Luận văn thạc sĩ nghiên cứu ứng dụng enzyme trong sản xuất chế phẩm chondroitin sulfate từ sụn chân gà

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KINH TẾ - KỸ THUẬT CÔNG NGHIỆP

NGUYỄN THỊ HỒI

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYME
TRONG SẢN XUẤT CHẾ PHẨM
CHONDROITIN SULFATE TỪ SỤN CHÂN GÀ

LUẬN VĂN THẠC SĨ
CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Hà Nội, 2021


BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KINH TẾ - KỸ THUẬT CÔNG NGHIỆP

NGUYỄN THỊ HỒI

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYME
TRONG SẢN XUẤT CHẾ PHẨM
CHONDROITIN SULFATE TỪ SỤN CHÂN GÀ
LUẬN VĂN THẠC SĨ
Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm
Mã số

: 8540101

Người hướng dẫn khoa học 1: TS. Trương Hương Lan
Người hướng dẫn khoa học 2: PGS.TS. Hồ Tuấn Anh

Hà Nội, 2021


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn đều mang
tính khách quan, trung thực và chính xác.
Do vốn kiến thức cịn hạn chế nên luận văn này không tránh khỏi các thiếu
sót, tơi thực sự rất mong nhận được sự thơng cảm và chỉ bảo tận tình của các Thầy,
Cơ và các bạn bè, đồng nghiệp sau khi đọc luận văn này.
Hà Nội, tháng 5 năm 2021
HỌC VIÊN

NGUYỄN THỊ HỒI

i


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành xong luận văn này và có được kết quả như trên tơi đã nhận
được sự giúp đỡ tận tình của các thầy cơ, các anh chị, bạn bè, các đồng nghiệp và
những người thân yêu trong gia đình tơi.
Trước hết, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS. Trương
Hương Lan, PGS.TS. Hồ Tuấn Anh các thầy cô đã trực tiếp hướng dẫn, động viên,
quan tâm và tạo mọi điều kiện giúp đỡ, chỉ bảo tơi trong suốt q trình thực hiện
và hồn thành ḷn văn nghiên cứu này.
Tơi xin chân thành cảm ơn tập thể các thầy cô giáo và cán bộ nhân viên Khoa
Công nghệ thực phẩm – Đại học kinh tế - Kỹ thuật Công nghiệp đã tạo mọi điều
kiện tḥn lợi cho tơi trong q trình học tập và nghiên cứu.
Tôi xin cảm ơn các anh chị giảng dạy, làm việc tại Bộ môn dinh dưỡng và thực

phẩm - Viện Công nghiệp thực phẩm đã giúp đỡ tơi trong suốt q trình thực hiện
ḷn văn. đã tại tạo điều kiện cho tôi thực hiện luận văn nghiên cứu này.
Xin cảm ơn tập thể lớp cao học cơng nghệ thực phẩm khóa 2019-2021, các
bạn đồng nghiệp, gia đình và người thân đã đợng viên, khích lệ và giúp đỡ tơi hồn
thành tốt khóa học này.
Hà Nội, tháng 5 năm 2021
HỌC VIÊN

NGUYỄN THỊ HỒI

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN.................................................................................................................i
LỜI CẢM ƠN ......................................................................................................................ii
DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU ................................................................................. vii
DANH MỤC CÁC HÌNH, ĐỒ THỊ ............................................................................. viii
MỞ ĐẦU ..............................................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..........................................................................2
1.1. Giới thiệu về Chondroitin Sulfate (CS) ........................................................................... 2
1.1.1. Khái niệm: ..................................................................................................................2
1.1.2. Phân loại Chondroitin Sulfate (CS) .........................................................................2
1.1.3. Cấu trúc của Chondroitin Sulfate (CS) ...................................................................4
1.1.4. Tầm quan trọng của Chondroitin Sunfate đối với con người ...............................6
1.2. Các phương pháp hỗ trợ quá trình trích ly từ sụn chân gà ............................................. 7
1.2.1. Phương pháp hóa học và phương pháp vật lý ........................................................7
1.2.2. Phương pháp sử dụng enzyme .................................................................................7
1.3. Giới thiệu chung về hệ enzyme protease ......................................................................... 9
1.3.1. Khái quát về protease ................................................................................................9

1.3.2. Phân loại protease......................................................................................................9
1.3.3. Cơ chế xúc tác của enzyme protease .....................................................................11
1.3.4. Các ứng dụng phổ biến của hệ enzyme protease .................................................11
1.4. Ứng dụng của hệ enzyme protease trong sản xuất Chondroitin Sulfate..................... 12
1.5. Các phương pháp tinh chế Chondroitin Sulfate............................................................ 16
1.6. Cô đặc dịch chiết CS bằng các thiết bị cô chân không................................................. 17
1.6.1. Khái niệm về cô đặc ................................................................................................18
1.6.2. Các phương pháp cô đặc.........................................................................................18
1.7. Phương pháp sấy chân không ......................................................................................... 19
1.7.1. Cấu tạo và nguyên lý hoạt động.............................................................................19
1.7.2. Các thiết bị sấy chân khơng....................................................................................21
1.8. Tình hình nghiên cứu và sử dụng Chondroitin Sulfate trên thế giới và Việt Nam.... 24

iii


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...26
2.1. Đối tượng nghiên cứu ...................................................................................................... 26
2.1.1. Nguyên liệu ..............................................................................................................26
2.1.2. Hóa chất và dụng cụ máy móc, thiết bị .................................................................26
2.2. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................................... 27
2.3. Phương pháp nghiên cứu và bố trí thí nghiệm .............................................................. 28
2.3.1. Nghiên cứu ứng dụng enzym trong thủy phân sụn chân .....................................28
2.3.2. Nghiên cứu xác định phương pháp lọc dịch Chondroitin Sulfate sụn chân gà ......31
2.3.3. Nghiên cứu xác định phương pháp sấy thu hồi chế phẩm Chondroitin Sulfate32
2.5. Phương pháp phân tích .................................................................................................... 33
2.5.1. Xác định hàm lượng Chondroitin Sulfate ............................................................33
2.5.2. Phương pháp phân tích hóa lý khác.......................................................................34
2.5.3. Phương pháp phương pháp vi sinh vật ..................................................................34
2.5.4. Phương pháp phân tích kim loại nặng ...................................................................34

