Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích kháng đến khả năng sinh trưởng và tích lũy hợp chất eurycomanone của tế bào cây mật nhân eurycoma longifolia jack nuôi cấy in vitro

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG

THÁI THỊ MỸ DIỆU

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT KÍCH KHÁNG
ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG VÀ TÍCH LŨY HỢP
CHẤT EURYCOMANONE CỦA TẾ BÀO CÂY MẬT NHÂN
(EURYCOMA LONGIFOLIA JACK) NUÔI CẤY IN VITRO

ĐÀ NẴNG, 05 - 2016


ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG

THÁI THỊ MỸ DIỆU

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT KÍCH KHÁNG
ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG VÀ TÍCH LŨY HỢP
CHẤT EURYCOMANONE CỦA TẾ BÀO CÂY MẬT NHÂN
(EURYCOMA LONGIFOLIA JACK) NUÔI CẤY IN VITRO

NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS. VÕ CHÂU TUẤN

ĐÀ NẴNG, 05 - 2016

LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi.
Các số liệu, kết quả nêu trong khóa luận là trung thực, khách quan và chưa
từng được ai cơng bố trong bất kì cơng trình nào khác.
Đà nẵng, ngày 2 tháng 5 năm 2016
Sinh viên

Thái Thị Mỹ Diệu


LỜI CÁM ƠN
Để hồn thành khóa luận này, trước hết em xin chân thành cảm ơn quý thầy
cô bộ môn Công nghệ sinh học, khoa Sinh - Môi trường, trường Đại học Sư phạm Đại học Đà Nẵng.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Võ Châu Tuấn, thầy giáo đã trực
tiếp hướng dẫn và chỉ bảo tận tình cho em từ khi nhận đề tài cho đến khi hồn thành
khóa luận.
Xin chân thành cảm ơn các Thầy Cô giáo – người đã trực tiếp giảng dạy truyền
đạt những kiến thức khoa học chuyên ngành công nghệ sinh học cho em trong những
năm qua.
Cuối cùng, em xin bày tỏ lịng biết ơn đối với gia đình, bạn bè đã ln động
viên, khích lệ em cả về vật chất lẫn tinh thần để em có thể đạt được kết quả tốt nhất.
Xin chân thành cảm ơn!
Đà nẵng, ngày 2 tháng 5 năm 2016
Sinh viên

Thái Thị Mỹ Diệu


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1

1. Đặt vấn đề ...............................................................................................................1
2. Mục tiêu đề tài .........................................................................................................2
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn.................................................................................2
3.1. Ý nghĩa khoa học .................................................................................................2
3.2. Ý nghĩa thực tiễn ..................................................................................................2

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................. 3
1.1. Nuôi cấy tế bào thực vật.......................................................................................3
1.1.1. Nuôi cấy callus ..................................................................................................3
1.1.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật ..................................................................4
1.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến q trình ni cấy tế bào thực vật ..........................5
1.1.3.1. Môi trường nuôi cấy.......................................................................................5
1.1.3.2. Điều kiện nuôi cấy .........................................................................................6
1.2. Sự tích lũy các hợp chất thứ cấp trong tế bào thực vật ni cấy in vitro .............7
1.3. Chất kích kháng bảo vệ thực vật (elicitor) ...........................................................8
1.3.1. Sự kích kháng bảo vệ thực vật (elicitation) ......................................................8
1.3.2. Một số chất kích kháng thường dùng ................................................................9
1.3.3. Những nghiên cứu bổ sung chất kích kháng trong sản xuất các hợp chất thứ
cấp từ nuôi cấy tế bào thực vật ..................................................................................10
1.3.3.1. Những nghiên cứu ngoài nước .....................................................................10
1.3.3.2. Những nghiên cứu trong nước .....................................................................13
1.4. Giới thiệu về cây mật nhân ................................................................................14
1.4.1. Nguồn gốc và phân bố.....................................................................................14
1.4.2. Đặc điểm hình thái ..........................................................................................14
1.4.3. Thành phần hóa học ........................................................................................15
1.4.4. Tác dụng dược lý.............................................................................................15
1.4.5. Một số nghiên cứu trên cây mật nhân .............................................................16

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 19
2.1. Đối tượng nghiên cứu.........................................................................................19

2.2. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................19
2.2.1. Phương pháp nuôi cấy callus ..........................................................................20
2.2.2. Phương pháp nuôi cấy huyền phù tế bào cây mật nhân có bổ sung kích kháng
...................................................................................................................................21
2.2.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ dịch chiết nấm men lên khả năng sinh trưởng của
tế bào mật nhân .........................................................................................................21
2.2.2.2. Ảnh hưởng của thời gian bổ sung dịch chiết nấm men lên khả năng sinh
trưởng của tế bào mật nhân .......................................................................................21
2.2.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ NaH2PO4 lên khả năng sinh trưởng của tế bào mật
nhân ...........................................................................................................................21
2.2.2.4. Ảnh hưởng của thời gian bổ sung NaH2PO4 lên khả năng sinh trưởng của tế
bào mật nhân .............................................................................................................21
2.2.2.5. Xác định sinh khối tế bào .............................................................................22
2.2.3. Xác định hàm lượng eurycomanone bằng HPLC ...........................................22
2.2.4. Xử lý thống kê .................................................................................................22

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................ 23
3.1. Ảnh hưởng của nồng độ dịch chiết nấm men lên khả năng sinh trưởng của tế
bào mật nhân .............................................................................................................23
3.2. Ảnh hưởng của thời gian bổ sung dịch chiết nấm men lên khả năng sinh trưởng
của tế bào mật nhân ...................................................................................................25
3.3. Ảnh hưởng của nồng độ NaH2PO4 lên khả năng sinh trưởng của tế bào mật
nhân ...........................................................................................................................26
3.4. Ảnh hưởng của thời gian bổ sung NaH2PO4 lên khả năng sinh trưởng của tế bào
mật nhân ....................................................................................................................27
3.5. Sự tích lũy của hợp chất eurycomanone trong tế bào mật nhân nuôi cấy in vitro
có bổ sung kích kháng ...............................................................................................28

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................... 32
1. Kết luận .................................................................................................................32
2. Đề nghị ..................................................................................................................32

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 33


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT
2,4-D

: 2,4-dichlorophenoxyacetic acid

BA

: 6-benzyl adenine

BAP

: 6-benzyl amino purine

cs

: cộng sự

ĐHST

: điều hòa sinh trưởng

GA

: gibberellin acid

HPLC

: high performance liquid chromatography

IBA

: indole 3-butyric acid

KIN

: kinetin (6-furfuryl aminopurine)

L

: lít

MS

: Murashige và Skoog (1962)

