Luận án Tiến sĩ Y học: Nghiên cứu ứng dụng quy trình thu thập, xử lý, bảo quản tế bào gốc máu dây rốn cộng đồng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

ĐẶNG THỊ THU HẰNG

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG QUY TRÌNH
THU THẬP, XỬ LÝ, BẢO QUẢN TẾ BÀO GỐC
MÁU DÂY RỐN CỘNG ĐỒNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

HÀ NỘI - 2020


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

ĐẶNG THỊ THU HẰNG

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG QUY TRÌNH
THU THẬP, XỬ LÝ, BẢO QUẢN TẾ BÀO GỐC
MÁU DÂY RỐN CỘNG ĐỒNG
Chuyên ngành : Huyết học – Truyền máu
Mã số

: 62720151

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. GS.TS. NGUYỄN ANH TRÍ
2. TS. BS. TRẦN NGỌC QUẾ

HÀ NỘI - 2020


LỜI CẢM ƠN
Trong q trình học tập và hồn thành luận án, tôi đã nhận được nhiều sự
hướng dẫn chỉ bảo tận tình, tâm huyết, trách nhiệm và những sự động viên
nhiệt tình từ các Thầy, Cơ, các anh chị bác sĩ, cử nhân kỹ thuật, kỹ thuật viên,
điều dưỡng viên, bạn bè và gia đình, đặc biệt những những sản phụ hiến tế
bào gốc máu dây rốn đã cho tơi những số liệu q giá. Với tình cảm và sự biết
ơn sâu sắc, tơi xin kính gửi lời cám ơn chân thành đến:
- Đảng ủy, Ban Giám hiệu, Phòng Quản lý Đào tạo Sau đại học, Bộ môn
Huyết học - Truyền máu, Trường Đại học Y Hà Nội đã đào tạo, dạy dỗ và
giúp đỡ để tơi hồn thành chương trình học tập và luận án Tiến sĩ;
- Đảng ủy, Ban Lãnh đạo Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương, các
khoa/phòng của Viện đã ủng hộ và tạo mọi điều kiện cho tơi trong q trình
cơng tác, học tập và thực hiện đề tài nghiên cứu.
- Đảng ủy, Ban Giám hiệu Trường Đại học Y Dược Thái Bình, Bộ môn
Huyết học Truyền máu, Khoa Huyết học trường Đại học Y Dược Thái Bình,
đã ủng hộ và tạo mọi điều kiện cho tơi trong q trình cơng tác, học tập và
thực hiện đề tài nghiên cứu.
- Đảng ủy, Ban Lãnh đạo Viện Phụ sản Hà Nội, đặc biệt khoa C3 đã thu
thập mẫu máu dây rốn, tạo điều kiện cho tơi trong q trình cơng tác, học tập
và thực hiện đề tài nghiên cứu.

- Với lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cám ơn
GS.TS. Nguyễn Anh Trí – Nguyên Viện trưởng Viện Huyết học - Truyền máu
Trung ương. Thầy đã tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất ngay từ khi em bắt đầu
nhận đề tài. Thầy ln tâm huyết, tận tình chỉ bảo, truyền đạt cho em những
kiến thức cũng như phương pháp làm việc và những sáng tạo trong nghiên
cứu khoa học vô cùng quý giá. Thầy luôn động viên và tạo điều kiện tốt nhất
cho em trong suốt quá trình thực hiện luận án.
- Với lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cám ơn TS.
Trần Ngọc Quế - Giám đốc Ngân hàng Tế bào gốc, Viện Huyết học - Truyền
máu Trung ương, người Thầy đã hướng dẫn giúp đỡ và dìu dắt em từ khi bắt
đầu thực hiện luận án. Thầy luôn tạo mọi điều kiện, luôn động viên, khích lệ,


chỉ bảo tỉ mỉ, tận tình, giảng dạy những kiến thức chuyên sâu trong lĩnh vực
nghiên cứu và định hướng trong q trình nghiên cứu để em tự tin hồn thành
luận án.
- Với lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cám ơn
GS.TS. Phạm Quang Vinh – Nguyên Chủ nhiệm Bộ môn Huyết học - Truyền
máu, Trường Đại học Y Hà Nội, người Thầy đã dìu dắt em từ khi em thực hiện
luận văn thạc sĩ. Thầy ln động viên, giúp đỡ để em có được những kiến thức
giá trị, định hướng nghiên cứu, tạo điều kiện và đóng góp những ý kiến rất quý
báu cho em trong suốt thời gian học tập và thực hiện nghiên cứu này.
- Tôi xin chân thành cảm ơn các bác sĩ, các anh chị em cử nhân, điều
dưỡng… làm việc tại Ngân hàng Tế bào gốc, Viện Huyết học Truyền máu –
Trung ương, những người luôn sát cánh, động viên, giúp đỡ tơi nhiệt tình. Nơi
đây như cơ quan làm việc thứ 2 trong cuộc đời tôi.
- Tôi gửi lòng biết ơn sâu sắc tới những sản phụ và thai nhi đã hiến tặng
các mẫu máu quý giá để tôi thực hiện thành công đề tài.
Xin được cảm ơn chân thành nhất tới các anh, chị, em đồng nghiệp và
bạn bè đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ, luôn quan tâm, động viên, chia sẻ,

thường xun khích lệ tơi trong suốt q trình học tập, nghiên cứu và hồn
thành luận án.
Nhân dịp này, Con xin được tỏ lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới
Cha, Mẹ, xin được trân trọng cảm ơn các anh, các chị, các em và những người
thân trong gia đình, trong họ tộc Nội, Ngoại đã luôn động viên, cổ vũ để con
học tập, phấn đấu và trưởng thành trong cuộc sống và sự nghiệp. Cám ơn
Chồng và hai con thân yêu đã hy sinh rất nhiều cả tâm, sức, thời gian, tiền bạc
và là nguồn sức mạnh thôi thúc để tôi phấn đấu vươn lên, chuyên tâm học tập
và nghiên cứu.
Xin trân trọng cảm ơn!
Hà Nội, ngày 2 tháng 12 năm 2020
Học viên
Đặng Thị Thu Hằng


