Phân lập vi khuẩn bacillus megaterium có tiềm năng ứng dụng trong sản xuất chế phẩm phân bón sinh học

LỜI CẢM ƠN
Để hồn thành đề tài khóa luận này, tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh
đạo Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp đã cho phép và tạo điều kiện thuận
lợi để tôi thực tập tại Viện. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo trong
Viện Cơng nghệ sinh học Lâm nghiệp đã tận tình truyền đạt kiến thức cho tôi
trong suốt 4 năm học tập tại trƣờng. Với vốn kiến thức đƣợc tiếp thu trong q
trình học khơng chỉ là nền tảng cho q trình nghiên cứu đề tài mà còn là hành
trang quý báu để tôi bƣớc vào đời một cách vững chắc và tự tin.
Tơi xin đƣợc bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến Ths. Nguyễn Thị Thu Hằng
giảng viên Viện CNSH Lâm nghiệp đã tận tình định hƣớng và hƣớng dẫn tơi
trong suốt q trình hồn thành đề tài nghiên cứu khoa học.
Trong q trình thực hiện và hồn thành đề tài nghiên cứu khoa học do
thời gian và kiến thức cịn hạn chế nên khơng thể tránh khỏi những thiếu sót rất
mong nhận đƣợc sự đóng góp ý kiến, chỉ bảo tận tình của q thầy, cơ để đề tài
khóa luận của tơi đƣợc hồn thiện hơn.
Tơi xin chân thành cảm ơn!
Giáo viên hƣớng dẫn

Sinh viên thực hiện

Ths. Nguyễn Thị Thu Hằng

Hoàng Thị Thu Hiền

i


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................ I
MỤC LỤC ............................................................................................................ II
DANH MỤC VIẾT TẮT .................................................................................... IV

DANH MỤC BẢNG ............................................................................................ V
DANH MỤC HÌNH ............................................................................................ VI
ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU......................................... 2
1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ VI HUẨN BACILLUS ..................................... 2
1.2. TỔNG QUAN VỀ BACILLUS MEGATERIUM............................................ 3
1.2.1. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA BACILLUS MEGATERIUM...................... 3
1.2.2. ĐẶC ĐIỂM PHÂN LOẠI ........................................................................... 3
1.2.3. ĐẶC ĐIỂM ................................................................................................. 4
1.2.4. LỊCH NGHIÊN CỨU VỀ VI KHUẨN BACILLUS MEGATERIUM ........ 5
1.2.5. TIỀM NĂNG ỨNG DỤNG ........................................................................ 5
1.2.6. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ BACILLUS MEGATERIUM.................. 7
CHƢƠNG 2MỤC TIÊU – NỘI DUNG - NGUYÊN LIỆU ................................. 9
VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................. 9
2.1. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU........................................................................... 9
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU .......................................................................... 9
2.3. NGUYÊN LIỆU ............................................................................................. 9
2.3.1. NGUỒN VI SINH VẬT.............................................................................. 9
2.3.2. HÓA CHẤT .............................................................................................. 10
2.3.3. THIẾT BỊ SỬ DỤNG ............................................................................... 10
2.3.4. MÔI TRƢỜNG NGHIÊN CỨU ............................................................... 10
2.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................ 11
2.4.1. PHÂN LẬP, GIỮ CHỦNG VI SINH VẬT TỪ CHẾ PHẨM.................. 13
2.4.2. XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH LÝ, SINH HÓA CỦA
BACILLUS ........................................................................................................... 13
ii


2.4.3. XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME NGOẠI BÀO ............................... 16
2.4.4. XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG CHỐNG CHỊU MỘT SỐ YẾU TỐ BẤT LỢI

CỦA MƠI TRƢỜNG .......................................................................................... 17
2.4.6. KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN ......................................... 17
CHƢƠNG 3.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 19
3.1. PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC SƠ BỘ CÁC CHỦNG BACILLUS
MEGATERIUM .................................................................................................. 19
3.2. XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG ĐỒNG HÓA NGUỒN CARBON .................... 21
3.3. XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH LÝ, SINH HÓA CỦA BACILLUS
............................................................................................................................. 22
3.4. XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG SINH ENZYME NGOẠI BÀO ........................... 23
3.4.1. XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH AMYLASE ..................................................... 24
3.4.2. XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CELLULASE .................................................. 25
3.4.3. XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH PROTEASE .................................................... 26
3.5. XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG CHỐNG CHỊU MỘT SỐ YẾU TỐ BẤT LỢI
CỦA MÔI TRƢỜNG .......................................................................................... 27
3.5.1. XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG CHỊU NHIỆT ................................................. 27
3.5.2. XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG CHỊU NACL .................................................. 28
3.6. XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN ............................................. 30
CHƢƠNG 4.KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................... 32
4.1. KẾT LUẬN .................................................................................................. 32
4.2. KIẾN NGHỊ ................................................................................................. 32
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 25

iii


DANH MỤC VIẾT TẮT

B. cereus

: Bacillus cereus

B.megaterium

: Bacillus Megaterium

B.subtilis

: Bacillus subtilis

ĐC

: Đối chứng

VK

: Vi khuẩn

VSV

: Vi sinh Vật

iv


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1: Công thức Môi trƣờng Ashby không chứa Nitơ để phân lập vi khuẩn
Bacillus megaterium............................................................................................ 10
Bảng 2.2: Công thức môi trƣờng LB .................................................................. 11
Bảng 2.3: Môi trƣờng xác định khả năng đồng hóa nguồn Cacbon ................... 11
Bảng 2.4: Cơng thức mơi trƣờng thử hoạt tính enzyme...................................... 11

