Xây dựng cơ sở dữ liệu mã vạch DNA DNA barcode cho một số loài cây lâm nghiệp gỗ lớn lâm sản ngoài gỗ có giá trị kinh tế

LỜI CẢM ƠN
Để hồn thành đƣợc khóa luận này, với lịng biết ơn sâu sắc nhất, tơi xin
chân thành cảm ơn quý thầy cô Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp Trƣờng Đại học Lâm nghiệp đã giúp đỡ và chỉ bảo tận tình tơi trong suốt q
trình thực hiện khóa luận tại trƣờng, đặc biệt là sự giúp đỡ của các thầy cô
bên bộ môn Công nghệ gen và Di truyền phân tử của Viện Công nghệ sinh
học Lâm nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Hà Văn Huân, TS. Bùi Thị Mai
Hƣơng đã tận tình giúp đỡ và chỉ bảo tơi trong q trình hồn thành khóa
luận. Đặc biệt, Khóa luận này nhận đƣợc sự hỗ trợ từ Đề tài cấp Nhà nƣớc
"Xây dựng cơ sở dữ liệu mã vạch DNA (DNA barcode) cho một số loài cây
lâm nghiệp gỗ lớn, lâm sản ngồi gỗ có giá trị kinh tế" do PGS.TS. Hà Văn
Huân làm Chủ nhiệm. Với những kiến thức và kỹ năng thầy và cô truyền dạy
khơng chỉ giúp tơi hồn thành khóa luận mà cịn là tài sản quý báu theo giúp
tôi sau này.
Cảm ơn các anh chị thuộc Viện Công nghệ sinh học đã quan tâm giúp đỡ
tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận.
Chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè luôn động viên và hỗ trợ tôi trong
suốt thời gian qua.
Do trong q trình thực hiện cịn có nhiều hạn chế về mặt thời gian,
kiến thức và kinh nghiệm vì vậy khơng tránh khỏi những thiếu sót nhất định.
Tơi rất mong nhận đƣợc những ý kiến đóng góp của thầy cơ và các bạn để
khóa luận tốt nghiệp của tơi đƣợc hoàn thiện hơn.
Xuân Mai, ngày 10 tháng 05 năm 2019
Sinh viên
Lưu Thị Thu

i


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... i

MỤC LỤC ......................................................................................................... ii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ........................................................................... iv
DANH MỤC BẢNG ........................................................................................ vi
DANH MỤC HÌNH ......................................................................................... vi
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 3
1.1. Tổng quan về Keo Lai ................................................................................ 3
1.1.1. Phân loại khoa học.................................................................................. 3
1.1.2. Phân bố ................................................................................................... 3
1.1.3. Đặc điểm sinh học ................................................................................... 4
1.1.4. Giá trị sử dụng ........................................................................................ 4
1.2. Tổng quan về DNA barcode ( DNA mã vạch) .......................................... 5
1.2.1. Giới thiệu về mã vạch DNA barcode...................................................... 5
1.2.2. Một số DNA barcode được sử dụng ....................................................... 7
1.2.3.

ng dụng c a D

barcode tr n thực v t ........................................... 14

CHƢƠNG 2. MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU ................................................................................................ 16
2.1. Mục tiêu nghiên cứu................................................................................. 16
2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 16
2.3. Vật liệu, hóa chất, các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ........................ 16
2.3.1.V t liệu nghiên cứu ................................................................................ 16
2.3.2. Hóa chất ................................................................................................ 16
2.3.3. Dụng cụ và thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ...................................... 18
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu .......................................................................... 18
2.4.1. Tách chiết D

t ng số ........................................................................ 18

2.4.2. iểm tra ết quả tách chiết D

t ng số ............................................. 20
ii


2.4.3. Phương pháp nhân bản gen đích c a ỹ thu t PCR ............................. 20
2.4.3.1. Các bước tiến hành phản ứng PCR ................................................... 20
2.4.4. Tinh sạch sản phẩm PCR ...................................................................... 22
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................ 24
3.1. Kết quả tách chiết DAN tổng số .............................................................. 24
3.2. Kết quả nhân bản vùng gen nghiên cứu bằng kỹ thuật PCR ................... 24
3.3. Phân tích kết quả ...................................................................................... 25
3.3.1. Xác định và phân tích trình tự DNA trên các vùng gen nghiên cứu .... 25
3.3.2. So sánh hả năng phân biệt c a các đoạn trình tự ............................... 35
CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................. 37
4.1. Kết luận .................................................................................................... 37
4.2. Kiến nghị .................................................................................................. 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO

iii


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
TT

Chữ viết

tắt

Nghĩa tiếng Anh

Nghĩa tiếng Việt

1

ATP

Adenosin triphosphat

Adenosin triphosphat

2

BME

β-mereaptoethanol

β-mereaptoethanol

3

BOLD

Barcode of Life data

Barcode of Life data

4

Bp

Base pair

Cặp base

5

CBOL

Consortium for the Barcode Consortium for the
of Life
Barcode of Life

6

CITES

Convention on International
Trade in Endangered
Công ƣớc về buôn bán
Species of Wild Fauna and quốc tế các loài nguy cấp
Flora

7

cpDNA

Chloroplast DNA

8

CTAB

Cetyl trimethylammonium
bromide

Cetyl trimethylammonium
bromide

9

Cytb

Cytochrome b

Cytochrome b

10

DNA
(DNA)

Deoxyribonucleic acid

Axit deoxyribonucleic

11

dNTP

Deoxyribonucleotide
triphosphate

Deoxyribonucleotid
triphosphate

12

EBA

Extraction Buffer A

Đệm tách A

13

EBB

Extraction Buffer B

Đệm tách B

14

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic

acid

15

F-Primer

Foward-Primer

Mồi xuôi

16

IGS

Intergenic Spacer

vùng liên gen

bộ gen lục lạp

iv

axit ethylenediamine
tetraacetic


17

ITS

Internal Transcribed Spacer

vùng DNA nằm giữa các
gen

18

Kb

Kilobase (1000 base)