LỜI CAM ĐOAN

Tôi là Đặng Thị Thu Hằng nghiên cứu sinh khóa 35 Trường Đại học Y
Hà Nội, chuyên ngành Huyết học và Truyền máu, xin cam đoan:
1. Đây là cơng trình nghiên cứu do tơi tham gia và trực tiếp thu thập số
liệu, thực hiện dưới sự hướng dẫn của Thầy Nguyễn Anh Trí và Thầy Trần
Ngọc Quế
2. Luận án này không trùng lặp với bất kỳ luận án nghiên cứu nào khác
đã được công bố tại Việt Nam.
3. Các số liệu và thông tin trong luận án là hồn tồn chính xác, trung
thực và khách quan, đã được thông qua hội đồng đạo đức trường Đại học Y
Hà Nội và có xác nhận và chấp thuận của cơ sở nơi nghiên cứu.
Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này.

Hà Nội, ngày 2 tháng 12 năm 2020

Tác giả luận án

Đặng Thị Thu Hằng


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Ý nghĩa

Viết tắt
AT

Adipose tissue

Mô mỡ

BM

Bone marrow

Tủy xương

BFU-E

Burst Forming Unit - Erythrocyte

Đơn vị tạo cụm hồng cầu lớn

CD

Cluster of diffirentiation antigens

Kháng nguyên biệt hóa

CFU-E

Colony Forming Unit - Erythocyte

Đơn vị tạo cụm hồng cầu nhỏ

CFUGEMM

Colony forming unitgranulocyte/erythrocyte/monocyte/ Đơn vị tạo cụm hỗn hợp
megakaryocyte

CFU-

Colony Forming Unit - Granulocyte/ Đơn vị tạo cụm dòng hạt-đại

GM

Macrophage

thực bào

CIBMTR Center for International Blood and Trung tâm nghiên cứu về máu
Marrow Transplant Research

và ghép tủy thế giới

CMV

Cytomegalovirus

Virus Cytomegalo

CXCR4

C-X-C chemokine receptor type 4

Receptor loại 4 của C-X-C

FHCRC

The

Fred

Hutchinson

Research Center
G-CSF

Granulocyte

Cancer Trung tâm nghiên cứu ung
thư Fred Hutchinson

colony-stimulating Yếu tố tăng trưởng bạch cầu

factor

hạt

GVHD

Graft versus host disease

Bệnh ghép chống chủ

HBV

Hepatitis B virus

virus viêm gan B

HGB

Hemoglobin

Huyết sắc tố

HCV

Hepatitis C virus

Virus viêm gan C

HES

Hydroxyethyl Starch

Dung dịch cao phân tử


HIV

Human immunodeficiency virus

Virus gây suy giảm miễn
dịch ở người

HLA

Human leukocyte antigen

Kháng

nguyên

bạch

cầu

người
JMDP

The Japan Marrow Donor Program

Chương trình hiến tủy của
Nhật Bản

KN

Kháng ngun

KT

Kháng thể

MCV

Mean corpuscular volume

Thể tích trung bình hồng cầu

MDR

Umbilical cord blood

Máu dây rốn

MPB

Mobilized peripheral blood

Máu ngoại vi ssau huy động

MSC

Mesenchymal stem cell

Tế bào gốc trung mô

NK

Natural killer

Tế bào diệt tự nhiên

NMDP

United Stated National Marrow Chương trình hiến tủy quốc
Donor Program

gia Hoa Kỳ

TB

Tế bào

TBCN

Tế bào có nhân

TBG

Tế bào gốc

XN

Xét nghiệm


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................... 3
1.1. Đặc điểm của dây rốn, bánh rau và tế bào gốc máu dây rốn ..................... 3
1.1.1. Đặc điểm của dây rốn và bánh rau .......................................................... 3
1.1.2. Đặc điểm của tế bào gốc máu dây rốn .................................................... 4
1.2. Tạo nguồn tế bào gốc từ máu dây rốn ...................................................... 11
1.2.1. Quy trình thu thập, xử lý và bảo quản máu dây rốn ............................. 11
1.2.2. Các loại hình ngân hàng máu dây rốn ................................................... 14
1.2.3. Tìm kiếm tế bào gốc máu dây rốn cho ghép ......................................... 17
1.3. Ứng dụng nguồn tế bào gốc từ máu dây rốn ............................................ 23
1.3.1. Ứng dụng ghép máu dây rốn trong các bệnh lý huyết học ................... 23
1.3.2. Ứng dụng của TBG máu dây rốn trong y học tái tạo ............................ 24
1.3.3. Một số hình thức ghép tế bào gốc máu dây rốn trong điều trị bệnh lý ....... 25
1.4. Tình hình nghiên cứu tế bào gốc máu dây rốn trong và ngồi nước ....... 28
1.4.1. Tình hình nghiên cứu tế bào gốc máu dây rốn trên thế giới ................. 28
1.4.2. Tình hình nghiên cứu tế bào gốc máu dây rốn tại Việt Nam ................ 32
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......... 37
2.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................... 37
2.2. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 38
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu ............................................................................... 38
2.2.2. Quy trình nghiên cứu ............................................................................ 38
2.2.3. Các xét nghiệm thực hiện...................................................................... 41
2.2.4. Các biến số nghiên cứu ......................................................................... 44
2.3. Phương tiện, vật liệu và các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu ............. 45
2.3.1. Các trang thiết bị ................................................................................... 45
2.3.2. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................... 46