Bảng 3.1. Tổng hợp các đặc điểm hình thái khuẩn lạc và một số đặc điểm sinh
học của các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc......................................................... 19
Bảng 3.2. Khả năng đồng hóa nguồn cacbon của các chủng vi khuẩn ............... 21
Bảng 3.3: Xác định đặc tính sinh lý, sinh hóa của Bacillus ................................ 22
Bảng 3.4. Hoạt tính amylase ngoại bào của các chủng vi khuẩn sau các khoảng
thời gian nuôi cấy khác nhau............................................................................... 24
Bảng 3.5. Hoạt tính cellulase ngoại bào của các chủng vi khuẩn sau các khoảng
thời gian nuôi cấy khác nhau............................................................................... 25
Bảng 3.6. Hoạt tính protease ngoại bào của các chủng vi khuẩn sau các khoảng
thời gian nuôi cấy khác nhau............................................................................... 26
Bảng 3.7. Khả năng chịu nhiệt của chủng L3 trên môi trƣờng LB-lỏng và agar 27

v


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Bacillus Megaterium ............................................................................. 4
Hình 1.2: Bacillus megaterium nhuộm màu ......................................................... 5
Hình 3.1. A, Ba dạng khuẩn lạc đặc trƣng đƣợc làm .......................................... 20
thuần trên môi trƣờng Ashby agar ...................................................................... 20
B, Hình ảnh nhuộm gram của ba khuẩn lạc ........................................................ 20
Hình 3.2: A, Hình ảnh vi khuẩn B2 và B3 trên môi trƣờng cố định Nitơ .......... 23
B, Hình ảnh các chủng vi khuẩn có khả năng sinh catalase ............................... 23
Hình 3.3. Hoạt tính enzyme amylase ngoại bào của các chủng Bacillus
megaterium đã phân lập ...................................................................................... 24
Bảng 3.5. Hoạt tính cellulase ngoại bào của các chủng vi khuẩn sau các khoảng
thời gian ni cấy khác nhau............................................................................... 25
Hình 3.4. Hoạt tính phân giải cellulase của các chủng Bacillus phân lập .......... 25
Hình 3.5. Hoạt tính phân giải protease của các chủng Bacillus phân lập ........... 26
Hình 3.6: Hình ảnh chủng L3 nuôi ở các nhiệt độ khác nhau ở mơi trƣờng LBlỏng ...................................................................................................................... 28

Hình 3.7. a, Hình ảnh biểu đồ khả năng chịu muối của vi khuẩn ....................... 29

vi


ĐẶT VẤN ĐỀ
Cơng nghệ vi sinh đã đóng góp cho nền nông nghiệp thế giới những thành
tựu to lớn, trở thành một trong những ngành mũi nhọn tham gia giải quyết các
mục tiêu bảo vệ tài nguyên đất đai và nâng cao độ phì nhiêu, tăng năng suất cây
trồng và chất lƣợng nông sản.
Nông nghiệp Việt Nam mỗi năm tiêu thụ trên 9 triệu tấn phân hóa học để
bảo đảm sản lƣợng, nhƣng hiệu quả sử dụng phân bón thấp, nhiều vùng đất đang có
xu hƣớng suy thối độ phì, sâu bệnh phát triển mạnh, chất lƣợng nông sản chƣa
cao. Vì vậy việc nghiên cứu ứng dụng các nguồn gen vi sinh vật tốt để sản xuất các
chế phẩm vi sinh, phân vi sinh vất, phân hữu cơ vi sinh và hữu cơ sinh học đang là
xu hƣớng tích cực trong chiến lƣợc phát triển một nền nông nghiệp theo hƣớng hữu
cơ hiệu quả và bền vững. Tuy nhiên, ngành cơng nghệ vi sinh nói chung ở Việt
Nam cịn rất non trẻ so với các nƣớc có nền nơng nghiệp tiên tiến, do đó nghiên
cứu tuyển chọn làm giàu nguồn gen vi sinh vật hữu ích có chất lƣợng cao phục vụ
cho sản xuất nông nghiệp đang là vấn đề cấp thiết.
Hiện nay, hầu hết các sản phẩm vi sinh vật đều đƣợc sản xuất từ một loại
vi sinh vật, hay phối hợp nhiều chủng có tác dụng hỗ trợ cho nhau cùng phát huy
tác dụng chuyên biệt của chúng nhƣ: (Cố định đạm cộng sinh – Nitragin,
Rhizoda; Cố định đạm hội sinh, tự do – Azogin, Rhizolu; Phân giải hợp chất
photpho khó tan – Phosphobacterein, phân hữu cơ vi sinh cố định đạm, phân giải
lân, phân hữu cơ vi sinh đa chức năng gồm vi sinh vật cố định đạm, phân giải
lân, kích thích sinh trƣởng hoặc kết hợp với chủng vi sinh có khả năng hạn chế
bệnh trong đất hại cây trồng) và hiệu quả sử dụng của các chế phẩm này ở các
địa phƣơng thì khác nhau. Nguyên nhân của hiện tƣợng này là do sự phong phú,
đa dạng của hệ vi sinh vật đất và tác động qua lại nhiều chiều cùa các vi sinh vật

với nhau, của vi sinh khác nhau với cây trồng và điều kiện mơi trƣờng. Vì vậy,
chúng tơi thực hiện đề tài: “Phân lập vi khuẩn Bacillus Megaterium có tiềm
năng ứng dụng trong sản xuất chế phẩm phân bón sinh học”.
1


Chƣơng 1
TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1 1 Giới thiệu chung về vi hu n Bacillus
 Phân loại khoa học:
Giới (regnum):

Bacteria

Ngành (divisio):

Firmicutes

Lớp (class):

Bacilli

Bộ (ordo):

Bacillales

Họ (familia):

Bacillaceae

Chi (genus):

Bacillus

Tế bào Bacillus hình que, thẳng hoặc gần thẳng, kích thƣớc 0,3 - 2,2 x 1,2 7 µm. Tế bào Bacillus thƣờng xếp thành cặp hay chuỗi, đầu trịn hoặc hơi
vng. Bacillus VK là gram dƣơng, hầu hết dƣơng tính với catalase có khả năng
di động nhờ lơng roi. Mỗi tế bào Bacillus chỉ có thể hình thành một nội bào tử
có hình oval hoặc hình trụ. Bào tử V

có khả năng chịu nhiệt, acid. Sự hình

thành nội bào tử khơng bị ngăn cản bởi sự tiếp xúc khơng khí. Các lồi thuộc chi
Bacillus đặc trƣng cho trực khuẩn sinh bào tử vẫn giữ nguyên hình que khi
mang bào tử, trong một số trƣờng hợp chỉ hơi phình to lên một chút. Tùy theo
lồi chi Bacillus, bào tử có thể nằm giữa, gần cuối, hoặc ở cuối [15,20].
- Đặc điểm phân bố: Nhờ khả năng sinh bào tử nên Bacillus có thể tồn tại
trong thời gian rất dài dƣới các điều kiện khác nhau. Bacillus rất phổ biến trong
tự nhiên nên có thể phân lập từ nhiều nguồn khác nhau nhƣ đất, nƣớc, khơng
khí, phân, trầm tích biển, thức ăn, sữa, lớp mùn,... Chủ yếu là đất nơi mà đóng
vai trị quan trọng trong chu kỳ carbon và nito.
- Hầu hết các loài thuộc chi Bacillus là những sinh vật hóa dị dƣỡng, thu
nhận năng lƣợng nhờ sự oxi hóa các hợp chất hữu cơ nhƣ đƣờng, amino acid,
acid hữu cơ,... [8].
- Phần lớn các lồi thuộc chi Bacillus là V hiếu khí hoặc kị khí tùy tiện,
nhiệt độ sinh trƣởng tối ƣu từ 30-45°C, một số chịu nhiệt với nhiệt độ sinh
2


