Luận văn thạc sĩ nghiên cứu tuyển chọn một số chủng lactobacillus, bacillus và rhodospirillaceae dùng để sản xuất chế phẩm sinh học cải thiện môi trường nước nuôi trồng thủy sản​

i

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN THỊ THÙY LINH

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG
LACTOBACILLUS, BACILLUS VÀ RHODOSPIRILLACEAE
DÙNG ĐỂ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH HỌC CẢI THIỆN
MÔI TRƢỜNG NƢỚC NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN – 2015
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




ii

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN THỊ THÙY LINH

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG
LACTOBACILLUS, BACILLUS VÀ RHODOSPIRILLACEAE
DÙNG ĐỂ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH HỌC CẢI THIỆN
MÔI TRƢỜNG NƢỚC NI TRỒNG THỦY SẢN

Chun ngành

: Cơng nghệ sinh học

Mã số

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học : PGS.TS LƢƠNG THỊ HỒNG VÂN
TS. TRẦN ĐỨC HẠNH

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




iii

THÁI NGUYÊN - 2015

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




iv

LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu,

kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chƣa từng đƣợc ai cơng
bố trong bất kì cơng trình nào khác.
Tơi xin cam đoan rằng các thơng tin trích dẫn trong luận văn đều đã đƣợc
ghi rõ nguồn gốc.

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Thùy Linh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




v

LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình học tập và nghiên cứu tại lớp Cao học công nghệ sinh
học trường đại học Khoa Học, tôi đã nhận được sự giúp đỡ, giảng dạy nhiệt
tình của các thầy giáo, cơ giáo trong nhà trường. Nhân dịp này tôi xin bày tỏ lời
cảm ơn chân thành tới tập thể các thầy giáo, cô giáo; đặc biệt là các thầy, cô
trong bộ môn Khoa học sự sống, Đại học Khoa học – Đại học Thái Ngun
Đặc biệt, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến các thầy hướng dẫn khoa
học là PGS. TS Lương Thị Hồng Vân và TS. Trần Đức Hạnh – CTHĐQT công
ty cp thuốc thú y Đức Hạnh Marphavet đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ tơi
trong q trình thực hiện đề tài và hồn thành luận văn.
Tơi xin gửi lời cảm ơn đến PGS.TS Cù Hữu Phú và ThS. Âu Xuân Tuấn đã
cung cấp tài liệu và những ý kiến q báu để tơi hồn thiện đề tài nghiên cứu.
Tôi chân thành cám ơn tới các Giáo sư, Tiến sỹ trong q trình đọc luận văn
đã có những nhận xét tinh tế, sắc sảo, giúp tôi sửa chữa các thiếu sót của mình.

Xin cám ơn ban Giám Đốc, các phịng ban và các đồng nghiệp trong cơng
ty Cp thuốc thú y Đức Hạnh Marphavet đã tạo điều kiện về thời gian và cổ vũ,
động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Xin trân thành cảm ơn!
Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Thùy Linh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




vi

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

1.

Vi khuẩn quang hợp

2.

Bacteriochlorophyll

3.

BT

4.

KL

5.

TH

6.

LM

7.

CFU

8.

CP

9.

CTV

10.OD
11.DO
12.COD
13.BOD

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

vii

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN..................................................................................................i
LỜI CẢM ƠN.......................................................................................................ii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT..............................................................................i
MỤC LỤC...........................................................................................................vii
DANH MỤC BẢNG.............................................................................................x
DANH MỤC HÌNH............................................................................................xii
MỞ ĐẦU...............................................................................................................1
1. Đặt vấn đề......................................................................................................... 1
2. Mục tiêu nghiên cứu......................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu.........................................................................................2
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU...................................................................3
1.1. Tình hình phát triển nghề ni trồng thủy sản ở Việt Nam............................3
1.1.1. Hiện trạng nuôi trồng và dịch bệnh trong hoạt động nuôi trồng thủy sản .. 4

1.1.2. Hiện trạng sử dụng chế phẩm sinh học trong nuôi trồng thủy sản..............5
1.2. Giới thiệu chung về Probiotic........................................................................6
1.2.1. Định nghĩa probiotic................................................................................... 6
1.2.2. Vai trị của probiotic....................................................................................8
1.2.3. Những nhóm vi sinh vật thƣờng đƣợc sử dụng trong sản xuất probiotic. .9
1.2.4. Vi khuẩn Bacillus......................................................................................11
1.2.5. Vi khuẩn Lactobacillus............................................................................. 14
1.2.6. Vi khuẩn quang hợp tía............................................................................. 18
1.2.7. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh trƣởng và phát triển của vi

khuẩn...................................................................................................................20
1.3. Đặc điểm và những chỉ số cơ bản đánh giá nƣớc nuôi trồng thủy sản........21
1.3.1. Đặc điểm nƣớc nuôi tôm cá......................................................................21
1.3.2. Những chỉ số cơ bản đánh giá nƣớc nuôi tơm cá..................................... 22
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




viii

1.3.3. Yêu cầu về nƣớc nuôi tôm cá................................................................... 24
1.4. Các bệnh thƣờng xảy ra cho tôm khi ao nuôi bị nhiễm bẩn........................25
1.5. Ứng dụng Chế phẩm sinh học trong nuôi trồng thủy sản............................ 27
1.6. Một số sản phẩm probiotic dùng trong chăn nuôi thủy sản trên thị trƣờng
hiện nay...............................................................................................................29
Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.....................31
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu và lý do chọn đối tƣợng nghiên cứu.......................31
2.2. Hóa chất và thiết bị sử dụng.........................................................................32
2.2.1. Hóa chất.................................................................................................... 32
2.2.2. Thiết bị...................................................................................................... 32
2.3. Môi trƣờng nghiên cứu................................................................................33
2.3.1. Môi trƣờng MRS (g/l).............................................................................. 33
2.3.2. Môi trƣờng SA (g/l)..................................................................................33
2.3.3. Môi trƣờng MPA (g/l)...............................................................................33
2.3.4. Dung dịch vi lƣợng (g/l)...........................................................................34
2.3.5. Hỗn hợp vitamin (mg/ml)..........................................................................34
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu và xác định các chỉ tiêu nghiên cứu...................34
2.4.1. Phƣơng pháp lựa chọn chủng vi khuẩn sử dụng để sản xuất chế phẩm sinh học
.................................................................................................................................... 34