2.3.3. Hóa chất, sinh phẩm .............................................................................. 46
2.4. Các kỹ thuật thực hiện trong nghiên cứu ................................................. 47
2.4.1. Quy trình thu thập máu dây rốn ............................................................ 47
2.4.2. Quy trình xử lý máu dây rốn bằng để lắng có HES ly tâm 1 lần .......... 48
2.4.3. Quy trình bảo quản khối tế bào gốc sau xử lý bằng nitơ lỏng .............. 49
2.4.4. Quy trình đếm CD34 bằng máy Beckman Coulter FC500 ................... 50
2.4.5. Quy trình xét nghiệm HLA bằng kỹ thuật PCR-SSO ........................... 51
2.4.6. Quy trình ni cấy tạo cụm tế bào ........................................................ 52
2.4.7. Quy trình rã đơng đơn vị tế bào gốc ..................................................... 53
2.5. Địa điểm nghiên cứu ................................................................................ 54
2.6. Xử lý số liệu ............................................................................................. 54
2.7. Đạo đức nghiên cứu ................................................................................. 55
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ................................................... 57
3.1. Một số đặc điểm sản phụ và thai nhi của các đơn vị MDR được bảo quản ... 57
3.2. Kết quả thu thập, xử lý, bảo quản máu dây rốn cộng đồng ..................... 59
3.2.1. Kết quả thu thập máu dây rốn ............................................................... 59
3.2.2. Kết quả xử lý và bảo quản..................................................................... 62
3.3. Một số yếu tố liên quan đến chất lượng và khả năng sử dụng đơn vị TBG
MDR cộng đồng .............................................................................................. 66
3.3.1. Một số yếu tố liên quan đến chất lượng đơn vị TBG MDR cộng đồng...... 66
3.3.2. Khả năng sử dụng đơn vị TBG MDR cộng đồng ................................. 81
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN ............................................................................ 89
4.1. Một số đặc điểm sản phụ và thai nhi của các đơn vị MDR được lựa chọn ... 89
4.2. Kết quả thu thập, xử lý, bảo quản máu dây rốn cộng đồng ..................... 93
4.2.1. Kết quả thu thập máu dây rốn ............................................................... 93
4.2.2. Kết quả xử lý và bảo quản..................................................................... 98
4.3. Một số yếu tố liên quan đến chất lượng và khả năng sử dụng đơn vị TBG
MDR cộng đồng ............................................................................................ 109

4.3.1. Một số yếu tố liên quan đến chất lượng đơn vị TBG MDR cộng đồng.... 109
4.3.2. Khả năng sử dụng đơn vị TBG MDR cộng đồng ............................... 115
KẾT LUẬN .................................................................................................. 122
KIẾN NGHỊ ................................................................................................. 125
DANH DÁCH CÁC BÀI BÁO VÀ CƠNG TRÌNH LIÊN QUAN
ĐẾN NỘI DUNG LUẬN ÁN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC 1
PHỤ LỤC 2


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Một số đặc điểm sản phụ của TBG MDR được lưu trữ ................ 57
Bảng 3.2. Phân bố dân tộc của sản phụ .......................................................... 57
Bảng 3.3. Hình thức sinh của sản phụ ............................................................ 57
Bảng 3.4. Một số đặc điểm thai nhi của TBG MDR lưu trữ .......................... 58
Bảng 3.5. Tỷ lệ theo giới tính trẻ sơ sinh ....................................................... 58
Bảng 3.6. Một số đặc điểm dây rốn, bánh rau ............................................... 58
Bảng 3.7. Kết quả chung thu thập, xử lý MDR cộng đồng............................. 59
Bảng 3.8. Nguyên nhân loại túi máu dây rốn sau thu thập ............................. 59
Bảng 3.9. Nguyên nhân loại đơn vị tế bào gốc sau xử lý ............................... 60
Bảng 3.10. Một số đặc điểm của mẫu máu dây rốn trước xử lý .................... 60
Bảng 3.11. Tỷ lệ thể tích máu dây rốn trước xử lý ........................................ 61
Bảng 3.12. Đặc điểm tế bào bạch cầu trong túi máu dây rốn trước xử lý ..... 61
Bảng 3.13. Đặc điểm hồng cầu và tiểu cầu trong túi máu dây rốn trước xử lý .... 61
Bảng 3.14. Một số thông số đơn vị TBG lưu trữ ........................................... 62
Bảng 3.15. Tỷ lệ trung bình các thành phần loại bỏ sau ly tâm ..................... 62
Bảng 3.16. Thành phần tế bào máu trong túi TBG lưu trữ ............................ 63

Bảng 3.17. Tỷ lệ nhóm máu đơn vị tế bào gốc lưu trữ .................................. 63
Bảng 3.18. Đặc điểm thành phần huyết sắc tố đơn vị TBG MDR lưu trữ .... 64
Bảng 3.19. Đặc điểm tế bào máu của đơn vị TBG MDR trước và sau rã đông..... 64
Bảng 3.20. Thành phần tế bào trong đơn vị TBG MDR trước và sau rã đông ...... 65
Bảng 3.21. Kết quả cấy cụm sau bảo quản đông lạnh .................................... 65
Bảng 3.22. Liên quan giữa một số yếu tố của mẹ với thể tích mẫu máu dây rốn .. 66
Bảng 3.23. Liên quan giữa một số yếu tố thai nhi với thể tích MDR ............ 67
Bảng 3.24. Liên quan giữa một số yếu tố mẹ với tổng số TBCN ................... 68
Bảng 3.25. Liên quan giữa một số yếu tố của thai nhi với tổng số TBCN .... 69
Bảng 3.26. Liên quan giữa một số yếu tố mẹ với TB CD34 .......................... 70
Bảng 3.27. Liên quan giữa một số yếu tố của trẻ với TB CD34 ................... 71


