Xây dựng tiêu chuẩn cho dược liệu chó đẻ thân xanh

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐHSP

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

*******************

KHOA HÓA

**********
NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Họ và tên sinh viên: Trần Thị Thủy Tiên
Lớp

: 09 CHD

1. Tên đề tài: Xây dựng tiêu chuẩn cho dược liệu Chó đẻ thân xanh
(Phyllanthus amarus Schum. et Thonn)
2. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất
2.1. Dụng cụ, thiết bị
Bộ chiết soxhlet, máy đo sắc kí khí kết hợp với khối phổ (GC-MS) (Trung
tâm kỹ thuật đo lường chất lượng II, số 2, Ngô Quyền, Đà Nẵng), tủ sấy, lị nung,
cân phân tích, cốc thuỷ tinh, bình tam giác, ống nghiệm, bếp điện, bếp cách thuỷ,
cốc sứ, các loại pipet, bình định mức, bình hút ẩm, giấy lọc,…
2.2. Hóa chất
- Hóa chất hữu cơ: Ethanol 96%, chloroform, methanol.
- Hóa chất vơ cơ: acid sulfuric 10% (TT), amoni hydroxyd 10% , acid

hydrocloric (TT) bột magnesi, dung dịch gelatin 1% (TT), dung dịch sắt (III) clorid
5% (TT)…
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Nghiên cứu lí thuyết
Tổng quan các tài liệu về đặc điểm hình thái thực vật, thành phần hố học,
ứng dụng của cây chó đẻ thân xanh, trao đổi kinh nghiệm với thầy, cô và các bạn.
3.2. Nghiên cứu thực nghiệm
 Phương pháp lấy mẫu: Tồn cây Chó đẻ thân xanh sau khi thu hái về, tiến
hành loại tạp sơ bộ. Rửa thật sạch bằng nước, để ráo nước, cắt khúc dài khoảng 3


cm sau đó phơi khơ và nghiền thành bột mịn.
 Phương pháp trọng lượng để xác định độ ẩm, hàm lượng tro, định lượng
trong cây chó đẻ thân xanh.
 Chiết bằng phương pháp soxhlet với dung môi ethanol 96%.
 Xác định thành phần các hợp chất chính trong dịch chiết ethanol từ cây chó
đẻ thân xanh bằng phương pháp sắc kí khí ghép khối phổ (GC-MS).
 Các phương pháp thử nghiệm các hoạt tính sinh học.
 Các phương pháp phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật.
 Các phương pháp định tính một số nhóm chất có trong cây Chó đẻ thân
xanh.
4. Giáo viên hướng dẫn: ThS. Đỗ Thị Thúy Vân
5. Ngày giao đề tài: 10/4/2012
6. Ngày hoàn thành: 20/5/2013
Chủ nhiệm khoa

PGS.TS. Lê Tự Hải

Giáo viên hướng dẫn

ThS. Đỗ Thị Thúy Vân

Sinh viên đã hoàn thành và nộp báo cáo cho Khoa ngày....tháng....năm 2013
Kết quả điểm đánh giá:
Ngày ....tháng....năm 2013
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
(Ký và ghi rõ họ tên)


3

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA HÓA


TRẦN THỊ THỦY TIÊN

Tên đề tài:

XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CHO DƯỢC LIỆU
CHÓ ĐẺ THÂN XANH
(Phyllanthus amarus Schum. et Thonn)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN HÓA DƯỢC


4

Đà Nẵng – 2013

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA HÓA


Tên đề tài:

XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CHO DƯỢC LIỆU
CHÓ ĐẺ THÂN XANH
(Phyllanthus amarus Schum. et Thonn)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN HÓA DƯỢC

Sinh viên thực hiện

: Trần Thị Thủy Tiên

Lớp

: 09CHD

Giáo viên hướng dẫn : ThS. Đỗ Thị Thúy Vân


5

Đà Nẵng – 2013
DANH MỤC BẢNG

Bảng

Tên bảng

Trang

Bảng 3.1

Thành phần hóa học của cắn chiết cây chó đẻ thân xanh

29

Bảng 3.2

Kết quả thử hoạt tính kháng sinh.