2.4.2. Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình nhân giống..............35
2.4.3.Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men....................36
2.4.4. Phƣơng pháp định tính vi khuẩn nghiên cứu............................................37
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..........................................................39
3.1. Kết quả nghiên cứu tuyển chọn giống sản xuất........................................... 39
3.1.1. Chọn chủng có hoạt tính sinh học ổn định, an tồn với vật ni..............39
3.1.2. Xác định điều kiện nhân giống................................................................. 42
3.2. Kết quả nghiên cứu quy trình lên men sản xuất chế phẩm..........................47
3.2.1. Lên men chìm............................................................................................47
3.2.2. Kết quả nghiên men Bacillus, Lactobacillus trên mơi trƣờng xốp...........49
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




ix

3.3. Kết quả nghiên cứu kỹ thuật thu hồi sinh khối tạo chế phẩm và bảo quản chế
phẩm....................................................................................................................55
3.3.1. Tạo chế phẩm dạng dịch và dạng bột........................................................55
3.3.2. Thử an toàn với động vật thí nghiệm........................................................57
3.3.3. Kỹ thuật bảo quản chế phẩm.....................................................................58
3.4. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở và quy trình kiểm nghiệm chế phẩm................59
3.5. Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm........................................................62
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.............................................................................67
TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................68

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

x

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Các loài vi khuẩn sử dụng để xử lý môi trƣờng.................................11
Bảng 1.2: Sự sắp xếp của các chi Lactobacillus................................................. 15
Bảng 1.3: Một số đặc điểm của vi khuẩn tía.......................................................19
Bảng 1.4: Ảnh hƣởng của pH đến sự sinh trƣởng và phát triển của tôm cá......23
Bảng 1.5: Một số chỉ tiêu của nƣớc nuôi trồng thủy sản [5]..............................25
Bảng 1.6: Các thơng số mơi trƣờng thích hợp cho tơm sú thâm canh [2]..........25
Bảng 3.1. Kiểm tra khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh tôm cá.............39
Bảng 3.2. Khả năng sinh enzym phân hủy hữu cơ của vi khuẩn........................40
Bảng 3.3: Khả năng sinh trƣởng (theo tích lũy sinh khối OD660) của chủng vi
khuẩn tía Rhodopseudomonas palustris trong các nguồn nƣớc thải..................41
Bảng 3.4: Thành phần môi trƣờng nhân giống Bacillus thích hợp.....................42
Bảng 3.5: Nhiệt độ nhân giống Bacillus thích hợp............................................. 43
Bảng 3.6: Tỷ lệ giống thích hợp..........................................................................43
Bảng 3.7: Thành phần mơi trƣờng nhân giống L.acidophillus TN thích hợp.....44
Bảng 3.8: Nhiệt độ nhân giống Lactobacillus acidophillus TN thích hợp..........44
Bảng 3.9: pH mơi trƣờng nhân giống L.acidophillus TN thích hợp...................44
Bảng 3.10: Tỷ lệ giống L.acidophillus TN thích hợp..........................................45
Bảng 3.11: Nhu cầu vitamin của Rhodopseudomonas palustris RD..................45
Bảng 3.12: Khả năng sinh trƣởng của R.palustris RD trong các khoảng pH.....45
Bảng 3.13: Xác định độ thơng khí trong bình lên men L.acidophillus TN và
R.palustris RD.....................................................................................................48
Bảng 3.14: Xác định độ thơng khí trong bình lên men Bacillus.........................48
Bảng 3.15: Khảo sát thời gian lên men Bacillus và L.acidophillus TN..............49
Bảng 3.16: Khảo sát thời gian lên men R.palustris RD......................................49

Bảng 3.17: Tỷ lệ giống thích hợp........................................................................50
Bảng 3.18: Nguồn cacbon thích hợp đối với lên men Lactobacillus trên mơi
trƣờng xốp.......................................................................................................... 50
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




xi

Bảng 3.19: Thời gian lên men thích hợp.............................................................51
Bảng 3.20: Thành phần lên men Bacillus trên môi trƣờng xốp..........................52
Bảng 3.21: Ảnh hƣởng nguồn cacbon đến quá trình lên men Bacillus trên môi
trƣờng xốp.......................................................................................................... 52
Bảng 3.22: Nhiệt độ lên men Bacillus trên môi trƣờng xốp...............................53
Bảng 3.23: Tỷ lệ giống lên men Bacillus trên môi trường xốp...........................53
Bảng 3.24: Thời gian lên men Bacillus trên mơi trƣờng xốp thích hợp.............53
Bảng 3.25: Nhiệt độ sấy thích hợp đối với chế phẩm lên men B.subtilis DA.....56
Bảng 3.26: Thành phần công thức tạo chế phẩm bột..........................................56
Bảng 3.28: Kết quả thử độc tính cấp của chế phẩm bột......................................57
Bảng 3.29: Kết quả thử độc tính cấp của chế phẩm lỏng....................................57
Bảng 3.30: Bảo quản chế phẩm dạng dịch..........................................................58
Bảng 3.31: Bảo quản chế phẩm dạng bột............................................................59
Bảng 3.32: Tóm tắt các tiêu chuẩn chế phẩm..................................................... 59
Bảng 3.33: Định tính của chế phẩm theo TCVN 2011....................................... 60

