Tài liệu Tách dòng phân tử và xây dựng thư viện hệ gen pdf

Tách dòng phân t và xâyử
d ng th vi n h gen ự ư ệ ệ
Tách dòng phân t (molecular cloning) làử
khái ni m ch m t nhóm các ph ngệ ỉ ộ ươ
pháp đ c s d ng đ : i) phân l p m tượ ử ụ ể ậ ộ
m t trình t gen (ADN) đ c hi u t h nộ ự ặ ệ ừ ỗ
h p các phân t ADN ban đ u đ c táchợ ử ầ ượ
chi t t các m u sinh h c v n có c uế ừ ẫ ọ ố ấ
trúc ph c t p, kích th c l n; và ii)ứ ạ ướ ớ
khu ch đ i (sao chép) trình t lên m tế ạ ự ộ
s l ng l n đ đ có th ti n hànhố ượ ớ ủ ể ể ế
phân tích v c u trúc và ch c năng c aề ấ ứ ủ
gen t ng ng.ươ ứ

Kh năng tinh s ch các đo n gen (ADN)ả ạ ạ
đ c hi u có s l ng đ l n là c n thi tặ ệ ố ượ ủ ớ ầ ế
đ có th “thao tác” các đo n gen đó vìể ể ạ
các m c tiêu nghiên c u khác nhau.ụ ứ
Ch ng h n, t các phân đo n ADNẳ ạ ừ ạ
đ c tách dòng, ng i ta có th t o raượ ườ ể ạ
các phân t ADN tái t h p mang cácử ổ ợ
phân đo n ADN mang ngu n g c khácạ ồ ố
nhau. Các phân t ADN tái t h p m iử ổ ợ ớ
có th làm thay đ i m c đ bi u hi nể ổ ứ ộ ể ệ
bình th ng c a m t gen (ch ng h nườ ủ ộ ẳ ạ
b ng vi c dung h p gi a m t trình tằ ệ ợ ữ ộ ự
mã hóa c a m t loài này v i trình tủ ộ ớ ự
promoter c a m t loài khác) ho c th mủ ộ ặ ậ
chí mã hóa t ng h p m t lo i proteinổ ợ ộ ạ
“dung h p” m i (protein lai) mang cácợ ớ
trình t axit amin t các protein có ngu nự ừ ồ

g c khác nhau. Hi n nay, các k thu tố ệ ỹ ậ
tách dòng phân t (bao g m c PCR) đãử ồ ả
tr thành các công c thi t y u trongở ụ ế ế
nghiên c u v s đi u hòa và bi u hi nứ ề ự ề ể ệ
c a các gen và h gen các loài sinh v tủ ệ ở ậ
khác nhau.
Quá trình tách dòng ADN và t o nên cácạ
phân t ADN tái t h p đi n hìnhử ổ ợ ể
th ng liên quan đ n vi c s d ng cácườ ế ệ ử ụ
véct là trình t mang thông tin đi uơ ự ề
khi n ho t đ ng nhân lên (khu ch đ i)ể ạ ộ ế ạ
và/ho c bi u hi n trong t bào c a phânặ ể ệ ế ủ
t ADN tái t h p mang đo n ADN càiử ổ ợ ạ
(đo n trình t đ c phân l p) bao g mạ ự ượ ậ ồ
trình t gen đ c quan tâm nghiên c u.ự ượ ứ
Các “công c ” chính đ t o nên các phânụ ể ạ
t ADN tái t h p là các enzym gi i h nử ổ ợ ớ ạ
giúp c t các phân t ADN t i các v tríắ ử ạ ị
xác đ nh và các enzym n i cho phép ghépị ố
n i các phân đo n ADN có ngu n g cố ạ ồ ố
khác nhau v i nhau. B ng vi c t o nênớ ằ ệ ạ
các phân t ADN tái t h p có th tử ổ ợ ể ự
nh n lên trong t bào ch , m t đo nậ ế ủ ộ ạ
ADN cài xác đ nh nào đó có th đ cị ể ượ
phân l p, tinh s ch và nhân lên thànhậ ạ
m t s l ng l n các b n sao.ộ ố ượ ớ ả
Ti p theo đây, chúng ta s mô t b ngế ẽ ả ằ
cách nào các phân t ADN đ c c t, táiử ượ ắ
t h p và nhân lên, đ ng th i đ c pổ ợ ồ ờ ề ậ
đ n vi c xây d ng th vi n h gen g mế ệ ự ư ệ ệ ồ