NAA

: α-nathyl acetic acid

NXB

: Nhà xuất bản

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình

Tên hình

Trang

2.1

Tế bào callus mật nhân

19

2.2

Sơ đồ thí nghiệm

20

3.1

3.2
3.3
3.4

3.5

Dịch huyền phù của tế bào mật nhân sau 14 ngày ni cấy
trong bình tam giác có bổ sung 1 g/L dịch chiết nấm men

Khối lượng tươi và khối lượng khô của tế bào mật nhân bổ
sung NaH2PO4 vào ngày nuôi cấy thứ 6.
Phổ HPLC của eurycomanone chuẩn
Phổ HPLC eurycomanone của tế bào mật nhân bổ sung
NaH2PO4 sau 15 ngày nuôi cấy
Phổ HPLC eurycomanone của tế bào mật nhân bổ sung dịch
chiết nấm men sau 15 ngày nuôi cấy

24

28
29
29

29


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng
3.1

3.2

3.3

3.4

3.5

Tên bảng

Ảnh hưởng của dịch chiết nấm men lên khả năng sinh trưởng
của tế bào cây mật nhân
Ảnh hưởng của thời gian bổ sung dịch chiết nấm men lên khả
năng sinh trưởng của tế bào cây mật nhân
Ảnh hưởng của nồng độ NaH2PO4 lên khả năng sinh trưởng của
tế bào cây mật nhân
Ảnh hưởng của thời gian bổ sung NaH2PO4 lên khả năng sinh
trưởng của tế bào mật nhân
Hàm lượng eurycomanone của tế bào mật nhân ở các loại kích
kháng khác nhau

Trang
23

25

26

27

30


1

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Từ xa xưa, con người đã biết sử dụng một số cây cỏ để làm thực phẩm và làm
thuốc điều trị bệnh tật và các vết thương. Những tác dụng chữa bệnh, tăng cường và
bảo vệ sức khoẻ của cây cỏ đối với con người chủ yếu là do các hợp chất tự nhiên mà

chúng đã sinh tổng hợp, tích luỹ trong q trình sinh trưởng và phát triển. Đến nay,
mặc dù đã có rất nhiều các dược phẩm được sản xuất bằng con đường tổng hợp hoá
học nhưng con người vẫn quan tâm hơn đến các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên. Bởi
các nhà khoa học đã phát hiện ra rằng nhiều thuốc tổng hợp hóa học tồn phần có cấu
trúc hóa học xa lạ, ngoại lai với cấu trúc hóa học của các hợp chất thiên nhiên nên đã
sinh ra nhiều tác dụng phụ độc hại cho con người [7].
Hiện nay, nạn khai thác bừa bãi, quá mức các loài cây thuốc phục vụ nhu cầu
về dược liệu đã làm suy giảm nhanh chóng cả về chất và lượng của các lồi cây thuốc
và đã đẩy rất nhiều loài cây quý, hiếm vào nguy cơ tuyệt chủng. Như vậy, việc sản
xuất các hợp chất thứ cấp thực vật bằng con đường canh tác truyền thống và tổng hợp
hóa học sẽ có nhiều hạn chế, khó có thể đáp ứng đủ nhu cầu dược liệu ngày càng tăng
trong tương lai [18]. Vì vậy, ứng dụng công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật để sản xuất
dược liệu được các nhà khoa học quan tâm ngày một nhiều hơn.
Cây mật nhân (Eurycoma longifolia Jack) là cây thuốc quý, được sử dụng
nhiều ở các nước Đông Nam Á. Hầu hết các bộ phận của cây được sử dụng làm thuốc
để chữa nhiều loại bệnh, chẳng hạn như bệnh sốt rét, tiểu đường, viêm loét, nhiễm
khuẩn…; đặc biệt có tác dụng rất tốt trong cải thiện sinh lý ở nam giới. Tuy nhiên,
mật nhân là loài cây thân gỗ, sinh trưởng chậm, phải mất khoảng 4 năm trồng mới
thu hoạch cho nguyên liệu dùng làm dược liệu [13]. Mặc khác, cũng bị ảnh hưởng
bởi nạn khai thác bừa bãi, cây mật nhân có thể lâm vào nguy cơ tuyệt chủng trong
tương lai không xa. Nuôi cấy tế bào huyền phù có bổ sung chất kích kháng thực vật
là một trong những biện pháp làm tăng hiệu suất tổng hợp các hoạt chất sinh học
trong tế bào, tăng hàm lượng hoạt tính sinh học cao, rút ngắn thời gian và giảm chi
phí sản xuất so với thu cây từ tự nhiên. Các chất kích kháng thường được sử dụng là
methyl jasmonate, acid salicylic, dịch chiết nấm men, ethrel… [16], [67].


2

Xuất phát từ những cơ sở trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu ảnh

hưởng của chất kích kháng đến khả năng sinh trưởng và tích lũy hợp chất
eurycomanone của tế bào cây mật nhân (Eurycoma longifolia Jack) nuôi cấy in
vitro”.
2. Mục tiêu đề tài
Xác định được các điều kiện kích kháng tốt nhất cho sự sinh trưởng và tích
lũy eurycomanone của tế bào mật nhân ni cấy in vitro.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
3.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học về khả năng
tăng sự sinh trưởng và tích lũy eurycomanone trong tế bào cây mật nhân khi bổ sung
chất kích kháng thực vật.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả của đề tài là cơ sở khoa học cho các ứng dụng sản xuất các hợp chất
thiên nhiên có hoạt tính sinh học bằng phương pháp nuôi cấy huyền phù trên quy mô
công nghiệp.


3

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Nuôi cấy tế bào thực vật
1.1.1. Nuôi cấy callus
Callus là một khối tế bào phát sinh vơ tổ chức, có hình dạng khơng nhất định
do khơng có nhu mơ. Callus được hình thành từ mặt cắt của thân hay rễ, bao gồm các
tế bào nhu mơ và thành phần tế bào rây. Callus hình thành ở hầu hết các bộ phận của
cây (thân, lá, rễ) khi nơi đó có vết cắt [10]. Ví dụ như mô sẹo được tạo ra từ cuống
lá, phiến lá và nụ hoa Đồng tiền (Gerbera jamesonii Bolus) [4] hay sự hình thành mơ
sẹo từ chồi cây thơng đỏ Hymalaya (Taxus wallichiana Zucc.) [11]. Trong quá trình
phát triển callus thường xuất hiện 2 loại tế bào: loại tế bào xốp, có khơng bào to, nhân