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

xii

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Tế bào Bacillus subtilis.......................................................................12
Hình 1.2. Tế bào Bacillus licheniformis............................................................. 13
Hình 1.3. Tế bào Bacillus amyloliquefaciens..................................................... 13
Hình 3.1: Khả năng chịu mặn của các chủng vi khuẩn.......................................40
Hình 3.2: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sinh trƣởng của R.palustris RD...........46
Hình 3.3: Sơ đồ quy trình nhân giống.................................................................47
Hình 3.4: Sơ đồ quy trình lên men chìm và lên men trên mơi trƣờng xốp.........54
Hình 3.5: Quy trình kiểm nghiệm chế phẩm.......................................................61
Hình 3.6: Quy trình sản xuất chế phẩm.............................................................. 63
Hình 3.7: Hệ thống lên men sục khí hãng Sartorius – Đức.................................65

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




1

MỞ ĐẦU
1.

Đặt vấn đề
Nuôi trồng thủy sản đƣợc coi là ngành sản xuất thực phẩm quan trọng

trong việc cung cấp protein động vật cho nhu cầu tiêu dùng của con ngƣời.
Trong hai mƣơi năm qua, ngành nuôi trồng thủy sản đã tăng trƣởng nhanh

chóng, đƣợc coi ngành có tốc độ tăng trƣởng cao nhất trong các ngành sản xuất
thực phẩm. Tại Châu Âu, sản lƣợng nuôi trồng thủy sản dự đoán vƣợt mức 2,5
triệu tấn trong năm 2015 và đạt mức 4 triệu tấn trong năm 2030. Các nƣớc khu
vực châu Á Thái Bình Dƣơng là các nƣớc có sản lƣợng nuôi trồng thủy sản cao
nhất trên thế giới, chiếm 89% về khối lƣợng.
Tại Việt Nam ngành nuôi trồng thủy sản đã và đang thu hút nhiều ngƣời
tham gia và cũng đã đóng góp đáng kể vào sự tăng trƣởng kinh tế. Tuy nhiên,
nuôi trồng thủy sản cũng đang phải đối mặt với thực trạng hết sức khó khăn hiện
nay là sự nhiễm bẩn môi trƣờng nuôi và dịch bệnh ở tôm, cá đã gây thiệt hại
nặng nề cho ngƣời nuôi.
Khi ao đầm nuôi bị nhiễm bẩn là cơ hội tốt cho nhóm vi sinh vật có hại
phát triển mạnh mẽ, khơng kiểm sốt đƣợc và hậu quả là vật ni bị bệnh. Có
khi bệnh phát thành dịch do lây lan. Đặc biệt nhóm bệnh cơ hội do Vibrio gây ra
nhƣ bệnh phát sáng, bệnh đen mang, bệnh ăn mòn vỏ kitin, bệnh mịn đi, cụt
râu chỉ phát sinh khi nƣớc nuôi bị nhiễm bẩn.
Nguyên nhân gây ô nhiễm của ao đầm nuôi trồng thủy sản là do lƣợng
thức ăn thừa cùng với uế thải hữu cơ và phế thải do lột xác để duy trì hoạt động
sống của tơm cùng với xác của động vật thủy sinh phù du là những yếu tố làm
cho ao nuôi bị nhiễm bẩn, bên cạnh đó việc sử dụng hóa chất, kháng sinh để
phịng ngừa bệnh và xử lý mơi trƣờng ni, ngồi những tác dụng mong muốn
đã gây ra nhiều ảnh hƣởng không tốt đến môi trƣờng và con ngƣời, tồn dƣ
kháng sinh trong môi trƣờng thủy sinh đã ảnh hƣởng đến sự cân bằng của hệ vi
sinh vật trong ao, vi phạm vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm, gây khó khăn trong
việc xuất khẩu thủy sản trên thị trƣờng thế giới.


2

Vì vậy, việc xử lý mơi trƣờng trong q trình ni nhằm cải thiện mơi
trƣờng nƣớc và phịng ngừa dịch bệnh là cấp thiết. Một trong những giải pháp

quan trọng là sử dụng chế phẩm sinh học có chứa các vi sinh vật mang những
đặc tính hữu ích ( phân hủy hữu cơ, đối kháng với vi khuẩn gây bệnh…) để xử
lý mơi trƣờng, tăng khả năng phịng bệnh của vật nuôi đã đƣợc nhiều nƣớc trên
thế giới áp dụng.
Tuy nhiên, các chế phẩm sinh học, thuốc thú y thủy sản trên thị trƣờng
hiện nay chủ yếu là chế phẩm nhập khẩu từ nƣớc ngồi, có giá thành khá cao,
cách sử dụng phức tạp ( thƣờng phải hoạt hóa trƣớc khi sử dụng) nên gây tâm lý
ngại sử dụng cho ngƣời dân.
Từ những cơ sở lý luận về thực tiễn nói trên, chúng tơi tiến hành đề tài:
“Nghiên cứu tuyển chọn một số chủng Lactobacillus, Bacillus và
Rhodospirillaceae dùng để sản xuất chế phẩm sinh học cải thiện môi trường
nước nuôi trồng thủy sản ”.
2.
-

Mục tiêu nghiên cứu
Tuyển chọn đƣợc các chủng vi khuẩn thuần chủng có hoạt tính sinh

enzym phân giải hữu cơ, sinh chất kháng khuẩn và khử H 2S dùng để sản xuất
chế phẩm sinh học.
-

Tạo ra chế phẩm sinh học có chất lƣợng tốt để cải thiện, xử lý môi

trƣờng nƣớc nuôi thủy sản.
3.
-

Nội dung nghiên cứu
Tuyển chọn chủng vi khuẩn có đặc tính và tính chất phù hợp để sử dụng

sản xuất chế phẩm sinh học xử lý môi trƣờng nƣớc nuôi trồng thủy sản.
- Xác định đƣợc các điều kiện tối ƣu trong lên men sản xuất chế phẩm.
-

Thu hồi sinh khối tạo chế phẩm probiotic và bảo quản chế phẩm

probiotic.
-

Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở và quy trình kiểm nghiệm chế phẩm

probiotic.
-

Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm probiotic từ các chủng vi khuẩn

nghiên cứu.


