Phân lập tuyển chọn các chủng bacillus có khả năng diệt bọ gậy của muỗi

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG

NGUYỄN ĐỖ HƯƠNG GIANG

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS
CÓ KHẢ NĂNG DIỆT BỌ GẬY CỦA MUỖI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đà Nẵng – Năm 2016


ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG

NGUYỄN ĐỖ HƯƠNG GIANG

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS
CÓ KHẢ NĂNG DIỆT BỌ GẬY CỦA MUỖI

Ngành: CỬ NHÂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn: TS. Võ Châu Tuấn

Đà Nẵng – Năm 2016


MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài
Từ xưa đến nay dịch sốt xuất huyết luôn gây lo ngại cũng như đe dọa đến sức
khỏe của con người. Hằng năm, có hàng triệu ca mắc và có hàng ngàn ca tử vong do
sốt xuất huyết trên thế giới. Theo Cục Y tế Dự phòng (Bộ Y tế), năm 2015 Việt
Nam có gần 82.000 ca mắc sốt xuất huyết, trong đó có 52 trường hợp tử vong (Trần
Ngoan, 2015). Thời gian gần đây, thế giới lại phải đối mặt với một loại virus nguy
hiểm lây truyền qua muỗi có thể gây dị tật bẩm sinh cho thai nhi đó là virus Zika.
Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã công bố tình trạng khẩn cấp đối với sức khỏe cộng
đồng về virus Zika. Giải pháp phòng ngừa tốt nhất đưa ra là chống bị muối đốt
(Minh Hải, 2016). Với điều kiện thời tiết ngày càng biến chuyển bất thường, đặc
biệt là hiện tượng El Nino kéo dài như hiện nay thì tình trạng kiểm sốt dịch sốt
xuất huyết hay virus Zika càng gặp nhiều khó khăn. Tháng 12/2015, Bộ Y tế
Mexico chính thức cơng nhận vaccine đầu tiên chống lại loại virus gây sốt xuất
huyết là Dengvaxia. Theo WHO, vào cuối năm 2014, vaccine này có tỷ lệ phịng
ngừa đạt hiệu quả 60,8% (Minh Nguyên, 2015). Tuy nhiên, WHO vẫn khuyến cáo
rằng phòng ngừa là cách tốt nhất và một trong biện pháp hiệu quả nhất là diệt trừ bọ
gậy của các lồi muỗi.
Cuộc chiến phịng chống bệnh dịch giữa con người và muỗi diễn ra vô cùng
cam go, sự ra đời của thuốc diệt bọ gậy hóa học là sự đánh dấu thắng lợi to lớn.
Thuốc hóa học diệt bọ gậy có nhiều ưu điểm vượt trội. Thứ nhất, thuốc có hiệu quả
nhanh trên cơ thể sinh vật hại. Thứ hai, thuốc có phạm vi tác dụng rộng. Tuy nhiên,
đi cùng với những ưu điểm đó thì thuốc hóa học diệt bọ gậy cũng tồn tại nhiều
nhược điểm, gây ra những tác hại không nhỏ đối với môi trường và sức khỏe con
người. Nếu sử dụng thuốc nhiều lần với nồng độ cao sẽ làm cho bọ gậy nhờn thuốc,
tạo nên tính kháng thuốc ở quần thể bọ gậy sau vài thế hệ chọn lọc. Do phổ tác
dụng rộng nên thuốc hóa học có thể tiêu diệt các sinh vật có ích, làm mất cân bằng
sinh thái. Và do là chất độc nên không thể dùng cho nước sinh hoạt vì vậy mà bất
lợi trong việc diệt bọ gậy. Ngồi ra, thuốc hóa học có thời gian tồn tại lâu dài trong
môi trường nên gây ô nhiễm lớn đến môi trường. Nếu thuốc tích tụ lâu trong nước,

trong đất sẽ dễ dàng đi vào chuỗi thức ăn của sinh vật, khi tích tụ đủ lượng sinh học
cần thiết sẽ gây hại cho sức khẻ con người [43]. Chính vì vậy, việc cần thiết là phát
triển loại thuốc để diệt bọ gậy mới, đảm bảo có tác dụng cao, hiệu lực nhanh; phổ
tác dụng rộng; không ảnh hưởng đến các lồi sinh vật khác; khơng khơng tạo nên
tính kháng thuốc của bọ gậy; không gây ô nhiễm môi trường và không ảnh hưởng
đến sức khỏe con người cũng như có hiệu quả kéo dài [43] - Chế phẩm diệt trừ bọ
gậy có nguồn gốc sinh học ra đời để đáp ứng những yêu cầu thiết yếu ấy.
Bacillus là tên của một chi gồm các vi khuẩn hình que, Gram dương, hiếu
khí thuộc về họ Bacillaceae. Bacillus có ở mọi nơi trong tự nhiên và khi điều kiện
sống khắc nghiệt, chúng có khả năng tạo ra bào tử gần như hình cầu, để có thể tồn
tại trong thời gian dài. Bacillus có nhiều lồi khác nhau, đa số là vơ hại. Trong đó
có một số lồi Bacillus có khả năng tổng hợp tinh thể protein độc gây tê liệt ấu
trùng của một số lồi cơn trùng. Với những đặc tính đó thì một số lồi Bacillus có
thể ứng dụng để tạo chế phẩm diệt trừ bọ gậy của các loài muỗi như Bacillus
thuringiensis [43, 45].
Xuất phát từ các cơ sở trên đây, chúng tôi thực hiện đề tài: “Phân lập, tuyển
chọn các chủng Bacillus có khả năng diệt bọ gậy của muỗi”.
2. Mục tiêu đề tài
Tuyển chọn các chủng Bacillus có khả năng diệt trừ bọ gậy của các loài muỗi
để làm cơ sở sản xuất chế phẩm diệt trừ bọ gậy sinh học.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
3.1. Ý nghĩa khoa học
Cung cấp dẫn liệu khoa học mới về khả năng diệt bọ gậy muỗi của các chủng
vi khuẩn Bacillus.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở để nghiên cứu, phát triển các chế phẩm
vi sinh vật diệt muỗi hữu hiệu, góp phần bảo vệ sức khỏe cho cộng đồng.

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. GIỚI THIỆU VỀ CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS THURINGIENSIS
1.1.1. Sơ lược lịch sử nghiên cứu của vi khuẩn Bacillus thuringiensis
Lịch sử về Bacillus thuringiensis bắt đầu từ khi Loius Pasteur phát hiện thấy
một loài vi khuẩn có khả năng gây bệnh cho tằm, ơng đặt tên là Bacillus bombyces
[18].
Năm 1901, Shigetane Ishiwatari - nhà sinh vật học người Nhật - khi đang thực
hiện nghiên cứu nguyên nhân của bệnh Sotto gây chết đột ngột, giết nhiều quần thể
tằm, đã phân lập được một loại vi khuẩn (chính là Bacillus thuringiensis) là ngun
nhân gây bệnh và ơng đã đặt tên loại vi khuẩn đó là Bacillus sotto [18, 34, 45].
Ernst Berliner - nhà sinh vật học người Đức - phân lập được một loại vi khuẩn
giết hại mối Mediterranean flour tại Địa Trung Hải vào năm 1911, ông đặt tên cho
nó là Bacillus thuringiensis, theo tên của thị trấn Thuringia, nơi các lồi mối đã
được tìm thấy. Năm 1915, Berliner báo cáo sự tồn tại của một tinh thể
trong Bt, nhưng hoạt động của các tinh thể này đã không được phát hiện cho đến
mãi sau này [18, 34, 43, 45].
Năm 1920, những người nông dân ở các nước phát triển bắt đầu sử dụng sinh
khối vi khuẩn Bt phun cho cây trồng như một loại thuốc phòng trừ sâu bệnh. Đặc
biệt là Pháp, đã sớm chế tạo các loại thuốc có nguồn gốc từ bào tử và xác của Bt,
gọi là Sporine [20, 34].
Năm 1956, Hannay, Fitz - James và Angus đã nghiên cứu và phát hiện ra tác
nhân chính quyết định khả năng tiêu diệt mối và sâu bọ của Bt là các phân tử
protein được sản sinh trong cơ thể vi khuẩn Bt, từ đó mở ra hướng nghiên cứu mới
của các nhà khoa học về tác nhân, cơ chế diệt sâu và di truyền của Bt [20, 34, 45].
Trong suốt những năm 1960, nhiều chế phẩm thương mại của Bt đã được sản
xuất ở nhiều quy mô khác nhau tại Mỹ, Pháp, Đức. Sau đó Howard Dulmage và