trƣởng tối ƣu lên tới 6°C, hoặc ƣa lạnh (5°C-25°C). Các loài V

thuộc chi

Bacillus sinh trƣởng trong khoảng pH rộng từ 2-11. Trong phịng thí nghiệm,
dƣới điều kiện sinh trƣởng tối ƣu, Bacillus có thời gian thế hệ là 25 phút. Nhờ có
phổ chịu đựng pH, nhiệt độ và muối rộng nên Bacillus có thể tồn tại ở điều kiện
bất lợi trong thời gian dài [15].
1.2 Tổng quan về Bacillus Megaterium
1.2.1. Đặc điểm sinh học của Bacillus Megaterium
Bacillus megaterium là vi khuẩn Gram dƣơng , hiếu khí chủ yếu là bào tử
đƣợc tìm thấy phổ biến trong mơi trƣờng. Với chiều dài tế bào lên tới 4 Pha và
đƣờng kính 1,5 Thaym, B. megaterium là một trong những vi khuẩn lớn nhất
đƣợc biết đến. Các tế bào thƣờng xuất hiện theo cặp và chuỗi, trong đó các tế
bào đƣợc nối với nhau bằng các polysaccharide trên thành tế bào .
Vào những năm 1960, B. megaterium là sinh vật mẫu chính trong số các
vi khuẩn gram dƣơng cho các nghiên cứu chuyên sâu về sinh hóa, bào tử và vi
khuẩn. Hiện nay, Bacillus megaterium đƣợc ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực
công nghệ sinh học cho khả năng sản xuất protein tái tổ hợp, làm phân bón.
1.2.2. Đặc điểm phân loại
Giới:

Bacteria

Ngành:

Firmicutes

Lớp:

Bacilli

Bộ:

Bacillales

Họ:

Bacillaceae

Chi:

Bacillus

Lồi:

B. megaterium

3


Hình 1.1: Bacillus Megaterium
1.2.3. Đặc điểm
B. megaterium phát triển ở nhiệt độ từ 3°C đến 45°C, với mức tối ƣu
khoảng 37°C. Một số phân lập từ một hồ địa nhiệt ở Nam Cực đã đƣợc tìm thấy
phát triển ở nhiệt độ lên tới 63°C.
B. megaterium đã đƣợc công nhận là một endophyte và là một tác nhân
tiềm năng cho việc kiểm soát sinh học các bệnh thực vật. Sự cố định đạm đã
đƣợc chứng minh ở một số chủng B. megaterium.
B. megaterium là một sinh vật công nghiệp quan trọng trong nhiều thập
kỷ. Nó sản xuất penicillin amidase đƣợc sử dụng để sản xuất penicillin tổng hợp,
các loại amylase khác nhau đƣợc sử dụng trong ngành làm bánh và glucose

dehydrogenase đƣợc sử dụng trong xét nghiệm glucose máu. Hơn nữa, nó đƣợc
sử dụng để sản xuất pyruvate, vitamin B12, các loại thuốc có đặc tính diệt
nấm và kháng vi-rút, ... Nó tạo ra các enzyme để điều chỉnh corticosteroid, cũng
nhƣ một số axit amin dehydrogenase.
B. megaterium đƣợc biết là sản xuất axit poly-glutamic . Sự tích lũy của
polymer

đƣợc

tăng

lên

rất

nhiều

trong mơi

trƣờng nƣớc

muối

(2

xăng10% NaCl ), trong đó polymer bao gồm phần lớn L-glutamate (hàm lƣợng
đồng phân L lên tới 95%). Ít nhất một chủng B. megaterium có thể đƣợc coi
là halophile , vì sự tăng trƣởng của NaCl lên đến 15% đã đƣợc quan sát thấy
[27].
4

Hình 1.2: Bacillus megaterium nhuộm màu
Về mặt phát sinh, dựa trên 16S rRNA , B. megaterium đƣợc liên kết mạnh
mẽ với B. flexus, sau này đƣợc phân biệt với B. megaterium một thế kỷ trƣớc,
nhƣng chỉ mới đƣợc xác nhận là một lồi khác. B. megaterium có một số điểm
tƣơng đồng về kiểu hình và phát sinh gen với mầm bệnh B. anthracis và B.
cereus, mặc dù bản thân nó tƣơng đối vô hại [28]
1.2.4. Lịch nghiên cứu về vi khuẩn Bacillus megaterium
Lồi này đƣợc mơ tả bởi de Bary vào năm 1884, với Bacillus megaterium,
nhƣng không đƣa ra từ nguyên. Tuy nhiên, một số tác giả sau đó gọi nó là B.
megatherium giả sử tên này đƣợc viết sai chính tả. Xu hƣớng này tiếp tục khi
nhiều nhà khoa học (chủ yếu từ các nƣớc đang phát triển ) vẫn sử dụng tên B.
megatherium, gieo rắc sự nhầm lẫn.
Tên B. megaterium là bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp mega, (ας, μεγάλη, μέγα)
có nghĩa là "lớn", tức chi vi khuẩn có kích thƣớc lớn hơn so với các vi khuẩn
khác trong chi Bacillus.


