Nghiên cứu định danh tỏi lý sơn allium sativum l bằng kỹ thuật chỉ thị phân tử SSR

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
KHOA SINH – MÔI TRƢỜNG

MAI XUÂN CƢỜNG

NGHIÊN CỨU ĐỊNH DANH TỎI LÝ SƠN (ALLIUM SATIVUM L.)
BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR

Đà ẵng
N- Năm2019


ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
KHOA SINH – MÔI TRƢỜNG

MAI XUÂN CƢỜNG

NGHIÊN CỨU ĐỊNH DANH TỎI LÝ SƠN (ALLIUM SATIVUM L.)
BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Giảng viên hƣớng dẫn: TS. NGUYỄN MINH LÝ

Đà ẵng
N–Năm

2019


LỜI CAM ĐOAN
Đề tài: “Nghiên cứu định danh tỏi Lý Sơn (Allium sativum L.) bằng chỉ thị phân tử
SSR” là tơi thực hiện. Mọi số liệu, hình ảnh, kết quả là hồn tồn lấy từ các thí nghiệm sau
khi thực hiện. Các tài liệu có trong bài được tìm trong các sách, bàibáo, tạp chí… trong
nước và thế giới đáng tin cậy và chính xác.
Tác giả

Mai Xuân Cƣờng

i


LỜI CẢM ƠN
Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô khoa Sinh học-Môi trường, Trường Đại học
Sư phạm-Đại học Đà Nẵng đã tận tình giúp đỡ chúng em trong suốt 4 năm học qua.
Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Minh Lý, người đã tận tình
hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất để em hồn thành tốt khố luận tốt
nghiệp này.
Cũng xin được gửi lời cảm ơn đến Hội động vật FrankFurt đã hỗ trợ một phần kinh
phí để em thực hiện đề tài này và tập thể lớp Cơng Nghệ Sinh học khố 2015-2019 đã ln
bên cạnh quan tâm và giúp đỡ tôi trong thời gian qua.
Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn!

ii


MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN .................................................................................................................. 1
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................................ ii
MỤC LỤC............................................................................................................................. iii
DANH MỤC BẢNG .............................................................................................................. v
DANH MỤC HÌNH .............................................................................................................. vi
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................................. vii
MỞ ĐẦU ................................................................................................................................ 1
1. Tính cấp thiết ................................................................................................................... 1
2. Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................................ 1
3. Ý nghĩa của đề tài ........................................................................................................... 2
3.1 Ý nghĩa khoa học ........................................................................................................................2
3.2 Ý nghĩa thực tiễn .........................................................................................................................2
Chƣơng I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................................. 3
1.1 Giới thiệu về cây tỏi ...................................................................................................... 3
1.2 Các phương pháp định danh tỏi ..................................................................................... 4
1.2.1 Phân tích hình thái ................................................................................................ 4
1.2.2 Phân tích sinh hóa ...................................................................................................................4
1.2.3 Định danh loài tỏi bằng chỉ thị phân tử .............................................................................5
Chƣơng II: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 8
2.1 Vật liệu nghiên cứu ....................................................................................................... 8
2.2 Phạm vi nghiên cứu ....................................................................................................... 8
2.3 Nội dung nghiên cứu ..................................................................................................... 8
2.4 Phương pháp nghiên cứu ............................................................................................... 8
2.4.1 Phương pháp phân tích một số đặc điểm hình thái ........................................................8
2.4.2 Phương pháp thiết kế mồi SSR trên hệ gen lục lạp của tỏi ..........................................8
2.4.3 Phương pháp tách chiết DNA ..............................................................................................9
2.4.4 Phương pháp PCR ...................................................................................................................9
iii

2.4.5 Phương pháp điện di ...............................................................................................................9
2.4.6 Phương pháp xử lý dữ liệu .................................................................................... 9
Chƣơng III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................... 11
3.1 Nghiên cứu hình thái các loại tỏi ................................................................................. 11
3.1.1 Đặc điểm hình thái bên ngồi của các loại củ tỏi. ........................................................11
3.1.2. Đặc điểm cấu trúc bên trong của các loại củ tỏi ..........................................................12
3.2 Thiết kế chỉ thị phân tử SSR nhận biết các loại tỏi ..................................................... 16
3.3 Tách chiết DNA tổng số .............................................................................................. 16
3.4 Tối ưu hóa phản ứng PCR ........................................................................................... 17
3.4.1 Khảo sát thành phần phản ứng ...........................................................................................17
3.4.2 Mẫu DNA đại diên ............................................................................................... 17
3.5 Sự khác biệt về di truyền của các loài tỏi .................................................................... 18
3.6 Mối quan hệ và khoảng cách di truyền giữa các mẫu tỏi dựa trên phân tích ............. 18
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................................ 23
1.Kết luận .......................................................................................................................... 23
2.Kiến nghị ........................................................................................................................ 23
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................................. 24
1 Tài liệu nước ngoài ......................................................................................................... 24
2 Tài liệu Việt Nam ............................................................................................................ 26

iv


DANH MỤC BẢNG
Bảng

Nội dung

Trang

Bảng 3.1

Đặc điểm bên ngoài của các loài tỏi

13

Bảng 3.2

Đặc điểm cấu trúc bên trong của các lồi tỏi

14

Bảng 3.3
Bảng 3.4
Bảng 3.5

Chỉ thị phân tử SSR
Trình tự các cặp mồi SSR chọn lọc
Hệ số tương đồng các mẫu tỏi