nhỏ và tế bào chất lỗng; loại tế bào chặt, có khơng bào nhỏ, nhân to và tế bào chất
đậm đặc [19].
Sự hình thành callus chia ra 3 giai đoạn: phát sinh callus, phân chia tế bào và
biệt hóa. Trong phase phát sinh callus, sự trao đổi chất kích thích tế bào chuẩn bị phân
chia, giai đoạn này dài hay ngắn phụ thuộc vào tình trạng sinh lý của mô được đưa
vào nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy. Tiếp đến tế bào đi vào giai đoạn phân chia tăng
sinh khối. Cuối cùng tế bào đi vào q trình biệt hóa, xuất hiện sự biệt hóa tế bào và
sự xuất hiện các con đường trao đổi chất dẫn đến sự sản xuất các chất thứ cấp có hoạt
tính sinh học. Callus thường có màu vàng, trắng, xanh hay màu sắc tố anthocyanin.
Sự biệt hóa của tế bào hình thành những chất liệu cấu tạo nhu mơ các loại, các tế bào
rây,… hơn nữa hình thành vùng mơ phân sinh, trung tâm của sự tạo nên chồi và rễ
[10].
Nuôi cấy callus đạt được bằng cách nuôi cấy các mẫu mô tách từ thực vật trên
môi trường dinh dưỡng cơ bản có chất làm rắn là agar [18]. Sau khi callus hình thành
sẽ được cấy truyền lên mơi trường cũng giống như môi trường tạo callus nhưng chất
sinh trưởng được giảm nồng độ. Kích thước tách mơ sẹo nhỏ vừa phải để tế bào phát
triển mạnh nhất, thường cụm callus có kích thước 5 – 10 mm và có trọng lượng 20 –


4

100 mg, thời gian giữa 2 lần cấy truyền là 20 – 30 ngày phụ thuộc vào từng loại callus.
Callus cấy truyền càng nhiều lần khả năng tái sinh càng giảm [10].
1.1.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật
Nuôi cấy tế bào huyền phù là phương thức nuôi cấy tế bào đơn (single cell)
hay cụm nhiều tế bào (cell aggregate) ở trạng thái lơ lửng trong môi trường lỏng.
Dịch huyền phù được tạo ra do sự nuôi cấy một mảnh mơ sẹo khơng có khả năng biệt
hóa, trong mơi trường lỏng và được chuyển động (lắc hoặc khuấy) trong suốt thời
ni cấy. Trong q trình ni cấy, các tế bào sẽ dần dần tách ra khỏi mô sẹo và phân
tán trong mơi trường lỏng do những chuyển động xốy của môi trường. Sau một thời

gian ngắn trong dịch huyền phù sẽ có các tế bào đơn, các cụm tế bào với kích thước
khác nhau, các mẫu ni cấy cịn thừa chưa phát triển và các tế bào chết. Tuy nhiên,
cũng có những dịch huyền phù hồn hảo, chứa tỷ lệ cao các tế bào đơn và tỷ lệ nhỏ
các cụm tế bào [9]. Mức độ tách rời của tế bào trong ni cấy phụ thuộc vào đặc tính
của các khối tế bào xốp và có thể điều chỉnh bằng cách thay đổi thành phần môi
trường [61].
Cho đến nay, nuôi cấy huyền phù tế bào là phương thức được sử dụng nhiều
nhất để nghiên cứu và sản xuất các chất có hoạt tính sinh học cao. Năm 1994, Yeh và
cs đã nghiên cứu sản xuất diosgenin bằng nuôi cấy tế bào huyền phù của cây
Dioscorea doryophora. Nuôi cấy tế bào huyền phù được thiết lập bằng cách đưa
callus vào môi trường có 0,2 mg/l chất 2,4-D. Nồng độ saccharose thích hợp cho tổng
hợp diosgenin là 3%. Lượng diosgenin thu được trong trường hợp này đạt tới 3,2%
khối lượng khô. Sản xuất diosgenin từ cây D. doryophora bằng nuôi cấy tế bào huyền
phù hiện nay đã được ứng dụng trên quy mô công nghiệp [82]. Quách Ngô Diễm
Phương và cs (2010) cũng đã nghiên cứu nuôi cấy mô sẹo và dịch huyền phù tế bào
cây bèo đất Drosera burmanni Vahl cho mục tiêu thu nhận quinone. Kết quả nghiên
cứu cho thấy, môi trường tạo mô sẹo tốt nhất là môi trường Gamborg’s B5, saccharose
20g/l, casein 100mg/l, PVP 1g/l bổ sung 2,4-D 0,2mg/l, NAA 0,2mg/l, sinh khối tế
bào tăng trưởng mạnh nhất vào ngày thứ 12 [14]. Hay trong nghiên cứu sự hình thành
mơ sẹo và tế bào đơn cây Kiwi (Actinidia deliciosa) của Dương Tấn Nhựt và cs
(2012). Số tế bào đơn thu được cao nhất là 342 tế bào/µl sau 16 ngày nuôi cấy; 0,8 g


5

mơ sẹo trong 20 ml mơi trường MS lỏng có bổ sung 0,6 mg/l 2,4-D; 60 g/l sucrose
và pH môi trường là 6,1 [12].
1.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến q trình ni cấy tế bào thực vật
1.1.3.1. Mơi trường nuôi cấy
Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong sự tăng trưởng và phát triển

hình thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy mô là thành phần môi trường nuôi
cấy. Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào và mô thực vật thay đổi tùy theo lồi, bộ
phận ni cấy và cách thức ni cấy [9].
- Nguồn carbon: Trong môi trường nuôi cấy nhân tạo, nguồn carbon giúp mô
và tế bào thực vật tổng hợp nên các chất hữu cơ để tế bào phân chia, tăng sinh khối
khơng phải từ q trình quang hợp mà chính là nguồn carbon bổ sung vào môi trường
dưới dạng đường. Hai dạng đường thường gặp nhất là glucose và sucrose [3]. Các
nguồn carbonhydrate khác cũng được tiến hành thử nghiệm như lactose, galactose,
rafinose, maltose và tinh bột nhưng hiệu quả kém hơn so với glucose và sucrose.
Sucrose là một nguồn carbon quan trọng đối với mô và tế bào nuôi cấy. Nồng độ
sucrose ban đầu có thể ảnh hưởng đến một số tham số nuôi cấy như tốc độ tăng trưởng
và sản lượng hợp chất thứ cấp trong tế bào ni cấy [3]. Ví dụ như trong nghiên cứu
ni cấy tế bào và tái tạo mô sẹo từ huyền phù tế bào cây thông đỏ Hymalaya của
Dương Tấn Nhựt và cs (2007) thì điều kiện tốt nhất để tạo huyền phù tế bào là môi
trường bổ sung 60 g/L sucrose, tuy nhiên môi trường để mô sẹo tái tạo tốt nhất là 20
g/L sucrose [11].
- Nguồn Nitơ: Mô tế bào thực vật trong ni cấy có thể sử dụng các dạng nitơ
khoáng như amon (NH4+) và nitrat (NO3-), đồng thời có thể sử dụng các dạng hữu cơ
như axit amin. Tỷ lệ giữa Nitơ dạng amon và nitrat tích hợp tùy loại cây và trạng thái
phát triển mô [3].
- Các chất ĐHST: Trong môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật, thành
phần phụ gia quan trọng nhất quyết định kết quả nuôi cấy là các chất ĐHST. Chúng
là yếu tố quan trọng nhất trong điều khiển sự phát sinh hình thái và tái sinh cây hồn
chỉnh. Có 5 nhóm chất ĐHST quan trọng trong ni cấy mơ thực vật: auxin,
cytokinin, gibberellin, ethylen, abscisic acid [47]. Miller là người đầu tiên nhận thấy


6

tỉ lệ auxin/cytokinin xác định dạng phân hóa cơ quan của tế bào thực vật nuôi cấy [3].