32

Bảng 3.3

Kết quả thử hoạt tính độc tế bào

32

Bảng 3.4

Kết quả khảo sát độ ẩm

36

Bảng 3.5

Kết quả khảo sát hàm lượng tro

36

Bảng 3.6

Kết quả khảo sát hàm lượng chất chiết được trong dược liệu

37


6

DANH MỤC HÌNH

Hình

Tên hình

Trang

Hình 1.1

Hình ảnh cây chó đẻ thân xanh

5

Hình 1.2

Hình ảnh hoa, lá và quả cây chó đẻ thân xanh

6

Hình 1.3

Hình ảnh cây chó đẻ quả trịn

7

Hình 2.1

Bột cây chó đẻ thân xanh

16

Hình 2.2

Bộ dụng cụ chiết soxhlet

18

Hình 3.1

Sắc kí đồ biểu thị thành phần hóa học trong cắn chiết cây chó
đẻ thân xanh

29

Hình 3.2

Định tính flavonoid

33

Hình 3.3

Định tính poliphenol

33

Hình 3.4

Định tính tanin

34

Hình 3.5

Định tính ankaloid

34

Hình 3.6

Sắc kí đồ lớp mỏng

35
MỞ ĐẦU

1. Lí do chọn đề tài


7
Từ xư đến nay, những cây thuốc dân gian vẫn đóng một vai trị hết sức quan trọng
trong đời sống hàng ngày của con người. Từ trước khi có sự ra đời cả thuốc tây, nhiều
loài cây cỏ trong tự nhiên đã được sử dụng trong dân gian để chữa bệnh và rất có hiệu
quả. Rất nhiều loại bệnh tật được chữa khỏi nhờ thảo dược.
Theo cách đánh giá của WHO, Việt Nam khơng chỉ là nước có bề dày truyền thống
phát triển y học cổ truyền từ hàng nghìn năm nay, mà thực sự là nước có tiềm năng về y
học cổ truyền và đã đạt được nhưng thành công ban đầu trong vấn đề kết hợp y học cổ
truyền với y học hiện đại. Những thành tựu đó đã góp phần tích cực trong việc giảm nhẹ
chi phí y tế, nâng cao hiệu quả điều trị đối với một số bệnh mạn tính.
Tuy nhiên theo thống kê của Cục Quản Lý Dược Việt Nam, thuốc từ dược liệu
chỉ chiếm khoảng 30% tổng số thuốc đăng ký trong nước, hơn 90% nguyên liệu sản
xuất thuốc trong nước vẫn phải nhập khẩu. Vì thế, chắc chắn sẽ khơng tránh khỏi việc
làm giả, làm nhái nguyên liệu dược liệu. Điều này có thể ảnh hưởng rất nghiêm trọng đến
sức khỏe của người sử dụng, cũng như gây mất lòng tin của mọi người khi sử dụng các
chế phẩm và cây cỏ từ dược liệu. Vì vậy, để phát huy tiềm năng của nguồn dược liệu
đáp ứng yêu cầu chăm sóc sức khỏe nhân dân đòi hỏi các cơ quan chức năng cần có
giải pháp hiệu quả. Một trong số đó là vấn đề xây dựng các tiêu chuẩn cho dược liệu.
Đây cũng là một yêu cầu cấp bách đối với các nhà nghiên cứu dược liệu. Để có thể sử
dụng dược liệu làm ngun liệu thuốc thì địi hỏi người ta phải xây dựng các tiêu chuẩn
chất lượng, đồng thời xây dựng các phương pháp thử để đánh giá các tiêu chuẩn đó.
Chó đẻ thân xanh, một dược liệu quý có tác dụng chữa trị rất nhiều bệnh như
vàng da, rối loạn tiêu hóa, sốt, đau mắt, tác dụng sát khuẩn, lợi tiểu, phù, đái tháo đường,
đặc biệt với khả năng khôi phục chức năng gan trong trường hợp suy giảm chức năng
gan do sử dụng nhiều bia rượu cũng cần phải có một tiêu chuẩn chất lượng cụ thể trước
khi được dùng làm thuốc. Vì thế, vấn đề“ Xây dựng tiêu chuẩn cho dược liệu Chó đẻ

thân xanh” là một vấn đề cấp thiết. Trong phạm vi bài khoá luận tốt nghiệp này xin
đề cập đến những vấn đề có liên quan đến dược liệu Chó đẻ thân xanh như tổng quan
về thực vật học, thành phần hóa học, tác dụng dược lý,...và đề nghị một tiêu chuẩn


8
kiểm nghiệm.
2. Mục đích nghiên cứu
-

Xác định thành phần hố học và hoạt tính sinh học trong dịch chiết cây Chó đẻ

thân xanh.
-

Xây dựng tiêu chuẩn cho dược liệu Chó đẻ thân xanh.

3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
Toàn cây Chó đẻ thân xanh được thu hái tại xã Hòa Khương, huyện Hòa Vang,
thành phố Đà Nẵng và dịch chiết ethanol từ cây chó đẻ thân xanh bằng phương pháp chiết
soxhlet.
4. Các phương pháp nghiên cứu
+ Nghiên cứu lý thuyết: Phương pháp nghiên cứu các hợp chất tự nhiên, tổng quan các
tài liệu về đặc điểm hình thái thực vật, thành phần hoá học, và ứng dụng của cây Chó đẻ
thân xanh.
+ Các phương pháp nghiên cứu thực nghiệm:
 Phương pháp lấy mẫu: Tồn cây Chó đẻ thân xanh sau khi thu hái về, tiến hành
loại tạp sơ bộ. Rửa thật sạch bằng nước, để ráo nước, cắt khúc dài khoảng 3 cm sau đó
phơi khơ và nghiền thành bột mịn.
 Phương pháp trọng lượng để xác định độ ẩm, hàm lượng tro, định lượng trong

cây chó đẻ thân xanh.
 Chiết bằng phương pháp soxhlet với dung môi ethanol 96%.
 Xác định thành phần các hợp chất chính trong dịch chiết ethanol từ cây chó đẻ
thân xanh bằng phương pháp sắc kí khí ghép khối phổ (GC-MS).
 Các phương pháp thử nghiệm các hoạt tính sinh học.
 Các phương pháp phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật.
 Các phương pháp định tính một số nhóm chất có trong cây Chó đẻ thân xanh.
5. Bố cục đề tài
Đề tài gồm có 44 trang trong đó có 6 bảng và 11 hình. Phần mở đầu (3 trang), kết


9
luận và kiến nghị (1 trang), tài liệu tham khảo (2 trang) và phần phụ lục. Nội dung của đề
tài chia làm 3 chương:
Chương 1- Tổng quan (12 trang)
Chương 2- Những nghiên cứu thực nghiệm (13 trang)
Chương 3- Kết quả và bàn luận (13 trang)

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN
1.1.