16
18
21

v


DANH MỤC HÌNH
Hình

Nội dung

Trang

Hình 3.1

Màu sắc vỏ lụa bên ngồi của các mẫu tỏi

11

Hình 3.2

Màu sắc vỏ tép và hình dạng mặt cắt ngang

15

Hình 3.3

DNA tổng số của các mẫu

17

Hình 3.4

Sự đồng nhất về di truyền các mẫu tỏi

19

Hình 3.5

Sự khác biệt giữa các lồi tỏi nghiên cứu

20

Hình 3.6

Mối quan hệ di truyền giữa các loại tỏi

21

vi


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
µg

microgram

µL

microliter

bp

base pair

Cs

cộng sự

CTAB

cetyltrimethyl-ammonium bromide

DAF

DNA amplification fingerprinting

DNA

deoxyribonucleic acid

dNTP

deoxyribonucleoside triphophate

EDTA

ethylene diamine tetraacetic acid

ISSR

inter-simple sequence repeats

Kb

kilobase

mg

milligram

mL

millilite

mM

millimol

NCBI

National Center for Biotechnology Information

PCR

polymerase chain reaction

RAPD

randomly amplified polymorphic DNA

SRAP

sequence related amplified polymorphism

SSR

simple sequence repeats

PIC

Polymorphic Information Content

TAE

Tris-Acetic acid-EDTA

vii


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết
Tỏi (Allium sativum L.) là một trong những cây gia vị quan trọng có giá trị dinh
dưỡng, giá trị dược liệu và giá trị kinh tế cao. Tỏi được trồng ở nhiều tỉnh thành của Việt
Nam như đảo Lý Sơn – tỉnh Quảng Ngãi, Hải Dương, Lâm Đồng, Khánh Hòa, Phan Rang...
Tỏi được người tiêu dùng ưa chuộng và được chế biến tạo nên các loại thực phẩm bổ dưỡng
như tỏi đen lên men, nước ép tỏi. Sản phẩm từ tỏi lên men thành tỏi đen cũng là nguồn dược
liệu quý hiếm trong việc trị các bệnh về điều trị huyết áp cao và các bệnh về tim mạch,
phòng ngừa hỗ trợ tiểu đường, ngăn ngừa sự phát triển của các tế bào ung thư (Joo Hee Kim
et al ., 2012).
Lý Sơn trồng tỏi với diện tích khoảng 250 – 300 ha, đạt năng suất khoảng 70 – 80
tạ/ha. Mỗi năm trồng được một mùa tỏi, bắt đầu trồng vào khoảng giữa tháng 9 (âm lịch) và
thu hoạch xong vào khoảng cuối tháng 2 năm sau. Tỏi Lý Sơn có giá trị kinh tế cao 120.000
- 130.000 đồng/kg (Hoàng Thị Lệ Hằng và cs ., 2011) chiếm ¾ giá trị nơng nghiệp của cả
huyện đảo Lý Sơn. Tại tỉnh Quảng Ngãi, năm 2009 Hồ Huy Cường đã thực hiện đề tài “
Nghiên cứu phục tráng giống tỏi Lý Sơn” với mục đích khơi phục giống sản xuất có năng
suất cao, sinh trưởng và phát triển tốt trong các điều kiện khắc nghiệt của địa phương, giúp
nâng cao đời sống của người dân trồng tỏi ở huyện đảo Lý Sơn. Tỏi Lý Sơn được nhà nước
công nhận thương hiểu tỏi quốc gia vào năm 2009.

Hiện nay, việc phân biệt củ tỏi Lý Sơn với các củ tỏi khác trên thị tường là điều hết
sức khó khăn và chưa có nghiên cứu chuyên sâu nào. Dẫn đến có nhiều loại tỏi trên thị
trường không rõ xuất sứ, nguồn gốc mang thương hiệu là tỏi Lý Sơn. Điều này ảnh hưởng
nghiêm trọng đến thương hiệu tỏi Lý Sơn bản địa và niềm tin của người tiêu dùng. Chính vì
lý do trên nên em thực hiện đề tài : “Nghiên cứu định danh tỏi Lý Sơn (Allium sativum L.)
bằng kỹ thuật chỉ thị phân tử SSR´
Nghiên cứu này sẽ được tiến hành nhằm mơ tả, xác
định các đặc điểm hình thái củ đặc trưng, đặc điểm di truyền và phân tích dữ liệu thu thập
được hỗ trợ cho cơng tác định danh loài, phục vục cho các nghiên cứu về chọn lựa giống,
nhân giống và giúp người tiêu dùng nhận định chính xác củ tỏi Lý Sơn có giá trị này.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Xác định được chỉ thị phân tử có khả năng ứng dụng để nhận diện tỏi Lý Sơn (Allium
sativum L.) trên thị trường và góp phần vào công tác giám định thương hiệu tỏi Lý Sơn

1


3. Ý nghĩa của đề tài
3.1 Ý nghĩa khoa học
Tạo ra nguồn cơ sở dữ liệu khoa học về mặt di truyền tỏi Lý Sơn. Củng cố cơ sở lý
thuyết cho đánh giá hiệu quả của coongcuj sinh học phân tử trong định danh thương hiệu tỏi
Lý Sơn nói riêng và các sản phẩm nơng nghiệp nói chung.
3.2 Ý nghĩa thực tiễn
Cung cấp bộ cơng cụ hình thái và phân tử để phục vụ công tác định danh tỏi Lý Sơn

2


Chƣơng I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Giới thiệu về cây tỏi