1000 cặp base

19

mtDNA

Mitochondrial DNA

DNA ty thể

20

NAD(P)H

Nicotinamide adenine
dinucleotide phosphate

Nicotinamide adenine
dinucleotide phosphate

NCBI

National Center for
Biotechnology Information

Trung tâm Quốc gia về
Thông tin Công nghệ sinh
học

22

ORF

Open Reading Frame

Khung đọc mở

23

PCR

Polymerase Chain Reaction

Phản ứng chuỗi
polymerase

24

PVP

Polyvinyl pyrrolidone

Polyvinyl pyrrolidone

25

RFLP

Restriction fragment length
polymorphism

Phân tích đa hình trình tự
DNA

26

RNA

Ribonucleic acid

Axit ribonucleic

27

rRNA

Ribosomal RNA

ARN ribosome

28

SDS

Sodium Dodecyl Sulphate

Sodium Dodecyl Sulphate

29

R-Primer

Reverse primer

Mồi ngƣợc

30

TAE

Tris-Acetate-EDTA

31

tRNA

Transfer RNA

ARN vận chuyển

31

UV

Untraviolet

Tia cực tím

21

v

Tris-Acetate-EDTA


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Phân loại khoa học cây Keo Lai [24] ............................................... 3
Bảng 1.2. Thông tin của một số mồi DNA Barcode thiết kế cho hệ gen lục
lạp .................................................................................................................... 11
Bảng 2.1. Kí hiệu các mẫu Keo Lai sử dụng cho nghiên cứu......................... 16
Bảng 2.2. Thành phần đệm tách A (100ml) .................................................... 17
Bảng 2.3. Thành phần đệm tách B (100ml) .................................................... 17
Bảng 2.4. Thành phần đệm TE (100ml).......................................................... 17
Bảng 2.5. Trình tự và thơng tin của các cặp mồi đƣợc sử dụng ..................... 21
Bảng 2.6. Thành phần của một phản ứng PCR ............................................... 21
Bảng 3.1. Một số lồi có trình tự gen matK tƣơng đồng với loài Acacia
auriculiformis mangium, Acacia hybrid trên ngân hàng gen NCBI ............... 26
Bảng 3.2. Một số lồi có trình tự gen rbcL tƣơng đồng với loài Acacia
auriculiformis mangium, Acacia hybrid trên ngân hàng gen NCBI ............... 30

Bảng 3.4. Một số lồi có trình tự gen trnH-psbA tƣơng đồng với loài Acacia
auriculiformis mangium, Acacia hybrid trên ngân hàng gen NCBI ............... 33
Bảng 3.7. Bảng so sánh khả năng phân biệt của Các đoạn trình tự matK,
rbcL, trnH-psbA .............................................................................................. 36

DANH MỤC HÌNH
vi


Hình 1.1. Hình thái cây Keo Lai ....................................................................... 4
Hình 3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số 3 mẫu Keo lai.............................. 24
Hình 3.2. Kết quả PCR gen matK, trnH-psbA, rbcL của 3 mẫu Keo Lai ...... 25
Hình 3.4. Cây phân loại dựa vào trình tự trên đoạn matK tạo bởi NCBI ....... 27
Hình 3.3. Sự sai khác trình tự đoạn gen matK của lồi Acacia auriculiformis
mangium, Acacia hybrid với trình tự với trình tự gen của lồi Acacia
longhiphyllodinea (các vị trí sai khác đƣợc bơi đỏ)........................................ 29
Hình 3.6. Cây phân loại dựa vào trình tự trên đoạn rbcL tạo bởi NCBI ........ 31
Hình 3.5. Sự sai khác trình tự đoạn gen rbcL của lồi Acacia auriculiformis
mangium, Acacia hybrid với trình tự với trình tự gen của lồi Acacia
longhiphyllodinea ............................................................................................ 32
Hình 3.6. Cây phân loại dựa vào trình tự trên đoạn trnH-psbA tạo bởi NCBI
......................................................................................................................... 34
Hình 3.7. Sự sai khác trình tự đoạn gen trnH-psbA của loài Acacia
auriculiformis mangium, Acacia hybrid với trình tự với trình tự gen của lồi
Acacia longhiphyllodinea (các vị trí sai khác đƣợc bơi đỏ) ........................... 35

vii


ĐẶT VẤN ĐỀ

Keo Lai là cây thuộc họ Đậu. Tên khoa học là Acacia auriculiformis
mangium, Acacia hybrid. Keo Lai là sự kết hợp giữa Keo lá tràm (Acacia
Auriculiormis) và Keo Tai Tƣợng (Acacia Mangium). Giống keo lai tự nhiên
này đƣợc phát hiện đầu tiên bởi Messir Herbern và Shim ghi nhận vào năm
1972 trong số các cây Keo tai trƣợng trồng ven đƣờng ở Sook Telupid thuộc
bang Sabah, Malaysia [23]. Năm 1976, M.Tham đã kết luận thông qua việc
thụ phấn chéo giữa Keo tai tƣợng và Keo lá tràm tạo ra cây Keo lai có sức
sinh trƣởng nhanh hơn giống bố mẹ. Cây Keo lai có nguồn gốc ở Australia,
đƣợc trồng khá phổ biến ở các nƣớc Đông Nam Á. Tuy nhiên, trong những
năm gần đây, giống Keo Lai này đã đƣợc phát hiện ở một số tỉnh vùng Đông
Nam Bộ. Ở Ba Vì (Hà Nội) và một số tỉnh khác ở Việt Nam. Đồng thời,
giống keo này đƣợc Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng thuộc Viện Khoa
học Lâm Nghiệp Việt Nam nghiên cứu khảo nghiệm thành công. (Diễn đàn
nongnghiepViet.info)
Cây Keo Lai hiện nay là một trong những loài cây chủ lực trong trồng
rừng kinh tế của đa số ngƣời dân và các Công ty Lâm Nghiệp. So với các loài
cây Keo khác nhƣ Keo lá tràm, Keo tai tƣợng thì cây Keo lai có những đặc
điểm hơn hẳn về sinh khối, tỷ trọng và độ dồng đều trong sinh trƣởng. Những
cây gỗ thẳng, kích thƣớc lớn đƣợc sử dụng trong xây dựng, đóng đồ mộc mỹ
nghệ, hàng hóa xuất khẩu. Phải đến 80% gỗ Keo Lai dùng cho cơng nghiệp
chế biến gỗ. Phần cịn lại các “phụ phẩm” nhƣ cành nhánh, cây nhỏ cong, xấu
hơn mới đem bán cho nhà máy giấy. Ngoài ra, Keo Lai đƣợc sử dụng để làm
sàn gỗ, đóng và sản xuất pallet gỗ với các kích thƣớc, độ dài ngắn khác nhau.
Trƣớc đây, việc phân loại hay giám định sinh vật chủ yếu dựa trên chỉ
thị về hình thái hoặc các đặc tính sinh lý sinh hóa bên trong nhờ vào bảng
hƣớng dẫn định danh có sẵn. Phƣơng pháp phân loại truyền thống này trong
nhiều trƣờng hợp cịn gặp nhiều khó khăn và hạn chế, nhƣ: nhiều sinh vật có
1