Lỗi chính tả khơng chủ ý (khơng cho thực tế rằng de Bary và học sinh

của mình, liên tục sử dụng biệt danh "megaterium"), trong khi nó cần phải có
đƣợc megatherium, từ therion ( θηρίον , có nghĩa là "con quái vật"), có nghĩa là
"con thú lớn ".
1.2.5. Tiềm năng ứng dụng
B. megaterium là một loại vi khuẩn hoại sinh rất thƣờng có trong đất. Chu
trình hoại sinh chất hữu cơ có trong đất là q trình phân hủy, giáng hóa chất
5

hữu cơ để trở thành các hợp chất đơn giản hơn đƣợc thực hiện bởi các loại vi
sinh bao gồm nhiều loài vi khuẩn và nấm khác nhau, mà B. megaterium là một
trong số đó. Các lồi vi sinh này sử dụng các chất dinh dƣỡng từ các vật liệu hữu
cơ chết hay hoại sinh để duy trì nguồn năng lƣợng cho sự phát triển của chúng.
Trong môi trƣờng đất vi khuẩn ở dạng sinh dƣỡng khi có sẵn cơ chất cho chúng
phát triển và chuyển thành dạng bào tử khi chất dinh dƣỡng trở nên cạn kiệt.
Điều này là một chiến lƣợc sinh tồn đƣợc sử dụng bởi nhiều loại vi sinh chiếm
ƣu thế trong môi trƣờng sống hiếu khí của đất ngồi vi khuẩn cịn có các loại
nấm sợi và các lồi xạ khuẩn (actinomyces). Các nhóm vi sinh sống trong đất và
tạo ra kháng sinh quần hợp với qui trình tạo thành bào tử của chúng. Vì có rất
nhiều lồi vi sinh tạo bào tử có thể có hiệu quả làm giáng hóa nhiều hợp chất
polymer sinh học nhƣ protein, tinh bột, pectin…, chúng đƣợc cho là có vai trị
đáng kể trong chu trình sinh học của carbon và nitrogen. Chính nhờ đặc tính này
hiện nay B. megaterium là một trong những loại vi khuẩn đƣợc dùng khá phổ
biến trong lĩnh vực xử lý môi trƣờng [30].
B. megaterium đƣợc coi là vi khuẩn không gây bệnh nhƣng V

đóng vai

trị lớn trong việc tạp nhiễm các mơi trƣờng vô khẩn thông qua việc tiếp xúc trực
tiếp hay thông qua các hạt bụi, và chúng có thể là tác nhân gây nên hiện tƣợng
phân hủy và thối rữa [30].
Trong cơng nghệ sinh học nhờ kích thƣớc lớn của vi khuẩn B. megaterium
đã cho phép sử dụng B. megaterium trong các nghiên cứu về protein cũng nhƣ các
nghiên cứu về màng tế bào thành công. Chủng đơn đƣợc sử dụng cho nhiều
nghiên cứu trên nhiều lĩnh vực của sinh lý bào tử và cấu trúc màng tế bào. Một số
của các ứng dụng đó đƣợc áp dụng trong xử lý môi trƣờng và công nghiệp nhƣ
sản xuất các enzyme glucose dehydrogenase, penicillin aminidase và đặc biệt là
b-amylase, ứng dụng trong sản xuất vitamin B12, Oxetanocin, P450 cytocrome…
và rất nhiều các ứng dụng khác trong công nghệ gen và tái tổ hợp [19].

6


1.2.6. Tình hình nghiên cứu về Bacillus megaterium

B. megaterium thƣờng đƣợc sử dụng trong phịng thí nghiệm và đƣợc sử
dụng nhƣ một sinh vật cơng nghiệp có khả năng sản xuất nhiều loại protein và
nguồn sinh học. Bacillus megaterium là một nguồn protein cơng nghiệp tốt vì nó
vừa là vật chủ nhân bản vừa mong muốn và tạo ra một biến thể lớn của các
enzyme. Loài này là vật chủ nhân bản tốt vì có thể chứa nhiều vectơ plasmid, sử
dụng Bacillus megaterium nhà khoa học đã phát triển nhiều loại protein thƣờng
đƣợc sử dụng trong lĩnh vực y tế và nơng nghiệp. Ví dụ, nhiều penicillin tổng
hợp đã đƣợc tạo ra bằng cách sử dụng penicillin amidase trong vi
khuẩn; glucose dehydrogenase thu hoạch đƣợc sử dụng trong xét nghiệm
glucose máu; ß-Amylase thƣờng đƣợc sử dụng trong ngành cơng nghiệp bánh
mì; và protease trung tính đƣợc sử dụng bởi ngành công nghiệp da. Một số
chủng đã đƣợc chứng minh là vật chủ tốt cho biểu hiện gen. Một chủng, QM
B1551, vẫn đƣợc sử dụng để tạo kháng nguyên cho Bộ chẩn đốn HIV. Nghiên
cứu cơng nghệ sinh học của Bacillus megaterium cung cấp rất nhiều protein
khác nhau mà họ có thể sử dụng trong các tiến bộ y tế, khoa học và công nghiệp
quan trọng [19].
Phạm Minh Triết (2013) đã tiến hành phân lập đƣợc từ đất và nƣớc 18
dòng vi khuẩn có khả năng phân giải keratin. Trong đó có dịng vi khuẩn
Bacillus megaterium cho kết quả cao và khác biệt có ý nghĩa so với các dịng
cịn lại với tỷ lệ phân hủy lơng lên đến 40,48% [21].
Nhóm nấm đối kháng Trichoderma hiện nay đang đƣợc ứng dụng rất rộng
rãi trong công nghệ sản xuất phân hữu cơ sinh học hiện nay ở Việt Nam. Phân
hữu cơ sinh học có phối trộn thêm nấm đối kháng Trichoderma là lọai phân có
tác dụng rất tốt trong việc phịng trừ các bệnh vàng lá chết nhanh, còn gọi là

bệnh thối rễ do nấm Phytophthora palmirova gây ra. Hay bệnh vàng héo rũ hay
còn gọi là bệnh héo chậm do một số nấm bệnh gây ra: Furasium
solari, Pythium sp, Sclerotium rolfosii….
Các sản phẩm phân hữu cơ sinh học hiện có trên thị trƣờng phía Nam với
chất lƣợng tốt và có uy tín nhƣ nhóm sản phẩm phân hữu cơ Cugasa của Công