Tỏi có tên khoa học là Alliums sativum L. thuộc họ Hành tỏi (Alliaceae) và có nguồn
gốc ở Trung Á. Tỏi được phát hiện và sử dụng cách đây khoảng 7.000 năm và được biết đến
trong việc dùng làm thực phẩm và thuốc ở giai đoạn Ai Cập cổ đại.
Theo các nhà phân loại thực vật, trong loài Alliums sativum có 2 thứ thứ (lồi phụ).
Trong đó, thứ Alliums sativum var. ophioscorodon (Link), cịn được gọi là nhóm tỏi cổ
cứng, bao gồm: tỏi sứ (porcelain garlics); tỏi tầm (rocambole garlics); và tỏi sọc tía (purple
stripe garlics). Thứ Alliums sativum var. sativum, cịn được gọi là nhóm tỏi cổ mềm, bao
gồm: tỏi atisô (artichoke garlics), tỏi bạc (silverkin garlics) và tỏi creole. Đặc biệt, Gourmet
Garlic Gardens, nhóm tỏi cổ cứng là nguồn gốc tổ tiên ban đầu của lồi Alliums sativum,
cịn nhóm tỏi cổ mềm là nhóm giống đã cải tiến thơng qua q trình phát triển và chọn lọc
của tự nhiên (Hồ Huy Cường và cs., 2009).
Đến nay, trên thế giới có khoảng 600 giống/dịng của cây tỏi đang sử dụng để trồng
trọt. Sự khác nhau giữa các giống/dòng chủ yếu tập trung vào đặc điểm sinh trưởng, màu
sắc, kích thước, hình dạng và mùi vị của cây, lá, hoa, rễ và củ. Tuy nhiên, với phương pháp
phân loại dựa vào phân tích DNA, Gali Volk và Joachim Keller (2003) đã chia các giống tỏi
đang được trồng trọt thuộc 10 nhóm khác nhau. Đặc biệt, theo Zohary và Hopf (2000),
ngồi các giống tỏi thông thường (nhiều tép trên một củ), trong sản xuất còn tồn tại giống
tỏi một tép (còn gọi là tỏi ngọc trai hay tỏi đơn) và được cho là có nguồn gốc từ Vân Nam Trung Quốc (Hồ Huy Cường và cs., 2009),(Nguyễn Phú Sơn và cs., 2014).
Tỏi là một thảo dược quý có chứa kháng sinh thực vật với rất nhiều ưu điểm, được
canh tác ở nhiều nơi như Việt Nam, Trung Quốc, các nước Trung Á, Châu Âu (FAO,2012).
Trong tỏi có chứa chất Allicin - kháng sinh thảo mộc rất mạnh và các hợp chất sulphur,
polyphenol có nhiều tác dụng sinh học khác (Đỗ Tất Lợi và cs., 1999)[30]. Tỏi đã được sử
dụng nhiều trong phịng và trị bệnh ở người và vật ni, được dùng làm thuốc chữa các
bệnh cảm cúm, cảm lạnh, đầy hơi, mụn nhọt, tim mạch và một số bệnh khác. Gần đây,
không chỉ ở Việt Nam mà nhiều nước trên thế giới đã chiết tách và sử dụng những hoạt chất
của tỏi như những dược phẩm quý trong y học và thú y (Đỗ Tất Lợi và cs., 1999). Ngoài ra,
dịch chiết tỏi có tác dụng diệt khuẩn in vitro (Nguyễn Thanh Hải và cs., 2013)
Ở Việt Nam tỏi được trồng phổ biến ở một số nơi như Huyện đảo Lý Sơn-Quảng
Ngãi, Phan Rang-Ninh Thuận, Bắc Giang … Tỏi ở vùng Lý Sơn là một loại đặc sản của đất
3

nước mang lại giá trị kinh tế cao (Đỗ Tất Lợi và cs., 1999). Tỏi ở các địa phương khác thì
có các đặc điểm đặc trưng về hình thái và mùi vị riêng biệt.
1.2 Các phƣơng pháp định danh tỏi
1.2.1 Phân tích hình thái
Dựa vào đặc điểm hình thái có thể phân biệt các giống tỏi với nhau. Anderson
Rodrigo da Silva (2014) đã tiến hành phân tích các đặc điểm như: chiều dài củ, trọng lượng
củ, số lượng đinh hương trên mỗi củ giúp phân biệt và nhận diện 10 loại tỏi được trồng ở
vùng Bắc Mỹ. Bên cạnh đó, năm 2008, Azuara Hernández L đã phân tích hình thái từ một
bộ sưu tập mẫu ở Mexico gồm 21 mẫu tỏi. Kết quả phân tích thể hiện sự khác biệt về nguồn
gốc của các giống tỏi.
Ở nước ta, loài thường được phân loại thơng qua các đặc điểm hình thái như màu sắc, hình
dạng, kích thước và nhiều đặc điểm khác. Với ưu điểm dễ dàng tiếp cận và nghiên cứu, dễ
quan sát, khơng địi hỏi thiết bị đặc biệt hay quy trình phức tạp, kỹ thuật phân loại dựa trên
đặc điểm hình thái đã được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu đa dạng di truyền thực vật.
Trong đánh giá và chọn mẫu truyền thống thì phương pháp này khá hiệu quả trên nhiều đối
tượng (Viện di truyền Nông nghiệp, 1998).
Về việc phân loại các loài tỏi bản địa của nước ta dựa vào hình thái và các đặc điểm
sinh hóa các đề án nghiên của vùng, huyện, tỉnh có trồng canh tác cây tỏi (Torgils F et al
1996). Một số cuốn sách về thực vật đề cập đến phân loại của tỏi cũng nhưng công dụng của
chúng (Bùi Thị Tho và cs., 2009)(Đỗ Tất Lợi và cs., 1999).
Các nghiên cứu về phân lồi thực vật dựa vào hình thái cho kết quả trực quan, chính
xác. Tuy nhiên, nghiên cứu chỉ đánh giá một phần các đặc điểm bên ngồi tỏi, khơng thể
xây dựng được mối quan hệ phát sinh lồi
1.2.2 Phân tích sinh hóa
Năm 1997, J. Lallemand tiến hành nghiên cứu 65 loài tỏi trên thế giới từ 25 đất nước
khác nhau. Kết quả phân tích hóa sinh thu được: Đối với các giống tỏi ở châu Âu, châu Mỹ
và châu Phi, các loại tỏi được chia làm 6 nhóm với mức độ đa dạng về isozyme cao, cụ thể
là 4 loại enzyme: esterase, esterase, phosphoglucomutase. malate dehydrogenase và