t p h p các phân t ADN lai ch a cácậ ợ ử ứ
đo n cài xu t phát t m t h gen c nạ ấ ừ ộ ệ ầ
đ c thi t l p đ ph c v cho vi cượ ế ậ ể ụ ụ ệ
nghiên c u, phân tích m t h gen. Thôngứ ộ ệ
th ng m t th vi n h gen đ c thi tườ ộ ư ệ ệ ượ ế
l p b ng vi c s d ng chung cùng m tậ ằ ệ ử ụ ộ
lo i véct mang các phân đo n ADN càiạ ơ ạ
khác nhau. Chúng ta s th y b ng cáchẽ ấ ằ
nào các phân đo n ADN đ c hi u có thạ ặ ệ ể
đ c xác đ nh và phân l p t các thượ ị ậ ừ ư
vi n h gen.ệ ệ
Tách dòng ADN trong các véct plasmitơ
Sau khi m t phân đo n ADN đ c c tộ ạ ượ ắ
kh i m t phân t ADN có kích th cỏ ộ ử ướ
l n h n b ng enzym gi i h n, phânớ ơ ằ ớ ạ
đo n ADN đó c n đ c “cài” vào m tạ ầ ượ ộ
véct đ có th nhân lên. Hay nói cáchơ ể ể
khác là m t phân đo n ADN c n đ cộ ạ ầ ượ
cài vào m t phân t ADN th hai (véct )ộ ử ứ ơ
đ có th nhân lên đ c trong t bàoể ể ượ ế
ch nh đã nói trên. Cho đ n nay, tủ ư ở ế ế
bào ch đ c s d ng r ng rãi nh t đủ ượ ử ụ ộ ấ ể
nhân lên các đo n ADN trong công nghạ ệ
ADN tái t h p là vi khu nổ ợ ẩ
E. coli.
Các véct ADN đi n hình th ng có 3ơ ể ườ
đ c tính:ặ
1) Chúng ph i ch a m t trình t kh iả ứ ộ ự ở
đ u sao chép (tái b n), cho phép chúngầ ả
t sao chép đ c l p v i nhi m s c thự ộ ậ ớ ễ ắ ể

c a t bào ch .ủ ế ủ
2) Chúng ph i mang m t d u chu nả ộ ấ ẩ
ch n l c cho phép d dàng xác đ nh vàọ ọ ễ ị
phân l p đ c các t bào mang véct táiậ ượ ế ơ
t h p (mang đo n ADN cài) v i các tổ ợ ạ ớ ế
bào không mang véct tái t h p.ơ ổ ợ
3) Có v trí c t c a m t ho c nhi uị ắ ủ ộ ặ ề
enzym gi i h n khác nhau. Đây chính làớ ạ
v trí cài c a phân đo n ADN c n táchị ủ ạ ầ
dòng vào véct .ơ
Véct tách dòng ph bi n nh t là cácơ ổ ế ấ
phân t ADN s i kép, m ch vòng kíchử ợ ạ
th c nh (kho ng 3 kb) đ c g i làướ ỏ ả ượ ọ
các plasmit. Các véct này ph n l n cóơ ầ ớ
ngu n g c t các loài vi khu n và m tồ ố ừ ẩ ộ
s t các sinh v t nhân chu n đ n bàoố ừ ậ ẩ ơ
(n m men). Trong nhi u tr ng h p, cácấ ề ườ ợ
phân t ADN này trong t nhiên đã mangử ự
s n các gen mã hóa tính kháng ch tẵ ấ
kháng sinh. Nh v y, các plasmid trongư ậ
t nhiên đã có s n hai thu c tính là: khự ẵ ộ ả
năng t sao chép trong t bào ch và cóự ế ủ
trình t d u chu n ch n l c. Ngoài ra,ự ấ ẩ ọ ọ
các véct plasmit còn m t u đi m n aơ ộ ư ể ữ
là chúng có th đ ng th i t n t i nhi uể ồ ờ ồ ạ ề
b n sao trong t bào. Đi u này có thả ế ề ể
giúp khu ch đ i và phân l p đ c m tế ạ ậ ượ ộ
s l ng l n m t phân đo n ADN nàoố ượ ớ ộ ạ
đó t m t qu n th t bào nh .ừ ộ ầ ể ế ỏ
Tr c đây, m t s véct plasmit ch cóướ ộ ố ơ ỉ