hình thái rất giống nhau nhƣng thực tế lại rất khác nhau trong hệ thống phân
loại (hệ gen rất khác nhau), ngƣợc lại nhiều sinh vật có hình thái rất khác
nhau nhƣng lại rất gần nhau trong hệ thống phân loại (hệ gen rất giống nhau).
Mặt khác, phƣơng pháp phân loại này dựa trên các đặc điểm hình thái rất khó
phân biệt đƣợc sự khác biệt giữa các biến dị dƣới lồi. Đặc biệt, đối với
những mẫu vật có nguồn gốc sinh vật đã bị biến đổi về hình thái, nhƣ: những
mẫu sinh vật đã chết, bị chôn vùi dƣới đất, ở các cơng trình xây dựng, đã qua
chế biến thì khơng thể xác định đƣợc bằng chỉ thị hình thái. Do đó, địi hỏi
cần có phƣơng pháp định danh và phân loại hiện đại hơn khắc phục đƣợc
những hạn chế này.
Việc ứng dụng các gen mã vạch, xác định các đoạn DNA barcode là
một phƣơng pháp định danh, sử dụng một đoạn DNA chuẩn ngắn nằm trong bộ
genome của sinh vật đang nghiên cứu để phục vụ giám định lồi, mang lại hiệu
quả cao trong thời gian ngắn, góp phần không nhỏ vào sự định danh và bảo tồn
các loài thực vật trên thế giới. Phƣơng pháp xác định các đoạn DNA barcode
cũng đƣợc áp dụng phổ biến cho các lồi thực vật có giá trị kinh tế cao.
Từ những lý do trên, tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu xác định các
đoạn DNA barcode cho Loài Keo Lai (Acacia auriculiformis mangium,
Acacia hybrid) phục vụ giám định loài” sẽ là căn cứ để phân loại, lựa chọn
và xây dựng dữ liệu gen quý góp phần quản lý tài nguyên thiên nhiên, bảo tồn
nguồn gen quý của quốc gia.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về Keo Lai
1.1.1. Phân loại khoa học
Bảng 1.1. Phân loại khoa học cây Keo Lai [24]
Giới (Regnum)

Plantae

Bộ (Ordo)

Fabales

Họ (Familia)

Fabaceae

Phân họ (Subfamilia)

Mimosoideae

Chi (Genus)

Acacia

Loài (Species)

A.auriculiformis mangium

1.1.2. Phân bố
Cây Keo Lai hiện nay phân bố rộng khắp cả trên thế giới và trong nƣớc
trong những năm gần đây, mọc chủ yếu ở khu vực đồi núi, vùng sƣờn dốc hay
có gió và ở hầu hết các dạng đất, thích nghi nhất là ở các tỉnh từ Quảng Bình
trở vào. Vùng đất thích nghi nhất là đất có độ pH từ 3-7, chủ yếu trồng trên
các loại đất ferali, tầng dày tối thiểu 75 cm, tối ƣu từ 4-50 cm, đất phù sa cổ,
đất xám bạc màu, đất phèn lên luống không bị ngập nƣớc đều có thể trồng

đƣợc [25]. Trong nƣớc, Keo lai thƣờng phân bố ở các khu vực nhƣ: Tân Tạo,
Trảng Bom, Sông Mây, Cà Mau, Quảng Bình và ở Ba Vì ( Hà Tây), Phú Thọ,
Hịa Bình, Tun Quang, Thái Ngun.
Trên thế giới thƣờng phân bố ở các nƣớc: Australia, Papua New
Guinea, Indonesia, Maylaysia, Philippines, Thailand.

3


1.1.3. Đặc điểm sinh học

Hình 1.1. Hình thái cây Keo Lai
Keo Lai là cây gỗ nhỡ, cao tới 25-30m, đƣờng kính tới 30-40cm, cao và
to hơn Keo tai tƣợng và Keo lá tràm, các đặc tính khác có dạng trung gian
giữa 2 loài bố mẹ. Thân thẳng, cành nhánh nhỏ, tỉa cành khá, tán dày và rậm.
Từ khi hạt nẩy mầm tới hơn 1 tháng hình thái lá cũng biến đổi theo 3
giai đoạn lá mầm, lá thật và lá giả. Lá giả mọc cách tồn tại mãi. Chiều rộng lá
hẹp hơn chiều rộng lá keo tai tƣợng nhƣng lớn hơn chiều rộng lá keo lá tràm.
Hoa tự bông 5-6 hoa/1 hoa tự vàng nhạt mọc từng đôi ở nách lá. Quả đậu
dẹt, khi non thẳng khi già cuộn hình xoắn ốc. Mùa hoa tháng 3-4, quả chín
tháng 7-8. Vỏ quả cứng, khi chín màu xám và nứt. Mỗi quả có 5-7 hạt màu
nâu đen, bóng. Một kg hạt có 45.000-50.000 hạt, thu đƣợc từ 3-4kg quả [26].

1.1.4. Giá trị sử dụng
Gỗ keo lai có thớ mịn, màu sáng nên đƣợc sử dụng chủ yếu để làm bột
giấy. Gỗ có thể dùng trong xây dựng và đóng đồ mộc mỹ nghệ, hàng hóa xuất
khẩu. Ngồi ra do hệ rễ có nhiều nốt sần nên Keo lai cịn có khả năng cải tạo
đất tốt. Ƣu điểm của cây Keo Lai là sinh trƣởng nhanh về đƣờng kính, chiều
cao và hình khối, thân cây thẳng, cành nhánh nhỏ, sinh trƣởng và phát triển
4

tốt, khả năng chống chịu sâu bệnh hại tốt, có khả năng thích ứng với nhiều điều
kiện lập địa và các loại đất khác nhau. Hiện nay ngƣời trồng rừng cây Keo Lai
có thể thu nhập gấp đơi trƣớc đây, bình qn 50-60 triệu đồng/ha, nếu thâm
canh tốt có thể đạt 70 - 80 triệu đồng/ha sau chu kỳ 6-7 năm trồng [27].