7


Ty Anh Việt, phân VK của Công ty Viễn Khang, phân hữu cơ Phaga,
Trimix của Cơng ty Phaga……
Nhóm phân hữu cơ sinh học có bổ sung vi sinh vật trợ giúp và làm giàu
dinh dƣỡng (phân hữu cơ vi sinh) thƣờng đƣợc chế biến bằng cách đƣa thêm
một số vi sinh vật có ích khác vào sau khi nhiệt độ đống ủ đã ổn định (30°C ).
Nhƣ nhóm vi khuẩn cố định nitơ tự do (Azotobacter), vi khuẩn hoặc nấm sợi
phân

giải

photphát

megaterium, Pseudomonas

khó

tan

(Bacillus

striata; Aspergillus

polymyxa, Bacillus

awamori…),

xạ

khuẩn

Streptomyces. Rất nhiều lọai phân hữu cơ vi sinh, phân lân vi sinh đang lƣu
thông trong sản xuất tại Việt nam.
- Phân gà (hoặc phân heo, phân bị) thải ra từ các trại chăn ni là dạng cơ
chất rất giàu dinh dƣỡng, hàm lƣợng đạm chiếm đến hơn 2%, độ ẩm phân gà
(hoặc phân heo, phân bò) khá cao, trung bình khoảng 70-80%. Do độ ẩm cao,
phân gà (hoặc phân heo, phân bò) rất dễ phát sinh mùi, quá trình ủ phân cần phải
phơi hoặc trộn với các giá thể khác để làm giảm ẩm.
- Hàm lƣợng hữu cơ trong phân gà (hoặc phân heo, phân bò) cao, rất dễ
gây ngộ độc hữu cơ cho cây trồng nếu chƣa qua quá trình ủ hoai.
- Phân gà (hoặc phân heo, phân bị) có chứa nhiều vi sinh vật gây bệnh,
đặc biệt là nhóm vi khuẩn Salmonella (vi khuẩn gây bệnh thƣơng hàn) và E. coli
gây bệnh đƣờng ruột ở ngƣời, cần phải ủ hoai trƣớc khi sử dụng làm phân bón
trong canh tác nơng nghiệp [13].

8


Chƣơng 2
MỤC TIÊU – NỘI DUNG - NGUYÊN LIỆU
VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2 1 Mục tiêu nghiên cứu

Phân lập chủng vi khuẩn Bacillus megaterium có khả năng cố định Nitơ,
sản sinh một số enzyme ngoại bào và xác định một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa
của vi khuẩn đã phân lập đƣợc.
2 2 Nội dung nghiên cứu
- Phân lập, tuyển chọn các chủng Bacillus megaterium có khả năng cố
định Nitơ từ ba mẫu đất ruộng.
- Xác định hình thái khuẩn lạc, hình dạnh tế bào của Bacillus megaterium
các chủng vi khuẩn đã phân lập
- Xác định một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng vi khuẩn đã
phân lập
+ hả năng cố định Nitơ.
+ hả năng đồng hóa các nguồn carbon khác nhau
+ hả năng sinh trƣởng trong điều kiện kỵ khí
+ hả năng sinh catalase
- Xác định hoạt tính loại enzyme (amylase, protease, cellulase) ngoại bào
của các chủng vi khuẩn Bacillus megaterium đã phân lập.
- Xác định khả năng chống chịu một số yếu tố bất lợi với môi trƣờng của
các chủng vi khuẩn (khả năng chịu nhiệt độ cao và nồng độ NaCl cao) của
vi khuẩn
- Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng Bacillus
megaterium đã phân lập.
2 3 Nguyên liệu
2.3.1. Nguồn vi sinh vật
- Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Bacillus megaterium từ một số mẫu
đất thu thập ở ruộng lúa của tỉnh Cao Bằng.
9


2.3.2. Hóa chất
Các hóa chất nhƣ: Peptone, yeast extract, NaCl, K2HPO4 , MgSO4.7H2SO4,

(NH4)2SO4, CaCO3, MgSO4.7H2O, Mannitol, Glucose, Lactose, Glyxerol,
Maltose, Sucrose và Fructose,… do Trung Quốc, Việt Nam, Mỹ, Đức, … sản
xuất.
2.3.3. Thiết bị sử dụng
Các máy móc, dụng cụ đƣợc sử dụng có tại Viện Cơng nghệ sinh học Lâm
Nghiệp bao gồm:
- Máy đo pH HANA HI 2211 PH/ORP Meter – Ý, Nồi khử trùng HVE
50 - Nhật Bản, Máy ly tâm lạnh - Mỹ, Máy lắc ổn nhiệt - Thụy Sĩ, Tủ ấm
(Memmert) - ức, Cân phân tích OHAUS PA 213 - Mỹ, Tủ lạnh 4ºC; -20ºC; 80ºC - Nhật Bản, Kính hiển vi quang học, Tủ cấy (Box laminar PII) - ức,
Micropipet - ức, Máy ảnh Sony Lens 14.1 megaPixels - Nhật Bản, Lị vi sóng 20
lít, 30 lít – Liên Doanh
2.3.4. Mơi trường nghiên cứu
- Mơi trƣờng Ashby
Bảng 2.1: Công thức Môi trƣờng Ashby không chứa Nitơ để phân lập vi
khu n Bacillus megaterium
Thành phần

Hàm lƣợng (g/l)

Mannitol

20

K2HPO4

0,2

MgSO4.7H2O

0,2

K2SO4

0,1

NaCl

0,2

CaCO3

1

Agar

15
pH = 7

10


- Môi trƣờng LB nuôi cấy các chủng Bacillus
Bảng 2.2: Công thức môi trƣờng LB
Thành phần

Hàm lƣợng (g/l)

Peptone

10

Yeast extract

5

NaCl

10
pH = 7

- Mơi trƣờng ISP4 xác định khả năng đồng hóa nguồn cacbon
Bảng 2.3: Môi trƣờng xác định khả năng đồng hóa nguồn Cacbon
Thành phần

Hàm lƣợng (g/l)

Nguồn Cacbon

10

K2HPO4

1

MgSO4.7H2O

1

NaCl

1

(NH4)2SO4

2
pH = 7

+ Nguồn cacbon: Bổ sung một số loại đƣờng Glucose, Lactose, Glyxerol,
Maltose, Sucrose, Fructose và Mannitol.
-

Mơi trƣờng xác định hoạt tính enzyme ngoại bào của vi khuẩn
Bảng 2.4: Công thức môi trƣờng thử hoạt tính enzyme

Mơi trƣờng định tính

Thành phần, hàm lƣợng

Thuốc thử

Amylase

2% Agar + 1% Tinh bột

Lugol 1%

Cellulase

2% Agar + 1% CMC

Lugol 1%

Protease

2% Agar + 1% Casein

Thuốc thử Comassi

enzyme

blue
Ghi chú: Các môi trƣờng trên đƣợc hấp khử trùng ở 121ºC, 20 phút trƣớc
khi sử dụng.
2 4 Phƣơng pháp nghiên cứu
11