Clayton Beesle của Viện nghiên cứu Nông nghiệp USA đã thu thập được bộ sưu
tầm đầu tiên về các chủng Bt [20, 34, 45].
Năm 1970, Dulmage đã phân lập được chủng HD – 1 và cho đến nay nó vẫn
được sử dụng cho nhiều nghiên cứu và trong chế phẩm Bt [20]. Năm 1976, Robert
A. Zakharyan đã báo cáo sự xuất hiện của một plasmid ở B. thuringiensis và đề xuất
rằng plasmid này có liên quan đến tế bào của thực vật và sự hình thành tinh thể [5,
47].
Năm 1977, Goldberg và Margalit đã xác định được vi khuẩn Bt độc hại đối
với ấu trùng của muỗi và ruồi đen. Bt độc cao đối với các sinh vật mục tiêu, chúng
hình thành bào tử, dễ dàng vận chuyển, xâm nhập và lưu trữ trong cơ thể của sinh
vật đích. Trong thời gian hình thành bào tử, Bt tạo ra một lượng lớn tinh thể độc có
nguồn gốc từ protein có khả năng gây độc khi ấu trùng của muỗi, ruồi đen ăn phải
[20, 26]. Năm 1978, lần đầu tiên phân lập từ ấu trùng muỗi chết ở Israel một chủng
Bt có hoạt lực cao đối với cơn trùng, đặc biệt là ấu trùng muỗi [45].
Cho đến nay, Bt vẫn là chủng được ứng dụng cao nhất trong việc khống chế,
kiểm soát ấu trùng của bộ cánh vẩy, hai cánh và cánh cứng.
Tại Việt Nam, việc nghiên cứu về Bacillus thuringiensis cũng đã có nhiều kết
quả đáng kể. Nhiều chủng Bacillus thuringiensis có hoạt lực cao đã được phân lập,
một vài dịng gen đã được nghiên cứu tách dịng, đọc trình tự và biểu hiện. Chúng ta
cũng đã bước đầu thử nghiệm thành cơng chế phẩm trong phạm vi phịng thí
nghiệm như sự thành công của chế phẩm vi sinh diệt lăng quăng từ chủng vi khuẩn
Bacillus thuringiensis subsp. israelensis serotype H14 của TS. Hồ Thị Hồng Nhung
và cộng sự tại Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh, năm 2007 [28]. Ngồi ra, năm
2013 nghiên cứu của nhóm tác giả Nguyễn Thiện Phú và cộng sự đã phân lập được
20 chủng vi khuẩn Bacillus từ đất rừng ngập mặn Cần Giờ, trong đó tuyển chọn
được 4 chủng có tinh thể độc, có khả năng ứng dụng vào diệt trừ sâu hại [30].
1.1.2. Phân loại Bacillus thuringiensis
Chủng Bacillus thuringiensis được phân loại khoa học như sau: [34]
Giới : Eubacteria
Ngành : Firmicutes

Lớp

: Bacilli

Bộ

: Bacillates

Họ

: Bacillaceae

Chi

: Bacillus

Loài

: Thuringiensis

Cho đến nay các nhà khoa học đã phân lập, phân loại được một số lượng lớn
các chủng Bt dựa theo các đặc điểm sau:
- Khả năng hình thành enzyme leucitinase.
- Cấu trúc tinh thể, khả năng gây độc.
- Đặc tính huyết thanh học (kháng huyết thanh tiêm mao (Krieg, 1968)).
- Phản ứng ngưng kết của các tế bào sinh dưỡng với các kháng huyết thanh.
Phương pháp phân loại theo đặc tính huyết thanh là phổ biến. Theo phương
pháp này, dựa vào 50 type huyết thanh chuẩn người ta đã chia các chủng Bt đã phân

lập được ra làm 63 loài phụ (subspecies) [2, 3, 6, 18, 41]. Một số type huyết thanh
và các chủng Bt đại diện tương ứng được trình bày ở Bảng 1.1 [45].
Bảng 1.1. Một số type huyết thanh và các chủng Bt đại diện tương ứng
Type huyết

Chủng đại diện

Viết tắt

1

B. thuringiensis

THU

3a, 3b

B. kurstaki

KUR

4a, 4b

B. sotto

SOT

5a, 5b

B. candensis

CAN

De Barjac & Bonnefoi (1972)

8b, 8d

B. nigeriensis

NIG

Weiser and prasertphon (1984)

14

B. israelensis

ISR

De Barjac & Cs (1992)

30

B. medellin

MED

Orduz & Cs (1992)

33

B. leesis

LEE

Lee & Cs (1944)

46

B. chanpaisis

CHA

Chainpaisang (1994)

thanh

Người nghiên cứu
Bliner (1915), Heimpel& Angus
(1958)
De Barjac & Lemill (1970)
Ishiwata (1905); Heimpel
& Angus (1958)


48

B. balearica

BAL

Iriate Garcia (1995)

49

B. muju

MUJ

Park (1995)

50

B. navarrersis

NAV

Iriate Garcia

Gần đây, nhờ sự phát triển mạnh của công nghệ gen, các nhà khoa học đã giải
mã được hầu hết các gen mã hóa cho tinh thể độc. Từ cơ sở đó, một phương pháp
phân loại khác đã được đưa ra: phương pháp phân loại dựa vào lớp gen Cry. Với
phương pháp này, các nhà khoa học đã đưa ra 20 lớp gen với các đặc điểm protein
tinh thể độc, type huyết thanh, cơn trùng đích khác nhau [2, 18].
1.1.3. Đặc điểm hình thái của Bacillus thuringiensis
Bacillus thurigiensis là vi khuẩn đất, gram (+), hơ hấp hiếu khí hoặc hiếu khí
khơng bắt buộc. Tế bào hình que, kích thước khoảng 3 - 6µm, có tiêm mao phủ
mỏng, có khả năng di động, tế bào đứng đơn độc hoặc xếp thành chuỗi [17, 33, 43,
45, 46].
Bacillus thurigiensis có khả năng sinh nội bào tử và tinh thể độc. Bào tử hình

trứng với kích thước khoảng 1,5 - 2 µm. Tinh thể độc có kích thước khoảng 0,6 x
0,02 µm và có nhiều hình dạng như hình ơ van, hình lập phương, hình sao, hình
trứng, hình kim ... Khi tế bào sinh dưỡng bị phá vỡ, nội bào tử và thể vùi được giải
phóng (Hình 1.1) . Giống như bào tử của các loại vi khuẩn khác thuộc chi Bacillus,
bào tử của Bt rất bền, có khả năng kháng lại nhiệt, bức xạ, hố chất cao. Có thể
quan sát thấy bào tử, tinh thể độc, tế bào sinh dưỡng của Bt dưới kính hiển vi điện
tử, kính hiển vi quang học [17, 43, 45, 46].
1.1.4. Đặc điểm sinh hóa của Bacillus thuringiensis
Bacillus thurigiensiss sinh trưởng tối ưu ở nhiệt độ 28 – 30oC, pH 6,8 - 7,2.
Trong q trình sinh trưởng, vi khuẩn chuyển hố thành phần đường của môi trường
thành acid acetic, lactic, pyruvic… Sau đó những chất này lại được cơ thể sử dụng
tiếp. Do đó pH của mơi trường lúc đầu thì tăng (pha logarit), về sau thì giảm. Khả
năng sinh bào tử của Bacillus thurigiensis phụ thuộc vào nhiều yếu tố mà đặc biệt là
các yếu tố dinh dưỡng. Vi khuẩn có khả năng nitrit hố, khơng có khả năng lên men


đường arabinoza, xiloza, manitol và phát triển yếu trong môi trường kị khí [3, 29,
43, 45, 46].