Cả auxin và cytokinin đều được bổ sung vào môi trường nuôi cấy để kích thích sự
phát sinh hình thái và tỷ lệ hormone sử dụng để kích thích sự tạo chồi hay tạo rễ là
không giống nhau. Trong nghiên cứu của Phan Duy Hiệp và cs (2014) về ảnh hưởng
của chất điều hịa sinh trưởng thực vật lên sự phát sinh hình thái của một số giống
sâm Bố chính (Hibiscus sagittifolius kurz) trong điều kiện in vitro. Sau 30 ngày nuôi
cấy, hệ số nhân chồi các giống hoa màu vàng, đỏ và hồng hình thành đạt cao nhất
(4,5 chồi/mẫu) khi cấy mẫu trên môi trường MS bổ sung 1 mg/l BA, nước dừa 10%,
0,2 mg/l GA3. Sau 30 ngày nuôi cấy chồi in vitro tạo rễ bất định và tăng trưởng tốt
nhất (6,6 rễ/chồi và chiều cao 10,5 cm/chồi) khi được nuôi trên môi trường MS bổ
sung 0,5 mg/l IBA và 0,5 mg/l NAA [5]. Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất ĐHST
đến sự phát sinh hình thái của mơ lá cây Hoắc hương (Pogostemon cablin (Blaco)
Benth) nuôi cấy in vitro đã tiến hành bổ sung riêng rẽ và kết hợp các auxin (NAA,
IBA, 2,4-D) và cytokinin (BAP, KIN) vào môi trường MS ở các nồng độ khác nhau.
Tỷ lệ hình thành mô sẹo cao nhất khi bổ sung phối hợp NAA với BAP. Chồi cũng
hình thành ở các cơng thức sử dụng môi trường MS bổ sung NAA, IBA và KIN riêng
rẽ. Chồi khơng hình thành ở các cơng thức bổ sung 2,4-D. Nhiều thể chồi hình thành
ở mơi trường bổ sung 0,5 và 0,7 mg/l BAP. Ở các nồng độ bổ sung BAP khác, chồi
khơng hình thành. Ngồi ra, ở các công thức phối hợp NAA (0,5 mg/l) và BAP tỷ lệ
hình thành chồi rất thấp và giảm đi khi hàm lượng BAP tăng lên và ở nồng độ 1 mg/l
BAP chồi khơng được hình thành [1].
1.1.3.2. Điều kiện ni cấy
Ngồi mơi trường ni cấy, các điều kiện mơi trường như ánh sáng, nhiệt độ,
tốc độ lắc cũng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của tế bào thực vật.
- Ánh sáng: Ánh sáng có ảnh hưởng đến mẫu cấy thơng qua thời gian chiếu
sáng, cường độ ánh sáng và chất lượng ánh sáng [13]. Với đa số các loài cây, thời
gian chiếu sáng thích hợp là 8 - 12 giờ/ngày [68]. Cường độ ánh sáng là một nhân tố
quan trọng trong quang hợp, ảnh hưởng đến khả năng nuôi cấy in vitro cây có lá xanh.
Việc ni cấy in vitro tốt nhất trong điều kiện ánh sáng 1000 lux (Dương Công Kiên,
2002). Tuy nhiên, trong nghiên cứu ảnh hưởng của cường độ ánh sáng và hàm lượng

7

đường sucrose trong môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của chồi Dưa hấu tam bội
in vitro thì cường độ ánh sáng tốt nhất là 1800 lux [15], hay trong nghiên cứu sự hình
thành mơ sẹo và tế bào đơn cây Kiwi, Dương Tấn Nhựt sử dụng cường độ chiếu sáng
2.500-3.000 lux [12].
- Nhiệt độ: Theo Murashige (1974), nhiệt độ ảnh hưởng sâu sắc đến sinh
trưởng và phát triển cây in vitro qua những tiến trình sinh lý như hơ hấp hay hình
thành tế bào hay cơ quan. Nhiệt độ thích hợp cho ni cấy mơ là 20-27oC, cịn đối
với mơ sẹo thì phạm vi nhiệt độ chỉ từ 17 - 250C [13].
- Tốc độ lắc: là yếu tố quan trọng trong nuôi cấy huyền phù tế bào, ảnh hưởng
đến khả năng trao đổi chất trong q trình ni cấy. Theo nghiên cứu của Trần Thị
Kiều Oanh (2015), tốc độ lắc thích hợp cho ni cấy huyền phù tế bào cây mật nhân
là 120 vòng/phút. Nếu tốc độ lắc thấp hoặc cao hơn (80 và 140-160 vòng/phút) đều
bất lợi cho sinh trưởng của tế bào [13].
1.2. Sự tích lũy các hợp chất thứ cấp trong tế bào thực vật nuôi cấy in vitro
Thực vật là nguồn cung cấp các hợp chất dùng làm dược liệu hoặc phụ gia
thực phẩm có giá trị. Những sản phẩm này được biết như là các chất trao đổi thứ cấp,
được sinh tổng hợp từ sản phẩm trao đổi chất sơ cấp và chức năng trao đổi chất chưa
được biết đầy đủ. Sản phẩm trao đổi chất thứ cấp hiện diện ở thực vật với lượng nhỏ
hơn nhiều so với sản phẩm trao đổi chất sơ cấp. Sản phẩm thứ cấp không phải lúc nào
cũng cần thiết nên thực vật chỉ sản xuất khi có áp lực chọn lọc. Chúng dường như là
sản phẩm của các phản ứng hóa học của thực vật với mơi trường hoặc là sự bảo vệ
hóa học chống lại vi sinh vật và động vật [8]. Hơn nữa, chúng thường được tổng hợp
ở những tế bào đặc biệt, trong những giai đoạn nhất định nên việc chiết tách, cô lập
và tinh chế rất khó khăn. Do đó, các sản phẩm trao đổi chất thứ cấp có hoạt tính sinh
học được dùng trong thương mại (làm dược liệu, hương liệu, gia vị hay thuốc trừ sâu)
thường có giá trị cao nhưng lại có số lượng rất hạn chế [8].
Các hợp chất thứ cấp của thực vật có thể phân thành ba nhóm chính là alkaloid,

tinh dầu và các glycoside.
- Nhóm alkaloid: có dạng tinh thể là các hợp chất chứa nitrogen, có hoạt
tính sinh lý trên tất cả động vật và được sử dụng trong công nghiệp dược. Họ alkaloid