Bảng 3.28. Tỷ lệ các alen HLA ở mức độ phân giải thấp của từng locus ..... 81
Bảng 3.29. Tỷ lệ các alen HLA-A của mẫu nghiên cứu ................................ 82
Bảng 3.30. Tỷ lệ các alen HLA-B của mẫu nghiên cứu ................................ 83
Bảng 3.31. Tỷ lệ các alen HLA-DR của mẫu nghiên cứu ............................. 84
Bảng 3.32. Đặc điểm của bệnh nhân tìm kiếm .............................................. 87
Bảng 3.33. Tỷ lệ bệnh nhân tìm kiếm theo bệnh ............................................ 87
Bảng 3.34. Tỷ lệ bệnh nhân tìm thấy đơn vị TBG MDR hịa hợp HLA ........ 87
Bảng 3.35. Liều tế bào tìm kiếm được tương ứng với các mức hòa hợp ....... 88
Bảng 3.36. Số đơn vị TBG MDR đã ghép ...................................................... 88
Bảng 4.1. So sánh thể tích máu dây rốn trong nghiên cứu với một số tác giả
trong và ngoài nước ...................................................................... 96
Bảng 4.2. So sánh tổng số tế bào có nhân với một số nghiên cứu trong và
ngoài nước..................................................................................... 97
Bảng 4.3. So sánh chỉ số hồng cầu trong nghiên cứu với nghiên cứu của
Nelida I Noguera ........................................................................... 98
Bảng 4.4. So sánh hiệu suất xử lý trong nghiên cứu với một số nghiên cứu khác 100

DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1. Số lần sinh của sản phụ ............................................................. 58
Biểu đồ 3.2. Liên quan giữa thể tích máu dây rốn và tuổi sản phụ ............... 66
Biểu đồ 3.3. Liên quan thể tích máu dây rốn và trọng lượng thai ................. 67
Biểu đồ 3.4. Liên quan giữa số lượng TBCN và thể tích MDR trước xử lý .. 72
Biểu đồ 3.5. Liên quan giữa số lượng TB CD34 và thể tích MDR ............... 72
Biểu đồ 3.6. Liên quan giữa hiệu suất xử lý và thể tích MDR thu được ....... 73
Biểu đồ 3.7. Liên quan giữa hiệu suất xử lý và số lượng TBCN ................... 73
Biểu đồ 3.8. Liên quan giữa hiệu suất xử lý và hematocrit ........................... 74
Biểu đồ 3.9. Liên quan giữa hiệu suất xử lý và thời gian lưu trước xử lý .... 74
Biểu đồ 3.10. Liên quan giữa hiệu suất xử lý và thời gian xử lý ................... 75
Biểu đồ 3.11. Liên quan giữa TB CD34 sống và thời gian chờ xử lý .......... 75
Biểu đồ 3.12. Liên quan giữa TB CD34 sống và thời gian xử lý .................. 76
Biểu đồ 3.13. Liên quan giữa tỷ lệ TB CD34 sống và số lượng TBCN ....... 76
Biểu đồ 3.14. Liên quan giữa TB CD34 và cụm sau rã đông ........................ 77
Biểu đồ 3.15. Liên quan giữa số lượng TBCN và cụm sau rã đông .............. 77
Biểu đồ 3.16. Mối liên quan giữa thời gian bảo quản và CFU-E .................. 78
Biểu đồ 3.17. Mối liên quan giữa thời gian bảo quản và BFU-E .................. 78
Biểu đồ 3.18. Mối liên quan giữa thời gian bảo quản và CFU-GM .............. 79
Biểu đồ 3.19. Mối liên quan giữa thời gian bảo quản và CFU-GEMM ........ 79
Biểu đồ 3.20. Mối liên quan giữa thời gian bảo quản và tổng số cụm ........... 80
Biểu đồ 3.21. Mối liên quan giữa thời gian bảo quản và tỷ lệ sống ............... 80
Biểu đồ 3.22. Xác xuất tìm kiếm ít nhất 1 đơn vị TBG MDR hòa hợp HLA
theo các cỡ mẫu lưu trữ................................................................. 85
Biểu đồ 3.23. Khả năng tìm kiếm đơn vị TBG MDR theo liều TBCN tối thiểu
2 x 107/kg ..................................................................................... 86
Biểu đồ 3.24. Khả năng tìm kiếm TBG MDR theo liều CD34 tối thiểu 1 x
105/kg ......................................................................................... 86
Biểu đồ 4.1. Tần suất gặp các alen HLA-A, B, DR trong nghiên cứu và tác giả

trong nước ................................................................................... 116


DANH MỤC HÌNH, SƠ ĐỒ
Hình 1.1. Rau thai và dây rốn chụp ngay sau khi sinh...................................... 4
Hình 1.2. Tế bào gốc có trong máu dây rốn...................................................... 4
Hình 1.3. Khả năng tự tái tạo và biệt hóa đa dịng của TBG MDR .................. 5
Hình 1.4. Kháng nguyên bề mặt của tế bào gốc tạo máu dây rốn .................... 9
Hình 1.5. Thu thập máu dây rốn trước sổ rau ................................................. 12
Hình 1.6. Quá trình xử lý máu dây rốn bằng phương pháp thủ cơng ............. 13
Hình 2.1. Các bước hạ nhiệt độ theo quy trình định sẵn................................. 40
Hình 2.2. Bước để lắng sau khi thêm dung dịch HES .................................... 49
Hình 2.3. Một số loại cụm phổ biến tạo thành sau quá trình nuôi cấy trên môi
trường methocult ........................................................................... 53
Sơ đồ 2.1. Quy trình xử lý và xét nghiệm máu dây rốn .................................. 43
Sơ đồ 2.2. Sơ đồ nghiên cứu ........................................................................... 56