diaphorase. Nhóm 1 và 2 biểu hiện cùng một loại enzyme. Nhóm 3 đến 6 được đặc trưng
bởi các cơng thức enzyme độc đáo. Đối với các loài tỏi ở châu Á, hai giống tỏi tù
Uzabekistan và Lebanon có cùng cấu trúc isozyme giống với nhóm IV tuy chúng có các đặc
điểm về hình thái hồn tồn khác biệt nhau. 10 giống hạt tỏi thuộc khu vực trung tâm châu
4


Á và Moscow có cơng thứ izozyme tương đồng, ngồi ra xuất hiện 4 giống xuất hiện các
mẫu enzyme khác với phương Tây. Bên cạnh đó, 9 mẫu tỏi ở Nhật Bản, Trung Quốc có sự
phân biệt về hình thái nhưng xuất hiện chung các loại isozyme (chưa từng được biết đến ở
phương Tây). (Lallemand Jet al 1997)
Năm 2012, Naouel Jabbes nghiên cứu sự đa dạng của 31 loại đất tỏi từ Tunisia và
cấu trúc sự đa dạng này. Nó đã giúp thiết lập mối tương quan giữa nội dung của các hợp
chất lưu huỳnh hữu cơ và đặc điểm hình thái nơng nghiệp. Với mục đích này, sự thay đổi
định lượng của năm hợp chất lưu huỳnh hữu cơ, đó là: alliin, isoalliin, glutamyl allyl
cysteine (GluAlCs), isoglutamyl allyl cysteine (isoGluAlCs).
Các nghiên cứu sinh hóa của tỏi trên thế giới tập trung hầu hết về các hoạt tính có
tính sinh học như allicin … ứng dụng của các hợp chất đó trong kháng khuẩn và trị bệnh.
Ngồi ra, dựa vào đặc tính của các hợp chất có trong tỏi để điều trị một số bệnh ở người và
động vật.
Việc dựa vào thành phần các chất có trong tỏi để phân biệt các loại tỏi có tính khả thi nhưng
quy trình tách chiết phưc tạp, hóa chất chuẩn mắc gây cản trợ đế một số nghiêp cứu sau này.
(Hồ Huy Cường và cs., 2009)
1.2.3 Định danh loài tỏi bằng chỉ thị phân tử
Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu đánh giá di truyền của tỏi bằng chỉ thị phân tử
như AFLP, SSR
Vào năm 2014, Meryem Ipek sử dụng chỉ thị EST-SSR trong các nghiên cứu di
truyền như lập bản đồ di truyền, lập bản đồ lien kết, đa dạng di truyền và so sánh bộ gen của
các loài Allium. Đồng thời nghiên cứu cịn có thể nhận biết các dịng tỏi khác nhau dựa vào
“dấu vân tay” của tỏi (Ipek M et al 2014).

Năm 2009, Kyung-Ho Ma ứng dụng chỉ thị SSR trong việc đánh giá đa dạng di
truyền của 90 loài tỏi trên thế giới. Kết quả nghiên cứu cho thấy kỹ thuật SSR rất hữu ích
trong việc xác định kiểu gen và đánh giá di truyền trong loài (Ma K.H et al 2009).
Năm 2012, Camila P. Cunha đã sử dụng chỉ thị SSR trong nghiên cứu tính đa dạng di
truyền và xác định các chiến lược hiệu quả trong việc bảo tồn nguồn gen dòng tỏi Brazil
(Cunha C.P et al 2012). Năm 2013, Shuxia Chen tiến hành phân tích đa dạng di truyền của
lồi tỏi bằng chỉ thị SSR và ISSR. Kết quả nghiên cứu cho thấy 8 đoạn mồi SSR và 17 đoạn
mồi ISSR có thể sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền và xác định sự khác nhau giữa các
dòng tỏi (Chen S.X et al 2014).
5


Các nghiên cứu trên đã tạo ra một cơ sở dữ liệu lớn về tỏi trong ngân hàng gen và các trình
tự đoạn mồi SSR được sử dụng. Vì tính ứng dụng cao của chỉ thị SSR trong định danh và
đánh giá đa dạng của lồi tỏi nên tơi lựa chọn chỉ thị này để thực hiện đề tài này.
Giới thiệu về chỉ thị SSR. Microsatellite (SSR marker) là một dạng của VNTR
(variable number oftandem repeats) là chuỗi mã di truyền lặp lại rất đơn giản thường xảy ra
ngẫu nhiên trên hầu hết genome thực vật (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999), là một
đoạn DNA được mô tả đặc điểm bởi sự xảy ra của số lượng bản copy biến thiên (từ một vài
bản lên đến 30 hay nhiều hơn) của dãy trong vòng 5 hoặc số bases ít hơn (gọi là đơn vị lặp
lại). Một microsatellite điển hình có đơn vị lặp lại AC, xảy ra ở khoảng 100.000 vị trí khác
nhau trong bộ genome động vật điển hình. Ở bất kì một vị trí nào (locus), thường xuyên có
khoảng 5 – 7 “alleles” khác nhau, mà mỗi alleles có thể nhận biết tuỳ thuộc vào số đơn vị
lặp lại. Những alleles này có thể phát hiện bởi PCR, sử dụng primers được thiết kế từ một
dãy đơn và cũng có trên cả mặt kia của microsatellite. Khi sản phẩm PCR được chạy trên
gel điện di, alleles được ghi nhận khác biệt về độ dài trong giá trị đến kích cỡ của đơn vị lặp
lại,...Microsatellite là một marker DNA chuẩn, chúng dễ dàng được phát hiện bằng PCR và
chúng có khuynh hướng xác định vị trí bằng nhau từ đầu đến cuối của genome. Hàng ngàn
SSR đã được lập bản đồ trong nhiều loài khác nhau (Ipek M et al 2014), (Singh N et al
2016).