3

Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình phát triển nghề nuôi trồng thủy sản ở Việt Nam
Trong những năm qua, ni trồng thủy sản phát triển mạnh, góp phần tích
cực vào việc phát triển nền kinh tế, xã hội. Ni cá nƣớc ngọt, ba ba, ếch cũng
có tốc độ tăng nhanh, tạo công ăn việc làm và tăng thu nhập cho một bộ phận
lớn ngƣời dân. Theo trang thông tin điện tử Tổng cục Thủy sản, giám đốc trung
tâm thơng tin thủy sản Dƣơng Long Trì [30], ƣớc tính giá trị nuôi trồng thủy sản
6 tháng đầu năm 2013 đạt 45.185 tỷ đồng (trong tổng số 83.318 tỷ đồng giá trị

sản xuất thủy sản). Sản lƣợng ƣớc đạt 1.405 nghìn tấn ( tăng 2,6% so với cùng
kì năm 2012).
Trong lĩnh vực nuôi trồng thủy sản, đặc biệt thu hút nhiều ngƣời tham gia
là nuôi tôm. Tôm cũng là mặt hàng xuất khẩu chiếm thị phần đáng kể trong kim
ngạch xuất khẩu thủy sản của nƣớc ta. Hàng năm, riêng tôm đã thu đƣợc hàng
ngàn USD. Tôm sú và nghề nuôi tôm sú đã từng đem lại lợi nhuận cao, góp phần
khơng nhỏ trong việc phát triển kinh tế của nhiều vùng. Công nghệ nuôi tôm sú
cũng từng bƣớc đƣợc hồn thiện từ ni quảng canh ở những vùng có nhiều
diện tích đến bán thâm canh và thâm canh với mật độ cao (40-50 con/m2).
Trong thời gian qua, nuôi tôm bán thâm canh và thâm canh phát triển khá
nhanh, tạo cơ hội du nhập công nghệ nuôi của các nƣớc tiên tiến trên thế giới
vào Việt Nam, nhanh chóng thay thế cho nuôi quảng canh lạc hậu, kém hiệu quả
và phá hủy môi trƣờng tự nhiên [10].
Một số cơ sở nuôi tôm thâm canh cũng bắt đầu đánh giá đƣợc vai trị quan
trọng của việc quản lý mơi trƣờng ni nên đã chú ý đầu tƣ cơ sở hạ tầng đúng yêu
cầu kỹ thuật. Xây dựng đầm, ao nuôi, hệ thống cấp thoát nƣớc đúng với yêu cầu.
Tuy vậy, phần lớn cơ sở nuôi trồng thủy sản lại chƣa nhận thức đúng về việc bảo vệ
môi trƣờng nuôi để phát triển bền vững. Nuôi tôm thâm canh, đặc biệt là nuôi tôm
sú chịu nhiều rủi ro về khách quan nhƣ mƣa, bão, lũ lụt, hạn hán và rủi ro về chủ
quan nhƣ kỹ thuật lạc hậu, con giống, thức ăn, hóa chất, chế phẩm xử lý mơi
trƣờng, thuốc trị bệnh kém chất lƣợng. Ngay cả khi thu hoạch


4

đƣợc sản phẩm thì ngƣời ni tơm cũng cịn gánh chịu thiệt hại nếu sản phẩm
còn dƣ lƣợng kháng sinh. Bởi vậy, rất nhiều cơ sở nuôi tôm bị thua lỗ nặng.
1.1.1. Hiện trạng nuôi trồng và dịch bệnh trong hoạt động ni trồng thủy sản
Sự phát triển nhanh chóng của hoạt động ni trồng thủy sản kéo theo tình
trạng ô nhiễm nặng nề, làm lây lan và bùng phát dịch bệnh. Trong điều kiện nuôi