1.2. Tổng quan về DNA barcode ( DNA mã vạch)
1.2.1. Giới thiệu về mã vạch DNA barcode
Phƣơng pháp phân loại hình thái có lịch sử phát triển lâu đời và đã xây
dựng đƣợc một hệ thống phân loại sinh vật nói chung và thực vật nói riêng
tƣơng đối đầy đủ và toàn diện. Phƣơng pháp phân loại này chủ yếu dựa vào
sự khác biệt hình thái của các cơ quan trong cơ thể thực vật, đặc biệt là cơ
quan sinh sản (hoa). Tuy nhiên, phƣơng pháp này cũng gặp rất nhiều khó
khăn khi cần xác định những mẫu vật đang trong giai đoạn phát triển (chƣa ra
hoa), những mẫu có đặc điểm giống nhau do cùng thích nghi với điều kiện
mơi trƣờng hoặc khó nhận biết do có nhiều điểm tƣơng đồng ở bậc phân loại
thấp nhƣ loài và dƣới loài [5]. Ngoài ra, phƣơng pháp phân loại hình thái
thƣờng chỉ đƣợc thực hiện bởi các chuyên gia hình thái học, việc phân loại
đơi khi tốn nhiều thời gian và công sức [4].
Từ giữa những năm 1990, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân
tử, một phƣơng pháp nghiên cứu mới trong lĩnh vực phân loại học đã hình
thành và đƣợc gọi là phƣơng pháp phân loại học phân tử. Phƣơng pháp này
dựa trên các dữ liệu thơng tin về hệ gen (DNA) trong và ngồi nhân hoặc các
sản phẩm của chúng (protein). Tùy mục đích hoặc đối tƣợng nghiên cứu,
ngƣời ta có thể lựa chọn các gen (đoạn DNA) khác nhau hoặc các sản phẩm
khác nhau của hệ gen. Trong phƣơng pháp phân loại phân tử, các kỹ thuật
thƣờng đƣợc ứng dụng để nghiên cứu tính đa dạng sinh học, mối quan hệ tiến
hóa giữa các loài, xây dựng cây phát sinh chủng loại cũng nhƣ giúp nhận
dạng đến cấp phân loại loài hoặc chi [1].

5


Ở thực vật, một số phƣơng pháp chỉ thị phân tử đƣợc sử dụng để nhận
dạng loài cũng nhƣ sử dụng enzyme giới hạn kết hợp với lai DNA (RFLP),
dấu vân tay DNA (DNA fingerprinting), phản ứng chuỗi trùng hợp PCR và
đặc biệt việc sử dụng các kỹ thuật mã vạch DNA (DNA barcode) ngày càng
trở nên phổ biến. Các phƣơng pháp này đều dựa trên thực tế rằng cấu trúc hóa
học của DNA từ mọi lồi là giống nhau và sự khác biệt duy nhất giữa chúng
là trình tự các cặp base.
Năm 2003, Paul Hebert, nhà nghiên cứu tại Đại học Guelph ở Ontario,
Canada, đề xuất “mã vạch DNA” (DNA barcode) nhƣ là một cách để xác định
loài [3]. Mã vạch đƣợc sử dụng là một đoạn DNA ngắn từ một phần của hệ gen
và đƣợc dùng giống nhƣ một máy quét ở siêu thị phân biệt đƣợc các sản phẩm
bằng cách nhận diện các sọc màu đen đặc trƣng của từng sản phẩm. Trong
cơng nghệ mã vạch, có thể hai mặt hàng trông rất giống nhau và không phân
biệt đƣợc bằng mắt thƣờng song qua mã vạch, máy qt có thể phân biệt đƣợc.
DNA barcode là một trình tự nucleotide của một chuỗi DNA ngắn của
một gen đã biết, trong đó có vùng ít bị thay đổi và vùng dễ thay đổi trong q
trình tiến hóa. Dựa vào mức độ thay đổi trong trình tự DNA này để đánh giá
sự sai khác di truyền giữa các sinh vật [6].
DNA barcode là một cơng cụ mới, rất có hiệu quả cho các nghiên cứu về
phân loại, giám định sinh vật, gồm cả động vật, thực vật, vi sinh vật và virus.
Việc xác định lồi bằng DNA mã vạch có hiệu quả cao trong việc phân biệt
các loài sinh vật khi những quan sát hình thái, sinh trƣởng và phát triển chƣa
đủ cơ sở để định danh hoặc phân biệt loài.
Việc giải mã toàn bộ hệ gen của sinh vật gặp nhiều khó khăn, tốn kém
nhiều cơng sức và kinh phí nên khơng phải phịng thí nghiệm nào cũng có thể
thực hiện đƣợc. Vì vậy việc xác định một đoạn DNA đã biết, đặc trƣng cho

lồi (thậm chí cá thể) để làm căn cứ phân biệt cá thể này với cá thể khác, loài
này với loài khác. DNA mã vạch đƣợc xem là một cơng cụ quan trọng trong
phân tích, đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen, xác định nguồn gốc, xuất xứ
6


của sinh vật, bản quyền các sản phẩm sinh học. Vì vậy, hƣớng nghiên cứu
DNA mã vạch đang đƣợc phát triển mạnh mẽ và đƣợc ứng dụng rộng rãi
trong nhiều lĩnh vực khác nhau: nghiên cứu về đa dạng sinh vật, giám định
loài, giám định mẫu vật, xét nghiệm bệnh, bản quyền sản phẩm (giống cây
trồng, vật nuôi, sản phẩm nông - lâm - thủy sản,…).
Việc sử dụng DNA barcode để nhận dạng các lồi trên quy mơ tồn cầu
có ý nghĩa ngày càng lớn. Theo barcode of Life Data Systems, năm 2011 đã
lƣu trữ đƣợc hơn 1.100.000 DNA barcode từ hơn 95.000 đối tƣợng sinh vật
khác nhau. Đã có hơn 180.000 trình tự DNA barcode của thực vật đƣợc lƣu
trữ trong Ngân hàng gen quốc tế và liên kết với hơn 2.000 bài báo khác nhau.
Để chuẩn hóa ở mức độ quốc tế về việc sử dụng DNA barcode, cộng đồng
khoa học đã nỗ lực trong việc tìm kiếm các vùng trình tự DNA có thể làm mã
vạch có thể phân biệt đồng thời nhiều loài [10], [11], [12], [14].
Một DNA barcode điển hình phải đáp ứng đƣợc các u cầu sau:
- Có tính phổ biến cao để có thể thực hiện trên nhiều lồi thực vật.
- Trình tự có tính đặc hiệu cao và có hiệu suất nhân bản cao.
- Có khả năng phân biệt đồng thời đƣợc nhiều lồi [13].
Đến nay, có rất nhiều đoạn DNA đƣợc sử dụng làm DNA barcode, tùy
thuộc nhóm sinh vật mà đoạn DNA đƣợc sử dụng làm mã vạch khác nhau.
1.2.2. Một số DNA barcode được sử dụng
1.2.2.1. Mã vạch DNA ở động v t
Việc lựa chọn các vùng DNA barcode liên quan đến việc lựa chọn một
hoặc một vài vị trí có thể thu đƣợc trình tự thƣờng xun và đáng tin cậy
trong bộ mẫu lớn và đa dạng, đƣa ra dữ liệu so sánh một cách dễ dàng giúp