Tóm lại, microsatellite ngày nay trở thành một thuật ngữ chung nhất để miêu tả các
trình tự lặp lại ngắn và ngẫu nhiên, thay vì sử dụng các thuật ngữ STR(short tandem repeats)
hay VNTR (variable number of tandem repeats). Microsatellite bao gồm các đoạn lặp lại
ngắn từ 2 - 6 bp và kích thước tại mỗi locus là 20 - 100 bp. Microsatellite được tìm thấy
trong tất cả cá thể sống, đặc biệt là ở những cá thể sống có bộ gen lớn và phân bố đều trên
genome. Microsatellite có tính đa hình rất cao, là những codominant-al hay al đồng trội (bao
gồm 2 loại: al đồng hợp và al dị hợp), nó có các tính chất cần thiết cho một marker. Tần số
đột biến từ 10-4 5.10-6, tuân theo định luật Mendel. Vị trí của microsatellite trên nhiễm sắc
thể có thể được xác định bằng PCR từ một lượng DNA rất nhỏ. Xác định microsatellite PCR
trên một lồi nào đó thì có thể ứng dụng trên những lồi khác có quan hệ họ hàng. Những
markers này thường hiện diện với mức độ cao của hiện tượng đa hình, đặc biệt khi số lần
lặp lại lớn hơn hoặc bằng 10. Trình tự được lặp lại thường đơn giản, bao gồm 2, 3 hoặc 4
nucleotides (tương ứng với việc lặp lại di- , tri-, và tetranucleotide), và có thể được lặp lại từ
10 đến 100 lần. Sự lặp lại của nucleotide CA xảy ra rất thường xuyên trong bộ gene người
6


và các loài khác, và được hiện diện trong khoảng vài ngàn bases pair. Như vậy có sự xuất
hiện thường xuyên của nhiều alleles tại vị trí microsatellite, kiểu gene trong phả hệ th ờng
cung cấp đầy đủ thông tin về di truyền, trong đó alleles đặc thù của tổ tiên có thể được nhận
biết dễ dàng. Bằng cách này, microsatellite là marker lýtưởng để xác định nguồn gốc,
nghiên cứu di truyền quần thể và bản đồ tái tổ hợp. Nó cịn là marker phân tử dùng để cung
cấp đầu mối về những alleles có mối quan hệ gần nhau hơn. Microsatellite thường thay đổi
với tỉ lệ đột biến tăng dần so với vùng trung tính khác của DNA. Sự đột biến cũng xảy ra
suốt quá trình tái tổ hợp trong quá trình giảm phân. Một vài lỗi sai mục tiêu được sửa bởi cơ
chế đọc và sửa trong nhân, thế nhưng một vài đột biến có thể khơng được sửa chữa. Kích
thước của đơn vị lặp lại, số lần lặp lại và sự hiện diện của sự lặp lại khác nhau là tất cả các
yếu tố, cũng như là tính thường xuyên của sự dịch mã trong khu vực của DNA lặp lại. Sự
gián đoạn của microsatellites, có thể do đột biến, có thể là nguyên nhân trong việc giảm sự
đa hình (Ipek M et al 2014), (Singh N et al 2016).

7


Chƣơng II: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Vật liệu nghiên cứu
Vật liệu nghiên là các củ tỏi được thu thập trực tiếp từ các vùng chuyên canh sản
xuất gồm có củ tỏi Lý Sơn – Quảng Ngãi (Tọa độ: N 15o23’0.0996” E 109o6’38.5596”),
Lâm Đồng (Tọa độ: N 11o44’3.408” E 108o25’24.2652”),

Khánh Hòa (Tọa độ: N

12o34’33.1392” E109o9’5.3892”) và Phan Rang (Tọa độ: N 11o35’28.014” E
109o1’29.5212”). Ngoài ra, hai mẫu tỏi Hải Dương và Trung Quốc được mua tại siêu thị
Mega Market, tp Đà Nẵng.
2.2 Phạm vi nghiên cứu
Thời gian nghiên cứu: tháng 10/2018 – 5/2019
Địa điểm: Địa điểm nghiên cứu trong phịng thí nghiệm: Phịng thí nghiệm Sinh học phân
tử thuộc khoa Sinh - Môi trường, trường Đại học Sư Phạm, Đại học Đà Nẵng
2.3 Nội dung nghiên cứu
- Nội dung 1: Khảo sát và thu thập mẫu tỏi ở Lý Sơn, Khánh Hòa, Lâm Đồng, Phan Rang
cũng như thu thập các mẫu tỏi khác (tỏi ở Hải Dương và Trung Quốc) tại siêu thị Mega
Market – Đà Nẵng
- Nội dung 2: Đánh giá kiểu hình các mẫu tỏi thu thập được
- Nội dung 3: Thiết kế các cặp mồi chỉ thị SSR phụ vụ đề tài nghiên cứu
- Nội dung 4: Tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR với các cặp mồi SSR
- Nội dung 5: Khảo sát hiệu quả của các cặp mồi SSR trong công tác định danh tỏi Lý Sơn
và xác định mối quan hệ di truyền giữa các mẫu tỏi nghiên cứu.
2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1 Phƣơng pháp phân tích một số đặc điểm hình thái