tôm hiện nay, môi trƣờng ao nuôi rất giàu dinh dƣỡng. Nguyên nhân là do ngƣời
nuôi đã đƣa vào ao nuôi một lƣợng thức ăn tổng hợp rất lớn mà chỉ có một phần
nhỏ (khoảng 17%) lƣợng thức ăn đƣợc đồng hóa thành sinh khối tơm, cịn lại bị
hịa tan trong nƣớc hoặc bài tiết ra ngồi mơi trƣờng. Lƣợng thức ăn thừa, uế thải
hữu cơ và phế thải do lột xác để duy trì hoạt động sống của tôm cùng với xác động
vật thủy sinh phù du là những yếu tố làm cho ao ni nhiễm bẩn.
Có thể nói đa số những đầm tơm hiện tại bị thất bại là do môi trƣờng bị
nhiễm bẩn [1]. Sự nhiễm bẩn của ao đầm ngồi ơ nhiễm hữu cơ cịn nhiễm bẩn do
việc sử dụng hóa chất, kháng sinh trong q trình ni. Khi tơm có hiện tƣợng kém
ăn vì thay đổi thời tiết hay lột xác thì ngƣời ni thƣờng cho hóa chất, kháng sinh
vào ao ni. Việc sử dụng hóa chất khử trùng ao bên cạnh tác dụng mong muốn còn
gây ra những tác hại đối với mơi trƣờng nhƣ việc tồn lƣu hóa chất trong môi
trƣờng thủy sinh, làm giảm số lƣợng vi sinh vật có lợi trong ao ni (vi khuẩn
phân hủy hữu cơ, vi khuẩn đối kháng với vi sinh vật gây bệnh), làm cho quá trình
phân hủy hữu cơ bị đình trệ và hậu quả là mơi trƣờng bị q giàu dinh dƣỡng, kích
thích sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh, tăng cơ hội bệnh.
Bên cạnh đó việc sử dụng hóa chất, kháng sinh trong ni trồng thủy sản
cũng gây hiện tƣợng kháng thuốc, dƣ lƣợng kháng sinh trong thực phẩm hải sản
gây ra cho ngƣời tiêu dùng những rủi ro tiềm ẩn nhƣ tăng mẫn cảm với dƣ lƣợng
thuốc hoặc xuất hiện hệ vi khuẩn đƣờng ruột kháng lại các chất kháng khuẩn.
Vấn đề duy trì mơi trƣờng nuôi trong sạch là yếu tố cơ bản quyết định sự
thành bại của nghề nuôi tôm [1]. Tuy nhiên không phải ngƣời nuôi trồng thủy sản
nào cũng nhận thức đƣợc vấn đề đó. Nhiều cơ sở chƣa có hệ thống cấp thoát nƣớc
đúng kỹ thuật. Nƣớc trƣớc khi cấp vào đầm, ao và sau khi nuôi, xả ra


5

ngồi mơi trƣờng chƣa có biện pháp xử lý. Các ao hồ đƣợc bố trí dày đặc thiếu
quy hoạch nên đôi khi nƣớc xả của đầm này là nguồn cấp của đầm khác đó là cơ

hội để các mầm bệnh lây lan, phát triển thành dịch bệnh. Những thiệt hại do dịch
bệnh gây ra dẫn đến thua lỗ trong nuôi tôm xảy ra hàng năm và khắp nơi trong
cả nƣớc.
Theo thống kê, ở đồng bằng sông Cửu Long, năm 2004 có 50% tổng số
hộ ni bị thua lỗ. Ở khu vực miền Trung, tơm bị bệnh cịn nhiều hơn, đến 65%
số cơ sở ni bị bệnh. Có nhiều năm, nhiều cơ sở ni bị thiệt hại tồn bộ sản
lƣợng. Ở miền Bắc, hơn 50% số cơ sở nuôi tôm bị bệnh và gây thiệt hại khơng
nhỏ [10]. Nhóm bệnh đốm trắng, đỏ thân, đen mang thƣờng xuất hiện hơn cả.
Tiếp đó là bệnh nấm, ký sinh trùng, bệnh do vi khuẩn nhƣ phát sáng, bệnh mịn
đi, cụt đi chỉ mang tính chất cơ hội khi nƣớc bị ơ nhiễm, đặc biệt ô nhiễm
hữu cơ hoặc khi tôm cá bị stress do thay đổi nhiệt độ, pH, mật độ thả quá dày, sự
thay đổi độ mặn của nƣớc thì nguy cơ bị bệnh là không tránh khỏi [4,5,9].
1.1.2. Hiện trạng sử dụng chế phẩm sinh học trong nuôi trồng thủy sản
Để giảm thiểu những bất lợi của hóa chất trong ni trồng thủy sản, cần
phải hạn chế việc sử dụng. Điều đó có nghĩa là phải thƣờng xuyên đối mặt với
hàng loạt vấn đề ô nhiễm môi trƣờng và dịch bệnh. Vì vậy trong những năm gần
đây, nghiên cứu để tìm ra các yếu tố sinh học nhƣ probiotics, enzymes góp phần
cải tạo môi trƣờng, tăng sức đề kháng cho các đối tƣợng nuôi trồng đƣợc tiến
hành mạnh mẽ. Tuy vậy, việc sử dụng chế phẩm sinh học trong nuôi trồng thủy
sản hiện nay cũng là vấn đề cần bàn. Phần lớn các sản phẩm hiện nay lƣu hành
trên thị trƣờng là sản phẩm nhập ngoại bao gồm chế phẩm trộn vào thức ăn và
chế phẩm xử lý nƣớc. Nhiều công ty cung cấp, phân phối và nhận chuyển giao
kĩ thuật để sản xuất nhƣng vì mục đích thƣơng mại chƣa vì quyền lợi của
ngƣời sử dụng. Chƣa kể đến việc đƣa một lƣợng đáng kể các chủng vi sinh vật
vào Việt Nam cũng tiềm tàng nhiều nguy cơ an toàn sinh học.
Việc gia tăng mức độ thâm canh và diện tích ni trồng dẫn đến mơi
trƣờng càng có chiều hƣớng xấu đi và nhu cầu chế phẩm sinh học càng cao.