Quá trình nghiên cứu của đề tài đƣợc thực hiện theo sơ đồ sau:
Mẫu đất
Pha loãng 1g đất với nƣớc vô trùng
theo tỉ lệ 1:10
Gia nhiệt 80ºC trong 20 phút
Pha lỗng mẫu đất (10-3 )

Cấy trải trên mơi trƣờng Ashbyagar (khơng có Nitơ)
Ủ đĩa cấy trong tủ ấm 37ºC trong 48 giờ
Phân lập, tinh sạch các chủng vi khuẩn
có khả năng là Bacillus megaterium

Xác định hình dạng tế bào, hình thái, đƣờng kính vi

khuẩn, nhuộm Gram

Xác định một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa

Xác định
khả năng
sinh trƣởng
trong mơi
trƣờng
khơng có
Nitơ

Xác định
khả năng
đồng hóa
nguồn
Cacbon

Xác định
sinh trƣởng,
phát triển
trong điều
kiện kỵ khí

Xác định
khả năng
enzyme
ngoại bào

Xác định

khả năng
chống chịu
một số yếu
tố bắt lợi
của môi
trƣờng

Xác định
khả năng
kháng vi
sinh vật

Sơ đồ quy trình phân lập và xác định một đặc điểm sinh lý sinh hóa của
Bacillus
12


2.4.1. Phân lập, giữ chủng vi sinh vật từ chế phẩm
- Pha loãng mẫu: Tiến hành cân 1g đất cho vào 9ml nƣớc cất vô trùng vào
ống falcon đƣợc mẫu pha lỗng có nồng độ 10-1 và lắc đều, gia nhiệt ở 80ºC
trong 20 phút. Hút 1ml dịch từ mẫu pha lỗng có nồng độ 10-1 cho vào ống
falcon chứa 9ml nƣớc cất vơ trùng mới thì đƣợc mẫu pha lỗng có nồng độ 10-2.
Tƣơng tự pha lỗng mẫu đến nồng độ 10-3.
- Cấy phân lập: Hút 50 µl mẫu đã đƣợc pha lỗng lên mơi trƣờng Ashby
agar. Dùng que cấy trang vô trùng trang đều dịch lên bề mặt thạch. Các đĩa sau
đã đƣợc ủ ở 37ºC. Sau 48 giờ ngày quan sát sự hình thành khuẩn lạc của vi
khuẩn.
- Giữ giống trong glycerol: Dịch vi khuẩn nuôi lỏng đến đầu pha ổn định
đƣợc bổ sung khoảng 70% glycerol, làm lạnh nhanh trong nitơ lỏng và giữ ở 80ºC. Việc giữ giống theo cách này có thể giúp bảo quản vi khuẩn trong vài năm
và vi khuẩn còn đƣợc hoạt hoá trƣớc khi nhân giống [2].

2.4.2. Xác định một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa của Bacillus
Chủng đƣợc quan sát trên mơi trƣờng Ashby-agar bằng mắt thƣờng và
kính hiển vi quang học. Các đặc điểm ni cấy, hình thái dựa trên các chỉ số:
khả năng phát triển, hình thái, màu sắc, bề mặt và màu sắc khuẩn lạc.
2.4.2.1. Phương pháp quan sát đặc điểm khuẩn lạc
Quan sát một số chỉ tiêu của các chủng trên môi trƣờng LB-agar: khả
năng phát triển của khuẩn lạc, bề mặt khuẩn lạc, màu sắc khuẩn lạc.
2.4.2.2. Phương pháp nhuộm Gram


Nguyên tắc: Nhuộm Gram (phản ứng Gram) có vai trị đặc biệt trong
việc phân loại vi khuẩn. Trong quá trình nhuộm Gram, tế bào bƣớc đầu đƣợc
xử lý với tím kết tinh và iot nên có sự tạo thành phức chất tím kết tinh iot bên
trong tế bào. Khi vi khuẩn Gram âm bị tẩy cồn, lipit của lớp màng ngoài bị
hoà tan làm tăng tính thấm của màng dẫn đến sự rửa trơi phức chất tím – iot
và làm cho vi khuẩn mất màu. Khi nhuộm bổ sung chúng sẽ bắt màu với
thuốc này ( vàng với Safranin hay đỏ tía với Fuchsin). Ở vi khuẩn Gram
13


dƣơng cồn làm cho các lỗ trong peptidoglycan co lại do đó phức chất tím –
iot bị giữ lại bên trong tế bào.
 Cách tiến hành: Làm vết bôi vi khuẩn phẩm trên 1 lá kính sạch. Để khơ
tự nhiên và cố định bằng cách hơ nóng qua ngọn lửa đèn cồn. Nhỏ vài giọt
Crystal Violet (tím kết tinh) cho phủ lên bề mặt vết nhuộm và để yên trong vòng
1 phút. Rửa nhanh bằng nƣớc. Nhỏ vài giọt Lugol cho phủ đều lên trên bề mặt
vết nhuộm và để yên trong vòng 1 phút. Rửa nhanh bằng nƣớc. Tẩy màu bằng
cách nghiêng lamen và nhỏ từ từ ancol (cồn) lên vết nhuộm, khi giọt ancol rời
khỏi lamen khơng có màu tím thì ngừng ngay. Rửa nhanh bằng nƣớc. Nhỏ vài
giọt safranine cho phủ đều trên bề mặt vết nhuộm và để yên trong vòng 1 phút.

Rửa nhanh bằng nƣớc. Thấm khơ vết nhuộm và quan sát dƣới kính hiển vi với
vật kính x100.
 Đọc kết quả: VK Gram âm sẽ bắt màu hồng, V