Giới thiệu về cây chó đẻ thân xanh [2], [5], [6], [9], [10]

1.1.1. Sơ lược về nguồn gốc của cây chó đẻ thân xanh trong giới thực vật [9], [10]


10
Chó đẻ thân xanh (Phyllanthus amarus Schum. et Thonn) thuộc họ thầu dầu
(Euphorbiaceae), theo nghiên cứu thì họ này có khoảng 300 chi, trong đó có 200 là ở Mỹ,
100 ở châu Phi, 70 từ Madagascar và còn lại là ở Châu Á và Châu Úc (Webster, 1994).

Nhiều loài trong họ này có nguồn gốc từ Bắc, Trung và Nam Mỹ (Unander et al, 1995).
Việc phân loại các loài trong chi này dựa trên hình thái và phân bố địa lí. Cây chó đẻ thân
xanh được phân loại dựa trên loài P. Abnormis, đây là loài đặc hữu của vùng biển ở Texas
và Florida của miền Nam Hoa Kỳ. Do đó, nhiều khả năng rằng P. amarus có nguồn gốc ở
khu vực Ca-ri-bê thuộc miền Nam nước Mỹ và đã lây lan khắp các vùng nhiệt đới.
(Webster, 1957) [9].
Mặt khác cũng có nghiên cứu cho rằng đã khơng tìm thấy nguồn gốc địa lý chính
xác của lồi này. Lồi này có thể có nguồn gốc từ vùng nhệt đới châu Mỹ (Cabieses năm
1993; Morton, 1981; Tirimana,1987), Philippines hoặc Ấn Độ (Cabieses, năm 1993,
Chevallier, 2000)[10].
1.1.2. Cây chó đẻ thân xanh [2], [5], [6], [9], [10]
1.1.2.1.

Tên gọi [2], [5], [6], [9], [10]

Chó đẻ thân xanh hay còn gọi là Diệp hạ châu đắng [2], [5]
Tên khoa học là: Phyllanthus amarus Schum. et Thonn, thuộc họ thầu dầu
(Euphorbiaceae) họ này có khoảng 300 chi với hơn 6500 loài [2], [6], [9], [10].
Tên khác: Ở nhiều nước trên thế giới thì chó đẻ thân xanh được gọi với nhiều tên
khác nhau như: [9], [10].
- Bhoomyaamalakee, Taamalakee và Bhoodhatree (tên tiếng Phạn của vùng Ayurveda
thuộc Ấn Độ).
- Black catnip, Carry me seed, Child pick-a-black (Anh).
- Poudre de plomb (Pháp).
- Yerba magica (Tây Ban Nha).
- Chanca piedra, djari-bita (Mỹ).
- Prakphle (Capuchia).
Theo y sư Tuệ Tĩnh trong “ đơng dược thần thảo tịng thư” có tên là “chó đẻ” vì ở
các vùng nơng thơn, chó cái sau khi đẻ con xong thường ra vườn tìm cây diệp hạ châu

11
nhai nuốt liên tục 2-3 ngày, vừa để cầm máu, vừa để bảo vệ sinh mạng, một bản năng tự
vệ do tạo hóa ban cho lồi vật. Vì vậy, cây chó đẻ phải là thảo dược hữu ích.
1.1.2.2.

Phân loại [2]

- Giới: Plantae – Plants

- Họ: Euphorbiaceae

- Phân giới: Tracheobionta – Thực vật có mạch

- Tơng: Phyllantheae

- Nhóm: Spermatophyta – Thực vật có hạt

- Phân tơng: Flueggeinae

- Nghành: Magnoliophyta – Thực vật hạt kín

- Chi: Phyllanthus

- Lớp: Magnoliopsida – Hai lá mầm

- Lồi: Phyllanthus amarus

- Bộ: Malpighiales
1.1.2.3.

Mơ tả [2], [5], [9], [10]

Cây chó đẻ thân xanh là cây thảo, cây cao 40 - 80 cm, thân tròn, màu xanh, phân
nhánh đều, nhiều (xem hình 1.1).

Hình 1.1. Hình ảnh cây chó đẻ thân xanh
+ Lá mọc so le xếp thành 2 dãy xít

+ Hoa đực và hoa cái mọc ở kẽ lá, màu lục

nhau trơng như lá kép hình lơng chim.

nhạt, khơng có cánh hoa. Hoa đực có cuống

Phiến lá hình bầu dục, dài từ 5 - 10

ngắn 1-2 mm, đài 5, có tuyến mật, nhị 3, chỉ

mm, rộng 3 – 6 mm, màu xanh sẫm ở

nhị dính nhau. Hoa cái có cuống dài hơn

trên, màu xanh nhạt ở mặt dưới (xem

hoa đực (xem hình 1.2).

hình 1.2).

12
+ Quả nang, nhẵn, hình cầu, đường

Hình 1.2. Hình ảnh hoa, lá và quả cây

kính 1,8-2 mm, có đài tồn tại. Chứa 6

chó đẻ thân xanh

hạt hình tam giác, đường kính 1 mm,
hạt có sọc dọc ở lưng (xem hình 1.2).

1.1.2.4.

Phân bố và sinh thái [9], [10]

Cây chó đẻ thân xanh phân bố rộng rãi ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới trên
khắp thế giới. P. amarus được phân bố trên khắp Ấn Độ và một số vùng lân cận nhưng
phổ biến nhất vẫn là ở Ấn Độ (Chowdhury và Rao, 2002) [9]. Nó sống tập trung chủ yếu
ở khu vực rừng nhiệt đới Amazon và các nước nhiệt đới khác như Ấn Độ, Trung Quốc,
Thái Lan,… Là cây ưa ẩm và ưa sáng nên chúng thường mọc ở các thung lũng, ven bờ
hồ, bờ sông [10].
1.1.2.5.