Hình 1.1. Vi khuẩn Bacillus thuringiensis [10].

1.1.5. Các độc tố của Bacillus thuringiensis
Bacillus thurigiensiss có khả năng tạo 4 loại độc tố:
- Ngoại độc tố α (α - exotoxin).
- Ngoại độc tố β ( β - exotoxin).
- Ngoại độc tố γ (γ - exotoxin).
- Nội độc tố δ (δ - endotoxin)
Trong 4 loại độc tố, nội độc tố δ có tác dụng mạnh nhất đến nhiều loại côn
trùng và được ứng dụng rộng rãi trong bảo vệ thực vật như một loại thuốc sâu
không độc hại với môi trường, con người và động vật [12, 41, 43, 45].

a. Ngoại độc tố α
Ngoại độc tố α được phát hiện giữa những năm 1950 từ vi khuẩn Bacillus
thurigiensis vanenlesti bởi C. Toumaroff. Ngoại độc tố α cịn gọi là enzyme
Leucintinase, có hoạt tính phospholipase - tác động chủ yếu lên gốc phospholipit
của màng tế bào sâu, giúp cho vi khuẩn gây bệnh dễ xâm nhập vào các xoang trong
cơ thể côn trùng. Do vậy, enzyme Leucintinase đã trực tiếp tham gia vào việc tấn
công, gây tổn thương tế bào ở thành ruột.
Ngoại độc tố α có trọng lượng phân tử thấp, tan tốt trong nước, hoạt động ở
pH 6,6 – 7,2 và không bền nhiệt nên cịn được gọi là ngoại độc tố khơng bền nhiệt,


tác động đặc hiệu đến các loài như: ong cắn lá, sâu thuộc bộ cánh cứng, cánh vẩy
...[11, 29, 39, 44, 45].
b. Ngoại độc tố β
Do Hall và Arkavc phát hiện năm 1959 khi nuôi ấu trùng muỗi bằng thức ăn
chứa Bt. Đây là một độc tố bền nhiệt có bản chất là nucleotide. Khi xử lý ở 120oC
trong 15 phút vẫn giữ được hoạt tính. Cơ chế tác động của ngoại độc tố β là cạnh
tranh ATP với các enzyme ARN polymerase, dẫn đến kìm hãm hoạt động của
enzyme, ngừng tổng hợp ARN, gây rối loạn sinh tổng hợp protein. Mặt khác, khi
ngoại độc tố β cộng hưởng tác động với nội độc tố δ có thể khiến cơn trùng chết
nhanh chóng.
Ngoại độc tố β gây độc cho nhiều loại côn trùng thuộc bộ cánh cứng, hai cánh,
đặc biệt khi côn trùng ở giai đoạn ấu trùng, sâu non. Ngoại độc tố β gây cản trở sự
lột xác của côn trùng. Nếu được sử dụng ở nồng độ cao, độc tố β cịn tiêu diệt cả
trứng cơn trùng [29, 39, 45, 46].
c. Ngoại độc tố γ
Ngoại độc tố γ là một phospholipase, có bản chất là mạch peptide ngắn và một
số axit amin tự do. Độc tố này tan tốt trong nước, mẫn cảm với khơng khí, ánh sáng,
nhiệt độ và oxy nên ít hữu dụng trong thực tế đồng ruộng. Cơ chế tác dụng của
ngoại độc tố γ cũng tương tự như ngoại độc tố α [29, 39, 45].

d. Nội độc tố δ
Nội độc tố δ được hình thành trong khoảng 3 giờ của pha cân bằng. Tinh thể
này bền nhiệt (tới 80oC), không tan trong nước, dung mơi hữu cơ nhưng tan tốt
trong mơi trường có pH kiềm. Mỗi tế bào Bt có thể sinh ra một hoặc hai tinh thể
độc. Khối lượng tinh thể độc chiếm tới 30% khối lượng tế bào mang nó.
δ – endotoxin cịn được gọi là protein tinh thể độc do nó tồn tại dạng tinh thể
cùng với nhiều protein tinh thể khác nhờ cầu nối disufua và liên kết kị nước. Về bản
chất độc tố này là một protein với 1180 gốc axit amin trong đó chủ yếu gồm các
loại như glutmic, asparaginic những axit amin này chịu trách nhiệm cho đặc tính
điểm đẳng điện thấp của tinh thể. Cystein tuy chiếm tỷ lệ thấp hơn nhưng nó góp
phần quan trọng trong việc giữ vững cấu trúc tinh thể, làm tinh thể khơng có khả


năng hồ tan. Ngồi ra, trong tinh thể cịn tạp lẫn một số hydrocacbon với tỷ lệ
khoảng 5,6%. Về thành phần nguyên tố, toxin chứa chủ yếu các nguyên tố C, H, O,
N, S. Các nguyên tố Ca, Mg, Si, Fe chiếm tỷ lệ nhỏ hơn. Ni, Ti, Zn, Mn, Cu…
chiếm tỷ lệ rất nhỏ, cịn P hầu như khơng có [1, 29, 39, 41, 45].
1.1.6. Các yếu tố hình thành và cơ chế tinh thể độc
a. Các yếu tố hình thành
Bao gồm tất cả các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn
Bacillus thurigiensis như: nhiệt độ, nguồn C, N, P ... Điều kiện tối ưu cho Bt sinh
trưởng là 28 – 30oC. Nếu nhiệt độ là 15oC thì bào tử khơng hình thành và số lượng
tinh thể độc cũng giảm đi đáng kể. Nguồn dinh dưỡng C, N, P ảnh hưởng mạnh đến
sự hình thành tinh thể độc. Một số acid amin như leucin, isoleucin gây ức chế quá
trình sinh trưởng của vi khuẩn nên giảm lượng tinh thể độc. Các yếu tố cản trở sự
trao đổi acid acetic cũng làm ức chế sự hình thành bào tử, tinh thể độc. Các chủng
đột biến mất khả năng sinh protease ngoại bào thì khơng có khả năng sinh tinh thể
độc và bào tử [25, 32].
b. Cơ chế tác động của tinh thể độc lên côn trùng
 Q trình hoạt hóa tinh thể độc