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Ghép tế bào gốc (TBG) tạo máu đồng loài là phương pháp ngày càng
được sử dụng trong điều trị các bệnh máu. Phương pháp này nhiều khi đã trở
thành cứu cánh cuối cùng và hiệu quả cho bệnh nhân mắc bệnh hiểm nghèo
[1]. Trong ghép TBG tạo máu, thành công của cuộc ghép phần lớn phụ thuộc
vào sự phù hợp HLA giữa người cho và người nhận. Nguồn người hiến
trưởng thành là anh chị em cùng huyết thống là lựa chọn hàng đầu. Tuy nhiên,
nguồn này chỉ đáp ứng được phần nhỏ nhu cầu. Phần lớn người bệnh khơng
có nguồn người cho phù hợp [2].
Tại một số nước như Singapore, Australia… người ta đã huy động và

sử dụng ngân hàng người cho TBG qua đó có thể lựa chọn được người cho
khơng cùng huyết thống hịa hợp HLA. Tuy nhiên đến thời điểm này nhiều
nước trên thế giới trong đó có Việt Nam chưa thực hiện được. Do đó nguồn
TBG máu dây rốn (MDR) đã sử dụng thay thế cho nguồn người hiến trưởng
thành. MDR có thể cung cấp TBG và có ưu điểm khơng cần hịa hợp toàn bộ
hệ HLA cho cuộc ghép. Tuy nhiên hạn chế lớn nhất là số lượng TBG trong
MDR không nhiều, chỉ có một tỷ lệ đơn vị TBG MDR có thể đủ số lượng cho
ghép đồng loài người trưởng thành [3].
Ở Việt Nam đã có nhiều ngân hàng TBG MDR nhưng là ngân hàng tư
nhân như Ngân hàng của Bệnh viện Truyền máu – Huyết học Thành phố Hồ
Chí Minh, Bệnh viện Nhi trung ương, Bệnh viện Vinmec, MekoStem của
Dược phẩm Trung ương 2 (MekoPhar).... Đó là các ngân hàng thu thập, xử lý,
lưu trữ MDR theo yêu cầu người gửi và chỉ để dùng cho cá nhân họ, khơng có
khả năng sử dụng cho cộng đồng. Từ năm 2014, Viện Huyết học – Truyền
máu Trung ương đã triển khai xây dựng ngân hàng TBG MDR cộng đồng.
Tại đây diễn ra quá trình lựa chọn, xử lý và đưa vào bảo quản những đơn vị
TBG MDR của những người tình nguyện hiến tặng. Những đơn vị TBG này


2
được lựa chọn từ nguồn người hiến, từ kết quả của các bước xử lý, bảo quản
và được thực hiện các xét nghiệm đảm bảo chất lượng, xét nghiệm định danh
trong đó có xét nghiệm HLA. Qua mỗi bước sẽ lựa chọn và chỉ giữ lại các
đơn vị có thơng số tốt nhằm tạo một ngân hàng lưu trữ các đơn vị TBG có
chất lượng, có thơng tin miễn dịch để có thể cung cấp bất kỳ người bệnh nào
có nhu cầu ghép và bất kỳ thời điểm nào có yêu cầu.
Việc lựa chọn qua nhiều bước để tạo nên đơn vị TBG có chất lượng,
việc xét nghiệm HLA để có thơng tin miễn dịch đã tạo ra một ngân hàng có
hàng ngàn đơn vị TBG đã giải quyết được khó khăn trong tìm người nguồn
TBG hịa hợp HLA trong ghép TBG tạo máu đồng lồi. Tuy nhiên chưa có

nghiên cứu đánh giá tổng thể và toàn diện về chất lượng các đơn vị TBG
MDR cộng đồng, chưa có nhiều thông tin về khả năng sử dụng nguồn TBG
rất lớn này. Qua thực tế phân tích và sử dụng tại Viện chúng tôi thực hiện đề
tài với mục tiêu:
1.

Đánh giá quy trình thu thập, xử lý, bảo quản tế bào gốc máu dây rốn
cộng đồng tại Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương.

2.

Nghiên cứu một số yếu tố liên quan đến chất lượng và khả năng sử
dụng đơn vị tế bào gốc máu dây rốn cộng đồng.


3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Đặc điểm của dây rốn, bánh rau và tế bào gốc máu dây rốn
1.1.1. Đặc điểm của dây rốn và bánh rau
Dây rốn là dây kết nối thai nhi đang phát triển với rau thai. Dây rốn phát
triển từ túi nỗn hồng vào tuần thứ 5 của sự phát triển thai nhi và là nơi cung
cấp chất dinh dưỡng cho thai nhi thay cho túi noãn hoàng [4]. Khi kết thúc
thời kỳ mang thai dây rốn trung bình dài từ 50 – 60 cm và đường kính khoảng
2 cm [5]. Dây rốn chứa ba mạch máu, một tĩnh mạch và hai động mạch, cuộn
quanh tĩnh mạch theo cấu hình xoắn ốc [6].
Tĩnh mạch rau thai cung cấp cho thai nhi máu giàu oxy và dinh dưỡng.
Các động mạch đưa máu đã khử oxy dinh dưỡng trở lại rau thai. Ba mạch
máu được cách ly với một chất gelatin gọi là thạch Wharton, bảo vệ các mạch
này và ngăn chặn lực nén cơ học giữa chúng [7]. Dây rốn được kết nối với

thai nhi ở vùng bụng, sau khi sinh trở thành rốn. Khi ở trong bào thai, tĩnh
mạch của dây rốn chia thành hai nhánh, một nhánh nối với tĩnh mạch gan, dẫn
máu đến gan và nhánh thứ hai đến tĩnh mạch chủ ở tim thai nhi. Động mạch
dây rốn phân nhánh từ động mạch chậu trong của thai nhi, là động mạch
chính ở vùng chậu [8].
Rau thai là cơ quan kết nối thai nhi đang phát triển thông qua dây rốn với
thành tử cung của mẹ thực hiện các chức năng dinh dưỡng, hô hấp và bài tiết
Rau thai bắt đầu phát triển trong quá trình phơi nang làm tổ vào nội mạc tử
cung của mẹ và phát triển trong suốt thai kỳ. Về mặt giải phẫu, rau thai có
màu hạt dẻ sẫm và hình trịn phẳng, đường kính trung bình khoảng 20 cm và
dày 2,5 cm khi kết thúc thời kỳ mang thai (Hình 1). Rau thai được chia thành
hai phần, phần của thai nhi và phần của mẹ. Phần của thai nhi bao gồm các
lông nhung màng đệm, là những lông nhung hợp nhất từ màng đệm để tối đa


4

hóa vùng tiếp xúc với máu mẹ. Phần của mẹ chứa không gian xen kẽ, là
không gian giữa các nhung mao của thai nhi và các mạch máu của mẹ. Các
“bức tường” mỏng manh của nhung mao cho phép máu của thai nhi hấp thụ
các chất dinh dưỡng và oxy từ máu của mẹ và loại bỏ các chất thải vào đó mà
hai dịng máu khơng bị lẫn vào nhau [9],[10].