2.6. Phương pháp tính tốn và xử lý số liệu.......................................................................... 34
2.6.1 Phương pháp toán học .............................................................................................34
2.6.2. Phương pháp xử lý số liệu ......................................................................................35
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................36
3.1. Nghiên cứu lựa chọn các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân sụn chân gà
bằng enzyme để tạo dịch chiết giàu Chondroitin Sulfate .................................................. 36
3.1.1. Xác định loại chế phẩm enzyme protease thương mại thích hợp cho quá trình
trích ly Chondroitin Sulfate từ sụn chân gà ....................................................................36
3.2. Nghiên cứu lựa chọn phương pháp lọc thích hợp ..................................................... 42
3.3. Xác định các điều kiện thích hợp của q trình cô đặc chân không dịch chiết giầu
Chondroitin Sulfate ................................................................................................................ 43
3.4. Xác định phương pháp và điều kiện sấy thích hợp để thu hồi chế phẩm Chondroitin
Sulfate ....................................................................................................................................... 44
3.4.1. Xác định phương pháp sấy thích hợp để thu hồi chế phẩm Chondroitin Sulfate 44

iv


3.4.2. Nghiên cứu xác định nhiệt độ sấy chân không thích hợp để thu nhận chế phẩm
Chondroitin Sulfate............................................................................................................45
3.4.3. Nghiên cứu xác định áp suất sấy chân khơng thích hợp để thu hồi chế phẩm
Chondroitin Sulfate............................................................................................................46
3.4.4. Nghiên cứu xác định thời gian sấy chân khơng thích hợp để thu hồi chế phẩm
Chondroitin Sulfate............................................................................................................47
3.5. Xác định chất lượng chế phẩm Chondroitin Sulfate .................................................... 49
3.5.1. Xác định các chỉ tiêu hóa lý của các chế phẩm Chondroitin Sulfate .................49
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ......................................................................51

v

DANH MỤC TỪ CHỮ VIẾT TẮT

STT

Ký hiệu

Giải nghĩa

1

CS

Chondroitin Sulfate

2

GAG

Glycosaminoglycan

3

GalNAc

N-acetyl-D-galactosamine

4

GlcA

D-glucuronic acid

5

PG

Proteoglucan

6

Core protein

Protein lõi

7

TCVN

Tiêu chuẩn Việt Nam

8

TCA

axit trichloroacetic

9

CK

Chân không

10

CPC

Cetylpyridium chloride

11

CTAB

Cetyltrimethyl-amnonium bromide

12

KPH

Không phát hiện

13

EDTA

axit aminopolycarboxylic

vi

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
Bảng 1. 1. Tỷ lệ CS ∆Di – 4S/∆Di-6S từ khí quản vịt với alkal, enzyme và nhiệt độ............ 15

Bảng 2. 1.Các thông số công nghệ của quá trình thủy phân sụn chân gà bằng các
loại chế phẩm enzyme protease khác nhau .......................................................... 29
Bảng 2. 2. Bảng nghiên cứu ảnh hưởng của áp suất và nhiệt độ của phương pháp
cô đặc chân không tới hiệu suất thu hồi dịch CS sau cô đặc ............................... 31
Bảng 2. 3. Thiết bị sấy và các điều kiện sấy tương ứng ...................................... 32
Bảng 2. 4. Xác định định lượng Chondroitin Sulfate bằng methylen blue .......... 34
Bảng 3. 1. Ảnh hưởng của các loại chế phẩm enzyme protease tới hiệu suất ..... 36
Bảng 3. 2. Ảnh hưởng của các phương pháp lọc đến hiệu suất thu hồi CS ......... 42
Bảng 3. 3. Ảnh hưởng của các phương pháp lọc đến hàm lượng CS trong bột chiết
sụn chân gà thu được sau khi lọc, cô đặc và sấy khô. .......................................... 43
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của áp suất và nhiệt độ cô đặc chân không tới hiệu suất thu
hồi CS trong dịch cô đặc ...................................................................................... 44
Bảng 3. 5. Ảnh hưởng của các loại thiết bị sấy đến hiệu suất thu hồi CS ........... 45
Bảng 3. 6. Ảnh hưởng nhiệt độ sấy chân không tới hiệu suất thu hồi CS. ............... 46
Bảng 3. 7. Ảnh hưởng áp suất sấy chân không tới tới độ ẩm và hiệu suất thu hồi
CS sụn chân gà ..................................................................................................... 47
Bảng 3. 8. Ảnh hưởng của thời gian sấy chân không tới độ ẩm và hiệu suất thu hồi
Chondroitin Sulfate sụn chân gà. ......................................................................... 48
Bảng 3. 10. Các chỉ tiêu hóa lý của chế phẩm CS từ sụn chân gà qua 3 mẻ sản xuất
khác nhau.............................................................................................................. 49
Bảng 3.11. Xác định vi sinh vật và hàm lượng kim loại nặng của chế phẩm
Chondroitin Sulfate .............................................................................................. 49