phân biệt các lồi với nhau, hay có thể nói đây là vùng thơng tin di truyền có
ý nghĩa thực sự có thể cung cấp thơng tin nhận dạng: nó thƣờng phải đủ dài
để chứa đủ thơng tin để có thể phân biệt giữa các loài nhƣng đủ ngắn để thuận
tiện cho phân tích. Mã vạch DNA locus gen CO1 ở động vật thƣờng đƣợc
dùng rộng rãi do đáp ứng đƣợc tiêu chí này [13].
7


Đây là một gen đơn, đƣợc di truyền từ mẹ và cho mức độ phân biệt cao,
là một vùng gen mã hóa cho protein có mặt với nhiều bản sao trong mỗi tế
bào. Ở động vật, nó có tính bảo thủ với những vùng đảo ngƣợc nhỏ, hoặc các
đoạn lặp. Sử dụng gen này để phân biệt nhiều mẫu động vật đƣợc ghi nhận là
tốt ngay cả những mẫu vật đã đƣợc lƣu giữ qua thời gian dài.
Đặc biệt hệ gen của ty thể cũng đƣợc sử dụng trong việc lựa chọn các
vùng mã vạch DNA. Do đó một số đoạn ngắn DNA ty thể (mtDNA) có thể
đƣợc dùng để phân biệt các lồi. Ngồi ra, DNA ty thể có nhiều bản sao hơn
so với DNA nhân, vì vậy dễ phục hồi từ các mẫu vật, đặc biệt từ các mẫu với
lƣợng nhỏ hoặc các mẫu đã bị xuống cấp.
Ngoài locus gen CO1, các đoạn gen ty thể Cytb (cytochrome b), gen
ribosome 12S, 16S cũng đƣợc dùng nhƣ mã vạch DNA trong nhận dạng ở
động vật [13].
1.2.2.2. Mã vạch DNA ở thực v t
Khác với ở động vật, ngoài bộ gen nhân và ty thể, thực vật cịn có một
bộ gen bổ sung là bộ gen lục lạp (cpDNA). DNA nhân, ty thể và lục lạp đều
đƣợc sử dụng trong phân tích phát sinh lồi. Tùy vào mức độ phân tích mà
mỗi vùng gen và mỗi phƣơng pháp đƣợc áp dụng thích hợp. Do tính phức tạp
và lặp đi lặp lại, chỉ có một số gen thuộc DNA hệ gen nhân nhƣ 18S, 26S,
vùng ITS,… đƣợc sử dụng. Vùng 18S và 5,8S thƣờng đƣợc sử dụng để xác
định ở mức bộ hoặc họ, vùng 26S thƣờng đƣợc sử dụng để xác định ở mức
dƣới họ cho đến loài, vùng ITS và vùng 5S spacer thƣờng đƣợc dùng để phân

tích ở mức loài cho tới mức dƣới loài [28].
Nếu nhƣ các gen ty thể nhƣ CO1 và Cytb đƣợc dùng rộng rãi cho động
vật và tảo thì khi chúng đƣợc áp dụng cho các loài thực vật trên cạn lại biểu
hiện tính bảo thủ cao nên khơng phù hợp làm DNA mã vạch. Thay vào đó,
các vùng rời rạc trong hệ gen lạp thể đã đƣợc dùng trong các nghiên cứu phát
sinh loài (nhƣ các vùng exon của các gen rbcL, atpB, ndhF, matK và vùng
intron của các gen trnL, trnL-F).
8


Những vùng DNA này giống nhƣ mã vạch bởi tính bao thủ trong phạm
vi mỗi lồi nhƣng đa hình giữa các lồi. Một vùng trình tự thơng thƣờng khác
cho nghiên cứu phát sinh loài thực vật trên cạn là ribosome ITS nhân (vùng
đệm của tiểu đơn vị lớn RNA ribosome), tuy nhiên vùng này không đạt hiệu
quả cao ở một số nhóm thực vật do các yếu tố khác liên quan đến các diễn
biến tiến hóa phức tạp của các vùng lặp lại cao trong hệ gen nhân [13]. Tính
đến năm 2009, có khoảng 8 locus gen đƣợc sử dụng làm mã vạch DNA ở các
loài thực vật, bao gồm cả hệ gen nhân và hệ gen lục lạp.
a. Trình tự gen nhân
Các trình tự barcode đƣợc nhân bản từ DNA hệ gen của bố mẹ dự kiến
sẽ cung cấp nhiều hơn thơng tin về các lồi cần xác định. Tuy nhiên khó khăn
trong việc khuếch đại PCR từ gen nhân vì gen nhân chủ yếu là đơn gen hoặc
có bản sao gen thấp, đặc biệt từ sự suy thoái và chất lƣợng DNA genome và
khả năng phân biệt dƣới lồi do bảo tồn gen chức năng có thể chính là lý do
tại sao hạn chế số lƣợng các gen nhân đƣợc thử nghiệm trong xác định loài
bằng phƣơng pháp DNA barcode [9], [20].
b. Vùng gen mã hóa ribosome
Gen rDNA là hệ thống đa gen mã hóa phần RNA của ribosome. Các gen
DNA ribosome (rDNA) mang trình tự vừa có tính bảo thủ vừa có tính đa dạng
thích hợp để phân biệt các loài gần gũi. Trong tế bào, rDNA đƣợc sắp xếp

nhƣ các đơn vị đƣợc lặp lại ngẫu nhiên bao gồm DNA mã hóa ribosome 18S,
5,8S, 28S và xen giữa các trình tự khơng mã hóa ITS1, ITS2 (internal
transcribed spacers) nằm ở hai bên sƣờn của vùng 5,8S. Vùng mã hóa của ba
gen rDNA đƣợc bảo tồn cao hơn hai vùng ITS. Nhìn chung các đơn vị rDNA
đƣợc lặp lại hàng nghìn lần và đƣợc sắp xếp tập trung tại vùng lớn trên nhiễm
sắc thể. Một trong những tính năng đáng chú ý nhất của rDNA là từng đơn vị
trong hệ thống đa gen khơng tiến hố độc lập, thay vào đó tất cả các đơn vị
tiến hố một cách phối hợp nhờ vậy mà rDNA đạt mức ổn định cao hơn trong
loài nhƣng khác biệt giữa các loài khác nhau.
9