m t v trí c t c a enzym gi i h n duyộ ị ắ ủ ớ ạ
nh t. Cùng v i th i gian, c u trúc c aấ ớ ờ ấ ủ
các véct plasmit đ c c i ti n theoơ ượ ả ế
h ng c t b b t các trình t không c nướ ắ ỏ ớ ự ầ
thi t và g n thêm vào đo n trình t cóế ắ ạ ự
th đ c c t b ng nhi u lo i enzymể ượ ắ ằ ề ạ
gi i h n khác nhau. V trí trên véctớ ạ ị ơ
mang đo n trình t nh v y đ c g i làạ ự ư ậ ượ ọ
v trí đa tách dòng (polycloning site). Cóị
nh ng v trí đa tách dòng hi n nay cóữ ị ệ
kích th c ng n nh ng có th đ c c tướ ắ ư ể ượ ắ
b i trên 20 lo i enzym gi i h n khácở ạ ớ ạ
nhau. Nh đ c tính này, m t véct cóờ ặ ộ ơ
th đ c dùng đ tách dòng nhi u phânể ượ ể ề
đo n ADN có ngu n g c khác nhau.ạ ồ ố
Trên c s các nguyên t c t ng t ,ơ ở ắ ươ ự
ngoài véct plasmit, hi n nay ng i ta đãơ ệ ườ
phát tri n đ c nhi u lo i véct khácể ượ ề ạ ơ
nhau có ngu n g c phag , ho c lai gi aồ ố ơ ặ ữ
vi khu n - phag (nh phagemid, cosmidẩ ơ ư
P), ho c có ngu n g c t n m men (víặ ồ ố ừ ấ
d : YAC).ụ
Vi c cài m t phân đo n ADN vào m tệ ộ ạ ộ
véct th ng là m t công vi c t ngơ ườ ộ ệ ươ
đ i đ n gi n. Ng i ta th ng s d ngố ơ ả ườ ườ ử ụ
cùng m t lo i enzym gi i h n đ c tộ ạ ớ ạ ể ắ
véct và đo n ADN cài. Ch ng h n nhơ ạ ẳ ạ ư
vi c s d ng enzym EcoRI s c t vàệ ử ụ ẽ ắ
chuy n véct t d ng “vòng” sang d ngể ơ ừ ạ ạ
“m ch th ng” có hai đ u dính. Do đ cạ ẳ ầ ượ

c t b i cùng enzym gi i h n, nên đo nắ ở ớ ạ ạ
ADN cài cũng có hai đ u dính v i trìnhầ ớ
t b tr v i trình t đ u dính c aự ổ ợ ớ ự ầ ủ
véct . Các đ u dính này s liên k tơ ầ ẽ ế
véct và đo n ADN cài l i v i nhau hìnhơ ạ ạ ớ
thành nên m t phân t ADN m ch vòngộ ử ạ
m i (phân t ADN tái t h p) ch cònớ ử ổ ợ ỉ
thi u hai liên k t phosphodieste duy nh tế ế ấ
còn l i m i m ch. Hai liên k t này sạ ở ỗ ạ ế ẽ
đ c “hàn” kín nh s d ng enzymượ ờ ử ụ