Phân biệt với một số loài cùng họ Euphorbiaceae [2], [10]

Trên thực tế ở nước ta có nhiều lồi chó đẻ nhưng thường gặp nhất là 3 loại: chó
đẻ răng cưa, chó đẻ quả trịn và chó đẻ thân xanh.
Chó đẻ thân xanh (Phyllanthus amarus) thường được xác định nhầm với
Phyllanthus niruri L.( chó đẻ quả trịn) về hình dạng, cấu trúc, thành phần hóa học và

cách sử dụng (Morton, 1981) [10].
Cây chó đẻ quả trịn (Phyllanthus niuri Linn) (xem hình 1.3): Cây thảo mọc hàng
năm, nhẵn. Thân màu hồng nhạt, các cành có góc. Lá thn, tù cả gốc lẫn đầu. Lá kèm
hình dùi trong suốt. Cụm hoa ở nách gồm 1 hoa đực và 1 hoa cái hoặc chỉ có hoa cái.
Hoa đực có cuống rất ngắn, đài 5-6 hình bầu dục mũi mác, đĩa mật gồm những bé, nhị 3.
Hoa cái cũng xó cuống ngắn, đài 5-6 giống ở hoa đực nhưng rộng hơn một ít, đĩa mật


13
hình đấu có 5 thùy sâu, các vịi nhụy rất ngắn, rời nhau chẻ đơi ở đầu, bầu hình cầu. Quả
nang hình cầu. Ra hoa từ tháng 1-10. Cây mọc dại trong vườn, gặp khắp nơi trong nước
ta. Kinh nghiệm nhân dân là thuốc thơng tiểu, thơng sữa [2].

Hình 1.3. Hình ảnh cây chó đẻ quả trịn
1.2.

Một số nghiên cứu về thành phần hố học của cây chó đẻ thân xanh [2], [6],

[9], [10], [11]
1.2.1. Thành phần hóa học [2], [6], [9], [10]
Một số thành phần hóa học chính có trong cây:
-

Lignans: Phyllanthin, hypophyllanthin, nirurin niranthin, phyltetralin, niranthine,

nirtetralin vv… (Morton, 1981; Chevallier, 2000; Srivastava và cộng sự, 2008; Kassuya
et al., 2006. Huang và cộng sự, 2003;. Maciel và cộng sự, 2007; Singh và cộng sự, 2009)
[2], [6], [9], [10].
-

Flavonoid: Quercetin, quercetrin, rutin, gallocat-echin, phyllanthusiin,kaempferol

vv… (Foo và Wong, 1992; Foo, 1993a; Londhe et al., 2008; Morton, 1981), geraniin,
amariin, furosin, axit geraniinic, axit amariinic, Amaru-đơn độc, axit repandusinic,
corilagin, isocorilagin, elaeocarpusin, phyllanthin D galic, axit repandusinic vv… (Foo
và Wong, 1992; Foo, 1993a; Foo, 1995) [9], [10].
-

Triterpenes: Phyllanthenol, phyllan-thenone, phytllantheol vv… (Maciel và cộng

sự, 2007; Foo và Wong, 1992) [9], [10].
-

Alkaloid:

securinine,

dihydrosecurinine,

tetrahydrose-curinine,

securinol,

phyllanthine, allosecurine, norsecurinine, epibubbialine, isobubbialine, 4-methoxy


14
dihydrosecurinine, 4 - methoxytetrahydrosecurinine, 4 hydrosecurinine vv… (Houghton
và cộng sự, 1996; Kassuya et al., 2006; Foo và Wong, 1992) [9], [10].
-

Sterol: amarosterol-A, amarosterol-B vv... (Ahmad và Alam, 2003) [9], [10].

-

Tinh dầu dễ bay hơi: linalool, phytol vv... (Moronkola et al., 2009) [9], [10].

1.2.2. Một số hoạt chất có hoạt tính sinh học cao trong cây chó đẻ thân xanh [6], [9],
[10], [11]
Danh pháp

Công thức

Cấu tạo

phân tử

OCH3

Methyl
brevifolincarboxylate.

O
OH

C14H10 O8

HO

O

O

HO
O

O

Dehydrochebulic acid
trimethyl eter

OCH3
O
OCH3
O

OH

C17 H16 O11
HO

CH3
O
HO
O

Daphnoretin

C19H12 O7

O

H3C

O
HO

O

O

O


15
CH3
H3C

Ursolic acid

C30H48 O3
CH3

H3C

COOH

CH3
HO
H3C

Phyllanthin

C24H34 O6

CH3

H3CO

CH2OMe

H3CO

CH2OMe

OCH3
OCH3

H

H3CO

Hyphophyllanthin

C24H30 O7

H3CO

H3C
OCH3

H

CH2OMe

CH2OMe
OCH3

O
O

1.3.