Các tính trạng ổn định về di truyền: đường kính củ tỏi; hình dạng củ theo mặt cắt
dọc; hình dạng của đáy củ tỏi; độ chặt của tép; màu của lớp vỏ lụa bên ngoài củ tỏi; sắc tố
anthocyanin của lớp vỏ lụa bên ngoài củ tỏi; số tép/củ tỏi; sự phân bố của tép trong củ tỏi;
tép có vỏ lụa bao bọc; màu của lớp vỏ tép.
Các tính trạng chịu tác động của điều kiện mơi trường: hình dạng củ theo mặt cắt ngang; vị
trí tép tỏi ở đỉnh của củ; chiều rộng tép tỏi (Naouel Jabbes et al 2014).
2.4.2 Phƣơng pháp thiết kế mồi SSR trên hệ gen lục lạp của tỏi
Hệ gen lục lạp của tỏi được lấy trên Genbank ( với số
đăng ký là KX683282 (Mikhail A.F et al 2016). Trình tự các đoạn lặp lại trong hệ gen lục
8


lạp của tỏi được tìm kiếm bằng phần mềm SSRIT (simple sequence repeat identification
tool) ( ]và

phần mềm TANDEM

REPEATS FINDER ( />Dựa vào vị trí vùng lặp lại đơn(SSR) và vùng lặp lại song song ngắn (STR) chúng tơi tiến
hành tìm kiếm và chọn lọc các đoạn mồi bằng phần mềm PRIMER3PLUS
()
2.4.3 Phƣơng pháp tách chiết DNA
Mẫu tỏi được chọn để tách chiết (lá, tép tỏi), không bị sâu bệnh. Rửa mẫu bằng nước
cât vô trùng 2 lần. Cân 0.2 g mẫu để tách chiết DNA bằng dung dịch đệm CTAB 2% (Tris
HCl 2M, pH=7.5; EDTA 0.5 M; NaCl 5M; Sarkosy 5%; Sorbitol 0.35M; CTAB 2%)
ủ trong bể ổn nhiệt 60 oC trong vòng 60 phút. DNA được tinh sạch bằng dung dịch C:I (24
chloroform : 1 iso amyl alcolhol) và được kết tủa bằng isopropanol. Mẫu DNA tách chiết
được bảo quản lạnh -20oC.
2.4.4 Phƣơng pháp PCR
Thành phản ứng PCR có thể tích 20 Pl: Bao gồm dung dịch đệm Master mix PCR 2X
của công ty Phù Sa; 200 nM mỗi đoạn mồi; 0.125 đơn vị Taq polymeraza và 40 ng ADN

khuôn. Chu trình nhiệt gồm 95°C trong 5 phút, chu kỳ lặp lại là 35 vòng gồm 94°C trong30
giây; 55°C trong 30 giây đối với mồi SSR và 38°C trong 30 giây đối với mồi ISSR; 72°C
trong 30 giây tiếp theo là 72°C trong 7 phút và bảo quản mẫu ở 4°C (Chen S.X et al 2014),
(Rakesh Sharma V et al 2018)
2.4.5 Phƣơng pháp điện di
DNA tổng số được kiển tra bằng điện di trong gel Agarose 0,8 % ; Đệm TAE 0,5 X;
90V; 120 mA; 30 phút. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trong Gel Agarose 1.5
%; đệm 0.5 X TAE; 40V; 120 mA; 180 phút. Kết quả được soi trên máy phát tia UV, chụp
lại hình ảnh.
2.4.6 Phƣơng pháp xử lý dữ liệu
2.4.6.1 Xử lý dữ liệu kiểu hình
Số liệu thu thập được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học thường dung trong
nông nghiệp trên phần mềm SPSS 22 để so sánh sự khác biệt giữa các số liệu với giá trị
p=0.05
2.4.6.2 Xử lý dữ liệu di truyền

9


Các băng DNA được ghi nhận dựa trên sự có mặt hay vắng mặt của chúng ở các mẫu
nghiện cứu và tính tốn theo DNA layder. Nếu một băng DNA xuất hiện ở mẫu A nhưng
không xuất hiện ở mẫu B và ngược lại hoặc xuất hiện cả ở mẫu A và B nhưng khơng xuất
hiện ở mẫu khác thì bang DNA này được gọi là đa hình. Ngược lại, Nếu bang này xuất hiện
ở tất cả các mẫu thì gọi là băng đơn hình.
Các băng được mã hóa bằng số tự nhiên 0 và 1. Mẫu có bang ký hiệu là 1, khơng có
kí hiệu là 0. Các số liệu này được phân tích bằng phần mềm NTSYSpc 2.1 với hệ số NEI72,
phương pháp clustering SAHN để đánh giá mối quan hệ di truyền giữa các mẫu tỏi

10

Chƣơng III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Nghiên cứu hình thái các loại tỏi
3.1.1 Đặc điểm hình thái bên ngồi của các loại củ tỏi.
Qua đánh giá màu sắc vỏ lụa củ bên ngoài, các loại tỏi được chia làm hai nhóm.
Nhóm thứ nhất có màu sắc vỏ lụa bên ngồi là màu trắng gồm có tỏi Lý Sơn, tỏi Khánh
Hóa, tỏi Phan Rang và tỏi Trung Quốc. Trong đó tỏi Trung Quốc có thêm sắc tố anthynocin
màu tía xung quanh vỏ lụa. Nhóm thứ hai có màu sắc vỏ lụa bên ngồi là màu tía-chứa sắc
tố anthynocin, gồm có tỏi Lâm Đồng và tỏi Hải Dương (Hình 3.1). Sắc tố anthynocin tạo ra
các màu sắc tự nhiên cho thực vật. Trong trường hợp củ tỏi, sắc tố anthynocin tạo màu tía
của củ, có chất năng chống oxy hóa và peroxide hóa lipid (Bùi Thị Tho và cs., 2009),(Vũ
Xuân Quang và cs., 1993).