vii


DANH MỤC CÁC HÌNH, ĐỒ THỊ

Hình 1.1. Cấu tạo phân tử của các loại CS............................................................. 3
Hình 1.2. Các dạng đồng phân và cơng thức cấu tạo của CS ................................ 3
Hình 1. 3 Liên kết giữa chuỗi GAG và protein lõi ................................................ 6
Hình 1. 4. Sơ đồ phân loại protease ..................................................................... 10
Hình 1. 5. Cơ chế xúc tác của protease ................................................................ 11
Hình 1. 6. Hiệu suất trích ly CS từ sụn khí quản vịt bằng enzyme Papain. ......... 13
Hình 1. 7. Hiệu suất trích ly CS từ sụn khí quản vịt bằng enzyme Papain. ......... 14
Hình 1. 8. Mơ hình máy sấy chân khơng và ngun lý hoạt đợng....................... 20
Hình 1. 9. Tủ sấy chân khơng .............................................................................. 21
Hình 1. 10. Sơ đồ cấu tạo thùng sấy chân khơng có cánh đẩy ............................. 22
Hình 1. 11. Sơ đồ thiết bị sấy chân khơng liên tục .............................................. 23
Hình 1. 13. Sơ đồ hệ thống sấy phun chân khơng................................................ 24
Hình 2. 1. Ngun liệu chân gà cho sản xuất CS ................................................. 26
Hình 2. 2 Bóc tách phần sụn chân gà ................................................................... 28
Hình 3. 1. Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu: nước tới hiệu suất trích ly CS từ sụn chân
gà. ........................................................................................................................................38
Hình 3. 2. Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme/nguyên liệu tới hiệu suất trích ly CS ... 39
Hình 3. 3. Ảnh hưởng của nhiệt đợ thủy phân tới hiệu suất trích ly CS từ sụn chân gà.
.............................................................................................................................. 40
Hình 3. 4. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân tới hiệu suất trích ly................... 41

viii


MỞ ĐẦU
Theo thống kê của ngành xương khớp Việt Nam hiện nay tỉ lệ người mắc
các chứng bệnh về xương khớp chiếm 35% dân số, trong đó lứa tuổi từ 50 đến 70
chiếm 70%. Trong độ tuổi từ 25 đến 45 tuổi cứ 100 người thì có 27 người bị đau
lưng, 20 người bị đau vai, 8 người bị đau khớp và 3 người bị viêm khớp. Việt Nam
đang trở thành mợt trong những nước có tốc đợ già hóa dân số nhanh nhất thế giới

với 10,1 triệu người cao tuổi, chiếm 11%. Theo các chuyên gia, tuổi thọ con người
càng được nâng cao thì tỷ lệ mắc các bệnh cơ-xương-khớp cũng dần phổ biến hơn.
Chondroitin Sulfate (CS) là một hợp chất thiên nhiên tḥc nhóm
glycosaminoglycan (GAG) hay mucopolysacchride có khối lượng phân tử từ
10.000 - 100.000 Dalton, được tổng hợp ở cơ thể động vật bậc cao và tồn tại
trong mô liên kết. CS khi được uống vào cơ thể có chức năng tái tạo các mơ sụn
và xương, phụ trợ cho quá trình tổng hợp của cơ thể giúp phòng ngừa và hỗ trợ
điều trị các bệnh về xương khớp ở người lớn tuổi hoặc người vận động cơ bắp ở
mức đợ cao. Nó cũng là thành phần cần thiết để nuôi dưỡng tế bào giác mạc.
Trên thế giới CS thường được sản xuất từ các loại sụn của động vật, như sụn cá
mập, cá đuối, sụn mũi lợn, trâu, bò hoặc sụn ức gà…..Ở Việt Nam, nguồn nguyên
liệu CS cho sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe đang phải nhập ngoại hoàn toàn.
Theo thống kê năm 2017, đàn gia cầm cả nước đạt 385,46 triệu con và ước
tính đến năm 2020, số lượng gia cầm tăng lên khoảng 397,9 triệu con. Nguồn phụ
phẩm sau quá trình giết mổ, sản xuất thịt như xương, sụn, đặc biệt chân gà là rất
lớn, sẽ là một nguồn nguyên liệu phong phú cho ngành công nghiệp sản xuất CS.
Để đáp ứng nhu cầu sử dụng CS cho phòng chống bệnh cơ xương khớp, đồng thời
tận dụng được được nguồn phế phẩm sụn chân gà, tiến hành nghiên cứu đề tài
“Nghiên cứu ứng dụng enzyme trong sản xuất chế phẩm Chondroitin Sulfate
từ sụn chân gà” với các mục tiêu:

1


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu về Chondroitin Sulfate (CS)
1.1.1. Khái niệm:
Chondroitin Sulfate (CS) là một glycosaminoglycan gồm các đơn vị
disaccharide lặp lại của galactosamine và axit glucuronic thông qua các liên kết β

