [28] đã nghiên cứu vai trò của Bacillus
subtilis trong ức chế sản sinh aflatoxin của Aspergillus flavus. Kết quả ghi
nhận khi nuôi cấy chung với bào tử nấm mốc Asp. flavus trên m i trƣờng
bắp xay vỡ, 14 chủng Bacillus subtilis đƣợc sơ tuyển có thể làm giảm lƣợng
aflatoxin sinh ra từ 1,5 đến gần 45 lần so với đối chứng khơng có B.
subtilis. Hồ Văn Út Hậu, đã khảo sát tác động của vi khuẩn Bacillus
subtilis đối với nấm Aspergillus flavus. Kết quả đã cho thấy vi khuẩn
Bacillus subtilis có khả năng ức chế sự sinh trƣởng và sinh độc tố aflatoxin
của nấm mốc Aspergillus flavus, cũng nhƣ làm giảm tác hại của aflatoxin
trên vịt khi cho ăn thức ăn hỗn hợp gây nhiễm aflatoxin đƣợc xử lý với vi
khuẩn Bacillus subtilis.
Bacillus subtilis có thể tiết kháng sinh ức chế sự phát triển của E. coli.
Sự đối kháng của các chủng Bacillus subtilis đối với E. coli thay đổi tùy theo
chủng (9 chủng). Các chất khảng khuẩn của Bacillus subtilis đƣợc tiết từ giai
đọan rất sớm trong quá trình phát triển của vi khuẩn (khoảng 24 giờ ni
cấy) và Bacillus subtilis có khả năng bảo vệ chuột chống lại bệnh tiêu chảy xuất
huyết do E. coli O157:H7.

19