Theo Angus (1907), protein tinh thể độc của Bt hoạt động trên tế bào biểu mô
ruột giữa của côn trùng ở pH kiềm. Tinh thể tan vào mơi trường kiềm của ruột giải
phóng ra protein tinh thể, chất này sau đó bị phân cắt bởi protease. Kết quả là từ
một protein 135 kDa bị mất đi một nửa để còn lại phần lõi xấp xỉ 60 kDa bền với
protease. Những thí nghiệm chỉ ra rằng protein 135 kDa chưa bị cắt bởi protease
không có khả năng gây độc với cơn trùng gọi là “protoxin". Cịn lõi 60 kDa gây độc
vời cơn trùng gọi là “toxin”. Quá trình biến đổi từ tinh thể độc protoxin thành toxin
được gọi là q trình hoạt hố tinh thể độc.
Q trình hoạt hố tinh thể độc gồm hai giai đoạn: Giai đoạn một liên quan tới
sự giải phóng protoxin từ tinh thể độc. Giai đoạn này diễn ra do sự cắt đứt các liên
kết disulfua (nối giữa các phân tử protein) trong môi trường bởi các nhân tố khử
disulfua. Giai đoạn hai là sự tiêu hoá protoxin thành toxin. Năm 1990, Choma và
cộng sự báo cáo rằng để biến phân tử protoxin CryIAc 135 kDa thành lõi toxin 60


kDa phải trải qua bảy bước mà ở mỗi bước phân tử protoxin sẽ bị mất đi một mảnh
khoảng 10 kDa, trong quá trình này sự cắt bỏ diễn ra không theo một trật tự nào.
Tuy nhiên, đến nay cơ chế của sự cắt bỏ để biến protoxin 135 kDa thành toxin 60
kDa vẫn chưa được làm sáng tỏ, và các nhà khoa học vẫn chưa xác định được
protoxin bị cắt từ cả hai đầu C và N hay bị cắt tuần tự từ đầu C [3, 31].
 Cơ chế hoạt động của toxin trên tế bào biểu mô ruột của cơn trùng
Những nghiên cứu về hình thái sau khi bị chết bởi Bt của côn trùng cho thấy
ruột của cơn trùng bị tổn thương. Cụ thể là do hình thành các lỗ hổng trên các tế bào
biểu mô, dẫn đến gây rối loạn hoạt động hấp thụ dinh dưỡng của ruột. Có ba mơ
hình giải thích cơ chế hoạt động của toxin như sau:
- Mơ hình 1, thường được gọi là mơ hình “dung giải hồ tan thẩm thấu keo”
bao gồm sự tổng hợp các lỗ không đặc trưng bởi phân tử độc tố. Khi độc tố liên kết
với các receptor trên màng sẽ hình thành một phức hệ. Phức hệ này tạo nên một lỗ
xuyên qua màng tế bào biểu mô cho phép sự qua lại tự do của nhiều phân tử với
kích thước khác nhau dẫn đến gây rối loạn chức năng của ruột [6, 21].

- Mô hình 2, cho rằng lỗ hổng được hình thành bởi độc tố Bt là đặc trưng rất
cao đối với ion K+. Thuyết này được đưa ra từ bằng chứng là sự vận chuyển axit
amin phụ thuộc K+ bị ức chế bởi độc tố tinh thể. Cụ thể, những lỗ này dễ cho K+ đi
vào, sau đó làm giảm gradient điện thế màng làm rối loạn sự vận chuyển amino axit
trong cơ thể sâu [21, 31].
- Mơ hình 3, cho rằng độc tố Bt hoạt động trên nhiều kênh hiện có của tế bào
biểu mơ ruột. Sự có mặt của các độc tố dẫn đến các kênh cho phép K+ tràn vào
khơng giới hạn từ đó làm ức chế sự hấp thụ axit amin [40].
 Tác động chọn lọc của độc tố Bt lên côn trùng
Sở dĩ độc tố do Bt tiết ra có tác động chọn lọc lên cơn trùng bởi tinh thể độc
sau khi xâm nhập vào ruột côn trùng, để có thể gây chết cho vật chủ thì phải được
hoạt hoá thành toxin và toxin phải gắn được lên tế bào biểu mơ ruột. Tuy nhiên, q
trình hoạt hoá tinh thể độc phụ thuộc rất nhiều vào pH ruột và hệ enzyme. Nếu pH <
8 thì hầu hết các tinh thể độc khơng giải phóng ra protoxin. Mặt khác khi pH phù
hợp (pH > 8) nhưng hệ enzyme khơng phù hợp thì toxin cũng khơng được tạo ra.


Một điều nữa, khi tinh thể độc đã được hoạt hố thành toxin nhưng những toxin này
khơng bám được lên màng tế bào biểu mô ruột, độc tố vô tác dụng. Ví dụ: sâu xám
hại rau có pH ruột là 9,5 và có khả năng hoạt hố tinh thể độc nhưng khơng bị tiêu
diệt, chúng hồn tồn khoẻ mạnh khi được ni với thức ăn chứa chế phẩm Bt vì
trên màng ruột của chúng không chứa các thụ thể để toxin của Bt bám vào [9]. Quá
trình xâm nhập và gây độc của Bt được mơ tả ở hình 1.2 [45].

Hình 1.2. Quá trình xâm nhập và gây độc của Bt [45]

1.2. CHẾ PHẨM BACILLUS THURINGIENSIS
1.2.1. Tình hình nghiên cứu, sản xuất và sử dụng chế phẩm vi sinh Bt
a. Tình hình nghiên cứu, sản xuất và sử dụng chế phẩm Bt trên thế giới
Từ khi phát hiện ra vi khuẩn Bt, con người ngày càng nhận thức được rõ hơn

về tác dụng và hiệu quả của loại vi khuẩn này. Một loạt các nghiên cứu cấp quốc tế
và các nghiên cấp quốc gia đã và đang được đề ra nhằm phát triển công nghệ sử
dụng Bt một cách rộng rãi trong cộng đồng với mục đích bảo vệ mơi trường sống
của con người và môi trường tự nhiên trong sạch [3, 40].
Năm 1938, chế phẩm Bt được sản xuất và bán ra đầu tiên từ phịng thí nghiệm
của Pháp. Tiếp sau đó, một loạt các nhà sản suất của các nước khác trên thế giới sản


xuất thuốc trừ sâu có nguồn gốc từ Bt với các tên thương phẩm như: VMP, Pipel,
Biobit,...
Ở Trung Quốc, sản lượng thuốc trừ sâu Bt tăng lên rất nhanh từ 26 tấn năm
1983 lên 260 tấn 1986, đến năm 1990 sản lượng đạt 900 tấn. Ở Nga, từ năm 1987
đã đạt sản lượng 6100 tấn/năm, đủ phục vụ cho 110 ha ruộng. Tại Mỹ, lượng chế
phẩm Bt được sử dụng lên tới hơn 1000 tấn/năm. Ngoài việc ứng dụng để bảo vệ
cây trồng, chế phẩm Bt còn được nhiều nước sử dụng trong công tác vệ sinh dịch tễ
như diệt trừ các loại muỗi, ruồi,... bảo vệ sức khoẻ con người.
b. Tình hình nghiên cứu, sản xuất và sử dụng chế phẩm Bt ở Việt Nam
Bt được du nhập vào nước ta từ những thập niên 1970 nhưng do điều kiện
khách quan về kinh tế mà nước ta chưa có điều kiện áp dụng cũng như quan tâm
đến vấn đề này.
Trong vài năm trở lại đây, khi một loạt các vấn đề môi trường trong nông
nghiệp được khám phá gây nhiều dư luận bức xúc, lo ngại cho sức khoẻ con người.
Việc nghiên cứu và ứng dụng Bt được xem như là một cứu cánh trong lĩnh vực
phòng trừ sâu hại. Tuy vậy, việc sử dụng Bt ở nước ta hiện nay còn khá nhiều hạn
chế, cụ thể là trong lĩnh vực triển khai, nước ta còn rất thiếu các điều kiện, phương
tiện để nghiên cứu, có rất ít các nhà khoa học đi chuyên sâu trong lĩnh vực này. Bên
cạnh đó các cơ sở thực nghiệm về cơng nghệ sinh học của nước ta cịn nhỏ hẹp, số
lượng ít ỏi, đó là một trong nguyên nhân lớn dấn đến sự hạn chế trong việc sản xuất
và sử dụng các loại thuốc trừ sâu Bt.
Tuy nhiên, các chuyên gia thuộc Viện công nghệ sinh học (Viện Khoa học và