Hình 3.1: 0jXV
̷
c v͗lͭ
a cͯa FiFOR
̩
i cͯt͗i
Từ số liệu bảng 3.1, tỏi Lý Sơn có kích thước nhỏ nhất so với các loại còn lại (ĐKC:
2,79cm; ĐKR: 1,11cm) gần đúng với số liệu được báo cáo trong đề tài của Hồ Huy Cường
11


(Hồ Huy Cường và cs., 2009). Tỏi Trung Quốc có đường kính củ và vùng rễ to nhất (ĐKC:
4,37cm và ĐKR: 2,01cm). Các loại tỏi khác có kích thước từ lần lượt là Khánh Hòa
(3,33cm và 1,33 cm); Hải Dương (3,51cm và 1,58 cm), Phan Rang (3,81cm và 1,57 cm) và
Lâm Đồng (4,31cm và 1,78 cm). Tỏi Lý Sơn và Khánh hịa có cùng một nguồn gốc, vì vậy
sự khác biệt về kiểu hình của hai loại tỏi là do điều kiện sống tạo nên. Theo thông tin điều
tra được trong quá trình thực địa thu mẫu, nguồn nước ngọt ở Lý Sơn dành cho nông

nghiệp rất hạn chế, đây cũng là vấn đề khó khăn lớn nhất trong việc canh tác trồng tỏi của
người dân. Điều này làm cho củ tỏi được trồng ở Lý Sơn trở nên săn chắc, hương vị cay
nồng (Hồ Huy Cường và cs., 2009). Điều kiện nước tưới ở Khánh Hòa thuận lợi hơn, củ tỏi
phát triển tốt hơn nhưng theo đánh giá của 10 người nơng dân trồng tỏi ở Khánh Hịa có quê
quán ở Lý Sơn thì hương vị tỏi nhạt hơn và nhiều nước hơn tỏi trồng ở Lý Sơn. Ngoài ra,
các yếu tố như đất trồng, khí hậu, độ ẩm… tạo nên sự khác biệt giữa hai loại tỏi. Cần có
những nghiên cứu chuyên sâu để đưa ra kết luận chính xác về các sự khác biệt này.
Tuy có sự khác biệt về đường kính củ và rễ nhưng tỷ lệ đường kính củ/đường kính rễ
khơng cho thấy sự khác biệt giữa các loại tỏi.
Đây được xem như tính trạng di truyền ổn định của lồi tỏi. Hình dạng đáy củ chia làm hai
nhóm, đáy lồi gồm tỏi Hải Dương và Lâm Đồng, đáy bằng gồm 4 loại tỏi còn lại. Kết quả
phân chia này cũng tương đồng với phân tích màu sắc từ vỏ lụa bên ngồi củ tỏi.
3.1.2. Đặc điểm cấu trúc bên trong của các loại củ tỏi
Số liệu bảng 3.2 cho thấy, tỏi Lý Sơn có số tép tương đối nhiều (19,8 tép/củ) tương
đồng với các nghiên cứu trong nước (Hồ Huy Cường và cs.,2009; Hoàng Thị Lệ Hằng và
cs., 2011).Tỏi Phan rang chứa nhiều tép nhất (28,1 tép) tiếp đến là tỏi Khánh Hòa (24,63
tép), tỏi Lâm Đồng (19 tép), tỏi Hài Dương (15 tép) và tỏi Trung Quốc (10,8 tép).Các loại
củ tỏi Phan Rang, Lý Sơn và Khánh Hịa bên trong có 2 lớp tép, lớp bên ngồi gồm các tép
to đều cịn bên trong là các tép nhỏ, xếp đều nhau theo một trật tự nhất định. Màu sắc vỏ lụa
của tép tỏi cũng cho thấy sự khác biệt giữa 2 nhóm tỏi.
Mặt cắt ngang chia các loại tỏi thành hai nhóm: Allium sativum var sativum (tỏi mềm –
Softneck) và Allium sativum var ophioscorodon (tỏi cứng – Hardneck). Việc phân loại này
dựa vào sự có mặt của thân gỗ cứng nằm ở trung tâm củ, nên hai loại tỏi Hải Dương và Lâm
Đồng thuộc nhóm tỏi cứng, các loại tỏi cịn lại thuộc nhóm tỏi mềm (Helm J et al 1956).
Theo nghiên cứu của Jungmin Lee và cộng sự thì trong các loại tỏi cứng chứa hàm lượng
methiin, alliin và tổng lượng axit amin tự do lớn hơn so với tỏi mềm (Lee J et al 2005).
12


Hình mặt cắt ngang của tỏi Lý Sơn và Khánh Hịa là hình trịn, của tỏi Phan Rang và Trung

Quốc là gần tròn, còn lại tỏi Hải Dương và Lâm Đồng là hình oval. Kết quả hình dạng mặt
cắt được xác định dựa vào tỷ lệ
hai đường chéo vuông gốc và mức độ đối xứng trục của các củ tỏi (hình 3.2)
Bảng 3.1: Đặc điểm bên ngồi của các loại củ tỏi