(1→4) hoặc β (1→3) (cụ thể là N-acetyl-D-galactosamine (GalNAc) và Dglucuronic acid (GlcA). GAG được tìm thấy có hàm lượng cao trong các mơ sụn,
nợi mạng lưới collagen bám trong các cơ chất vô định hình có chứa axit
glycoprotein hyaluronic (HA).
CS là mợt polyme có phân tử lớn gồm 15-150 đến 200 đơn vị cấu trúc 2
đường đơn của GlcA và GalNAc. Cơng thức hố học của CS: (C14H21NO14S)n.
Khối lượng phân tử của CS thường biến động trong khoảng 10.000 - 100.000
Dalton. CS tinh khiết là chất bợt màu trắng hoặc trắng ngà, hịa tan tốt trong nước,
dễ hút ẩm, khơng hồ tan trong ethanol, methanol, cetone. Khối lượng phân tử của
CS nguyên liệu thường được sử dụng trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe là thấp
hơn, khoảng 15.000 – 20.000 Dalton.
1.1.2. Phân loại Chondroitin Sulfate (CS)
Chondroitin có 3 loại chính là A, B và C (Hình 1.1) và 2 loại phụ là D và
E, chúng đặc trưng bởi số lượng và vị trí của nhóm Sulfate trong nhóm
disaccharide lặp lại của chuỗi polysaccharide.
- CS A: gốc Sulfate gắn ở vị trí C-4 (GlcA-GalNAc-4S: chondroitin-4Sulfate, viết tắt là CS4 hoặc CS-A), có nhiều ở mơ sụn.
- CS B: acid iduronic thay thế acid glucuronic (IdoA-GalNAc-4S), viết tắt
là CS4 hoặc CS-B. Tên cũ của nó là dermatan Sulfate thường có nhiều ở da, cịn
thấy có ở van tim, gân, thành mạch. Vị trí bị Sulfate hố ở C-4 của GlcNAc và C5 của glucuronic acid bị epime hoá thành iduronic acid.

2


Hình 1.1. Cấu tạo phân tử của các loại CS
- CS C: gốc Sulfate gắn ở vị trí C-6 (GlcA-GalNAc-6S: chondroitin-6Sulfate, viết tắt là CS6 hoặc CS-C, phổ biến hơn hai loại trên).
- CS D: gốc Sulfate gắn ở vị trí carbon 2 của axit glucuronic and 6 của
GalNAc. Chondroitin-2,6-Sulfate (C2, S6).
- CS E: gốc Sulfate gắn ở vị trí Carbons 4 và 6 của GalNAc. Chondroitin4,6-Sulfate (C4, S6).
Loại A và B (CS4) thường được tìm thấy ở sụn đợng vật có vú (bị và lợn),
ngược lại loại C (CS6) được tìm thấy chủ yếu ở các lồi cá sụn (cá mập, cá đuối…).
Tuy nhiên, CS từ các nguồn nguyên liệu khác nhau rất đa dạng về cấu trúc và kích

thước, chúng chứa ở mức đợ nhiều hay ít các isome CS, có tới 16n-isome của CS,
do phụ tḥc vào sự thay đổi vị trí Sulfate hố của các cặp đường đơi tạo nên 16
isome/mỗi cặp. Trong đó, CS-A và CS-C là những thành phần chủ yếu hình thành
các Proteoglucan (PG).

Hình 1.2. Các dạng đồng phân và cơng thức cấu tạo của CS
CS với các disacarit khác nhau và khung carbohydrate tổng thể có thể được
sinh tổng hợp và có số lượng và vị trí khác nhau của các nhóm Sulfate (Hình 1.2).

3


Do đó, CS là mợt GAG khơng đồng nhất được hình thành từ các disacarit sunfate
xen kẽ và khác nhau của GlcA và GalNAc được liên kết bởi các liên kết β (13).
Hơn nữa, các disacarit khác nhau được liên kết với nhau bằng liên kết (14). CSA
và CSC được cấu thành bởi các disacarit sunfate ở vị trí C4 hoặc C6 của dư lượng
GalNAc, tương ứng, và có thể có tỷ lệ phần trăm nhỏ của disacarit monoSulfated
trên C2 của GlcA. Bên cạnh sự hiện diện chính của hai loại disacarit monoSulfated
này ở vị trí C4 hoặc C6 của GalNAc, các disacarit với số lượng và vị trí khác nhau
của các nhóm Sulfate có thể có mặt, với tỷ lệ phần trăm khác nhau, trong các chuỗi
carbohydrate. Các loại khác nhau của disacarit đã được disulfit hóa có thể có mặt
trong cấu trúc CS với số lượng khác nhau cũng liên quan đến các nguồn động vật
cụ thể (như ở sụn cá hoặc xương), chẳng hạn như disacarit diSulfated ở vị trí C2
của GlcA và C6 của GalNAc (được gọi là disacarit D), ở vị trí C4 và C6 của
GalNAc (disacarit E) hoặc C2 của GlcA và C4 của GalNAc (disacarit B) (Hình
1.2). Cuối cùng, mợt tỷ lệ phần trăm nhỏ của disacarit khơng sunfate hầu như ln
có trong khung CS trong khi disacarit tri-sunfate là ở dạng vết.
1.1.3. Cấu trúc của Chondroitin Sulfate (CS)
Trong tự nhiên, cấu trúc phân tử CS rất đa dạng và phức tạp, đa phần nhóm
-OH ở vị trí carbon 4 và 6 của GalNAc được Sulfate hố, đối với mợt số chuỗi

GAG khác thì ở vị trí 2 của GlcA. Q trình Sulfate hoá là nhờ các enzym
sulfotransferase đặc hiệu. Việc Sulfate hoá ở các vị trí khác nhau tạo nên hoạt tính
sinh học đặc thù của CS. Do vậy, cho tới nay chưa thu nhận được CS bằng con
đường tổng hợp hoá học, mà mới chỉ tổng hợp được các mạch oligosaccharide
ngắn có trình tự giống mợt đoạn mạch CS như mợt số CS tetrasaccharide (4 gốc
đường đơn) có khả năng kích thích sự phát triển và phân hố của neron thần kinh,
cịn phân tử disaccharide thì khơng có tác dụng trên. Vì thế, cho tới nay các CS
chỉ được tách chiết từ các nguồn nguyên liệu tự nhiên. Những năm trước đây, CS
được tinh chế chủ yếu từ sụn vây cá mập, sụn cá đuối, do đó giá thành rất cao và
có thể gây hại cho hệ sinh thái biển. Cho nên, đã có nhiều nghiên cứu trên thế giới