Hình 1.1. Rau thai và dây rốn chụp ngay sau khi sinh.
(Nguồn Hamad Ali (2012) Stem Cell Discovery Vol. 2 No. 1)

Hình 1.2. Tế bào gốc có trong máu dây rốn
1.1.2. Đặc điểm của tế bào gốc máu dây rốn
1.1.2.1. Đặc trưng cơ bản của tế bào gốc máu dây rốn
Đặc trưng cơ bản của TBG MDR cũng như các TBG tạo máu khác là

khả năng tự tái tạo, khả năng biệt hóa thành các TB trưởng thành và khả năng
phục hồi mơ tạo máu. Ngồi ra TBG MDR cịn có một số khả năng di chuyển,
từ cơ quan tạo máu ra máu ngoại vi và từ máu ngoại vi vào cơ quan tạo máu,


5
chúng có tính mềm dẻo trong biệt hóa và tn theo quy luật chết theo chương
trình [11]. TBG MDR có các đặc điểm sau:
Khả năng tự tái tạo (self renewal): TBG cung cấp liên tục các TB
máu trong suốt cuộc đời của một cá thể. Mỗi ngày hàng tỷ TB máu mới được
sản xuất ra trong cơ thể, và tất cả đều được bắt nguồn từ TBG tạo máu. Tế bào
gốc tạo máu trưởng thành có tuổi thọ giới hạn nên khả năng TBG tạo máu tự đổi
mới và tạo ra các tế bào máu mới cho đời sống của sinh vật là rất quan trọng để
duy trì sự sống. Vấn đề then chốt là sự tự đổi mới theo đúng chương trình sinh lý
của cơ thể.
Khả năng biệt hóa đa dịng (differentiation): TBG tạo máu tồn
năng (Totipotent hemopoietic stem cell) có khả năng biệt hóa thành tất cả các
tế bào máu, tạo ra các TBG định hướng đầu dòng, các TBG đa năng và đơn
năng để tạo thành từng loại tế bào chức năng như: hồng cầu, tiểu cầu, bạch
cầu hạt, lympho T… Trong trường hợp cần thiết thì TBG định hướng dịng
tủy có thể chuyển đổi thành định hướng dịng lympho và ngược lại.

Hình 1.3. Khả năng tự tái tạo và biệt hóa đa dịng của TBG MDR
Khả năng tái định cư (homing): Là hiện tượng các TBG khi truyền
vào cơ thể có thể di chuyển về tủy xương, ở đây chúng sẽ tăng sinh và biệt
hóa ra các tế bào máu. Có rất nhiều các chemokine và các receptor khác nhau


6
tham gia vào quá trình này. Nghiên cứu của David và cộng sự năm 2002 đã

chứng minh rằng GSCs và FSCs được gắn kết trong hốc tạo máu thông qua sự
kết dính tế bào E-cadherin [12]. Các nghiên cứu đã nhanh chóng được thực
hiện để tìm hiểu làm thế nào các phân tử bám dính có thể làm trung gian cho
sự tương tác giữa các TBG cũng như đóng vai trò quan trọng trong điều chỉnh
hoạt động của TBG. Dựa trên các kết quả từ các hệ thống nghiên cứu TBG
khác nhau, người ta thấy mặc dù nhiều phân tử kết dính cùng tham gia q
trình này nhưng họ cadherin và integrin đã trở thành các trung gian phổ biến
thích hợp cho hoạt động bám dính và neo giữ TBG. Do đó, tùy thuộc vào loại
tế bào, TBG có thể sử dụng cadherins, integrins, hoặc sự kết hợp với các phân
tử kết dính khác nhau để tương tác vật lý với hốc tạo máu. Sự tương tác nhờ
cadherin có thể làm cho các TBG trở nên thích hợp, cho phép tiếp xúc liên tục
với các tín hiệu ngắn và các tín hiệu phụ thuộc vào tế bào, do đó duy trì khả
năng tự tái tạo dài hạn. Sự kết dính TBG cũng có thể giúp các TBG được
ghép di chuyển vào các hốc thích hợp và thiết lập sự tương tác ổn định giữa
TBG và các hốc tạo máu [12].
1.1.2.2. Đặc điểm sinh học của tế bào gốc máu dây rốn
Tế bào gốc máu dây rốn là những tế bào có kích thước nhỏ, ngun
sinh chất hẹp. Nó có khả năng phát triển, tự tái sinh và biệt hóa thành các
dòng tế bào khác nhau trong cơ thể [13]. Trong MDR, khoảng 68% TBG
tạo máu nằm ở pha G0 của chu kỳ phân bào. Đây là trạng thái “lặng” của tế
bào, chúng hầu như khơng có sự trao đổi chất và cũng gần như khơng diễn
ra q trình tổng hợp protein. Do đó, các tế bào bắt màu rất yếu với các
thuốc nhuộm huỳnh quang như Rhodamine 123, Hochest 33342 hoặc
Pyronin Y [12].
Hoạt động của TBG là khi nó bắt đầu từ pha G0 sang pha G1. Sự hoạt
động này được đánh dấu bằng sự gia tăng quá trình phiên mã và tích lũy các
ARN thơng tin. Q trình ni cấy sẽ tạo ra các TBG có hình thái tương tự