Giá trị sử dụng của cây chó đẻ thân xanh [2], [5], [6], [9], [10], [11], [12]

1.3.1. Y dược dân gian[2], [5], [6], [9], [10]
Theo đông y, cây chó đẻ thân xanh có vị hơi đắng, có tính mát có tác dụng tiêu
độc, sát trùng, thơng huyết, thường được sử dụng làm thuốc thông tiểu, thông sữa, diều
kinh. Ngồi ra cịn dùng để chữa mụn nhọt, lở ngứa, rắn rết cắn [2], [5], [6].
Cây này có một lịch sử lâu dài trong điều trị các vấn đề gan, thận và bàng quang,
tiểu đường và ký sinh trùng đường ruột [9], [10].
Cây chó đẻ thân xanh để chữa nhiều bệnh bao gồm cả cổ chướng, tiểu đường,


16
vàng da, hen suyễn và các bệnh nhiễm trùng phế quản (Foo và Wong, 1992) [9].
- Trong y học Ấn Độ nó cịn được sử dụng để chữa các bệnh về dạ dày, các bệnh
có liên quan đến hệ thống tiết niệu, gan, thận và lá lách. Ngồi ra nó còn được sử dụng
trong điều trị bệnh lậu, rong kinh và các bệnh sinh dục khác. Cây chó đẻ thân xanh rất
hữu ích trong các bệnh tiêu chảy, kiết lị, sốt liên tục, ghẻ, lở loét và làm lành vết thương,
chữa đau bụng. Lá lồi này đun sơi với nước dùng để chữa bệnh tiểu đường, bệnh lỵ, rối
loạn kinh nguyệt và một số bệnh về da (Wessels Boer và các cộng sự,1976; Tirimana,

1987; HEYDE, 1968, 1990). Ngồi ra nó cịn có tác dụng lọc máu điều trị bệnh sốt rét
nhẹ và bệnh thiếu máu. Nó giúp giải phóng đờm (HEYDE, 1990) và để chống sốt
(nanden, 1998). Loại thảo dược này cịn có thể sử dụng để điều trị bệnh táo bón (Tjong
và Young, 1989) [9].
- Tại Suriname (Đơng Bắc thuộc 1 phần của Nam Mỹ) nó được xem như là một
cây thảo mộc quý dùng để tắm cho trẻ sau khi sinh, chữa một số bệnh như chuột rút, hen
suyễn, đau dạ dày (May, 1982; Tịtari, 1985; HEYDE, 1990; Sedoc, 1992; Nanden, 1998)
[9], [10].
- Tại Peru, nhân dân sắc nước phần trên mặt đất uống làm thuốc lợi tiểu, trị sỏi
mật, sỏi thận [9], [10].
- Tại một số nước Nam Mỹ, Diệp hạ châu đắng dùng trị sốt rét, sỏi niệu, sỏi bàng
quang, các bệnh về đường tiết niệu nói chung [9], [10].
- Tại Haiti, người dân sắc lá làm nước uống trị sốt [9].
- Tại Papua niugine, nước hãm toàn cây để trị đau đầu, hoặc đau nửa đầu [9],
[10].
- Tại Tanzania cao nước phần trên mặt đất của Diệp hạ châu dùng trị đái tháo
đường không phụ thuộc insulin [9], [10].
- Tại Tây Ấn, Diệp hạ châu đắng dùng trị giun ở trẻ em [9], [10].
- Tại bờ biển Ngà người dân dùng nước sắc lá uống trong trường hợp khó sinh,
trị vàng da, nơn, đau họng…[9], [10].
1.3.2. Các nghiên cứu dược học về cây chó đẻ thân xanh [6], [9], [10], [11], [12]
P. amarus đã được nghiên cứu là có tác dụng dược lý như một kháng sinh, khả


17
năng kháng virus chống lại viêm B và hạ đường huyết. Phyllanthin và hypophyllanthin
hiện diện trong P. amarus có khả năng kháng u chống lại EAC ở chuột bạch tạng Thụy
Sĩ, hiệu ứng gây độc tế bào trên các tế bào K-562, và chất chống oxy hóa [9]. Mới đây
nhất Harikuma và cộng sự đã khẳng định dịch chiết cây chó đẻ thân xanh có tác dụng
diệt tế bào ung thư thơng qua việc thúc đẩy q trình chết có chương trình [6], [11]. Cho

đến nay đã có nhiều nghiên cứu về hoạt tính sinh học của lồi cây này cho thấy hoạt tính
kháng khuẩn, chống viêm, ức chế sự sản sinh NO, có tác dụng bảo vệ gan [6]. Tại Việt
Nam, nhóm nghiên cứu của Lê Võ Định Tường (Học Viện Quân Y - 1990 - 1996) đã
thành công với chế phẩm Hepamarin từ Phyllanthus amarus. Dưới đây là một số tác
dụng dược lý của cây chó đẻ thân xanh đã được nghiên cứu trên thế giới [9].
- Tác dụng kháng khuẩn.
+ Các chất trong dịch chiết methanol 80% thu được từ bảy loài Phyllanthus sp.
được đánh giá hoạt tính kháng khuẩn với kết quả cho thấy hoạt tính kháng khuẩn tốt nhất
là từ P. amarus chống lại S. aureus (Gram dương) với một giá trị MIC là 17,7 g / mL
(Eldeen et al., 2011).
+ Khả năng kháng khuẩn của dịch chiết từ methanol từ P. amarus với nồng độ 5,
10, 25, 50, 100, 200, 400, 800, và 1000 mg / ml đã được nghiên cứu có khả năng kháng
chủng vi khuẩn gây bệnh như: Shigella dysen-teriae 1, S dysenteriae. 2, S. boydii 8, S.
aureus ML267, S. aureus NCTC 7447, Streptococcus pneumoniae 7465, E. coli ROW
7/12, E. coli CD/99/1, B. subtilis CD/99/1, Salmonella typhimurium ATCC 6539, Vibrio
cholerae 8531, P. aeruginosa 7241, và K. pneumonia RM 8/98 bằng cách khuếch tán đĩa
và phương pháp pha loãng thạch và kết quả đá là chúng kháng lại tất cả các chủng thử
nghiệm. Tác dụng ức chế tối đa đã được ghi nhận đối với Shigella spp, E.coli, V.
cholerae, và S. aureus. Ngoài ra cũng tìm thấy hoạt động chống lại S. typhimurium,
P.aeruginosa, B.subtilis, và viêm phổi khác gây ra bởi các chủng Klebsiella và Streptococcus spp. Hoạt tính kháng khuẩn chủ yếu là do các phyllanthin được phân lập
(Mazumder et al., 2006).
+ Các dịch chiết ethanol của chín lồi này ở Peru bao gồm P. amarus đã được
sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn chống lại vi khuẩn Bacillus cereus ATCC 11.778, B.