4


nhằm tách chiết CS từ da cá, sụn của bò, lợn, đặc biệt là sụn lưỡi hái, chân gà và
khí quản vịt…
Trước đây, các loài cá sụn (Chondrichthyes) như cá mập, cá đuối là những
lồi đợng vật có xương sống nhưng bợ xương chứa hồn tồn sụn cả khi ở tuổi
trưởng thành là nguồn nguyên liệu sụn đắt tiền, nhưng có chứa hàm lượng CS cao,
thường được sử dụng để sản xuất CS trên thế giới. Hàm lượng CS thu được từ sụn
vây cá mập hoặc khí quản cá sấu là 18% (chất khô), nhỏ hơn 23% trong sụn xương
ức cá sấu, và đặc biệt là 30% trong sụn xương móng cá sấu và sụn ức gà. Điều này
cho thấy sụn ức gà là một loại phụ phẩm thải ra trong q trình chế biến gà fillet
có thể trở thành mợt ngun liệu rẻ tiền cho q trình sản xuất CS nhằm thay thế
cho các loại nguyên liệu truyền thống quý hiếm và đắt tiền từ sụn vây cá mập hoặc
sụn cá sấu….[4] Ngồi ra, trong khí quản vịt cũng có 3,6% CS và trong sụn chân
gà có khoảng 2,5% CS cũng là các nguồn nguyên liệu sẵn có để sản xuất CS.
CS gắn với các protein bằng liên kết O-glycosid tạo thành một proteoglycan
(PG) (hay glucoprotein), là hợp chất hữu cơ tḥc nhóm mucopolysaccharide.
Phân tử PG của mơ sụn (chứa khoảng 80 - 100 mạch CS) gắn kết cùng với protein

và acid hyaluronic tạo thành một phức hệ thuỷ đợng học vững chắc. Sự kết hợp
giữa nhóm Sulfate (SO42-) của gốc đường với các nhóm carboxyl (-COO-) của gốc
đường axit làm cho phân tử CS có mật đợ điện tích âm rất cao (anion
polysaccharide) dễ dàng liên kết đồng hoá trị với các protein trong cấu trúc PG.
Chuỗi CS được gắn với nhóm -OH của gốc serine ở mợt số protein. Tuy
nhiên, các protein gắn chọn lọc chính xác như thế nào với GAG vẫn chưa được
làm sáng tỏ. GAG được tổng hợp trong mạng lưới nội bào và trong thể Golgi.
Theo hình 2 sự gắn kết của chuỗi GAG và protein lõi được bắt đầu với các gốc
đường đơn theo phương thức cố định là Xyl-Gal-Gal-GlcA; xylose được gắn với
phân tử serine của protein lõi trong mạng lưới nợi bào, cịn các phân tử đường
khác được gắn trong hệ Golgi.

5


Hình 1. 3 Liên kết giữa chuỗi GAG và protein lõi
1.1.4. Tầm quan trọng của Chondroitin Sunfate đối với con người
Ở cơ thể người, Chondroitin Sunfate là thành phần được tìm thấy ở sụn
khớp, xương, da, giác mạc mắt và thành các đợng mạch.
Các phân tử GAG (trong đó có CS) có chức năng tạo cấu trúc và điều khiển
trong cơ thể sống. Về cấu trúc, nó là thành phần chính của mơ sụn. CS có mặt
trong các tổ chức gân, cơ, dây chằng… tạo sự vận động linh hoạt và tính đàn hồi
trong hoạt đợng khớp, tạo đợ bền khi bị nén ép. Về điều khiển, CS rất dễ gắn kết
với protein trong mô tế bào, mối quan hệ này rất quan trọng cho việc điều hồ các
hoạt đợng của tế bào. Các liên kết cợng hóa trị CS và protein lõi tạo ra phân tử PG
của mô sụn (chứa khoảng 80-100 mạch CS) cùng với protein gắn kết với acid
hyaluronic tạo thành một phức hệ thuỷ động học có khả năng nén thuận nghịch rất
cần thiết cho sụn để chống lại sức ép nén với biến dạng nhỏ nhất.
CS cịn có tác dụng hỗ trợ điều trị các bệnh lý về xương khớp. CS làm tăng
sản xuất chất nhầy và khả năng bôi trơn của dịch khớp, đảm bảo chức năng dinh

dưỡng và sự vận động linh hoạt của khớp. Vì vậy, CS giúp giảm và ngăn chặn q
trình thối hố khớp. CS cịn có vai trị bảo vệ sụn khớp nhờ ức chế các enzyme
phá hủy sụn khớp như collagenase, phospholipase A2, N–acetylglucosaminedase.
Ngồi ra, CS cũng góp phần nuôi dưỡng các tế bào của giác mạc mắt, tái tạo lớp
giác mạc.
CS đã được dùng qua đường uống để điều trị viêm khớp với liều lượng 800
đến 1.200 mg/ ngày. Kết quả tích cực đạt được sau nhiều tháng điều trị. Các nghiên
cứu trên động vật cũng cho thấy hiệu quả sinh học của CS được tăng lên khi dùng
nhiều lần trong ngày [5].