6

Nhất là trong tình hình thị trƣờng thơng báo cấm nhiều loại kháng sinh sử dụng
trong nuôi trồng thủy sản.
Đối với hình thức ni tơm bán thâm canh hay ni thâm canh, việc sử
dụng chế phẩm sinh học đƣợc nhìn nhận nhƣ biện pháp tích cực nhất. Bởi vì
chế phẩm sinh học có tác dụng giảm độc trong ao, chủ yếu là NH 3 và H2S; giảm
mùi hôi; cải thiện màu nƣớc; ổn định pH và cân bằng hệ sinh thái trong ao. Chế
phẩm sinh học cũng có tác dụng phịng bệnh, giảm thiểu hiện tƣợng gây bệnh
cho tơm. Ngồi ra, việc áp dụng chế phẩm sinh học trong nuôi trồng thủy sản
cịn giúp đối tƣợng ni hấp thụ thức ăn tốt hơn, giảm hệ số tiêu thụ thức ăn,
tăng năng suất thu hoạch từ 20-30% [22,24]. Bên cạnh đó, việc sử dụng chế
phẩm sinh học trong nuôi trồng thủy sản sẽ hạn chế sử dụng hóa chất và kháng
sinh, yếu tố gây hậu quả của việc nuôi trồng thủy sản kém bền vững. Thực tế
cho thấy, những cơ sở sử dụng chế phẩm sinh học đã đạt năng suất tôm khá cao,
giảm thiểu nguy cơ mắc bệnh.
1.2. Giới thiệu chung về Probiotic
1.2.1. Định nghĩa probiotic
Thuật ngữ probiotic do Metchnikoff đƣa ra khi nghiên cứu tại sao những
ngƣời nông dân Bungary có sức khỏe tốt vào năm 1970.
Từ “probiotic” có nguồn gốc từ Hy Lạp có nghĩa là “Cho cuộc sống”. Tuy
nhiên, định nghĩa về probiotics đã phát triển nhiều theo thời gian. Lily và Stillwell
(1965), đã mô tả lần đầu tiên về probiotic nhƣ hỗn hợp đƣợc tạo thành bởi một
động vật nguyên sinh có khả năng thúc đẩy sự phát triển của đối tƣợng khác. Phạm
vi của định nghĩa này đƣợc mở rộng hơn bởi Sperti vào đầu những năm 70 bao
gồm, dịch chiết tế bào thúc đẩy quá trình phát triển của vi sinh vật [15],[23].
Probiotic là những nhóm vi khuẩn trung tính, sống trong đƣờng tiêu hóa của
động vật, chúng tạo thành một khu hệ vi sinh vật, có chức năng cản trở sự phát triển
của một số vi sinh vật gây bệnh ở ngƣời và cung cấp một số chất có lợi cho cơ thể,
có tác dụng tốt cho hệ miễn dịch. Con ngƣời sử dụng các chế phẩm có chứa các
probiotic nhƣ một loại thực phẩm và nhƣ một loại thuốc phòng và chữa bệnh

7

Probiotics là những vi sinh vật nhƣ: vi khuẩn hay nấm men mà có thể
thêm vào thực phẩm với mục đích điều chỉnh quần thể vi sinh vật đƣờng ruột
của vật chủ.
Theo Laurent Verschuere và công tác viên (2000) probiotic đƣợc định
nghĩa nhƣ sau: "Probiotics là sinh vật sống có ảnh hƣởng tốt cho vật chủ nhờ
vào sự biến đổi hệ sinh vật gắn với vật chủ hay xung quanh vật chủ, từ đó cải
thiện khả năng sử dụng thức ăn, nâng cao khả năng chống bệnh của vật chủ, và
cải thiện môi trƣờng xung quanh”.
Năm 2001 Schrezenmeir và Devrese định nghĩa Probiotic là "Lƣợng vi
sinh vật sống xác định với số lƣợng thích hợp đƣợc chuẩn bị trong các sản
phẩm, có tác dụng biến đổi tích cực hệ vi sinh vật vùng ruột và có tác dụng tốt
đến sức khỏe vật chủ”.
Theo định nghĩa của FAO/WHO 2002:" Probiotic, đó là những vi sinh vật
sống đƣợc kiểm soát chặt chẽ, với lƣợng thích hợp mang lại lợi ích cho vật chủ".

Tóm lại probiotic là:
- Tập hợp các vi sinh vật sống
- Đƣợc đƣa vào cơ thể vật nuôi qua đƣờng tiêu hóa (thức ăn hay
thuốc)
- Đem lại hiệu quả tích cực cho sức khỏe của vật chủ
Để “tập hợp các vi sinh vật sống “thực sự” đem lại hiệu quả tích cực cho sức
khỏe vật chủ”, chúng phải đƣợc chọn lọc đáp ứng các tiêu chuẩn về:
- An toàn sinh học
- Hoạt tính sinh học
- Đặc tính kỹ thuật để trở thành sản phẩm của ngành lên men công
nghiệp.

Cơ chế hoạt động của Probiotic
Theo một vài cơng trình nghiên cứu gần đây chế phẩm sinh học đƣợc
hoạt động theo một số phƣơng thức sau:
- Cạnh tranh loại trừ vi khuẩn gây bệnh: Chế phẩm sinh học có khả
năng


bám dính vào bề mặt niêm mạc ruột, do vậy tạo ra cơ chế bảo vệ chống lại mầm
bệnh qua việc cạnh tranh điểm bám và thức ăn.


8

-

Tạo ra các hoạt chất ức chế: các nghiên cứu gần đây đã chứng minh các

dòng chế phẩm sinh học sản sinh ra các chất diệt khuẩn chống lại các mầm bệnh
thông thƣờng trên cá nhƣ Enterococcus durans, Escherichia coli, Micrococcus
luteus và Pseudomonas aeroginosa.
-

Tăng cƣờng hệ miễn dịch của vật ni: các chế phẩm sinh học có thể

kích thích hệ miễn dịch của vật ni. Các chất kích thích miễn dịch khác nhau
tùy theo môi trƣờng và cách sử dụng. Các chất dẫn xuất nhất định nhƣ
polysaccharides, lipoproteins, nucleotides and ß-glucans có khả năng làm tăng
bạch huyết cầu bằng cách kích hoạt đại thực bào. Việc sử dụng Bacillus sp đã
đƣợc chứng minh có hiệu quả trong việc phịng bệnh trên vật ni bằng cách
kích hoạt hệ miễn dịch dịch và hệ miễn dịch tế bào trong nuôi tôm sú.