công nghệ) đã bước đầu tiến hành nghiên cứu và sản sản xuất thành công nhiều
thuốc trừ sâu sinh học Bt đạt hiệu quả cao, hứa hẹn một tương lai tốt đẹp cho nông
sản Việt Nam. Việc sử dụng Bt để sản xuất chế phẩm diệt trừ bọ gậy cũng đang
được tiến hành mạnh mẽ bởi các nhà nghiên cứu khoa học và các doanh nghiệp liên
kết chế tạo một số sản phẩm dạng bột hay dạng lỏng. Có rất nhiều chủng được ứng
dụng trong sản xuất chế phẩm nhưng một số chủng chủ yếu được sử dụng như
Bacillus

thuringiensi,

thuringiensis

Bacillus

subspecies

thuringiensis subspecies

darmstadiensis,

Bacillus

aizawai,

thuringiensis

Bacillus
subspecies

entomocidus, Bacillus thuringiensis subspecies israelensis, Bacillus thuringiensis
subspecies kurstaki, Bacillus thuringiensis subspecies konkukian, Bacillus
thuringiensis subspecies tenebrionis, Bacillus thuringiensis subspecies galleriae,…
[43, 45].
Với triển vọng của Bt đối với các ứng dụng trong nông nghiệp bảo vệ thực vật
cũng như diệt bọ gậy bảo để bảo vệ sức khỏe cộng đồng, các nhà khoa học trong
nước đã tiến hành nhiều nghiên cứu trên đối tượng Bacillus thuringiensi.
Năm 2003, tác giả Bùi Thị Hương và Đinh Duy Kháng cùng cs – Viện sau thu
hoạch thực hiện đề tài “Phân lập các chủng B. thuringiensis var. kurstaki ở Việt
Nam”, đã phân lập, phân loại các chủng B. thuringiensis có hoạt tính diệt sâu từ
nguồn tự nhiên của Việt Nam và sử dụng một số kỹ thuật sinh hoá và sinh học phân
tử để xác định tính chất của các chủng B. thuringiensis var. kurstaki phân lập được
[19].
Năm 2003, tác giả La Thị Nga và cs – Viện Công nghệ Sinh học đã tiến hành
nghiên cứu “Đa dạng phân tử của Bacillus thuringiensis ở các tỉnh bắc bộ và bắc
trung bộ” đã phân lập được 168 chủng Bt, quan sát và đánh giá được sự đa dạng về
hình thái tinh thể, gen Cry và thành phần protein [27].
Năm 2007, TS. Hồ Thị Hồng Nhung và cs – Viện Pasteur TP.HCM đã tiến
hành đề tài “Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh từ chủng vi khuẩn Bacillus
thuringiensis subsp. Israelensis serotype H14 diệt lăng quăng muỗi” đã thành công
bước đầu trong công nghệ sản xuất ra vi khuẩn B. thuringiensis subsp. israelensis
H14 (Bti) với hiệu năng cao, khoảng 1 tấn/tháng. Loại chế phẩm sinh học chứa vi
khuẩn này có tác dụng diệt lăng quăng trong nhiều điều kiện sống khác nhau, từ ao
tù nước đọng cho đến nước kênh rạch [28].
Năm 2013, tác giả Nguyễn Thiện Phú và cs đã tiến hành nghiên cứu “Phân
lập tuyển chọn một số chủng Bacillus thuringiensis từ rừng ngập mặn Cần Giờ có
hoạt tính diệt sâu” và đã phân lập được 20 chủng vi khuẩn Bacillus từ đất rừng ngập
mặn Cần Giờ, trong đó chọn được 4 chủng có sự hiện diện của tinh thể độc, chọn
được chủng P14 dựa trên khả năng hình thành bào tử, tinh thể độc và hoạt tính diệt

sâu cao nhất, chủng vi khuẩn P14 bằng việc giải trình tự gen 16S rRNA cho thấy
chủng này thuộc lồi Bacillus thuringiensis var. kurstaki [30].
1.2.2. Ảnh hưởng của chế phẩm Bt đến con người, động vật và thực vật
a. Ảnh hưởng của Bt đến sức khoẻ con người
Khi các chế phẩm Bt được ra đời và ứng dụng rộng rãi, nảy sinh cho con
người một mối lo ngại do khi sử dụng Bt phần lớn sử dụng bình xịt thuốc hoặc vãi,
vì thế mà Bt dễ dàng tiếp xúc với da của người, với giả thiết đặt ra là phun một
lượng thuốc đáng kể có thể gây ngộ độc. Ngồi ra cịn có thể gây phát tán bào tử.
Tuy vậy, nhiều báo cáo nghiên cứu đã cho thấy không hề có sự kích ứng đối với da
của con người cũng như không xuất hiện những ảnh hưởng không tốt đối với sức
khoẻ của con người [35].
Trước khi được đưa ra thị trường, các chế phẩm Bt phải trải qua rất nhiều thử
nghiệm quản lý nghiêm ngặt trong đó bao gồm các nghiên cứu về độc tính và khả
năng gây dị ứng. Cục Bảo vệ Môi trường Hoa kỳ (US Environmental Protectin
Agency US-EPA) đã triển khai những đánh giá độc tố và thậm chí các protein Bt đã
được thử ở liều lượng cao hơn. Theo Extension Toxicology Network (Extoxnet),
các dự án về thông tin thuốc trừ sâu ở một số trường đại học của Hoa kỳ cho thấy
“Kết quả cuộc thử nghiệm trên 18 người mỗi ngày ăn 1 gram Bt thương mại trong
vòng 5 ngày, và trong các ngày khác nhau… khơng gây ra chứng bệnh gì. Những
người ăn 1 gram Bt/ngày trong 3 ngày liên tục hồn tồn khơng bị ngộ độc hay
nhiễm bệnh”. Hơn nữa, ở mức phân tử protein nhanh chóng bị phân hủy bởi dịch vị
dạ dày (trong điều kiện phịng thí nghiệm) (Extoxnet, 1996).
Nhiều thí nghiệm trên con người với những người tình nguyện được thực hiện
bởi tổ chức y tế thế giới (WHO) và tổ chức môi trường thế giới (UNEP), kết quả thu
được cho thấy: mặc dù những người tình nguyện thường xuyên ăn và hít vào một
lượng lớn chế phẩm Bt và Btk, nhưng không hề thấy bất kỳ một biểu hiện bất
thường nào xảy ra trên cơ thể con người. Từ những nghiên cứu cụ thể của các tổ
chức uy tín trên thế giới, các nhà khoa học đã công nhận Bt và cơng nghệ Bt hồn
tồn vơ hại với con người và sức khoẻ cộng đồng.