7

như TBG tạo máu: là những tế bào tròn, nhân to, nguyên sinh chất hẹp, hạt
nhân to tròn.
1.1.2.3. Kháng nguyên bề mặt của tế bào gốc máu dây rốn
Cho đến nay, KN bề mặt CD34 được coi là dấu ấn duy nhất để xác định
TBG tạo máu. Tuy nhiên, trong tủy xương và MDR bề mặt các tế bào ngoài
KN CD34 cịn có các yếu tố quyết định KN khác. Các quyết định KN đó được
xác định qua các kỹ thuật như:
- Đếm tế bào dòng chảy để xác định sự hiện diện của dấu ấn CD34,
CD38 trên bề mặt tế bào;
- Phân tích các dấu ấn của các dịng tế bào trưởng thành (HLA-DR);
- Phân tích thụ thể tyrosine kinase c-kit và sử dụng kháng thể có gắn sẵn
màu fluorochromes để kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên tương ứng cần
nhận biết.
Như đã đề cập ở trên, một tính năng đặc trưng của tế bào tạo máu là sự
hiện diện của kháng nguyên CD34 trên bề mặt (TB CD34). Bản chất của
CD34 là một glycoprotein xuyên màng, có trọng lượng khoảng 104 - 120
kDa, thuộc họ phân tử bám dính được gọi là sialomucines. Cấu tạo gồm
một lõi protein chứa 6 đến 9 vị trí gắn với N-glycosyl và hơn 9 vị trí liên
kết với O-glycosyl. Trong tế bào chất, KN CD34 có hai vị trí cho sự
phosphoryl hóa của protein kinase C và một vị trí cho sự phosphoryl hóa
tyrosine. Do đó, chức năng của nó có liên quan đến sự dẫn truyền tín hiệu
qua màng tế bào và nó có vai trị trong việc bám dính của TBG tạo máu với
mô đệm tủy xương [13].
Xét nghiệm DNA cho thấy các tế bào biểu hiện các KN CD34+CD38- bị
ức chế thường trong pha G0. Các tế bào có KN CD34+CD38+ thường đang
trong pha S, pha G2/M, điều này phản ánh sự kích hoạt của chúng. Tế bào có
CD34+CD38- non hơn CD34+CD38+ [14]. Bên cạnh đó, một KN khác được
sử dụng để xác định mức độ trưởng thành là KN CD90, còn được gọi là Thy1.

8
Nó có trên bề mặt các tế bào non và vắng mặt trên các tế bào trưởng thành.
Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng số lượng TB CD34+CD90+ tương quan thuận
với số lượng tế bào CD34+ CD38-.
Các đồng KN CD117 và CD135 cũng được sử dụng để xác định sự
trưởng thành của tế bào CD34+. Hơn 60% tế bào CD34+ có thêm CD177
(được coi như receptor c-kit) trên bề mặt. Các tế bào non, đầu dòng thường
biểu hiện dấu ấn này ở mức độ thấp, các tế bào trưởng thành hơn thì dấu ấn
này có biểu hiện ở mức độ cao hơn. 90% TB CD34+ có dấu ấn CD135 (các
thuộc tính giống tyrosin kinase) và 25% có dấu ấn CD95 (chất điều hòa hoạt
động của TBG thời kỳ sớm) [13]. Ngồi ra cũng có CD71, nó được coi là
receptor vận chuyển cho tế bào. Bình thường TBG khơng có KN này, nếu
xuất hiện CD71 điều đó chứng tỏ các TBG này sẽ biệt hóa thành cụm hồng
cầu. Dấu ấn bề mặt đặc trưng cho dòng này là CD34+/CD45-/CD71+ [1313].
Ở giai đoạn rất sớm của sự biệt hóa, tế bào cùng có dấu ấn CD45RO và
CD45RB. Khi có CD45RA là đặc trưng của các tế bào tiền thân muộn và định
hướng biệt hóa thành CFU-GM. Dấu ấn bề mặt đặc trưng cho dịng này là
CD34+CD45RA+CD71- [13].
Ngồi dấu ấn CD34 cịn tìm thấy dấu ấn AC133 trên mặt TB. Nó là một
protein được glycosyl hóa với trọng lượng phân tử 120 kDa. Nó khơng hiển
thị cùng với bất kỳ của các KN nào kể trên và cấu trúc cũng khác biệt với các
dấu ấn khác trên bề mặt tế bào. Đóng vai trò là thụ thể của yếu tố tăng trưởng.
AC133 biểu hiện chủ yếu ở các tế bào CD34+/Lin-, biểu hiện ở số rất ít tế bào
CD34-Lin+ [15].
Đánh giá tiềm năng tăng sinh của các TBG tạo máu đã biệt hóa đến giai
đoạn đầu dòng (CFU-GM, CFU-M, BFU-E) là cần thiết. Grskovic và cộng sự
(2004) đã nuôi cấy cụm tế bào và cho kết quả là: các cụm tế bào đều phát
triển từ TB CD34 có độ biểu hiện thấp với CD117 [1515]. Ngoài ra, sự hiện

9
diện của dấu ấn CD135 tạo ra sự khác biệt hoạt động của các tế bào này.
Smogorzewska và cộng sự nhận thấy rằng: sau 60 ngày nuôi cấy, tế bào
CD34+CD38- vẫn có thể tạo cụm khi có mặt của các tế bào đệm trong tủy
xương. Sau 40 ngày nuôi cấy các tế bào CD34+CD38+ khơng có khả năng
biệt hóa thành cụm nữa [16].