8

bao gồm: codein, nicotine, caffeine và morphine. Các alkaloid có hoạt tính sinh học
rất khác biệt, một số tác dụng lên hệ thần kinh (caffeine, atropine, strychnine..), một
số tác dụng lên các cơ (veratrin, atropine…), một số tác dụng lên mạch máu
(hydrastin, aphedrin…), một số khác tác dụng lên bộ máy hô hấp [8]. Alkaloid thường
độc với liều lượng lớn nhưng với liều lượng nhỏ, chúng được sử dụng làm thuốc chữa
bệnh [61].
- Các tinh dầu: Chứa hỗn hợp terpenoid, được sử dụng như chất mùi, chất
thơm và dung môi. Giống như những lipid khác, các terpenoid không tan trong nước
[8]. Terpen là dẫn chất của các đơn vị isoprene. Cấu trúc hóa học của nó có chứa
khung carbon (C5)n và được phân thành 7 loại: các hemiterpene (C5), các
monoterpene (C10), các sesquiterpene (C15), các diterpene (C20), các sesterterpene (C25),

các triterpene (C30) và các tetraterpene (C40) [16]. Monoterpene có nhiều trong

tinh dầu thực vật như Limonen, linalool, citral, menthol, α-terineol… thường được
ứng dụng trong mỹ phẩm, trị liệu, sát trùng, diệt sâu bộ. Các sesquiterpene có mặt
trong cúc thơm, Thanh hao hoa vàng, cây Bông dùng trong điều trị thấp khớp, đau
đầu, chống viêm… Artemisinin là một sesquiterpene có cầu nối peroxit hiếm gặp, có
hoạt tính trị sốt rét cao [16]. Triterpene, tetraterpene cũng được sử dụng nhiều trong
dược phẩm.
- Các glycoside: bao gồm các hợp chất phenol và flavonoid, saponin và các
cyanogenic glycoside, một số trong chúng được sử dụng làm thuốc nhuộm, chất mùi
thực phẩm và dược phẩm [51].

1.3. Chất kích kháng bảo vệ thực vật (elicitor)
1.3.1. Sự kích kháng bảo vệ thực vật (elicitation)
Thực vật sản xuất các hợp chất thứ cấp trong tự nhiên như một bộ máy bảo vệ
chống lại các yếu tố gây bệnh. Chất kích kháng bảo vệ thực vật (elicitor) báo hiệu
việc hình thành các hợp chất thứ cấp. Sử dụng các elicitor của bộ máy bảo vệ cây,
tức sự kích kháng bảo vệ thực vật, là phương thức để nâng cao tích lũy các hợp chất
thứ cấp trong ni cấy tế bào [Eilert, 1987]. Chúng kích thích hình thành các hợp chất
thứ cấp trong q trình ni cấy tế bào, có thể giúp rút ngắn thời gian và đạt hiệu suất
cao [8].


9

Trên cơ sở của tự nhiên, elicitor có thể được chia thành hai loại sinh học (biotic
elicitor) và phi sinh học (abiotic elicitor). Biotic Elicitor là những chất có nguồn gốc
sinh học bao gồm các polysaccharides từ thành tế bào thực vật (ví dụ như kitin, pectin,
và cellulose) và vi sinh vật. Abiotic Elicitor bao gồm các chất có nguồn gốc phi sinh
học như các tác nhân vật lý, hóa học, và các yếu tố nội tiết tố (acid jasmonic, acid
salicylic) [67].
1.3.2. Một số chất kích kháng thường dùng
- Jasmonate: bao gồm acid jasmonic (JA) và dẫn xuất methyl
jasmonate (MeJA), hormon thực vật được tạo ra để phản ứng lại áp lực có thể di
chuyển khá nhanh khắp cây. Chúng có thể kích hoạt các enzyme chịu trách nhiệm
cho sự sinh tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp trong cây khi cây đối mặt với các
stress của môi trường, các tổn thương hay sự tấn công của các mầm bệnh [81]. JA và
MeJA kích thích việc sản xuất một loạt các chất chuyển hóa trung gian trong thực vật
như axit rosmarinic, terpenoid indole alkaloid, và plumbagin trong nuôi cấy tế bào
khác nhau [48], [75]. Các nghiên cứu cho thấy, JA kích thích sản xuất axit rosmarinic
trong Mentha piperita [48], anthocyanin trong Vitis Vinifera [33], và plumbagin
trong nuôi cấy rễ tơ Plumbago indica [39]. Các MeJA giúp tăng cường sản xuất

bacoside A, một triterpenoid saponin có hoạt tính điều trị nootropic trong nuôi cấy
chồi cây Bacopa monnieri [72]. Trong nuôi cấy tế bào Andrographis paniculata, các
MeJ giúp sản xuất hàm lượng lớn andrographolide [73].
- Acid salicylic (SA): một phân tử nhỏ với vai trò quan trọng trong hệ thống
quản lý bảo vệ cây trồng, được biết đến với khả năng đề kháng gây ra trong các chuỗi
phản ứng chống lại các tác nhân gây bệnh, kích thích sản xuất các chất chuyển hóa
thứ cấp trong cây [67]. Ví dụ như kích thích sản xuất các alkaloid như vincristine và
vinblastine trong cây dừa cạn [44] hay tăng cường sản xuất stillbene trong nuôi cấy
huyền phù tế bào V. Vinifera [33].
- Polysacchatde: là một biotic elicitor được sử dụng để tăng sản xuất các chất
chuyển hóa thứ cấp trong cây thuốc. Trong nuôi cấy huyền phù tế bào Panax ginseng,
axit oligogalacturonic được dùng như một chất kích kháng giúp tăng đáng kể hàm
lượng saponin nhân sâm [43]. Chitosan giúp tăng cường sản xuất trans-resveratrol và