1.2.2. Vai trò của probiotic



Tăng cường sức khỏe và ngăn chặn mầm bệnh:

Trong một thời gian dài, các chất kháng sinh đã đƣợc sử dụng để ngăn chặn
bệnh dịch trong nuôi trồng thủy sản. Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh gây ra
nhiều vấn đề nhƣ dƣ thừa chất kháng sinh trong các sản phẩm thủy sản, tạo ra
các cơ chế kháng kháng sinh cũng nhƣ làm mất cân bằng các men tiêu hóa trong
đƣờng ruột, gây ảnh hƣởng đến sức khỏe của vật nuôi. Hơn nữa, nhu cầu của
con ngƣời đối với các sản phẩm thủy sản sạch và an toàn trên thế giới ngày càng
cao. Do vậy, việc sử dụng chế phẩm sinh học là một biện pháp hữu hiệu trong
việc ngăn chặn mầm bệnh và kiểm soát dịch bệnh trong ni trồng thủy sản. Chế
phẩm sinh học có khả năng sản sinh ra các chất có tác dụng diệt các vi khuẩn
gây bệnh bám trên thành ruột của vật chủ, do vậy có thể coi chế phẩm sinh học
là một rào cản hữu hiệu ngăn chặn sự phát triển của mầm bệnh. Ngoài ra, chế
phẩm sinh học hay các “vi khuẩn có lợi” cịn có khả năng cạnh tranh vị trí bám
và thức ăn trong thành ruột với các vi sinh vật gây bệnh, không cho phép các vi
sinh vật này bám vào cơ thể vật nuôi, nhờ vậy giúp ngăn ngừa dịch bệnh, đảm
bảo sức khỏe cho vật nuôi.


9



Cải thiện hệ tiêu hóa:

Chế phẩm sinh học là nguồn dinh dƣỡng và enzyme cho bộ máy tiêu hóa

của vật nuôi. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng chế phẩm sinh học có ảnh hƣởng
tích cực đến q trình tiêu hóa của các vật ni bởi vì các dịng chế phẩm sinh
học sản xuất ra các enzyme ngoại bào nhƣ protease, amylase, lipaza và cung cấp
các dƣỡng chất phát triển cần thiết nhƣ vitamin, axit béo, acid amin,… Trong
nuôi trồng thủy sản, các vi sinh vật nhƣ Bacteroides và Clostridium sp đã cung
cấp dinh dƣỡng cho tôm cá, đặc biệt là cung cấp các axit béo và vitamin.



Cải thiện chất lượng nước:

Chế phẩm sinh học còn giúp ngăn ngừa và giảm thiểu ô nhiễm trong ao
nuôi. Các vi sinh vật có lợi giúp phân hủy các chất hữu cơ, góp phần làm giảm
thiểu việc hình thành các lớp bùn và chất cặn bã, nhờ vậy chất lƣợng nƣớc trong
ao nuôi đƣợc cải thiện, làm tăng số lƣợng của động vật phù du, giảm mùi hơi, từ
đó tăng sản lƣợng ni trồng thủy sản. Hơn nữa, sử dụng chế phẩm sinh học sẽ
góp phần làm giảm việc sử dụng các hóa chất, kháng sinh trong phịng và trị
bệnh trong ni trồng thủy sản, đảm bảo sản xuất sản phẩm an toàn cho sức
khỏe con ngƣời và góp phần phát triển ngành ni trồng thủy sản bền vững.
1.2.3. Những nhóm vi sinh vật thƣờng đƣợc sử dụng trong sản xuất probiotic

Chế phẩm sinh học đƣợc sử dụng trong nuôi trồng thủy sản đƣợc sản
xuất từ một, vài hay nhiều nhóm vi sinh vật, chủ yếu bao gồm các nhóm vi sinh
vật nhƣ sau:
-

Nhóm vi khuẩn dị dƣỡng hoại sinh: chủ yếu làm sạch môi trƣờng nhờ

khả năng sinh enzym phân hủy hữu cơ: protease phân hủy protein, amylase phân
hủy tinh bột, cellulase phân hủy cellulose. Ngoài chức năng phân hủy các hợp

chất hữu cơ làm sạch mơi trƣờng thì chúng cịn có tác dụng kiểm soát sự phát
triển quá mức vi sinh vật gây bệnh do cơ chế cạnh tranh nguồn dinh dƣỡng giữ
cho môi trƣờng luôn ở trạng thái cân bằng sinh học. Nhóm vi khuẩn dị dƣỡng
hoại sinh bao gồm một số lồi thuộc chi Bacillus đƣợc trình bày ở bảng 1.1