Hình 1.4. Kháng nguyên bề mặt của tế bào gốc tạo máu dây rốn
(Nguồn . Ref: Anna Hordyjewska et al. 2015.
Cytotechnology: DOI 10.1007/s10616-014-9796-y Nguyen Van Tinh, PhD)

1.1.2.4. Sự khác biệt giữa tế bào gốc máu dây rốn với tế bào gốc tủy xương và
tế bào gốc máu ngoại vi
TBG MDR khác với TBG tủy xương và máu ngoại vi về thành phần, số
lượng và tính chất [17].
- Các TBG MDR có CD34+/CD38- (được tìm thấy trong pha G0) có
đáp ứng tăng sinh với cytokine mạnh hơn và ít phụ thuộc vào tế bào đệm hơn
trong tủy xương hoặc máu ngoại vi [13].
- Gao và cộng sự đã chỉ ra rằng trong MDR chứa những tế bào là tiền
thân của tế bào đệm có khả năng tạo máu [18].
- MDR chứa các loại tế bào có tiềm năng tăng sinh tạo cụm cao gấp 8
lần trong tủy xương. Đánh giá khả năng mọc các cụm của TBG MDR người


10
ta thấy rằng 1 ml máu có khả năng tạo cụm CFU-E (8000 cụm) cao gấp 3 lần
tủy xương và máu ngoại vi, tạo cụm CFU-GM (13000-24000 cụm) cao gấp
15 lần tủy xương và máu ngoại vi, khoảng 1000-10000 cụm hỗn hợp CFUGEMM [19]. Thêm vào đó trong MDR chứa các tế bào tạo máu non nhiều
hơn tủy xương. Tỷ lệ các tế bào có dấu ấn CD34 trên bề mặt trong MDR dao
động 0,02 - 1,43%, thấp hơn trong dịch tủy xương (0,5-5%) nhưng cao hơn

rất nhiều máu ngoại vi (< 0,01%) [20]. Số lượng tế bào chưa hoạt động có dấu
ấn CD34+/HLA-DR- và CD34+/CD38- trong MDR cũng cao hơn so với tủy
xương (lần lượt là 4% và 1 %) [21].
- Trên tế bào mang dấu ấn CD34 của MDR, có biểu hiện CD44 và các
phân tử bám dính khác của nhóm integrins như CD49d hoặc CD49f cao hơn,
nhưng biểu hiện CD11 và CD18 thấp hơn so với tế bào tủy xương hoặc máu
ngoại vi [13].
- TBG MDR cũng được đặc trưng bởi vùng telomere dài hơn so với
máu ngoại vi hoặc tủy xương. Do đó, các TBG MDR có khả năng tạo máu
trong một thời gian dài hơn - chúng phân chia nhiều hơn và tạo ra một số
lượng lớn các tế bào con.
- Máu rốn có chứa một quần thể tế bào T đặc trưng (kiểu hình CD3-/
CD8-), là tiền thân của dòng tế bào T. Rất nhiều các nghiên cứu cho thấy tỷ lệ
NK trong MDR thấp hơn và do đó hoạt động độc tế bào thấp hơn so với
người trưởng thành. Do tính “ngây thơ” của các tế bào miễn dịch có trong
MDR mà dẫn đến mức độ gây độc tế bào thấp. Đây là một giá trị đặc trưng
của chu kỳ chu sinh và sơ sinh - chưa bị tác động bởi các yếu tố ngoại lai.
- Chang và cộng sự cho thấy: ngoài TBG tạo máu, MDR chứa các TBG
trung mô (MSC) tương tự như tủy xương. Chúng có 2 hình thái chính là dạng
sợi phẳng (93%) và dạng sợi hình con thoi. Cả 2 hình thái trên đều âm tính


11
với dấu ấn CD34, CD26, CD31, CD45 và HLA-DR. Dấu ấn bề mặt tế bào
điển hình cho các tế bào trung mô: SH2, SH3 và SH4, các phân tử kết dính
của các KN CD29, CD44 và HLA-A, B, C. MSC có hình dạng là con thoi và
sợi phẳng. Sự khác biệt duy nhất giữa hai loại MSC này là mức độ biểu hiện
KN CD90. MSC có dạng hình con thoi biểu hiện nhiều KN CD90, trong khi
MSC dạng sợi phẳng cho thấy khơng có biểu hiện KN này [22].
Tế bào gốc máu dây rốn có ưu điểm khác với các TBG được tạo ra từ

tủy xương: TBG MDR chưa bị hư hại do bệnh tật và đột biến. Chính vì vậy,
đây là một nguồn TBG đang được ứng dụng ngày càng nhiều trên thế giới.
Bên cạnh đó, so với các nguồn TBG khác thì đây là nguồn TBG có sẵn và đã
có kết quả xét nghiệm HLA sẵn trong ngân hàng lưu trữ MDR cộng đồng nên
thời gian chờ ghép sẽ được rút ngắn một cách đáng kể, có thể tận dụng được
thời điểm vàng trong điều trị cho bệnh nhân.
Nhược điểm chính của nguồn TBG này là số lượng TBG khá thấp dẫn
đến mọc mảnh ghép chậm và nguy cơ bội nhiễm cao. Hiện nay đã có rất nhiều
thử nghiệm nghiên cứu khắc phục vấn đề này.
1.2. Tạo nguồn tế bào gốc từ máu dây rốn
1.2.1. Quy trình thu thập, xử lý và bảo quản máu dây rốn
1.2.1.1. Thu thập máu dây rốn
Máu dây rốn là một nguồn TBG đặc biệt, tận dụng một sản phẩm thải
bỏ từ quá trình sinh sản để biến đổi thành nguồn thuốc quý giá phục vụ cho
điều trị [23]. Vì vậy, việc thu thập, xử lý và bảo quản nguồn TBG này cũng
đòi hỏi các quy trình khác biệt so với các nguồn TBG khác. Trên thế giới, rất
nhiều nghiên cứu để cải tiến các quy trình nhằm nâng cao số lượng và chất
lượng TBG MDR phục vụ cho lâm sàng. Công đoạn đầu tiên của quá trình
này là việc thu thập máu từ dây rốn và bánh rau của sản phụ và trẻ sơ sinh.