10

viniferins trong nuôi cấy tế bào V. Vinifera [78]. Hay chitin giúp sản xuất
phenylpropanoid

và

naphtodianthrone

trong

nuôi

cấy

huyền

phù

tế

bào Hypericum perforatum [76].
- Yeast extract (YE): dịch chiết nấm men được sử dụng như một chất kích
kháng sinh học giúp tăng cường sản xuất các hợp chất thứ cấp trong cây. Dịch chiết
nấm men kích thích sinh tổng hợp ethylene trong cà chua [38] và kháng khuẩn trong
đậu (Phaseolus vulgaris) [77]. Dịch chiết nấm men cũng giúp sản xuất tanshinone
trong nuôi cấy rễ Perovskia abrotanoides [25].
- Nấm: Elicitor Biotic sản xuất bởi các mầm bệnh chủ yếu được sử dụng để
tạo ra các phản ứng bảo vệ thực vật. Việc sử dụng các chế phẩm nấm gây bệnh và
không gây bệnh như elicitor đã trở thành một trong những chiến lược hiệu quả nhất
để tạo ra phenylpropanoid/con đường sinh tổng hợp flavonoid trong tế bào thực vật
[50]. Trong nuôi cấy tế bào Papaver somniferum, bào tử nấm giúp tăng hàm lượng
codeine, morphine và sanguinarine hơn 8 lần [27]. Một hỗn hợp của polysaccharides
từ nấm tăng lượng kháng sinh alkaloid epoxide acridone lên đến 100 lần trong ni
cấy Ruta graveolens [35]. Tế bào Taxus chinensis được kích kháng bằng một loại
nấm endophytic tìm thấy trong vỏ cây T. chinensis sản xuất gấp ba lần so với tế bào
taxol khơng được kích kháng [80]. Hàm lượng thiarubrine A đã được tăng cường gấp
3 lần trong nuôi cấy rễ tơ Ambrosia artemisiifolia thông qua việc sử dụng thành tế
bào nấm Protomyces gravidus, một tác nhân gây bệnh của A. artemisiifolia [28].
1.3.3. Những nghiên cứu bổ sung chất kích kháng trong sản xuất các hợp chất thứ
cấp từ nuôi cấy tế bào thực vật
1.3.3.1. Những nghiên cứu ngồi nước
Ni cấy tế bào huyền phù có bổ sung chất kích kháng thực vật để tăng hiệu
suất tổng hợp các hoạt chất sinh học trong tế bào, tăng hàm lượng hoạt tính sinh học
cao đã được nhiều nhà khoa học trên thế giới chú trọng quan tâm đến trong những

năm gần đây.
Năm 2011, Peiqin và cs đã nghiên cứu sự ảnh hưởng của Polysaccharide từ
nấm Fusarium oxysporium Dzf17 lên sự phát triển và sản xuất diosgenin trong nuôi
cấy tế bào huyền phù cây Củ Mài Gừng (Dioscorea zingiberensis). Các tác giả đã sử


11

dụng ba polysaccharides là exopolysaccharide (EPS), dịch chiết sợi nấm
polysaccharide (WPS) và dịch chiết NaOH sợi nấm polysaccharide (SPS) từ nấm
Fusarium oxysporium Dzf17 được cô lập ở rễ của cây Củ Mài Gừng. Kết quả cho
thấy, sự tăng trưởng và tích lũy diosgenin trong ni cấy tế bào huyền phù cây Củ
Mài Gừng khi bổ sung WPS là cao nhất. Cụ thể, khi WPS đã được thêm vào môi
trường ở mức 20 mg/L vào ngày nuôi cấy thứ 25, trọng lượng khô tế bào được tăng
lên 1,34 lần, hàm lượng diosgenin 2,85 lần, và diosgenin mang lại 3,83 lần so với
bình thường. EPS và SPS cho thấy tác dụng tăng cường độ vừa phải và tương đối yếu
trong sự tăng trưởng tế bào và tích lũy diosgenin tương ứng [66]. Một nghiên cứu
khác cũng sử dụng chất kích kháng sinh học có nguồn gốc từ nấm. Trichoderma
atroviride D16 là một loại nấm endophytic phân lập từ rễ Đan sâm (Salvia
miltiorrhiza) được sử dụng như một chất kích kháng nhằm tăng cường sản xuất
tanshinone I (TI) và tanshinone IIA (T-IIA). Ming và cs đã dùng dịch chiết của sợi
nấm (EM) và phần polysacchatide (PSF) từ T. atroviride D16 trong việc thúc đẩy
tăng trưởng rễ tơ và sinh tổng hợp tansinone trong nuôi cấy rễ tơ cây Đan sâm. Các
kết quả chỉ ra rằng cả EM và PSF đều thúc đẩy tăng trưởng rễ tơ và kích thích sự sinh
tổng hợp các tanshinones trong rễ [60].
Marvin và cs (2012) cũng đã nghiên cứu về ảnh hưởng của chất kích kháng
trong ni cấy rễ cây Kỳ Nham (Hyoscyamus Niger L.) lên sự phát triển của rễ và
sản xuất tropane alkaloids. Trong nghiên cứu này, chitosan, casein hydrolysate, dịch
chiết nấm men và d-sorbitol được dùng như là chất kích kháng nhằm tăng sinh khối
tế bào, phát triễn rễ và sản xuất tropane alkaloids. Bổ sung chitosan trong mơi trường

MS có 0,5 mg/L IBA kìm hãm rễ phát triển và sản xuất sinh khối của H. niger, trong
khi bổ sung thêm casein hydrolysate và d-sorbitol cũng không cho thấy bất kỳ sự gia
tăng đáng kể nào trong sản xuất rễ và tích lũy của scopolamine và hyoscyamine. Bổ
sung dịch chiết nấm men trong nuôi cấy rễ cây H. niger đã không tăng cường rễ phát
triển và sản xuất hyoscyamine nhưng việc bổ sung 0,5 g/L và 1,0 g/L dịch chiết nấm
men tăng cường sản xuất scopolamine. Nhìn chung, kết quả cho thấy rằng mơi trường
MS có bổ sung 0,5 mg/L IBA có thể được sử dụng trong nuôi cấy rễ cây H. niger và


12

chất kích kháng là khơng cần thiết cho việc sản xuất các tropane alkaloids
(scopolamine và hyoscyamine) [57].
Cũng năm 2012, Baque và cs đã nghiên cứu ảnh hưởng của chitosan và pectin
lên sự sinh tổng hợp anthraquinones, phenolics và flavonoids trong nuôi cấy huyền
phù rễ bất định cây Nhàu (Morinda citrifolia L.). Với các kết hợp khác nhau của
chitosan và pectin hoặc chỉ có chitosan dẫn đến tăng cường sinh tổng hợp các chất
chuyển hóa thứ cấp nhưng tăng trưởng của rễ bị ức chế. Nồng độ tối ưu của chất kích
kháng để tăng cường sinh tổng hợp chất chuyển hóa là 0,2 mg/ml chitosan, trong đó
103,16; 48,57 và 75,32 mg/g trọng lượng khô (DW) tương ứng với anthraquinones,
phenolics và flavonoids. Tăng 45%, 8% và 12% so với nuôi cấy không bổ sung chất
kích kháng. Thời gian tối ưu hóa là cho 0,2 mg/ml chitosan vào ngày nuôi cấy thứ 28
và thu sau 2 ngày bổ sung [58].
Amita và Saumya (2015) cũng đã sử dụng chất kích kháng trong nghiên cứu
nhằm tăng sinh khối solasodine trong nuôi cấy rễ tơ cây cà tím (Solanum melongena
L.). Các chất kích kháng được sử dụng là dịch chiết nấm men (1g/L, 2g/L, 3g/L),
salicylic acid (50 mM, 100 mM, 200 mM, 500 mM) và pectin (0,5%; 1%; 1,5%; 2%).
Kết quả cho thấy ở nồng độ pectin 1% cho hàm lượng solasodine cao nhất (151,23
mg/g trọng lượng khô) gấp 23 lần so với nuôi cấy không bổ sung [21]. Hay Zohreh
và cs (2014) cũng đã nghiên cứu tác dụng kích thích của methyl jasmonate (MeJA)