18
subtilis ATCC 6633, Bacteroides fragilis ATCC 25.285, E. faecalis ATCC 29.212, E.
coli

ATCC 25.922, P. aeruginosa ATCC 27.853, S. aureus ATCC 25.923,

Staphylococcus epidermidis ATCC 12,228, và pyogenes Streptococ-cus của ATCC
19.615. Trong số các loài thử nghiệm, 80% dịch chiết ethanol của các bộ phận trên mặt
đất của P. amarus cho thấy tính chất kháng khuẩn có triển vọng nhất, ức chế tất cả các
chủng thử nghiệm với nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) dao động từ 0,25 đến16 mg / ml
(Kloucek et al., 2005).
+ Tinh dầu và các thành phần được lấy từ lá tươi và hạt của P. amarus đã được
thử nghiệm trên 12 vi sinh vật nấm men, vi khuẩn gram dương và gram âm vi khuẩn bao
gồm: B. subtilis, Citrobacter sp., E. coli (cô lập), E. coli (ATCC 25922), Enterococcus
faecalis, Klebsiella pneumoniae, P. aeruginosa, P. mirabilis, Staphylococcus albus, S.
aureus (ATCC 25923), S. aureus (cô lập) và C. albicans. Tất cả các mẫu tinh dầu thiết
yếu và các thành phần đã ức chế đối với các vi sinh vật trên ngoại trừ P.
aeruginosa.(Ogunlesi et al., 2009).
- Tác dụng chống ung thư.
+ Dịch chiết từ methanol và nước của P. amarus có khả năng ngăn chặn MCF-7
(ung thư vú) và A549 (phổi ung thư biểu mô) tăng trưởng tế bào với giá trị IC50 khác
nhau, 56-126 g / ml và 150-240 g / ml. P. amarus chiết xuất đã được chứng minh là có
hiệu quả giảm xâm lược, di chuyển, và độ bám dính của cả hai MCF-7 và A549. P.
amarus đã được chứng minh là có khả năng gây chết tế bào. Nguyên nhân là do sự có
mặt của các hợp chất polyphenol trong dịch chiết của nó (Lee et al., 2011).
+ Những tác động của dịch chiết nước từ P. amarus chống lại Cr (VI) gây ra độc
tính oxy hóa in vitro các tế bào ung thư vú ở người MDA-MB-435S cho thấy một sự suy
giảm rõ rệt trong Cr (VI) gây độc tế bào được chú ý trong MDA- tế bào MB-435S với
tăng liều chiết xuất. Thành phần phenolic của nó có thể ức chế Cr (VI), gây ra độc tính
oxy hóa các tế bào MDA-MB-435S (Guha et al., 2010).
+ Dịch chiết từ thân và lá của P. amarus đã được nghiên cứu về khả năng nâng
cao tuổi thọ của động vật mắc bệnh bạch cầu và giảm tỷ lệ mắc bệnh thiếu máu.
(Harikumar và Kuttan, 2009).

19
+ Một hỗn hợp của phyllanthin và hypophyllanthin (1:1), từ P. amarus cho thấy
hoạt động kháng u chống lại EAC ở chuột bạch tạng Thụy Sĩ. (Islam et al., 2008a).
+ Dịch chiết cồn của các bộ phận trên không của P. amarus đã được tìm thấy để
ức chế enzym cytochrome P450. Nó cũng làm giảm tỷ lệ mắc khối u dạ dày ở chuột
(44%) cũng như số lượng của chúng. Lignans Phyllanthin, nirtetralin, và niranthin đã
được tìm thấy là rất hiệu quả chống lại ung thư. (Dhir et al., 1990).
- Tác dụng chống tiêu chảy, và chống loét.
Dịch chiết methanol từ lá và thân của P. amarus được nghiên cứu trên chuột
Wistar cho thấy ức chế đáng kể các tổn thương dạ dày, đồng thời chỉ số lở loét chảy máu
giảm một cách đáng kể (Raphael và Khuttan, 2003).
- Tác dụng kháng nấm.
Ảnh hưởng của norsecurinine một chất thuộc nhóm alkaloid được phân lập từ P.
amarus đã được nghiên cứu chống lại sự nảy mầm bào tử của một số nấm (Alternaria
brassicae, Alternaria solani, Curvularia pennisetti, Curvularia sp., Erysiphe pisi,
Helminthosporium frumentacei). (Agrawal et al., 2004).
- Tác dụng chống viêm và giảm đau.
Theo nghiên cứu cho thấy khả năng chống viêm của nirtetralin, phyltetralin hoặc
niranthin được thử nghiệm trên chuột cho thấy với liều lượng (30 nmol / chân), có thể
được xem tương tự như WEB2170 (một chất đối kháng thụ thể PAF (30 nmol / chân), ức
chế đáng kể PAF gây ra phù nề chân hình thành ở chuột. Như vậy nirtetralin hoặc
phyltetralin gây ra ức chế phù nề chân gây ra bởi PAF hoặc ET-1 (Kassuya et al., 2005).
- Tác dụng chống oxy hóa.
+ Dịch chiết từ nước của P. amarus cho thấy ý nghĩa (p <0,05) tiềm năng trong
gốc tự do, và trong ức chế peroxid hóa lipid. Hơn nữa, chiết xuất được chứng minh chứa
một hàm lượng cao các hợp chất phenolic đã được tìm thấy có mối tương quan mạnh mẽ
và có ý nghĩa (p <0,05) tích cực trong việc lấy đi gốc tự do, khả năng ức chế lipid peroxy
và hiệu quả trong việc bảo vệ chống lại Cr (VI) (Guha et al., 2010).
+ Dịch chiết methanol từ lá và thân của P. amarus đã được tìm thấy có hoạt tính
chống oxy vì nó có thể ức chế lipid peroxy, và sàn lọc các gốc hydroxyl và superoxide.