Năm 1995, chương trình “Các vấn đề hợp tác quốc tế cho sự quản lý chất hoá
học” (IOMC) hợp tác giữa các tổ chức UNEP, ILO, The Foof and Agriculture
Organization of the United Nations, WHO nhằm thúc đẩy hợp tác phát triển kinh tế,
chia sẻ và phối hợp trong các chính sách chung nhằm quản lý chất thải có ảnh
hưởng nguy hại tới đời sống của con người. Chương trình đã khuyến khích việc
phát triển sử dụng Bt thay cho các loại thuốc hoá học kinh điển khác.
b. Ảnh hưởng của Bt tới các loài động vật
Tinh thể độc do Bt sản sinh chủ yếu tiêu diệt các loại ấu trùng gây hại đối với
côn trùng như các loại côn trùng thuộc bộ cánh cứng, cánh vảy, các loại mối mọt,
muỗi gây bệnh… Các loại tinh thể độc của Bt có tính đặc hiệu nhất định đối với các
lồi nhất định và ngay cả một lồi thì cũng chỉ gây độc ở một giai đoạn sinh trưởng
nhất định đó là giai đoạn sâu non hay ấu trùng, theo nguyên tắc chìa khố và ổ
khố. Các tác nhân gây độc của Bt chỉ có thể gây hại khi tác động với thụ thể phù
hợp trên cơ thể ấu trùng, đối với các loại protein khơng phù hợp khác thì sự khơng
khớp được với loại protein của vật chủ làm cho độc tố khơng phát huy được tác
dụng. Thêm vào đó, mơi trường khác nhau trong thành ruột ở các loại sinh vật khác
nhau và trong giai đoạn sinh trưởng khác nhau cũng là yếu tố to lớn quyết định tính
chuyên biệt của protein độc tố.
Trong lịch sử nghiên cứu về Bt trên thế giới, nhiều nghiên cứu trên các loài
động vật hoang dã đã được thực hiện: Năm 1989, Bendell đã tiến hành các nghiên
cứu theo dõi tác động của Bt tới quần thể các lồi động vật có vú nhỏ ở một số khu
rừng gần trang trại sản xuất nông nghiệp ở Canada. Kết quả thu được khơng hề có
sự biến đổi số lượng quần thể này kể cả các loài thuộc bộ gặm nhấm, họ chuột đồng
là những sinh vật thường xuyên ăn cỏ ven rừng và trong cánh đồng…
Beavers và cộng sự, 1989; Lattin và cộng sự, 1990; Beavers, 1991 đã tiến hành
những nghiên cứu trên các loài chim trên thế giới: Các loài chim được chọn nghiên cứu
được xử lý bằng chế phẩm Bt và theo dõi, tính tốn sự biến động trong quần thể. Kết
quả nghiên cứu cho thấy rằng khơng hề có sự biểu hiện của bệnh trên chim, và khơng

có sự suy giảm số lượng cá thể chim trong quần thể.


Nhiều nghiên cứu khác của các nhà khoa học thuộc các quốc gia tiên tiên
trên thế giới cũng đã tiến hành nhằm điều tra ảnh hưởng của chế phẩm Bt và cây
trồng mang gen Bt đối với các loài sinh vật đất và các lồi cơn trùng khác được xem
là có ích trong nơng nghiệp. Kết quả phân tích trong một thời gian dài đã cho thấy,
Bt và công nghệ sử dụng cây trồng chuyển gen Bt không gây ra ảnh hưởng bất lợi
không chỉ đối với các sinh vật đất có ích mà cịn với các sinh vật đất khơng phải là
đích tấn cơng của chúng, thậm chí ngay cả khi các sinh vật này được xử lý Bt với
liều lượng cao hơn nhiều so với thực tế có thể xảy ra trong điều kiện trồng trọt mà
con người có thể đưa vào. Từ đó cho thấy khơng có sự thay đổi nào trong quần thể
vi sinh vật đất giữa các cánh đồng sử dụng thuốc trừ sâu Bt và cánh đồng không sử
dụng (Donegan và cộng sự, 1995).
Các cuộc thử nghiệm của Extoxnet năm 1996 được tiến hành trên chó, chuột,
chuột lang, thỏ, cá, ếch, kỳ giơng và chim… cho thấy: protein Bt không gây ra ảnh
hưởng xấu hay biến đổi số lượng quần thể. Cũng cần nhấn mạnh rằng, độc tố cũng
hồn tồn khơng gây ảnh hưởng đến các lồi cơn trùng có ích hoặc động vật ăn thịt
như ong mật và bọ cánh cứng. Hầu hết các chế phẩm của Bt như Bt, Btg, Btt,
Btte… qua nghiên cứu đều cho kết quả âm tính với những tác động bất lợi đến thế
giới các loài động vật. Chỉ những loài động vật gây hại chuyên biệt mới bị tác động
của Bt, các lồi động vật khơng phải là đích của Bt thì khơng hề chịu bất kỳ một tác
động bất lợi nào từ Bt [35].
c. Ảnh hưởng của Bt đến các lồi thực vật
Khi cơng nghệ Bt hiện đại phát triển, cùng với sự phát triển của sinh học phân
tử và khoa học kỹ thuật đã cho phép con người chuyển gen sản sinh protein đặc
hiệu của Bt vào trong cơ thể của các loài cây trồng. Kỹ thuật này đã được áp dụng
trong các loại cây trồng như ngô, lúa, bông… Tuy nhiên vấn đề đặt ra gây lo ngại
cho con người ở đây chính là chất lượng của sản phẩm từ cây trồng mang gen Bt có
ảnh hưởng tới hệ sinh thái và quần thể cây trồng trên các cánh đồng không?

Vấn đề này trở thành một chủ đề nóng khi năm 1999, một báo cáo khoa học đã
cơng bố về ảnh hưởng có hại của hạt phấn từ cây ngô mang gen Bt đến ấu trùng của
lồi bướm có lợi Monarch. Báo cáo này đưa ra đã gây một mối quan tâm đặc biệt và


lo ngại về những rủi ro mà thực vật chuyển gen Bt có thể gây ra đối với sinh vật có
ích và sinh vật trung lập trong tự nhiên.
Tuy nhiên, những nghiên cứu trong thời gian gần đây của các nhà khoa học đã
cho thấy lồi ngơ chuyển gen sản sinh độc tố của Bt gây ảnh hưởng không đáng kể
đối với quần thể bướm Monarch trên cánh đồng. Một chương trình hợp tác nghiên
cứu giữa các nhà khoa học Hoa Kỳ và Canada đã cung cấp những thông tin nhằm
xây dựng quá trình đánh giá rủi ro tiêu chuẩn về ảnh hưởng của ngô Bt đối với quần
thể bướm Monarch. Các nhà khoa học đi đến kết luận rằng, ở hầu hết các giống lai
thương mại thì protein độc tố Bt xuất hiện với nồng độ thấp hơn nhiều trong hạt
phấn và khơng hề gây ảnh hưởng có hại đến các loài bướm trên cánh đồng. Quần
thể các loài sinh vật có ích và trung lập khác khơng hề bị suy giảm trên các cánh
đồng này [35].
Như vậy, cây trồng sử dụng công nghệ chuyển gen Bt (công nghệ GMO)
không hề tác động đến đa dạng sinh học trên các cánh đồng, cũng như sản phẩm của
cây trồng Bt không gây tác động nào đối với các sinh vật sử dụng chúng cũng như
đối với con người.
GIỚI THIỆU VỀ MUỖI
Giới thiệu chung
Muỗi là một nhóm sinh vật thuộc lớp côn trùng họ Culicidae, bộ Hai cánh
(Diptera). Họ Culicidae thuộc bộ Diptera và chứa khoảng 2700 loài trong 35 giống
gồm: Anopheles, Culex, Psorophora, Ochlerotatus, Aedes, Sabethes, Wyeomyia,
Culiseta, Haemagoggus, .... Chúng có một đơi cánh vảy, một đơi cánh cứng, thân
mỏng, các chân dài. Kích thước thay đổi theo lồi, đa số có trọng lượng khoảng 2
đến 2,5 mg và có thể bay với tốc độ 1,5 đến 2,5 km/h.
Thức ăn của muỗi là chủ yếu là nhựa cây và hoa quả. Muỗi cái cần hút thêm

máu để có nguồn protein sản sinh ra trứng. Muỗi đực khơng có vịi thích hợp để hút
máu. Cũng có một nhánh muỗi, tên là Toxorhynchites, không hút máu. Muỗi cái
dựa vào nhiệt độ cơ thể con mồi, mùi mồ hôi, mùi cơ thể, axit lactic, cacbon dioxit
để tìm ra con mồi. Trong nước bọt của muỗi cái chứa protein chống máu đông nên
máu sẽ không bị đông lại. Khi muỗi đốt xong và bay đi, nước bọt của chúng vẫn