và squalestatin (S) lên sự trao đổi chất phenolic thông qua cảm ứng hoạt động
lipoxygenase (LOX) trong nuôi cấy huyền phù tế bào cây Thanh tùng Châu Âu (Taxus
baccata). Kết quả cho thấy MeJA và S có thể kích thích sản xuất các dẫn xuất phenol
trong nuôi cấy huyền phù tế bào T. baccata. Song song với sự cảm ứng sản xuất
phenol trong tế bào kích kháng, kết quả cho thấy rằng các hoạt động của enzyme
phenylalanine ammonialyase (PAL) và polyphenol oxidase (PPO) và chất chống oxy
hóa tổng tăng lên đáng kể trong tế bào Taxus khi bổ sung kết hợp 100 mM MeJA và
0,1 mM S, hàm lượng LOX tối đa thu được sau 48 giờ bổ sung chất kích kháng [84].
Một nghiên cứu khác về ảnh hưởng của vi khuẩn lam trong nuôi cấy huyền
phù cây Neem của Devi và cs (2008) cho thấy sự tăng cường sản xuất azadirachtin


13

lên đến 5-6 lần bằng cách bổ sung Anabaena sp. (530 tế bào/ml) hoặc Nostoc carneum
(265 tế bào/ml) trong ngày nuôi cấy thứ 10 [26].
1.3.3.2. Những nghiên cứu trong nước
Ở nước ta, cũng đã có nhiều nghiên cứu về các hợp chất thứ cấp với nhiều mục
đích khác nhau nhằm phục vụ cho ngành công nghiệp dược liệu đang phát triển như
hiện nay song các nghiên cứu bổ sung chất kích kháng thực vật để tăng sinh khối và
hoạt tính sinh học vẫn cịn hạn chế.
Nguyễn Hồng Lộc và cs (2014) nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết nấm
men (YE) và methyl jasmonate (MeJA) lên sinh trưởng và tích lũy solasodine của tế
bào Cà Gai Leo (Solanum hainanense Hance). Kết quả cho thấy nồng độ khác nhau
của MeJA (50-250 μM) và YE (1-4 g/L) có ảnh hưởng kích kháng khác nhau. Sự gia
tăng lượng solasodine khi bổ sung 3 g/L YE và 50 μM MeJA vào lúc bắt đầu nuôi
cấy tế bào tương ứng khoảng 1,9 và 1,3 lần so với tế bào khơng bổ sung chất kích
kháng. Nói chung, YE (biotic elicitor) là hiệu quả trong việc tăng cường sản xuất
solasodine hơn MeJA (abiotic elicitor) [64].
Curcumin là hoạt chất sinh học có tác dụng chống ung thư, bảo vệ gan, kháng

viêm, khống lt, kháng oxy hóa. Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết nấm men
lên khả năng tích lũy curcumin của tế bào nghệ đen (Curcuma zedoaria) đã được
Trần Vũ Ngọc Thi (2014) thực hiện. Kết quả nghiên cứu bước đầu cho thấy tế bào
nghệ đen sinh trưởng trong bình ni cấy huyền phù 250 mL đạt sinh khối cực đại
sau 14 ngày nuôi cấy tăng 2,74 lần so với ban đầu. Dịch chiết nấm men nồng độ từ
0,5-4,0 g/L có tác dụng ức chế sự tích lũy sinh khối của tế bào nghệ đen nuôi cấy
huyền phù trong bình 250 mL. Sinh khối khơ thấp nhất tại nồng độ 4,0 g/L chỉ đạt
6,2g tươi (0,51 g khô), giảm 29,17% so với đối chứng. Hàm lượng curcumin tăng dần
khi bổ sung từ 0,5-1,0 g/L dịch chiết nấm men vào mơi trường ni cấy. Hàm lượng
curcumin tích lũy cao nhất tại nồng độ dịch chiết nấm men là 1,0 g/L, đạt 31,69 µg/g
khơ, tăng 32,04 % so với đối chứng. Ở các nồng độ cao hơn 1,0 g/L, hàm lượng
curcumin giảm dần [16].


14

1.4. Giới thiệu về cây mật nhân
Cây mật nhân có tên khoa học là Eurycoma longifolia Jack, thuộc họ Thanh
thất (Simaroubaceae). Ngồi ra cây mật nhân cịn có các tên gọi khác nhau như Bá
bịnh, Bá bệnh, Bách bệnh, Lồng bẹt, Nho nan (Tày), Tongkat Ali ở Malaysia,
Pasakbumi hoặc Bidara Pahit ở Indonesia, Lan-don ở Thái Lan và tiếng Anh là
Longjack [71].
1.4.1. Nguồn gốc và phân bố
Mật nhân có mặt trong các khu rừng tự nhiên ở các nước trong khu vực Đông
Nam Á và một số khu vực lân cận. Phân bố rộng rãi từ Myanmar đến các nước Đông
Dương, Malaysia, Thái Lan, đảo Samatra, Bornco (Indonesia) và Philippin. Lồi này
cịn xuất hiện ở phía nam Trung Quốc, Ấn Độ [2].
Ở Việt Nam, cây mật nhân đã được phát hiện tại Vườn quốc gia Bái Tử Long
từ năm 2000, đến năm 2006 các nhà khoa học thuộc Trường Đại học Dược Hà Nội
đã nghiên cứu và công bố cây mật nhân ở Việt Nam có tác dụng dược lý tương đương,

có phần vượt trội so với cây có nguồn gốc từ các nước khác [17]. Cây mật nhân phân
bố rãi rác ở các tỉnh vùng núi thấp và trung du, tập trung ở các tỉnh Tây Nguyên, Miền
Trung, Đồng Nai, Quảng Ninh [6].
1.4.2. Đặc điểm hình thái
Theo Đỗ Huy Bích và cs (2006), cây mật nhân là cây thân gỗ nhỏ, có chiều
cao trung bình từ 2 – 8 m. Cây khơng có cành hoặc ít phân cành và thường mọc dưới
tán của những cây lớn. Cây mật nhân là lồi đơn tính khác gốc nên mỗi cây thường
chỉ trổ hoa đực hoặc hoa cái.
Lá cây có dạng hình kép, lông chim lẻ, mọc theo kiểu so le, gồm từ 21 – 25 lá
chét khơng có cuống, mọc như sánh đơi nhau. Lá cây có dạng hình mác hoặc bầu dục,
với góc lá thn, đầu nhọn, mặt trên lá có màu xanh sẵm bóng cịn mặt dưới lá có
màu trắng xám và có lơng, cuống lá kép có màu nâu đỏ [29].
Cây mật nhân có cụm hoa mọc ở ngọn thành chùm kép hoặc chùm rộng, cuống
hoa có lơng và có màu rỉ sắt. Hoa có màu đỏ nâu, đài hoa được chia thành năm thùy
hình tam giác; tràng hoa có năm cánh hình thoi, nhị có lơng dày và hai vảy ở gốc, bầu
có 5 nỗn, đầu nhụy rời.