Hiện tại, nrITS vùng ITS của gen nhân đƣợc xem là một trong những
cơng cụ hữu ích nhất để đánh giá phát sinh loài ở cả thực vật và động vật vì
nó phổ biến trong tự nhiên, kế thừa từ bố mẹ và biến đổi cao do ít hạn chế
chức năng. Một số nghiên cứu gần đây ở cây sinh sản hữu tính và cây sinh sản
vơ tính cho thấy một số mức độ biến đổi số các bản sao của trình tự ITS1 và
ITS2 do nhiều nguyên nhân nhƣ lai gần, phân ly, tái tổ hợp, tỷ lệ đột biến cao
và hình thành gen giả của các gen chức năng dẫn đến những thay đổi đó. Trên
cơ sở này nrDNA có thể đƣợc sử dụng để phân định chính xác và hiệu quả thực
vật trong cùng loài với đặc điểm lịch sử đời sống khác nhau (một năm, lâu
năm, trên cạn, dƣới nƣớc) và nguồn gốc tiến hóa khác nhau [9], [20], [24].
c. Trình tự gen lục lạp
Hệ gen lục lạp của thực vật gồm phân tử DNA mạch vịng có kích thƣớc
120 - 160 kb chia làm hai bản sao đơn là bản sao đơn lớn (large single - copy
region) và bản sao đơn nhỏ (small single - copy region). Hai bản sao đƣợc
phân cách bởi hai chuỗi lặp lại đảo nhau (IRa và IRb) có độ dài trung bình 20
- 30 kb. Hệ gen lục lạp chứa tất cả các gen rRNA (4 gen ở thực vật bậc cao),
các gen tRNA (35 gen) và các gen khác mã hóa cho các protein tổng hợp
trong lục lạp (khoảng 100 gen) cần thiết cho sự tồn tại của chúng.

10


Bảng 1.2. Thông tin của một số mồi DNA Barcode thiết kế
cho hệ gen lục lạp
Gen

Mồi

Trình tự 5’→3’

rbcL

a-f
a-r

ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC
CTTCTGCTACAAATAAGAATCGATCTC

→
←

matK

matK 1F
matK 1R
matK 2F
matK 2R

GAACTCGTCGGATGGAGTG
GAGAAATCTTTTTCATTACTACAGTG
CGTACTTTTATGTTTACAGGCTAA
TAAACGATCCTCTCATTCACGA

→
←
→
←

rpoB

rpoB 1
rpoB 2
rpoB 3
rpoB 4

AAGTGCATTGTTGGAACTGG
ATGCAACGTCAAGCAGTTCC
CCGTATGTGAAAAGAAGTATA
GATCCCAGCATCACAATTCC

→
→
←
←

rpoC1

rpoC1 1

rpoC1 2
rpoC1 3
rpoC1 4

GTGGATACACTTCTTGATAATGG
GGCAAAGAGGGAAGATTTCG
TGAGAAAACATAAGTAAACGGGC
CCATAAGCATATCTTGAGTTGG

→
→
←
←

ycf5
(ccsA)

ycf5 1
ycf5 2
ycf5 3
ycf5 4

GGATTATTAGTCACTCGTTGG
ACTTTAGAGCATATATTAACTC
ACTTACGTGCATCATTAACCA
CCCAATACCATCATACTTAC

→
→
←

trnH psbA

trnH2
psbAF
trnH(GUG)
psb A

CGCGCATGGTGGATTCACAATCC
GTTATGCATGAAAGTAATGCTC
ACTGCCTTGATCCACTTGGC
CGAAGCTCCATCTACAAATGG

→
←
→
←

trnL-c
trnL-d
trnL-e

CGAAATCGGTAGACGCTACG
GGGGATAGAGGGACTTGAAC
GGTTCAAGTCCCTCTTATCCC

→
←
→

trnL-f
trnL-g
trnL-h

ATTTGAACTGGTGACACGAG
GGGCAATCCTGAGCCAA
CCATTGAGTCTCTGCACCTATC

←
→
←

trnL-F

→: mồi xuôi; ←: mồi ngƣợc

11


Hệ gen lục lạp có tính bảo thủ cao và mang tính đặc thù của từng lồi do
vậy việc sử dụng các kết quả phân tích hệ gen lục lạp vào nghiên cứu phát
sinh loài và phân loại thực vật đƣợc các nhà khoa học rất quan tâm. Dựa trên
những thơng tin có sẵn từ các nghiên cứu về phát sinh loài và các nghiên cứu
gần đây, một số locus là đoạn gen hay các gen đƣợc chọn để nghiên cứu làm
chỉ thị barcode tiềm năng cho các loài thực vật trên trái đất. Có khoảng 20 gen
lục lạp có độ dài phù hợp (khoảng 1 kb) đƣợc sử dụng trong nghiên cứu phát
sinh loài. Các gen này chứa đựng nhiều mức độ tiến hố và vì vậy phù hợp
cho nhiều mức độ phân loại [19], [20], [22].
Các locus khác nhau đã đƣợc đề xuất về điều tra nhóm, mồi thích hợp
cho các gen này đƣợc trình bày trong bảng 1.2.

d. Trình tự gen rbcL
Trong các gen lạp thể, rbcL là trình tự gen đặc trƣng nhất, mã hóa các
tiểu đơn vị lớn của rubilose - 1,5 - bisphosphate cacboxylase/ oxygenase
(RUBISCO). rbcL là gen đầu tiên đƣợc giải trình từ thực vật. rbcL đã đƣợc sử
dụng rộng rãi trong nghiên cứu phát sinh loài và phân loại thực vật với hơn
10.000 trình tự rbcL có sẵn trong GenBank. Do sự dễ dàng trong khuếch đại
PCR ở một số nhóm thực vật, CBOL gần đây đã công nhận rbcL là một trong
những trình tự gen tiềm năng nhất cho các nghiên cứu DNA barcode ở thực
vật. Tuy nhiên, do khả năng phân biệt lồi thấp, nên hầu hết các nhóm đều
cho rằng nên sử dụng kết hợp rbcL với các với các chỉ thị barcode khác, ví dụ
nhƣ matK là hai locus barcode chuẩn cho thực vật [20], [21], [22].
e. Trình tự gen mat
Trong số các gen lục lạp, matK là một trong những gen tiến hố nhanh
nhất, có kích thƣớc khoảng 1550 bp và mã hóa cho Enzyme maturase liên
quan đến quá trình loại bỏ các intron loại 2 trong q trình phiên mã RNA.
Do matK tiến hố nhanh và có mặt hầu hết trong thực vật nên đã đƣợc sử
dụng nhƣ một chỉ thị trong nghiên cứu mối quan hệ giữa các loài và phát sinh
loài ở thực vật. CBOL đã thử nghiệm matK trên gần 550 loài thực vật và thấy
12