6


1.2. Các phương pháp hỗ trợ q trình trích ly từ sụn chân gà
Chondrontin Sulfate có thể thu nhận được nhờ thủy phân sụn bằng phương
pháp thủy phân hóa học hoặc enzyme.
1.2.1. Phương pháp hóa học và phương pháp vật lý
1.2.1.1. Phương pháp hóa học
Nói chung, các phương pháp sản xuất CS từ sụn đã được xác định và bao
gồm 4 bước khác nhau như sau:
1. Thủy phân sụn bằng tác nhân hóa học như kiềm hoặc axit.
2. Bẻ gẫy lõi proteoglycan bằng kiềm hoặc axit.
3. Loại bỏ protein bằng kết tủa với axit tricloaxetic và ly tâm lọc.
4. Thu hồi và tinh sạch CS.
Trong phương pháp hố học, mơ sụn được xử lý bằng nước nóng, dung dịch
muối, kiềm (NaOH) hoặc acid (HCl, H2SO4) để tách GAG khỏi các phân tử khác
(protein, hyaluronic acid…). Phương pháp này đã được áp dụng để thu CS từ sụn gà,
sụn bò,tuy nhiên đã xuất hiện việc phá vỡ các liên kết glycoside của CS sau khi thu
nhận CS. Các điều kiện thủy phân cũng có thể làm giảm trọng lượng phân tử trung
bình của sản phẩm thu được. Mặt khác trong phương pháp này, sản phẩm có những

mối nguy từ việc tồn dư các chất hóa học trong q trình xử lý và tạo ra sự ô nhiễm
môi trường.
1.2.1.2. Phương pháp vật lý
Sử dụng sóng siêu âm để tạo hệ bong bóng và sủi bọt khí, phá vỡ cấu trúc của
nguyên liệu, trích ly các hợp chất hịa tan. Bên cạnh đó, nhiệt đợ siêu âm có thể làm
duỗi mạch và biến tính protein, dẫn đến giải phóng CS ra khỏi liên kết protein.
1.2.2. Phương pháp sử dụng enzyme
Công nghệ enzym đang hứa hẹn mang lại nhiều lợi ích cho nhiều ngành
như nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm, y tế, dược… Trên thế giới, việc nghiên
cứu và ứng dụng enzym trong sản xuất đã được triển khai từ lâu. Ở Việt Nam, việc
nghiên cứu và ứng dụng enzyme, hiện nay được rất nhiều các doanh nghiệp, tổ
chức áp dụng trong quá trình sản xuất chế biến. Đặc biệt hiện nay với những ưu

7


điểm của enzyme so với các chất xúc tác hóa học là khả năng hoạt động mạnh ở
áp suất thường, nhiệt độ 20 đến 700C và vùng pH từ 1-12. Phần lớn enzyme có
tính đặc hiệu rất mạnh hay tính xúc tác chọn lọc cao, cho phép nó chỉ xúc tác với
một số chất xác định trong một hỗn hợp có nhiều tạp chất.
Trong thực tế có rất nhiều các ngun liệu nơng sản có giá trị thương phẩm
thấp. Sau khi được chuyển hóa bởi tác dụng của enzyme thì giá trị thương phẩm
cao hơn rất nhiều. Hiện nay trong q trình sản xuất, sơ chế thực phẩm có rất nhiều
các phụ phẩm thực phẩm khác nhau. Ở một số nhà máy lớn có quy mơ cơng nghệ
sản xuất lớn sẽ tận thu để phục vụ trở lại cho ngành nơng nghiệp như sản xuất thức
ăn chăn ni, phân bón… tuy nhiên doanh thu từ phụ phẩm rất thấp. Hầu hết các
xưởng sản xuất nhỏ tự xử lý, thậm chí gây ơ nhiễm mơi trường…Vì vậy việc xử lý
phụ phẩm cho ra từ q trình hoạt đợng sản xuất nơng nghiệp, công nghệ thực phẩm
hiện nay đang là xu hướng lựa chọn của nhiều nước trên thế giới. Hiện nay ở Việt
Nam các nhà sản xuất, doanh nghiệp đã lựa chọn áp dụng sử dụng Enzyme để xử

lý phụ phẩm nhằm giải quyết lượng chất thải thải ra môi trường, tận dụng nguồn
phụ phẩm cho các quá trình sản xuất các sản phẩm hữu ích khác phục vụ đời sống
con người, giảm nguy cơ ô nhiễm môi trường, tăng thêm thu nhập, nâng cao giá trị
thương phẩm, hướng tới quá trình sản xuất bền vững.
Đối với việc sử dụng enzyme do thu nhận CS từ sụn chân gà, các quá trình
này có thể được tóm tắt như sau:
1. Phân giải sụn và protein trong sụn bằng enzyme protease.
2. Kết tủa CS chọn lọc với dung dịch cồn.
3. Hòa tan lại và trung hòa bằng dung dịch muối;
4. Phân tách CS dựa trên trọng lượng phân tử sử dụng các công nghệ siêu
lọc – lọc thẩm thấu (UF-DF: ultrafiltration-diafiltration).
Phương pháp sinh học dùng enzym để thuỷ phân mô sụn là phương pháp
có hiệu quả để thu nhận CS khơng bị biến đổi về cấu trúc, giữ được hoạt tính sinh
học và làm giảm thiểu ơ nhiễm mơi trường do các hố chất (muối, kiềm, acid) gây
nên. Để tách các phân tử CS ra khỏi protein lõi, các nhà khoa học đã nghiên cứu

8


sử dụng các enzyme protease để phân cắt protein lõi thành các axit amin và peptide
và giải phóng GAG.
1.3. Giới thiệu chung về hệ enzyme protease
1.3.1. Khái quát về protease
Protease là nhóm enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết peptide (-CO-NH-)
của các peptide hoặc protein. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thủy phân
liên kết ester và vận chuyển amino acid. So với protease động vật và thực vật,
protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt, là một hệ thống rất phức tạp bao
gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử
nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất nên chúng thường có tính đặc
hiệu rợng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng.