10

-

Nhóm vi khuẩn đóng vai trị tích cực trong việc kiểm sốt vi sinh vật gây

bệnh trong mơi trƣờng nhờ sinh chất đối kháng là nhóm vi khuẩn Lactic. Nhóm
này bao gồm một số loài thuộc chi Lactobacillus và một số trƣờng hợp cịn sử
dụng cả Steptococus. Ngồi vai trị kiểm sốt vi sinh vật gây bệnh trong mơi
trƣờng thì chúng cũng có tác dụng làm giảm mùi hơi của ngƣ trƣờng.
Quan trọng hơn cả, sử dụng nhóm vi khuẩn này có tác dụng hạn chế việc
sử dụng kháng sinh, đảm bảo tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm cho sản
phẩm thủy sản.
Trong một số trƣờng hợp, ngƣời ta sử dụng nhóm vi khuẩn này để sản
xuất chế phẩm phòng trị một số bệnh do vi khuẩn gây ra. Nhóm vi khuẩn này
khi đƣợc sử dụng để bổ sung vào thức ăn tơm cá, ngồi mục đích làm cân bằng
hệ vi sinh vật đƣờng ruột, ngăn cản sự xâm nhập của vi sinh vật có hại, tăng khả
năng phịng ngừa một số bệnh đƣờng ruột thì chúng cịn có tác dụng tăng khả
năng tiêu hóa và hấp thụ thức ăn, giảm hệ số tiêu thụ thức ăn giúp cho vật ni
phát triển khỏe mạnh, tăng trƣởng nhanh [24].
Nhóm vi khuẩn khác cũng có vai trị quan trọng trong xử lý mơi trƣờng
ni trồng thủy sản là nhóm vi khuẩn quang hợp không thải oxy, đây là những
vi sinh vật có khả năng sử dụng năng lƣợng trực tiếp từ bức xạ mặt trời làm
nguồn năng lƣợng để sinh trƣởng và phát triển.

Nhóm vi khuẩn quang hợp khơng thải oxy (bao gồm các vi khuẩn quang
hợp tía và xanh) là nhóm vi sinh vật sống kị khí, chúng đồng hóa H 2S, CO2 để
xây dựng tế bào, đồng thời chúng làm mất mùi và màu do H2S hoặc sunfua kim
loại gây ra, làm giảm độc tính mơi trƣờng. Năm 1984, Imhoff chia nhóm vi
khuẩn quang dƣỡng tía lƣu huỳnh thành hai họ là Choromatiaceae,
Ecthiorhodospiriaceae và họ vi khuẩn tía khơng lƣu huỳnh thành họ
Rhodospirillaceae [16]
Ngồi ra, nhóm vi khuẩn cũng thƣờng xun có mặt trong các chế phẩm
xử lý mơi trƣờng ni trồng thủy sản là nhóm vi khuẩn tự dƣỡng thuộc chi
Nitrosomonas, Nitrobacter có tác dụng chuyển hóa Nito hữu cơ thành Nito phân


11

tử, giảm độc cho mơi trƣờng. Một số lồi vi khuẩn đƣợc sử dụng để sản xuất
chế phẩm sinh học và chức năng của chúng đƣợc trình bày trong bảng 1.1.
Bảng 1.1. Các loài vi khuẩn sử dụng để xử lý mơi trƣờng
Các lồi vi khuẩn
Nitrosomonas sp
Nitrobacter sp
Bacillus lichenifomis
Bacillus subtilis
Bacillus megaterium
Bacillus lacterospporus
Bacillus thuringiensis
Lactobacillus acidophilus
Lactobacillus lactic
Lactobacillus helveticus
Streptococus sp
1.2.4. Vi khuẩn Bacillus



Hình thái, sinh lý

Bacillus là vi khuẩn Gram dƣơng hình que, thuộc ngành Firmicutes, hiếu
khí bắt buộc hoặc kị khí khơng bắt buộc, catalase dƣơng tính. Bacillus có hình
dạng giống những chiếc que, phần lớn có bào tử trong hình oval có khuynh
hƣớng phình ra ở đầu. Tập đồn giống vi sinh vật này rất lớn, có hình dạng bất
định. Ngồi ra Bacillus có thể sản xuất cấu trúc đa bào và màng sinh học nên có
thể bám dính vào màng nhày, kết dính tốt trong đƣờng ruột, có khả năng sống
sót qua 36 ngày trong đƣờng ruột vật chủ.



Phân loại:

Giới (regnum):

Bateria

Ngành (divisio):

Firmicutes

Lớp (class):

Bacillus

12

Bộ (ordo):

Bacillales

Họ (familia):

Bacillaceae

Chi (genus):

Bacillus



Một số loài Bacillus sử dụng làm probiotic

* Bacillus subtilis:
Bacillus subtilis đƣợc phát hiện và đặt tên vào năm 1872, nó phân bố phổ
biến trong đất, đặc biệt trong cỏ khơ nên cịn có tên gọi khác là trực khuẩn cỏ
khơ. Là những vi khuẩn hình que, ngn, nh, kớch thc (3- 5) ì 0.6àm, nhiu
khi t bào nối với nhau thành chuỗi dài ngắn khác nhau hoặc tế bào đứng riêng
rẽ. Khuẩn lạc khô, không màu hoặc màu xám nhạt, hơi nhăn hoặc tạo ra lớp
màng mịn lan trên bề mặt thạch, có mép nhăn bám chặt vào mơi trƣơng thạch.
0

Nhiệt độ thích hợp cho B. subtilis sinh trƣởng là 30- 50 C, thƣờng nuôi cấy
0

ở 37 C. Bào tử hình bầu dục, kích thƣớc 0.6-0.9µm, phân bố lệch tâm, gần tâm
nhƣng khơng chính tâm. Bào tử có thể sống vài năm đến vài chục năm. Đã có
những chứng cứ về việc duy trì sức sống của bào tử B.subtilis trong 200-300 năm.

Vi khuẩn B.subtilis có màng nhày (giác mạc) giúp vi khuẩn có khả năng
chịu đựng đƣợc điều kiện thời tiết khắc nhiệt, vì màng nhày có thể dự trữ thức
ăn và bảo vệ vi khuẩn tránh tổn thƣơng khi khơ hạn. Màng nhày có thể quan sát
đƣợc khi nhuộm tiêu bản, qua kính hiển vi thấy màng nhày khơng mà, trong
suốt cịn tế bào vi khuẩn bắt màu nâu đỏ trên nền tiêu bản xanh hoặc đen.

Hình 1.1. Tế bào Bacillus subtilis