20
(Raphael et al., 2002a). Amariin, axit repandusinic, phyllanthusiin D, phyllanthin và
compouds phe-nolic phân lập từ P. amarus cho thấy hoạt động đáng chú ý chất chống
oxy hóa cao.
- Tác dụng kháng virus.
+ Tác dụng ức chế của dịch chiết methanol từ rễ và lá P. amarus trên NS3 và
enzyme NS5B của virus viêm gan C đã được sàng lọc bằng trong xét nghiệm enzyme
trong ống nghiệm. Kết quả cho thấy dịch chiết từ rễ ức chế đáng kể HCV NS3 protease
enzyme, trong khi dịch chiết từ lá lại ức chế đáng kể NS5B. Đặc biệt nó cịn ức chế đáng
kể sự sao chép của HCV monocistronic Replicon RNA và HCV RNA virus H77S trong
hệ thống nuôi cấy tế bào HCV. Điều quan trọng là không cho thấy khả năng gây độc
trong Huh-7 tế bào trong các khảo nghiệm MTT (Ravikumar et al., 2011).
+ Dung dịch nước cũng như cồn P. amarus chiết xuất potently ức chế HIV-1 nhân
bản trong tế bào CD4 + tế bào HeLa (Notka et al., 2003).
+ P. amarus ức chế hoạt động của virus viêm gan B, giảm hàm lượng DNA vi rút
viêm gan B (Lee et al.,1996).
- Tác dụng kích thích tình dục.
Tác động của methanol từ lá của P. amarus trên các thông số nội tiết tố của lợn
guinea đã được điều tra. Các thơng số kích thích tố điều tra là testosterone, leutinizing và
kích thích nang nội tiết tố. Kết quả cho thấy sự gia tăng đáng kể về mức độ testosterone
của những con lợn guinea (Obianime và Uche, 2009).
- Tác dụng lợi tiểu.
Tác dụng này được nghiên cứu trong các mẫu máu và nước tiểu của đối tượng với
chế độ ăn uống trước và sau thời gian điều trị. Kết quả cho thấy gia tăng được khối
lượng nước tiểu và nồng độ Na huyết thanh và giảm được lượng đường trong máu. Kết
quả lâm sàng cho thấy khồg có tác dụng phụ có hại (Srividya và Periwal, 1995).
- Tác dụng hạ đường huyết.
Khả năng hạ đường huyết của dịch chiết nước từ P. amarus đã được điều tra trong

alloxan gây ra bệnh tiểu đường chuột Wistar bạch tạng. Kết quả cho thấy mức độ đường
trong máu giảm từ 38 đến 30% (14 ngày) ở liều 130 và 260 mg / kg (Mbagwu et al.,


21
2011).
- Tác dụng điều hòa miễn dịch.
P. amarus cũng làm tăng GSH di động và thuế GST, qua đó làm giảm tác động
của các chất chuyển hóa độc hại của CTX trên các tế bào. P. amarus không làm giảm
khối u giảm hoạt động của CTX. Trong thực tế, đã có một hành động hiệp đồng của
CTX và P. amarus trong việc giảm khối u rắn ở chuột (Kumar và Kuttan, 2005).
- Tác dụng chống co thắt.
Hoạt động chống co thắt tiềm năng của các chất chiết xuất từ P. amarus được
đánh giá bởi khả năng của nó để giảm lực của cơ trơn lực kéo của một đoạn dài 2 cm của
chuột lang hồi tràng gây ra bởi EC50 acetylcholine (27 ± 5 g / L) hoặc EC50 histamin (
102 ± 13 g / l) (Mans et al., 2004).


22
CHƯƠNG 2 – NHỮNG NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM
2.1.

Nguyên liệu, dụng cụ, hố chất

2.1.1. Thu gom ngun liệu
Cây chó đẻ thân xanh được thu hái ở xã Hòa khương, huyện Hòa Vang, TP Đà
Nẵng.
Tên khoa học: Phyllanthus amarus Schum. et Thonn.
Tên khác: Diệp hạ châu đắng.
2.1.2. Xử lí ngun liệu

Tồn cây chó đẻ thân xanh sau khi thu hái về, tiến hành loại tạp sơ bộ. Rửa thật
sạch bằng nước, để ráo nước, cắt khúc dài khoảng 3 cm sau đó phơi khơ và nghiền thành
bột mịn (xem hình 2.1).

Hình 2.1. Bột cây chó đẻ thân xanh
2.1.3. Thiết bị - dụng cụ và hóa chất
2.1.3.1.