1.3.2. Phân loại protease
Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4) trong hệ thống
phân loại các nhóm enzyme. Protease được phân chia thành hai loại: endopeptidase
và exopeptidase. Các endoprotease cắt các liên kết peptide bên trong các chuỗi
polypeptide, trong khi các exopeptidase cắt từng amino acid ở cuối mạch.
- Dựa vào vị trí tác đợng trên mạch polipeptide, exopeptidase được phân
chia thành 2 loại:
+ Aminopeptidase: Xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của
chuỗi polypeptide để giải phóng ra mợt acid amin, mợt dipeptide hoặc tripeptide.
+ Carboxypeptide: Xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi
polypeptide và giải phóng ra một acid amin hoặc một dipeptide.
- Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành 4 nhóm:
+ Serin proteinase: Gồm các loại protease có các acid amin như acid
asparaginic, histidine và serine trong trung tâm hoạt đợng. Nhóm này bao gồm hai
nhóm nhỏ: Chymotrypsin và subtilisin. Các serine proteinase thường hoạt đợng
mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng.

9


Hình 1. 4. Sơ đồ phân loại protease
+ Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm -SH trong trung tâm hoạt
đợng. Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như Papayin, Bromelin,
một vài protein đợng vật và protein kí sinh trùng. Các cystein proteinase thường
hoạt đợng ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rợng.
+ Aspatic proteinase: Hầu hết tḥc nhóm pepsin, bao gồm các enzyme tiêu
hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin. Các aspartic proteinase có chứa nhóm
carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính.
+ Metallo proteinase: trung tâm hoạt đợng chứa ion kim loại và trực tiếp
tham gia quá trình xúc tác. Các metallo proteinase thường hoạt động ở vùng pH

trung tính và hoạt đợ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA.
- Ngồi ra, protease được phân loại mợt cách đơn giản hơn thành 3 nhóm:
+ Protease acid: pH 2,0÷4,0
+ Protease trung tính: pH 7.0÷8,0
+ Protease kiềm: pH 9,0÷11,0

10


1.3.3. Cơ chế xúc tác của enzyme protease

Hình 1. 5. Cơ chế xúc tác của protease
Cơ chế xúc tác của enzyme protease có thể chia làm 3 giai đoạn:
- Giai đoạn đầu: enzyme protease sẽ tương tác với cơ chất tạo thành phức
hợp ES. Ở giai đoạn này, nếu nồng đợ cơ chất thấp thì tốc đợ phản ứng (v) phụ
tḥc tuyến tính với nồng đợ cơ chất.
- Giai đoạn 2: Phức hợp ES sẽ được tách ra, tốc độ phản ứng cực đại và nó
hồn tồn khơng phụ tḥc vào nồng độ cơ chất.
- Giai đoạn 3: enzyme sẽ được giải phóng và hoạt đợng tự do. Hiện tượng
này được xem xét trên cơ sở phản ứng chỉ có một cơ chất duy nhất. Nếu nồng độ
cơ chất vượt q ngưỡng cực đại của tốc đợ phản ứng thì tốc đợ phản ứng khơng
có khả năng tăng lên. Ở giai đoạn này các enzyme đã bão hòa cơ chất do đó nó
khơng thể có tốc đợ phản ứng cao hơn được nữa.
1.3.4. Các ứng dụng phổ biến của hệ enzyme protease
Enzyme Protease được ứng dụng rất rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác
nhau, như là trong:
- Công nghiệp thực phẩm: đông tụ sữa làm phomat, làm mềm thịt, bổ sung
để làm tăng hiệu quả và chất lượng sản phẩm trong sản xuất bia, nước mắm...
- Y học: Protease thủy phân protein thành các acid amin. Dung dịch Papain cysteine
salicilate có cơng dụng chữa bỏng, giảm đợc tố, trị bệnh bạch cầu và viêm họng...

11


- Sản xuất chất tẩy rửa: protease bổ sung vào chất tẩy rửa trên thị trường
đều là serine protease, có tính đặc hiệu cơ chất rợng và hoạt đợng tốt trong điều
kiện pH và nhiệt độ...
- Công nghiệp thuộc da: protease sẽ tách các chất nhờn và làm cắt ngắn
phân tử collagen, loại bỏ khỏi da các chất nhớt, làm mềm da, rút ngắn thời gian
sản xuất.
1.4. Ứng dụng của hệ enzyme protease trong sản xuất Chondroitin Sulfate
Phương pháp sinh học sử dụng enzym để thuỷ phân mô sụn là phương pháp
có hiệu quả để thu nhận CS khơng bị biến đổi về cấu trúc, giữ được hoạt tính sinh
học của chúng và làm giảm thiểu ô nhiễm môi trường do các hoá chất (muối, kiềm,
acid) gây nên. Để tách các phân tử CS ra khỏi protein lõi, người ta có thể sử dụng
các enzyme protease (hầu hết là Papain và Alcalase) để phân cắt protein lõi thành
các axit amin và peptide để giải phóng GAG. Đã có nhiều nghiên cứu và ứng dụng
các loại enzyme protease như Papain, Alcalase hoặc Flavozymes cho trích ly CS
từ các phụ phẩm chế biến thị gia cầm như chân gà, chân vịt, sụn ức gà hay sụn khí
quản vịt…
Chẳng hạn như, Garnjanagoonchorn đã sử dụng Papain để thủy phân sụn
vây cá mập, sụn cánh của sao biển, sụn khí quản, sụn xương móng, xụn ức và xụn
xương sườn cá sấu. Protein trong các proteoglycan (PG) từ sụn vây cá mập đầu
búa cũng đã được phân giải 75% bởi Papain thương mại. Hoạt động phân giải bởi
Papain tương tự cũng được quan sát thấy ở cá ngựa vằn, cánh của sao biển và da
hải cẩu.... [4]. Các hoạt động phân giải protein và collagen của dịch enzyme tự
nhiên được phân lập từ tuyến tụy của cá đuối đã làm tăng 50% tỷ lệ thủy phân sụn
cá đuối trong 6 giờ [12].
Các nghiên cứu thủy phân protein lõi của sụn có nguồn gốc từ các loại phụ
phẩm chế biến gia súc, gia cầm cũng đã được nghiên cứu. Chẳng hạn như, Lou đã