Gram dƣơng sẽ bắt

màu tím. Quan sát hình dạng vi khuẩn (cầu khuẩn, trực khuẩn,...) và cách sắp
xếp (chuỗi, chùm, rời rạc,...)
2.4.2.3. Phương pháp xác định khả năng sinh nội bào tử của vi khuẩn
- Nguyên tắc: Bào tử vi khuẩn đƣợc sinh ra trong tự nhiên để chúng có
thể tồn Tại lâu dài trong các điều kiện khắc nghiệt, mà ở điều kiện đó vi khuẩn
trƣởng thành sẽ bị giết chết. Điểm quyết định để tạo bào tử phụ thuộc rất nhiều
vào sự suy giảm dinh dƣỡng hoặc/và điều kiện khắc nghiệt trong môi trƣờng
nuôi vi khuẩn. Dựa vào đặc điểm đó, tiến hành tạo ra điều kiện khắc nghiệt bằng
cách sốc nhiệt để xác định khả năng sinh bào tử.
 Cách tiến hành theo phƣơng pháp gia nhiệt: Lấy 1 khuẩn lạc đơn từ đĩa
petri cấy vào môi trƣờng LB- Lỏng (pH=7), nuôi ở 37ºC, lắc 150 vòng/phút,
trong 24 giờ thu huyền phù vi khuẩn.
Tiến hành pha loãng dịch huyền phù vào các ống eppendorf đã đƣợc khử
trùng. Đem các ống này đun cách thủy ở 80ºC trong 10 phút. Sau đó, dùng
mycropipet hút 100µl dịch cấy trải trên mơi trƣờng LB-agar, đặt vào tủ ấm 30ºC.
Sau 24 giờ, nếu trên đĩa thạch xuất hiện khuẩn lạc kết luận chủng có khả năng
hình thành bào tử và ngƣợc lại.
14


Xác định khả năng hình thành nội bào tử của vi khuẩn theo phương pháp của
Schaeffer–Fulton cải tiến
 Cách tiến hành theo phƣơng pháp nhuộm màu theo Schaeffer–Fulton
cải tiến: Lam kính đƣợc vơ trùng bằng cồn 70%, sau đó sinh khối vi khuẩn của

vi khuẩn đƣợc trải lên lam kính và đƣợc cố định bằng nhiệt (tạo vết bôi). Phủ lên
vết bơi một mảnh giấy lọc, sau đó dùng pipet nhỏ dung dịch xanh methylene lên
trên giấy lọc để nhuộm vết bơi. Mục đích của giấy lọc là lọc cặn của dung dịch
xanh methylene, giúp mẫu vi khuẩn sạch và dễ quan sát sau khi nhuộm. Vừa nhỏ
màu xanh methylene lên giấy lọc vừa đun nhẹ lam kính trên đèn cồn, liên tục
nhỏ thuốc nhuộm trong khi đun để tránh lam kính bị khơ (nhƣng khơng để thuốc
nhuộm sơi trên lam kính). Sau khi nhuộm với xanh methylene trên ngọn đèn cồn
trong 5 phút, để nguội lam kính và rửa lam bằng nƣớc cất đến khi màu nƣớc rửa
ra không cịn màu xanh. Hong khơ lam kính sau khi rửa, tiếp theo lại nhuộm vết
bôi với thuốc nhuộm fuchsin trong một phút (tƣơng tự nhƣ nhuộm xanh
methylene). Tiếp theo rửa vết bơi với nƣớc cất và quan sát dƣới kính hiển vi
quang học với vật kính x100 trong giọt dầu. Dƣới hiển vi trƣờng, bào tử của vi
khuẩn bắt màu xanh của xanh methylene và tế bào chất của vi khuẩn bắt màu
hồng của thuốc nhuộm fuchsin
2.4.2.4. Phương pháp xác định khả năng sinh catalase
- Nguyên tắc: Catalase hiện diện ở các VSV hiếu khí và kị khí tùy ý. Catalase
thủy phân hydrogen perioxide (H2O2 ) thành H2O và O2, ngăn cản sự tích tụ của
phân tử có độc tính cao này trong tế bào. Sự thủy phân H2O2 sẽ giải phóng O2,
đƣợc ghi nhận qua hiện tƣợng sủi bọt khí. Thử nghiệm này thƣờng đƣợc dùng để
phân biệt các VSV hiếu khí với kị khí ví dụ nhƣ Bacillus với Clostridium.
-

Cách tiến hành: Nhỏ một giọt dung dịch H2O2 30% lên trên khuẩn lạc
Bacillus, hoặc chuyển một lƣợng VSV lên lamen rồi thử bằng dung dịch
H2O2 30%. Ghi nhận hiện tƣợng sủi bọt nếu có.

-

Đọc kết quả: Thử nghiệm là (+) khi có hiện tƣợng sủi bọt khí do O2
đƣợc tạo ra, ngƣợc lại là (-) khi khơng có sủi bọt khí.

2.4.2.5. Xác định khả năng cố định Nitơ

15


Cách tiến hành: Lấy 1 khuẩn lạc đơn từ đĩa petri cấy vào môi trƣờng
Ashby (pH=7), nuôi ở 37°C trong 24 giờ. Dựa trên kết quả hình khuẩn lạc mọc
trên môi trƣờng rồi cho ra kết quả.
2.4.2.6. Xác định khả đồng hóa nguồn cacbon
 Cách tiến hành: Lấy 1 khuẩn lạc đơn của chủng đƣợc chọn cấy vào môi
trƣờng ISP4 lỏng có các nồng độ nguồn Cacbon 1% (tƣơng ứng với các loại
đƣờng Glucose, Lactose, Glyxerol, Maltose, Sucrose, Fructose và Mannitol). Ủ ở
37ºC, trong 24 giờ. Dựa trên sự đổi màu của mơi trƣờng có các loại đƣờng khác
nhau mà kết luận khả năng đồng hóa nguồn cacbon của chủng đƣợc tuyển chọn.
2.4.2.7. Xác định khả năng sinh trưởng, phát triển trong điều kiện kỵ khí
 Cách tiến hành: Dùng que cấy đầu nhọn (đã đƣợc khử trùng) lấy một
khuẩn lạc vi khuẩn trên môi trƣờng đĩa thạch. Cấy vi khuẩn bằng cách ấn sâu que
cấy đầu nhọn vào môi trƣờng LB-agar trong ống nghiệm có nắp đậy (bề mặt
thạch sát miệng ống nghiệm có nắp đậy), sau khi cấy chủng vào thì đổ thêm một
lớp mơi trƣờng LB 45ºC đến sát thành ống nghiệm rồi đậy nắp ống nghiệm lại. Ủ
ở 37ºC, trong 5-7 ngày. Dựa trên kết quả hình thành sinh khối dọc theo vết cấy để
kết luận khả năng sinh trƣởng trong điều kiện kỵ khí của các chủng vi khuẩn.
2.4.3. Xác định hoạt tính enzyme ngoại bào
 Cách tiến hành: Nuôi vi khuẩn trong môi trƣờng LB-lỏng, sau 24 giờ
lấy dịch đem ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút, thu phần dịch nổi bên trên
(enzyme thô). Chuẩn bị mơi trƣờng thử hoạt tính ( tinh bột 1%, CMC 1% và
casein 1% ). Dùng khoan nút chai (đƣờng kính d=0,7cm) khoan lỗ ở giữa đĩa
thạch. Dùng pipet hút 0,05ml dịch enzyme thô cho vào lỗ thạch, ủ ở 4ºC trong 2
giờ. Sau đó, ủ tiếp ở 37ºC trong 24 giờ. Kiểm tra hoạt tính amylase và cellulase