đọng lại trong vết thương. Lượng protein trong nước bọt này sẽ khiến cơ thể phản
ứng lại qua việc da căng phồng lên và cảm thấy ngứa, chỉ đến khi các protein nước
bọt bị các tế bào miễn dịch trong cơ thể phá vỡ thì cơn ngứa mới chấm dứt [4, 7, 8,
15, 22, 23, 24, 37].
1.3.2. Vòng đời và đặc tính sinh học của muỗi.
Muỗi thuộc lồi biến thái hồn tồn, vịng đời trải qua 4 giai đoạn: Trứng, ấu
trùng, nhộng, trưởng thành. Mỗi giai đoạn có thể dễ dàng nhận biết bởi những đặc
điểm khác biệt. Toàn bộ thời gian từ trứng đến muỗi trưởng thành, ở điều kiện tốt
nhất là khoảng 7 - 13 ngày. Nhiệt độ mơi trường càng cao, vịng đời phát triển của
muỗi càng ngắn, nhưng nếu cao q 350C thì muỗi khơng phát triển được. Nhiệt độ
mơi trường thích hợp cho muỗi phát triển khoảng 250C - 300C [4, 7, 8, 15, 22, 23,
37].
1.3.3. Tác hại của muỗi
Muỗi là tác nhân lây truyền những căn bệnh nguy hiểm. Muỗi Anopheles
mang ký sinh trùng sốt rét. Một số lồi muỗi có khả năng là vật trung gian truyền
bệnh giữa người với người, hay giữa động vật và người. Các bệnh do muỗi truyền
có thể gây tử vong cao chủ yếu là sốt xuất huyết, sốt rét, sốt vàng da, ...
Trên thế giới, bệnh sốt rét hiện dẫn đầu trong số ca tử vong, nhất là đối với trẻ
em dưới 5 tuổi, với khoảng 5,3 triệu trẻ em chết mỗi năm. Muỗi gây ra bệnh sốt rét
có tên Khoa học là Anopheles. Ở Việt Nam có 3 loại muỗi truyền sốt rét là
Anopheles dirut, Anopheles sundaiais và Anopheles. Chúng thường trú đậu trên
tường, mái, vách, gầm, gập, vật treo, hốc cây, hố đất, lùn bụi... Chúng thường chích
đốt máu người suốt đêm, đỉnh cao là từ 8 giờ tối đến 3 giờ sáng.

Hầu hết các loài muỗi đều mang ký sinh trùng giun chỉ, loại ký sinh trùng gây
nên biến dạng trên cơ thể phổ biến là bệnh chân voi thông qua việc gây sưng phồng
lớn một vài bộ phận trên cơ thể. Trên thế giới có khoảng 40 triệu người đang sống
tàn phế do ký sinh trùng giun chỉ gây ra. Các bệnh do virút gây ra như sốt vàng da
và dịch hạch được lan truyền chủ yếu bởi lồi muỗi vằn có tên khoa học là Aedes
aegypti.


Ở Việt Nam, vào mùa hè và mùa mưa hàng năm, sự phát triển của muỗi
thường xuyên diệt trừ muỗi gây nên các dịch bệnh gây tử vong ở nhiều người.
Theo nhận định của WHO, trong 5 – 8 năm tới tất cả các loại bệnh này đều
chưa có vắcxin phòng ngừa [7, 8, 15, 37].
1.3.4. Các biện pháp phòng và diệt trừ muỗi
Để tiêu diệt và khống chế muỗi có hiệu quả cần nghiên cứu kỹ địa bàn tập
trung và chọn lựa giai đoạn phát triển dễ tác động. Một số biện pháp phịng trừ tổng
hợp đối với lồi muỗi như sau:
- Khống chế trứng và bọ gậy: San lấp các hố nước đọng, khai thông cống rãnh,
đổ hết nước đọng tại các dụng cụ tồn lưu nước như chum, vại, ... Dọn dẹp, phát
quang bụi cây, thu dọn rác thải xung quanh khu vực cần xử lý.
- Phun hố chất định kỳ để diệt cơn trùng và các vectơ truyền bệnh, thời gian
phun tốt nhất là vào đầu và cuối mùa mưa.
- Đốt hương muỗi: Được sử dụng nhiều do giá thành rẻ và không tốn năng
lượng.
- Dùng đèn bẫy và vợt bắt muỗi: Đèn bẫy muỗi được bao quanh bởi lưới kim
loại có hiệu điện thế thấp với một đèn phát ánh sáng hấp dẫn muỗi và côn trùng tụ
tập đến. Khi muỗi và côn trùng sa vào lưới, dịng điện nhỏ sẽ phóng qua và tiêu diệt
chúng [7, 8, 15, 37].
Những phương pháp phòng và diệt trừ muỗi trên đây đã và đang mang lại
những hiệu quả nhất định. Tuy nhiên, còn tồn tại nhiều nhược điểm như cần phải
thực hiện định kỳ, tốn thời gian, cơng sức, hóa chất, dụng cụ... Do vậy, việc sử dụng

chế phẩm sinh học từ vi khuẩn Bacillus thuringensis đang là lựa chọn hàng đầu của
nhiều nước trên thế giới bởi những ưu điểm vượt trội của nó. Tại Việt Nam chế
phẩm này đã được sản xuất và thử nghiệm thành cơng. Tuy nhiên, giá thành cịn khá
cao.


CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Các chủng vi khuẩn Bacillus có khả năng diệt bọ gậy tồn tại trong:
- Mẫu đất thu thập ở khu vực trường Đại học Sư phạm, Liên Chiểu, Đà Nẵng
- Mẫu nước thu thập tại khu vực trường Đại học Sư phạm, Liên Chiểu, Đà
Nẵng.
2.2. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
Q trình phân lập, xác định hoạt tính, nghiên cứu đặc điểm sinh học, sử dụng
vi sinh vật để diệt bọ gậy và phân tích kết quả được tiến hành ở các phịng thí
nghiệm khoa Sinh – Mơi trường, trường Đại học Sư phạm Đà Nẵng:
- Phịng thí nghiệm Sinh lý – Sinh hóa – Vi sinh.
- Phịng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học.
Đề tài nghiên cứu được tiến hành từ tháng 10 năm 2015 đến tháng 4 năm
2016.
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Sơ đồ tóm tắt quy trình nghiên cứu:
Phân lập các chủng vi khuẩn Bacillus từ nước và đất

Đánh giá khả năng diệt bọ gậy của các chủng Bacillus phân
lập được, tuyển chọn chủng có hoạt lực mạnh nhất
Khảo sát đặc điểm sinh học của chủng Bacillus
được tuyển chọn