15

Quả có dạng hình trứng hơi dẹt, nhẵn, có rãnh dọc ỡ giữa dài từ 1  2 cm,
ngang khoảng 0,5  1 cm, chứa một hạt, trên mặt hạt có nhiều lơng ngắn. Quả khi
cịn non có màu xanh và chuyển dần sang màu đỏ sẫm khi chín [37].
Cây ra hoa thường là từ tháng 1 đến tháng 2 hàng năm và kết quả vào khoảng
từ tháng 3 đến tháng 4. Cây thường bắt đầu ra quả sau 2 – 3 năm trồng và cây hoàn
toàn trưởng thành sau 25 năm [2].
1.4.3. Thành phần hóa học
Các hoạt chất của mật nhân tập trung hầu hết ở rễ. Cho đến nay gần 65 hợp
chất được tìm thấy ở rễ cây mật nhân, phần lớn trong các hoạt chất của này là các hợp
chất quassinoids, các dẫn xuất squalene, các alkaloid loại canthin, các alkaloid

carbolin,…[69], [71].
Quassinoids: eurycomanone (pasakbumin-A), eurycomanols, pasakbumin-B,
hydroxyklaineanones,

eurycomalactones,

eurycomadilactones,

eurylactones,

laurycolactones, longilactones, và hydroxyglaucarubol đã được phân lập từ rễ của E.
longifolia [32], [34], [59]. Các dẫn xuất squalene bao gồm eurylene, 14deacetyleurylene; longilene peroxide và teurilene [45], [66], [71]. Lớp biphenyl
neolignans bao gồm: 2-hydroxy-3,2,6-trimethoxy-4 (2,3-epoxy-1-hydroxypropyl) 5- (3-hydroxy-1-propenyl) -biphenyl; hai đồng phân 2,2-dimetoxy-4- (3-hydroxy-1propenyl) -4 (1,2,3-trihydroxypropyl) diphenyl ethers; và 2-hydroxy-3,2-dimetoxy-4
(2,3-epoxy-1-hydroxypropyl) -5- (3 hydroxy-1-propenyl) biphenyl [63]. Alkoids bao
gồm: 9,10-dimetoxy canthin-6-one; 10-hydroxy-9-methoxy canthin-6-one; 11hydroxy-10-methoxy canthin-6-one; 5,9-dimetoxy canthin-6-one và 9-methoxy-3methyl canthin-5,6-dione [41], [83].
1.4.4. Tác dụng dược lý
Từ nhiều năm qua các dân tộc Đông Nam Á cũng như Việt Nam đã sử dụng
rễ của cây mật nhân để chữa nhiều chứng bệnh khác nhau và được khoa học hiện đại
lâm sàng chứng minh như chữa sốt rét, làm hạ sốt, giảm đau nhức, hạ cao huyết áp,
chống nhiễm trùng da, nhiễm trùng đường ruột, giảm mệt mỏi tinh thần và thể chất,
tăng sức chịu đựng và dẻo dai, giảm nguy cơ loãng xương ở người cao tuổi, tạo hồng
cầu, cải thiện tuần hoàn và tăng cường hệ miễn dịch, đặc biệt là tính tráng dương rất


16

mạnh [65], [71]. Trong những năm gần đây, một số phát hiện mới được công bố cho
thấy cây mật nhân có khả năng kháng tế bào ung thư, chống oxy hóa (chống lão hóa)
và an thần [55], [56].
Hầu như tất cả các bộ phận của cây đều được sử dụng cho sản xuất thuốc chữa

bệnh (Jiwajinda và cs, 2002; Osman và cs, 2003). Vỏ thân được dùng để chữa các
trường hợp ăn uống không tiêu, nôn mửa, đầy bụng, tiêu chảy, chữa sốt rét, giải độc
do uống nhiều rượu và chữa lưng đau mỏi do thấp. Lá nấu nước tắm chữa ghẻ lở,
chàm ở trẻ em. Quả được dùng trong chữa lỵ [23]. Rễ dùng chữa sốt, ngộ độc, căng
thẳng, say rượu và tẩy giun [71]. Ngoài ra, trong rễ cịn có chứa hợp chất được cho là
có hoạt tính kích thích sinh dục nam bằng cách giúp cơ thể sản sinh nội tiết tố
testosterone một cách tự nhiên sau khi được sử dụng [20], [65]. Đây chính là tác dụng
độc đáo và nổi bật nhất đang được nghiên cứu nhiều nhất ở cây mật nhân.
1.4.5. Một số nghiên cứu trên cây mật nhân
Mật nhân - một cây chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học với rất nhiều
cơng dụng cũng được các nhà khoa học hướng đến. Năm 2001, Ang và cs đã phân
lập được 3 quassinoids là eurycolactone D, eurycolactone E và eurycolactone F từ rễ
mật nhân ngoài tự nhiên [24]. Hay năm 2004, Kuo và cs đã tách chiết được gần 65
hợp chất hữu cơ từ rễ của mật nhân trong đó có các hợp chất như eurycomalide A;
eurycomalide B; 13, 21 - dihydroxyeurycomanol B và 5, 14, 15 trihydroxyklaineanone [43]. Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng những hợp chất từ mật
nhân có tác dụng dược liệu cao, ví dụ như Yusuf và cs đã cô lập được 4 hợp chất gồm
β-carboline-propionic

acid,

eurycomanone,

18-dehydro-6α-

hydroxyeurycomalactone, and eurycomanol từ rễ cây Mật nhân có tác dụng chống
sót rét [42]. Hay Low và cs (2011) đã phân tích huyết tương để tìm hiểu về thời gian
bán hủy của 4 chất thuộc quasinoid gồm 13α(21)-epoxyeurycomaone (EP),
eurycomaone (EN), 13α,21-dihydroeurycomaone (ED) và eurycomanaol (EL) sau
khi cho chuột uống Fr2 (dịch chiết từ Eurycoma longifolia Jack) liều 200mg/kg và
tiêm qua đường tĩnh mạch liều 100 mg/kg. Kết quả cho thấy EP và EN có thể là những

chất có tác dụng trong điều trị bệnh sốt rét [52], cịn Jiwajinda và cs đã tìm ra các loại