sử dụng Papain để thủy phân protein trong PG để giải phóng CS khỏi sụn ức gà.
Kết quả cho thấy trong mỗi gam nguyên liệu sụn ức gà tươi có 33 mg GAG, trong
đó có tới 76% là CS. Shin đã dụng chế phẩm Alcalase để phân giải protein của

12


sụn ức gà nhằm giải phóng các phân tử CS. Kết quả cho thấy là đã có khoảng 7376% CS được giải phóng khỏi các PG sau q trình thủy phân bằng enzyme so với
chỉ có 35-40% nếu chỉ đun sôi bằng nước [9]. Nếu tiếp tục tinh sạch thông qua
công đoạn kết tủa CS của bột sụn gà thủy phân trong ethanol sẽ thu được chế phẩm
bợt có hàm lượng CS lên tới 46-47%. Theo Nakano, so với các các enzyme
Tripsin, Flavozyme, Pancreatin thì Papain lại tỏ ra có hiệu quả nhất để giải phóng
các phân tử CS-peptide có phân tử lượng thấp khỏi các PG của các loại sụn gà thu
được từ các loại phụ phẩm của quá trình chế biến gà rút xương. Theo các nghiên
cứu lâm sàng, các phân tử CS thấp phân tử được cơ thể hấp thụ dễ dàng hơn và có
hoạt tính sinh học mạnh hơn so với các phân tử CS có khối lượng phân tử lớn [3].
Vittayamont cũng đã sử dụng enzyme Papain để thủy phân các PG của sụn
khí quản vịt nhằm tạo ra các loại CS4 và CS6. Kết quả cho thấy hiệu suất thủy
phân tăng từ 50% lên 80% sau khi tăng thời gian thủy phân từ 1h lên 10h ở nồng
độ enzyme tối ưu là 0,25%. Trong khi đó, tăng thời gian sử dụng enzyme từ 7 lên
10h khơng làm tăng đáng kể hiệu suất trích ly CS bằng enzyme Papain ở các nồng
độ từ 0,0625 % - 0,125 % và 0,5 - 1% [13] (Hình 1.6).

Hình 1. 6. Hiệu suất trích ly CS từ sụn khí quản vịt bằng enzyme Papain.

13


Hình 1. 7. Hiệu suất trích ly CS từ sụn khí quản vịt bằng enzyme Papain.
Các tác giả này cũng đã cho thấy xử lý sụn khí quản vịt bằng kiềm để tách

protein đã gây ra tổn thất CS cao hơn đến 50% so với enzyme Papain (Hình 1.7). Sự
gia tăng thời gian, nhiệt độ và nồng độ kiềm trong việc xử lý protein bằng kiềm đã làm
tăng đáng kể tỷ lệ tổn thất CS từ các mẫu khí quản vịt. Trong khi đó hiệu suất trích ly
CS khỏi sụn khí quản vịt tăng từ 0 lên 40 % khi sử dụng enzyne Alcalase 0,5% và tăng
thấp hơn từ 0 lên 22-25%, khi sử dụng enzyne Alcalase 0,1-0,3%.
Theo Patent CN1699428A (2005) thì trong q trình sản xuất cơng nghiệp,
các tác giả Trung Quốc đã xử lý sụn gà với Trypsin ở 500C, trong 8h. Dịch thu
được sau quá trình thủy phân tiếp tục được tinh sạch bằng cách lọc bỏ các kết tủa
protein thông qua hệ thống màng sợi siêu lọc và siêu lọc phân tử, tiếp theo là quá
trình lọc thẩm tích và cơ đặc chân khơng dịch lọc đến nồng độ 15-200Bx, trước
khi tiến hành sấy phun để thu hồi CS ở dạng bột mầu trắng. Trong Patent
WO2007/122179, người ta cũng đã sử dụng enzyme protease cho sản xuất CS từ
sụn gia cầm, tạo ra bột sấy phun có hàm lượng CS 9-15% [8].

14


Bảng 1. 1. Tỷ lệ ∆Di – 4S/∆Di-6S từ khí quản vịt với alkal, enzyme và nhiệt độ
Thí nghiệm

Thời gian

∆Di – 4S/∆Di-6S

Nguyên liệu thô

-

2,41

0,05M NaOH, 40C

1h

2,55

3h

2,30

6h

0,75

1h

0,94

3h

0,92

6h

0,91

1h

0,76

3h

0,80

6h

0,79

1h

0,79

3h

0,81

6h

0,81

1h

2,15

2h

2,02

3h

2,44

6h

1,73

1h

1,69

2h

1,80

3h

1,80

6h

1,72

1h

2,48

2h

2,30

3h

2,08

6h

2,25

0,05M NaOH, 250C

0,1M NaOH, 40C

0,1M NaOH, 250C

0,1% Alcalase

0,3% Alcalase

0,5% Alcalase

15