Nuôi cấy chủng Bacillus – Sản xuất sinh khối - Tạo chế phẩm
thô

Đánh giá khả năng tiêu diệt bọ gậy của chế phẩm


2.3.1. Phương pháp thu mẫu ngoài thực địa
 Mẫu nước [13, 38, 42]
- Thu thập mẫu nước ở các địa điểm khác nhau.
- Cách thu mẫu nước: khuấy cho nước được đồng nhất, mỗi điểm lấy 3 chỗ
sau đó trộn đều, cho vào bình thủy tinh sạch. Trên mẫu ghi rõ địa điểm lấy mẫu,
ngày lấy.
- Mẫu nên được tiến hành phân tích và phân lập ngay. Trong trường hợp cần
thiết phải lưu mẫu, mẫu nước được bảo quản trong tủ lạnh 4oC và sử dụng trong
vòng 24 giờ sau đó.
 Mẫu đất [13, 38, 42]
- Thu thập mẫu đất từ các địa điểm khác.
- Cách thu thập mẫu đất: Gạt bỏ lớp đất mặt khoảng 2 – 3 cm, dùng dụng cụ
sạch thu lấy 100 gam đất. Mỗi điểm lấy 3 chỗ sau đó trộn đều 3 mẫu này trong túi
nilon vô trùng. Lấy 100 gam đất cho vào túi vơ trùng khác. Dán kín, bảo quản ở
nhiệt độ thấp và khơ ráo. Trên mẫu đất có ghi rõ địa điểm thu mẫu, thảm thực vật,
ngày lấy mẫu.
2.3.2. Phương pháp phân lập và giữ giống vi sinh vật
 Phân lập các mẫu dựa trên phương pháp phân lập của Egorov
 Mẫu nước [13, 29, 42]
- Lấy 1 ml dung dịch mẫu cho vào ống nghiệm có chứa 9 ml nước cất, lắc đều,
ta có độ pha lỗng 10-1. Hút 1 ml cho tiếp tục vào ống nghiệm chứa sẵn 9 ml nước
cất, lắc đều, ta có độ pha lỗng 10-2. Tiếp tục pha loãng đến nồng độ cần thiết.
- Dùng pipep vơ trùng hút dịch pha lỗng ở nồng độ 10-4 – 10-8 khoảng 0,1 ml
nhỏ vào đĩa peptri chứa môi trường phân lập T3 đã vô trùng, dùng que gạt trang đều

trên mặt thạch. Sau đó bao gói cẩn thận và nuôi trong tủ ấm nhiệt độ 28 – 30oC
trong khoảng 48 – 72 giờ.
- Lựa chọn khuẩn lạc có hình thái giống khuẩn lạc Bacillus ni tiếp trong 72
giờ.


- Làm tiêu bản nhuộm đơn với fuchsin và kiểm tra dưới kính hiển vi quang
học. Các mẫu tế bào sinh dưỡng hình que và có tinh thể nội bào chính là Bacillus.
- Thuần khiết lại giống và bảo quản giống.
 Mẫu đất [13, 29, 42]
- Cân 1 gam mẫu, cho vào cối đá nghiền nhỏ. Cho 10 ml nước cất vào hòa tan
mẫu. Tiến hành thực hiện như mẫu là dạng lỏng. Tiếp tục pha loãng ở nồng độ cần
thiết.
- Dùng pipep vơ trùng hút dịch pha lỗng ở nồng độ 10-4 – 10-8 khoảng 0,1 ml
nhỏ vào đĩa peptri chứa môi trường phân lập T3 đã vô trùng, dùng que gạt trang đều
trên mặt thạch. Sau đó bao gói cẩn thận và ni trong tủ ấm nhiệt độ 28 – 30oC
trong khoảng 48 – 72 giờ.
- Lựa chọn khuẩn lạc có hình thái giống khuẩn lạc Bacillus ni tiếp trong 72
giờ.
- Làm tiêu bản nhuộm đơn với fuchsin và kiểm tra dưới kính hiển vi quang
học. Các mẫu tế bào sinh dưỡng hình que và có tinh thể nội bào chính là Bacillus.
- Thuần khiết lại giống và bảo quản giống.
 Phương pháp giữ giống
Theo phương pháp Egorov, để bảo quản chủng giống vi sinh vật cho những
nghiên cứu tiếp theo, tơi tiến hành cấy lại định kì trên mơi trường thạch nghiêng có
cùng mơi trường T3 để ở tủ ấm ở 28 – 30oC trong 2 – 3 ngày. Sau đó bảo quản
trong tủ lạnh ở 4oC, cấy chuyền định kì để giữ giống [40].
2.3.3. Phương pháp quan sát hình dạng tế bào, bào tử, tinh thể độc của vi
khuẩn Bacillus thuringiensis
Tiến hành làm vết bôi sinh khối vi khuẩn trên lam kính. Nhuộm vết bơi với

thuốc nhuộm fuchsin đậm đặc trong 1 phút. Rửa nhẹ bằng ethanol 10%, sau đó rửa
với nước cất và quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi ở vật kính x100 [24, 38].
2.3.4. Phương pháp khảo sát khả năng diệt bọ gậy của các chủng Bacillus
Để xác định độc lực của các chủng vi khuẩn Bacillus đã phân lập được đối với
các loại bọ gậy, tiến hành thực hiện các thí nghiệm sau:
 Nhân giống vi khuẩn Bacillus


Cấy giống và nhân giống cấp 1, cấp 2 trong các bình tam giác chứa 100 ml
mơi trường nhân giống vô trùng đã chuẩn bị từ trước. Tiến hành nhân giống mỗi
cấp ở 200 vòng/phút, 28oC trong 24 giờ.
 Lên men tạo sinh khối vi khuẩn Bacillus
Lấy 5 ml giống cấp 2 cấy sang các bình tam giác 250 ml chứa 100 ml môi
trường lên men (tỷ lệ tiếp giống 5%). Tiến hành lên men trên máy lắc với tốc độ
200 vòng/phút ở 28oC trong 50 – 60 giờ.
 Xác định số lượng bào tử/ tinh thể độc của vi khuẩn Bacillus
Do mỗi tế bào của các chủng Bacillus khi bị phá vỡ giải phóng ra một bào tử
và một tinh thể độc. Cho nên bằng cách đếm số lượng bào tử ta có thể ước tính số
lượng bào tử có trong dịch lên men, cũng như theo dõi được tốc độ sinh trưởng của
chủng Bacillus đang sử dụng.
Để đếm số lượng bào tử ta tiến hành xử lý mẫu ở 70oC trong 10 phút rồi pha
loãng mẫu. Lấy 0,1 ml ở 3 nồng độ pha loãng cuối cấy gạt vào các đĩa thạch vô
trùng chứa môi trường đếm số lượng bào tử (mỗi nồng độ 2 đĩa). Để vào tủ ấm ở
28oC trong 24h rồi đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên mỗi đĩa.
Số lượng bào tử trong 1ml dịch lên men sẽ được tính theo cơng thức:

N(CFU / g hay CFU / ml) =

C
n1.v.d1  ...  ni .v.d i

(1)

Trong đó:
- N: Số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn trong 1 g hay 1 ml mẫu
(CFU: colony forming units).
- C: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các hộp petri đã chọn.
- ni: Số hộp petri cấy tại độ pha loãng thứ i.
- di: Hệ số pha lỗng tương ứng.
- v: Thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa.
 Thử khả năng diệt bọ gậy của các chủng Bacillus
Để thử hoạt lực diệt bọ gậy của các chủng vi khuẩn Bacillus đã phân lập, tôi
tiến hành thu hồi dịch lên men tương ứng với từng chủng ở thời điểm thu được