Thiết bị - dụng cụ

Bộ chiết soxhlet, máy đo sắc kí khí kết hợp với khối phổ (GC-MS) (Trung tâm
kỹ thuật đo lường chất lượng II, số 2, Ngơ Quyền, Đà Nẵng), tủ sấy, lị nung, cân phân
tích, cốc thuỷ tinh, bình tam giác, ống nghiệm, bếp điện, bếp cách thuỷ, cốc sứ, các loại
pipet, bình định mức, bình hút ẩm, giấy lọc,…
2.1.3.2.

Hóa chất

- Các dung mơi hữu cơ: Ethanol 96%, chloroform, methanol.
- Hóa chất vơ cơ: acid sulfuric 10% (TT), amoni hydroxyd 10% , acid hydrocloric


23
(TT) bột magnesi, dung dịch gelatin 1% (TT), dung dịch sắt (III) clorid 5% (TT)…
2.2.

Sơ đồ nghiên cứu

Thu và xử lí
ngun liệu

Bột tồn cây Chó
đẻ thân xanh
Chiết bằng
phương pháp
soxhlet

Xây dựng tiêu
chuẩn

Dịch chiết
Định
tính

Thử tinh
khiết

Định lượng

Phân tích sơ bộ
thành phần hóa
thực vật

Cơ đặc trong
cách thủy

Cắn

Nghiên cứu xác định
thành phần các hợp

chất chính (GC-MS)
2.3.

Thử hoạt tính
sinh học

Xác định thành phần các hợp chất chính từ cây chó đẻ thân xanh bằng

phương pháp GC-MS [7], [8]
2.3.1. Phương pháp chiết soxhlet [7], [8]


24
Cân chính xác lượng mẫu cần chiết soxhlet gói vào giấy lọc. Sau đó cho vào bộ
chiết soxhlet gồm một bình cầu, một thiết bị chiết và một sinh hàn hồi lưu. Dung mơi ở
trong bình cầu được làm bốc hơi từng phần, dung môi được ngưng tụ nhỏ vào chất được
chiết đựng trong một cái túi bằng giấy lọc và sau đó lại chảy vào bình. Đặc biệt dụng cụ
chiết soxhlet có thêm một ống xi-phơng đặt ở bên cạnh, chỉ để dung dịch chiết chảy vào
bình khi nào mức chất lỏng trong ống chiết đạt được khuỷu trên của ống xi-phơng (xem
hình 2.2). Chất được chiết cần có tỷ khối lớn hơn là dung mơi. Trong q trình đó cấu tử
cần được tách được làm giàu thêm trong dung mơi.

Hình 2.2. Bộ dụng cụ chiết soxhlet
Dịch chiết ethanol từ cây chó đẻ thân xanh thu được từ phương pháp chiết soxhlet
tiến hành cô trên bếp cách thủy thu được cắn. Gửi cắn này tới Trung tâm kỹ thuật đo
lường chất lượng II, số 2, Ngô Quyền, Đà Nẵng để đo phổ GC-MS.
2.3.2. Xác định thành phần các hợp chất chính từ cây chó đẻ thân xanh bằng phương
pháp GC-MS [7]
Phương pháp sắc kí khí – khối phổ (GC – MS) dựa trên cơ sở “nối ghép” máy sắc
kí khí với máy phổ khối lượng.

25
Sắc kí khí phân giải cao là một phương pháp hữu hiệu để phân tách các hỗn hợp
phức tạp trong một thời gian ngắn.
Khối phổ là phương pháp phân tích mà trong đó hợp chất xét nghiệm được ion hố
và phá thành các mảnh trong thể khí dưới chân khơng cao (10 -6 mmHg). Sau q trình ion
hố, các hạt có điện tích đó được gia tốc trong một điện trường, được tách trong một từ
trường theo tương quan giữa khối lượng và điện tích của chúng và được ghi nhận theo
cường độ của các hạt đó.
2.4.

Thử hoạt tính sinh học

2.4.1. Hoạt tính kháng sinh
Thử hoạt tính vi sinh vật kiểm định bằng định tính theo phương pháp
khuyếch tán trên thạch, sử dụng khoang giấy lọc tẩm chất thử theo nồng độ
tiêu chuẩn tại phịng thử hoạt tính sinh học – Viện hóa học Việt Nam.
Các chủng vi sinh vật thử gồm:
- Vi khuẩn Gram (+): Lactobacillus fermentum, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus.
- Vi khuẩn Gram (-): Salmonella enterica, Escherichia, Pseudomonas aeruginosa.
- Nấm: Candida albican.
2.4.2. Hoạt tính độc tế bào
Tiến hành thử hoạt tính chống ung thư bằng việc thử nghiệm khả năng gây độc tế bào
ung thư. Trong phạm vi đề tài này, thử hoạt tính độc tế bào của cắn chiết ethanol thu được từ
cây chó đẻ thân xanh với dòng tế bào ung thư gan Hep.
2.5.

Xây dựng tiêu chuẩn cho dược liệu Chó đẻ thân xanh [3], [4], [5], [7], [8]

2.5.1. Định tính [3], [5]
2.5.1.1.

Định tính flavonoid và poliphenol [3], [5]

Lấy 5 g bột dược liệu, thêm 50 ml ethanol 90% (TT), lắc đều, đun hồi lưu trong
cách thủy 30 phút. Lọc. Cơ dịch lọc cịn khoảng 40 ml, chia đều thành 2 phần.
Phần 1: Chia vào 2 ống nghiệm.
-

Ống 1: Làm ống đối chiếu.

-

Ống 2: Thêm 4 – 5 giọt acid hydrocloric (TT) và một ít bột magnesi (TT), đặt

trong cách thủy vài phút.