STT

1

2

3
4
5

6

Loại tỏi

Hải
Dương
Lâm
Đồng
Trung
Quốc
Lý Sơn
Khánh
Hịa
Phan
Rang

Số
mẫu

Màu
sắc vỏ
lụa

Sắc tố
anthyno
cin

Hình
dạng đáy
củ

Đƣờng kính
củ (ĐKC)
(cm)

Đƣờng kính
vùng rễ
(ĐKR)(cm)

Tỷ lệ rễ/củ

5

Nâu tía

Có

Lồi

3,51a±0,38

1,58f±0,1

2,22ab±0,11

5

Nâu tía

Có

Lồi

4,31a±0,69

1,78ef±0,09

2,42ab±0,31

Có ít

Bằng

4,37aed±0,29

2,01d±0,11

2,17b±0,05

5

Trắng
tía

35

Trắng

Khơng

Bằng

2,79ab±0,2

1,11a±0,09

2,52a±0,16

35

Trắng

Khơng

Bằng

3,33ac±0,25

1,33b±0,09

2,51a±0,14

10

Trắng

Khơng

Bằng

3,81ad±0,15

1,57c±0,13

2,44ab±0,17

&K~WKtFK
&iFFK
ͷFiLNKiFQKDXWUrQFQJP
͡t c͡t ch͑s͹VDLNKiFFyêQJK
͙QJNrY
ͣi
p=0,05

13

Bảng 3.2: Đặc điểm cấu trúc bên trong của các loại củ tỏi

STT

Loại tỏi

Màu vỏ
tép

Thân gỗ

Hình mặt

cứng bên

cắt ngang

trong củ

củ

Tỷ lệ hai
đƣờng chép
vng gốc

Số tép

Số lớp

Độ chặt

tép

của tép tỏi

(cm)

1

Hải Dương

Tím

Có

Hình oval

1,22

15a±2,23

1

Chặt

2

Lâm Đồng

Tím

Có

Hình oval

1,22

19a±2,34

1

Chặt

3

Trung Quốc

Nâu tím

Khơng có

Hình trịn

1,03

10,8d±0,83

1

Hơi chặt

4

Lý Sơn

Trắng

Khơng có

Hình trịn

1,0

19,8a±3,7

2

Chặt

5

Khánh Hịa

Trắng

Khơng có

Hình trịn

1,02

24,63bc±3,47

2

Chặt

6

Phan Rang

Trắng

Khơng có

Hình trịn

1,07

28,1c±5,8

2

Chặt

&K~WKtFK
&iFFK
ͷFiLNKiFQKDXWUrQFQJP

͡t c͡
t ch͑s͹VDLNKiFFyêQJKƭDWK{QJNr
ͣi p=0,05

14


Hình 3.2: 0jXV
̷
c v͗WpSYjP
̿t c̷t ngang cͯa cͯFiFOR
̩i cͯt͗
i

15


Nghiên cứu đã chỉ ra các đặc điểm về hình thái giúp nhận biết tỏi trồng ở Lý Sơn với
các loại tỏi được trồng ở các địa phương khác. Số lượng mẫu đại diện cho từng địa phương
phù hợp với mục đích nghiên cứu.
Cần có thêm các nghiên cứu phân tích chuyên sâu về đa dạng di truyền của các giống
tỏi. Các nghiên cứu test hóa sinh, xác định hàm lượng các hợp chất thứ cấp có trong củ tỏi
nhầm đưa ra những kết quả so sánh chính xác hơn về mặt khoa học.
Kết quả nghiên cứu của đề tài về tỏi Lý Sơn có sự tương đồng cao so với các nghiên
cứu trong nước đã thực hiện.
3.2 Thiết kế chỉ thị phân tử SSR nhận biết các loại tỏi
Bằng phần mềm SSRIT, tổng cộng có 18 trình tự lặp lại dinucleotide được tìm thấy
và khơng tìm kiếm được trình tự lặp lại trinucleotide với số lần lặp lại tối thiểu là 5. Trong
số các loại SSR dinucleotide, phần lớn các trình tự lặp lại nhỏ hơn 10 lần, trình tự lặp lại
phổ biến nhất là (AT) và (TA). Từ những trình tự trên, chúng tơi đã thiết kế 5 chỉ thị và

chọn lọc được 2 chỉ thị SSR phục vụ cho đề tài nghiên cứu
Bằng phần mềm TANDEM REPEATS FINDER, tổng cộng có 38 trình tự lặp lại được tìm
thấy, độ dài của các đoạn lặp lại dao động từ 13 đến 30 nucleotide. Từ những trình tự trên,
chúng tôi đã thiết kế 8 và chọn lọc được 3 chỉ thị STR phục vụ cho đề tài nghiên cứu. Trình
tự các cặp mồi được trình bày trong bảng 3.3
Bảng 3.3: Chỉ thị phân tử
Chi tiết về chỉ thị SSR
Tổng số SSR dinucleotde

56

Tổng số primer thiết kế

13

Primer chọn lọc được

5

3.3 Tách chiết DNA tổng số
6 loại tỏi thu thập được gồm: tỏi Lý Sơn, tỏi Phan Rang, tỏi Khánh Hòa, tỏi Hải
Dương, tỏi Lâm Đồng, tỏi Trung Quốc đã được trồng thử nghiệm tại trại thực nghiệm khoa
Sinh – Môi Trường trường Đại học Sư phạm Đà Nẵng.
Mẫu lá của các loại tỏi được thu thập trong vườn để tách chiết DNA tổng số với số lượng
mẫu của từng loại tỏi : Lý Sơn, Khánh Hòa, Phan Rang mỗi loại 10 mẫu lá; Hải Dương Lâm
Đồng, Trung Quốc 1, Trung Quốc 2 mỗi loại 5 mẫu lá; Áo 1 mẫu lá.

16