bằng thuốc thử lugol, protease bằng Comasi blue. Nếu VK có sinh sẽ tạo vòng
trong suốt quanh lỗ khoan, vùng tinh bột chƣa bị phân giải có màu tím đậm.
 Đánh giá khả năng sinh amylase, protease, cellulase bằng cách đo
đƣờng kính vịng phân giải (D-d), cm. Trong đó D: đƣờng kính vịng phân giải
(cm), d: đƣờng kính lỗ thạch (cm). Nếu: D-d ≥ 2,5 cm: hoạt tính sinh enzyme
16


ngoại bào rất mạnh, D-d ≥ 2,0 cm: hoạt tính sinh enzyme ngoại bào mạnh, D-d ≥
1,5 cm: trung bình và D-d < 1,0 cm: hoạt tính sinh enzyme ngoại bào yếu
2.4.4. Xác định khả năng chống chịu một số yếu tố bất lợi của môi trường
2.4.4.1. Xác định khả năng chịu nhiệt
 Cách tiến hành:
- Cách 1: Hút 30µl dịch khuẩn đƣợc nuôi lắc ở môi trƣờng LB-lỏng trong
24 giờ vào môi trƣờng LB-lỏng. Ủ ở 40ºC, 45ºC, 50ºC và 60ºC , trong 24 giờ.
Đo OD600nn rồi kết luận khả năng chịu nhiệt của các chủng đƣợc tuyển chọn.
- Cách 2: Lấy 1 khuẩn lạc đơn của chủng đƣợc chọn cấy ria trên môi
trƣờng LB-agar. Ủ ở 40ºC, 45ºC, 50ºC và 60ºC , trong 24 giờ. Dựa trên kết quả
hình thành khuẩn lạc ni ở các nhiệt độ khác nhau, kết luận khả năng chịu nhiệt
của các chủng đƣợc tuyển chọn.
2.4.42. Xác định khả năng chịu NaCl
Các chủng Bacillus có thể sinh trƣởng và phát triển trong mơi trƣờng có
nồng độ muối cao, đây là đặc điểm mà nhiều lồi vi khuẩn khác khơng có. Bên
cạnh đó, tình hình nhiễm mặn ngày càng phổ biến. Vì vậy, thí nghiệm xác định
khả năng chịu mặn của các chủng Bacillus là cần thiết trong việc tạo chế phẩm
probiotic trong nuôi thủy sản và xử lí ao hồ.
 Cách tiến hành: Hút 30µl dịch khuẩn đƣợc ni lắc ở mơi trƣờng LBlỏng trong 24 giờ vào môi trƣờng LB-lỏng ở các nồng độ muối 1,5; 2, 3 và 5%.
Ủ ở 37ºC, trong 24 giờ. Đo OD600nm có các nồng độ muối khác nhau mà kết
luận khả năng chịu mặn của các chủng đƣợc tuyển chọn.
2.4.6. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn

Khảo sát khả năng kháng khuẩn của các vi sinh vật thử nghiệm đối với một
số vi khuẩn gây bệnh nhƣ: E. Coli, Salmonella, Bacillus cereus, Shighella và
nấm men theo phƣơng pháp của Aslim và cộng sự (2005) [3].
Nguyên tắc: Thực hiện theo nguyên tắc khuếch tán trên đĩa thạch, nguyên
tắc này dựa trên khả năng kháng các vi sinh vật chỉ thị của 2 sản phẩm.

17


Tiến hành: Mơi trƣờng thử hoạt tính kháng khuẩn đƣợc đổ trên đĩa Petri (đã
chứa vi khuẩn kiểm định) sau khi môi trƣờng đã đông cứng tiến hành đục lỗ
thạch. Nhỏ phần dịch trong (dịch nuôi cấy đã li tâm ở 4000vòng/phút trong 10
phút) vào các lỗ đã đục để ở 4ºC trong 6 giờ sau đó mang các đĩa thạch để
37ºC.Sau 24 giờ quan sát vòng kháng khuẩn tạo thành. Hoạt tính kháng khuẩn
của các chủng vi sinh vật tuyển chọn đƣợc tính bằng đƣờng kính vịng kháng
khuẩn ∆D. ∆D = D-d (mm) với D: đƣờng kính vịng vơ khuẩn (mm).
d: đƣờng kính lỗ thạch (mm).

18


Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3 1 Phân lập và sàng lọc sơ bộ các chủng Bacillus megaterium
Từ 3 mẫu đất thu thập đƣợc ở ruộng lúa ở tỉnh Cao Bằng phân lập đƣợc
các chủng Bacillus megaterium trên môi trƣờng Ashby-agar (không chứa Nitơ)
thu đƣợc 3 dạng khuẩn lạc khác nhau, đƣợc kí hiệu là B1, B2, B3. Sau 24 giờ
quan sát hình dạng, màu sắc, bề mặt khuẩn lạc, làm tiêu bản nhuộm Gram và
khả năng sinh nội bào tử theo quy trình đã trình bày ở trên. Kết quả đƣợc trình
bày tóm tắt ở Bảng 3.1 và Hình 3.1

Bảng 3.1. Tổng hợp các đặc điểm hình thái khu n lạc và một số đặc điểm
sinh học của các chủng vi khu n phân lập đƣợc
STT
Ký
kiệu

1

Hình thái khu n lạc
trên mơi trƣờng

Hình thái tế bào

Ashby-agar
Trắng đục ở giữa và

B1

Tính

nhạt dần ra xung
quanh, đƣờng kính
8mm

chất
Gram

Khả

Catalase

năng
sinh nội
bào tử
+

Trực khuẩn, ngắn,
nhỏ, đứng riêng rẽ

+

+

hoặc xếp theo cụm
+

2

B2

Trắng, bề mặt hơi bông

Trực khuẩn, ngắn,

xốp, có tia xung quanh,

nhỏ, xếp thành đơn

đƣờng kính 3mm

hoặc đơi

+

+

3

+
B3

Có tia, mờ, đƣờng kính
7mm

Trực khuẩn, ngắn,
nhỏ, xếp đơn hoặc
đơi

19

+

+