rằng 90% mẫu thực vật hạt kín dễ dàng khuếch đại trình tự bằng cách sử dụng
một cặp mồi đơn và đề nghị sử dụng matK là một trong những locus barcode
chuẩn cho thực vật [20], [24].
f. Trình tự gen rpoB và rpoC1
Gen rpoB, rpoC1, rpoC2 mã hóa ba trong 4 tiểu đơn vị của RNA
polymerase lục lạp. Khi nghiên cứu họ Dipterocarpaceae, Tsumura và đồng
tác giả (1996) đã nhận thấy gen rpoB là thích hợp để nghiên cứu phát sinh
loài. Hiện nay rpoB là gen đƣợc sử dụng nhiều trong nghiên cứu phát sinh
loài và xác định các loài vi khuẩn, đặc biệt là khi nghiên cứu các chủng có

quan hệ gần gũi. Cùng với gen 16S rRNA, rpoB đƣợc sử dụng trong nhiều
nghiên cứu để xác định loài vi khuẩn mới, do vậy các gen này đƣợc đề xuất là
chỉ thị barcode độc lập hoặc kết hợp với một số gen khác. Trong các nghiên
cứu gần đây, CBOL đã thử nghiệm 7 locus và thấy rằng khả năng phân biệt
loài cuả đoạn gen rpoC1 là thấp nhất (43%). Mặc dù vậy, trong nghiên cứu
Liu và đồng tác giả (2010) đã chỉ ra rpoC1 là một chỉ thị rất hữu ích khi đƣợc
sử dụng để phân biệt các lồi bryophytes. Do vậy cần có các nghiên cứu tiếp
theo để chứng minh sự phù hợp khi sử dụng rpoB và rpoC1 làm chỉ thị
barcode trong các nghiên cứu giám định lồi [20], [22].
g. Trình tự gen ycf5
Gen ycf5 mã hóa cho một protein có chứa 330 amino acids. Gen này
đƣợc bảo tồn trên tất cả các vùng thực vật và đã đƣợc kiểm nghiệm cho phù
hợp với DNA barcode của một vài nhóm. Tuy nhiên, gen này chƣa đƣợc cơng
nhận và sử dụng nhiều trong vai trò của một DNA barcode [19], [20].
h. Trình tự hai gen trnH-psbA
Gen trnH-psbA có kích thƣớc trung bình khoảng 450 bp, nhƣng thay đổi
từ 296 đến 1120 bp, trnH-psbA đƣợc chứng minh là có khả năng xác định
loài cao. Locus trnH-psbA đã đƣợc khuếch đại thành cơng ở nhiều thực vật
hạt kín và hạt trần. Tuy nhiên, trong nhiều thực vật hạt kín trnH-psbA lại có
kích thƣớc rất ngắn (~ 300 bp), kích thƣớc của gen này thay đổi lớn do sự có
13


mặt của gen rpS19 hoặc các gen giả nằm giữa cùng gen của hai gen trnH và
psbA. Trong nhiều nghiên cứu gần đây đã đề xuất việc sử dụng trnH-psbA
nhƣ chỉ thị barcode độc lập cho thực vật hay kết hợp với matK. CBOL thấy
rằng khả năng phân biệt loài của trnH-psbA là cao nhất (69%) trong số 7
locus đƣợc thử nghiệm và do đó đề nghị nó nhƣ là chỉ thị barode bổ sung.
trnH-psbA có thể sử dụng trong hệ thống barcode ba locus khi hệ thống
barcode hai locus khơng cung cấp đầy đủ khả năng phân tích [17], [20].

i. Trình tự hai gen trnL(UAA)-trnF(GAA)
Locus trnL(UAA)-trnF(FAA) chứa gen trnL(UAA), vùng intron và vùng
nằm giữa hai gen trnL(UAA) và trnF(GAA). Taberlet và đồng tác giả là nhóm
nghiên cứu đầu tiên sử dụng trnL trong các nghiên cứu hệ thống học thực vật.
Vùng khơng mã hố trnL(UAA) và trnF(GAA) khơng phải là vùng có sự biến
đổi lớn nhất của DNA lục lạp nhƣng có ƣu thế nhƣ cấu trúc bậc 2 với vùng
biến đổi và vùng bảo thủ xen kẽ nhau. Điều này tạo thuận lợi cho các nghiên
cứu tìm kiếm trình tự nucleotide ở các vùng bảo thủ để thiết kế mồi và sử
dụng kỹ thuật PCR để khuếch đại các đoạn gen ở vùng biến đổi. Trong nghiên
cứu để xác định trnL(UAA) intron có nên đƣợc sử dụng làm vùng DNA
barcode, Taberlet (2007) đã sử dụng 100 loài thực vật và kết luận rằng trnL
intron có thể sử dụng nhƣ là một barcode của thực vật, trnL - trnF là một
barcode tiềm năng cho phân tích, xác định các loài thực vật [18], [20], [24].
1.2.3

n

n

N

r o

tr n th

v t

Mã vạch DNA thực vật đƣợc xem là một công cụ hữu hiệu trong việc
nhận diện và phân chia ranh giới giữa các lồi. Đồng thời hỗ trợ q trình
nhận diện các mẫu vật không nhận biết đƣợc hoặc chƣa xác định đƣợc thuộc

lồi nào.Vì vậy, hƣớng nghiên cứu DNA mã vạch đang đƣợc phát triển mạnh
mẽ và đƣợc ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực liên quan đến việc thực
hiện hoặc sử dụng nhận dạng thực vật nhƣ phân loại học, sinh thái học, bảo vệ
môi trƣờng, lâm nghiệp, nơng nghiệp, hải quan, kiểm dịch và trong nhiều tình
huống cần xác định “nhóm lồi”.
14


Sử dụng DNA barcode để nhận dạng các loài trên quy mơ tồn cầu có ý
nghĩa ngày càng lớn.Theo barcode of Life Data Systems, năm 2011 đã lƣu
trữ đƣợc hơn 1.100.000 DNA barcode từ hơn 95.000 đối tƣợng sinh vật khác
nhau. Đã có hơn 180.000 trình tự DNA barcode của thực vật đƣợc lƣu trữ
trong Ngân hàng gen quốc tế và liên kết với hơn 2.000 bài báo khác nhau. Để
chuẩn hóa ở mức độ quốc tế và việc sử dụng DNA barcode, cộng đồng khoa
học đã nỗ lực trong việc tìm kiếm các vùng trình tự DNA có thể làm mã vạch
có thể phân biệt đồng thời nhiều lồi [2], [5], [6]. Có khoảng 29.000 lồi cây
trồng đƣợc bảo hộ trong Công ƣớc CITES, và việc phát triển các phƣơng
pháp hiệu quả để phân biệt loài nằm trong danh sách CITES với những lồi
khơng nằm trong danh sách CITES.
DNA mã vạch đƣợc sử dụng để tăng cƣờng sự hiểu biết các lồi thực
vật có hạt, hoặc thơng qua đó đóng góp đến sự khám phá các lồi ẩn
danh[19]. Phƣơng pháp tiếp cận mã vạch DNA cũng đã cung cấp các thơng
tin hữu ích về những bí ẩn trong đa dạng lồi của các nhóm thực vật
Bryothytes (Rêu) [20]. Ngồi ra, DNA mã vạch còn đƣợc sử dụng để xác định
các rễ cây, cây giống hoặc giai đoạn sống chƣa rõ (ví dụ nhƣ cây Dƣơng xỉ
Gametophytes).
Nghiên cứu DNA mã vạch thực vật đã vƣợt xa nhiệm vụ so sánh các
vùng DNA khác nhau để tiến tới những ứng dụng thực tế hơn. Bằng cách so
sánh mã vạch DNA ở một vài sinh vật khác với các mã vạch đã đƣợc biên
soạn trong thƣ viện thơng tin, có thể giúp nhận diện loài, xác định các loài

mới hoặc các loài quý hiếm.Các nhà khoa học đã có những nghiên cứu, ứng
dụng đầy hứa hẹn, mở ra một triển vọng mới cho công tác đánh giá, phân loại,
quản lý và bảo tồn đa dạng sinh học.

15


CHƯƠNG 2 MỤC TIÊU, NỘI UNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN C U
21 M

ti u n hi n ứu

Phân lập đƣợc các đoạn gen matK, rbcL, trnH-psbA của loài Keo Lai
(Acacia auriculiformis mangium,Acacia hybrid).
2 2 Nội un n hi n ứu
- Tách chiết, tinh sạch DNA tổng số từ mẫu lá cây Keo Lai.
- Nhân bản các đoạn gen matK, rbcL, trnH-psbA
- Xác định và phân tích trình tự nucleotide của đoạn gen.
- Xác định mối quan hệ di truyền của cây Keo Lai.
2.3. V t liệu, hóa chất, các thiết bị sử d ng trong nghiên cứu
2.3.1.Vật liệu nghiên cứu

Lá cây Keo Lai (Acacia auriculiformis mangium, Acacia hybrid) đƣợc
thu thập tại vƣờn Quốc Gia Ba Vì
Bảng 2.1. Kí hiệu các mẫu Keo Lai sử dụng cho nghiên cứu
Ký hiệu

Chú giải

BV10.01

Keo lai mẫu số 1

BV10.02

Keo lai mẫu số 2

BV10.03

Keo lai mẫu số 3

2.3.2. Hóa chất
2.3.2.1. Hóa chất tách
- Đệm tách A (EBA- Extraction Buffer A): pha 100ml

16


Bảng 2.2. Thành phần đệm tách A (100ml)
STT

Thành phần

1

2%(w/v) CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide)

2,0g

2

100mM Tris (pH 8,0) (use 1M stock)

10ml

3

20mM EDTA (use 0,5M stock)

1ml

4

1,4M NaCl

8,2g

5

4%(w/v) PVP (polyvinyl pyrrolidone)

4,0g

6

0,1%(w/v) ascobic acid

0,1g

7

10mM β-mereaptoethanol (BME)* (use 14,3M stock)

70µl

- Đệm tách B (EBB- Extraction Buffer B): pha 100ml
Bảng 2.3. Thành phần đệm tách B (100ml)
STT

Thành phần

1

100mM Tris HCl (pH 8,0) (use 1M stock)

10ml

2

50mM EDTA (use 0,5M stock)

2,5ml

3

100mM NaCl

0,6g

4

10mM β-mereaptoethanol (BME)* (use 14,3M stock)

70µl

- Đệm TE (TE Buffer)
Bảng 2.4. Thành phần đệm TE (100ml)
STT

Thành phần

1

10mM Tris (pH 8,0) (use 1M stock)

1,0ml

2

1mM EDTA (use 0,5M stock)

50ml



Cá hó

hất khá :



20% SDS (sodium đoecyl sulphate).



5M CH COOK (bảo quản ở -20OC).



3M CH COONa (pH 5,2).

3

3

17




70% ethanol.



100% isopropanol.



Nƣớc deion.



DNA khn.



Mồi (F-Primer, R-Primer ).



Bộ hóa chất PCR: 2X PCR Master Mix Solution và hóa chất sử dụng
trong điện di RedSafe.



Hoá hất hạy điện i:
Điện di gel agarose gồm các hoá chất: TAE, agarose, thuốc nhuộm

Redsafe…
233

n

v thiết ị sử
n

đư

sử

n tron n hi n ứu



Một s

n tron n hi n ứu:



Pipet 0,5-10µl, 2-20µl, 10-100µl, 20-200µl, 100-1000µl.



Đầu tipe (10µl, 200µl, 1000µl).



Ống eppendorf 1,5ml, 20010µl



Một s thiết ị hính đư



Bể ổn nhiệt



Cân kỹ thuật điện tử



Máy ly tâm lạnh



Máy voltex



Lò vi sóng



Thiết bị chạy điện di



Máy nhân gen PCR ( 9700; 9800 Fast PCR)



Máy soi gel

sử

n tron n hi n ứu n y ồm :

2 4 Phư n pháp n hi n ứu
2.4.1. Tá h hiết N tổn s


Chuẩn ị

n



Dụng cụ, thiết bị:



Cối chày sứ

, thiết ị v hó

18

hất: