Phân lập và xác định một số đặc tính sinh học của chủng PEDV (porcine epidemic diarrhea virus) ở lợn nuôi tại thái nguyên và hưng yên

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

TRẦN THỊ NHÀN

PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH
SINH HỌC CỦA CHỦNG PEDV (PORCINE
EPIDEMIC DIARRHEA VIRUS) Ở LỢN NUÔI
TẠI THÁI NGUYÊN VÀ HƯNG YÊN

Chuyên ngành:

Thú y

Mã số:

8640101

Người hướng dẫn khoa học:

PGS.TS. Lê Văn Phan

NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2018


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu khoa học của riêng tôi. Các số
liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực, chính xác và chưa được cơng bố trong
bất kỳ cơng trình nào khác.
Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ thực hiện luận án đã được cảm ơn và các
thơng tin trích dẫn trong luận án đã được chỉ rõ nguồn gốc
Hà Nội, ngày .... tháng... năm 2018

Tác giả luận văn

Trần Thị Nhàn

i


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hồn thành luận văn, tơi đã nhận
được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cơ giáo, sự giúp đỡ, động viên của
bạn bè, đồng nghiệp và gia đình.
Nhân dịp hồn thành luận văn, cho phép tơi được bày tỏ lịng kính trọng và biết
ơn sâu sắc tới PGS.TS. Lê Văn Phan đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời
gian và tạo điều kiện cho tơi trong suốt q trình học tập và thực hiện đề tài.
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo,
Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiêm, Khoa Thú y- Học viện Nơng nghiệp Việt Nam đã
tận tình giúp đỡ tơi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hồn thành luận văn.
Tơi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức Công ty TNHH MTV
Avac Việt Nam đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tơi trong suốt q trình thực hiện đề tài.
Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện
thuận lợi và giúp đỡ tơi về mọi mặt, động viên khuyến khích tơi hoàn thành luận văn./.

Hà Nội, ngày .... tháng... năm 2018
Tác giả luận văn

Trần Thị Nhàn

ii

MỤC LỤC
Lời cam đoan............................................................................................................................... i
Lời cảm ơn.................................................................................................................................. ii
Mục lục....................................................................................................................................... iii
Danh mục chữ viết tắt............................................................................................................... v
Danh mục bảng biểu................................................................................................................. vi
Danh mục hình......................................................................................................................... vii
Trích yếu luận văn.................................................................................................................. viii
Thesis abstract............................................................................................................................ x
Phần 1. Mở đầu........................................................................................................................ 1
1.1.

Tính cấp thiết của đề tài............................................................................................. 1

1.2.

Mục tiêu của đề tài...................................................................................................... 2

1.3.

Phạm vi nghiên cứu.................................................................................................... 2

1.4.

Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học hoặc thực tiễn của đề tài..................... 2

Phần 2. Tổng quan tài liệu..................................................................................................... 3
2.1.

Giới thiệu chung về virus gây dịch tiêu chảy cấp trên lợn (PEDV) ...................3

2.1.1.

Hình thái cấu trúc và bộ gen virus............................................................................ 3

2.1.2.

Các loại protein cấu trúc của PEDV........................................................................ 4

2.1.3.

Đặc tính ni cấy của virus PED trên tế bào.......................................................... 5

2.1.4.

Tính khơng đồng nhất................................................................................................ 7

2.2.

Tình hình nghiên cứu trong nước và nước ngoài................................................... 8

2.2.1.

Nghiên cứu trong nước............................................................................................... 8

2.2.2.

Nghiên cứu nước ngồi............................................................................................ 10

2.3.

Tình hình sử dụng vắc-xin phòng PED trên thế giới và việt nam .....................15

2.3.1.

Trên thế giới............................................................................................................... 15

2.3.2.

Tại Việt Nam............................................................................................................. 16

Phần 3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu................................................................ 18
3.1.

Địa điểm nghiên cứu................................................................................................ 18

3.2.

Thời gian nghiên cứu............................................................................................... 18

3.3.

Đối tượng -Vật liệu nghiên cứu.............................................................................. 18

3.3.1.

Đối tượng - Nguyên liệu nghiên cứu..................................................................... 18

iii

3.3.2.

Mơi trường, hóa chất................................................................................................ 18

3.3.3.

Thiết bị, dụng cụ dùng trong phịng thí nghiệm.................................................. 18

3.4.

Nội dung nghiên cứu................................................................................................ 19

3.5.

Phương pháp nghiên cứu......................................................................................... 19

3.5.1.

Phương pháp thu thập và xử lí mẫu....................................................................... 19

3.5.2.

Phương pháp phân lập virus PED trên tế bào Vero............................................. 20

3.5.3.

Phương pháp kiểm tra vô trùng và thuần khiết.................................................... 20

3.5.4.

Phương pháp RT – PCR........................................................................................... 21

3.5.5.

Phương pháp chuẩn độ hiệu giá virus (TCID 50/ml)............................................ 24

3.5.6.

Phương pháp kiểm tra tính độc............................................................................... 25

3.5.7.

Phương pháp chẩn đoán nhanh PEDV bằng PED-Ag test kit ........................... 26

3.5.8.

Phương pháp xác định đường cong sinh trưởng của virus ................................. 27

3.5.9.

Phương pháp giải trình tự gen................................................................................ 28

3.5.10. Phương pháp xây dựng cây sinh học phân tử....................................................... 29
Phần 4. Kết quả và thảo luận............................................................................................. 30
4.1.

Kết quả thu thập mẫu bệnh phẩm dương tính với PEDV trên lợn .................... 30

4.2.

Kết quả phân lập virus từ các mẫu bệnh phẩm trên tế bào vero .......................31

4.2.1.

Kết quả phân lập PEDV........................................................................................... 31

4.2.2.

Kết quả kiểm tra vô trùng và thuần khiết của hai chủng virus phân lập ..........34

4.3.

Kết quả xác định một số đặc tính sinh học của chủng PEDV phân lập ...........36

4.3.1.

Khả năng thích nghi và gây bệnh tích tế bào của 2 chủng PEDV phân lập ....36

4.3.2.

Hiệu giá 2 chủng virus PED phân lập................................................................... 38

4.3.3.

Đường cong sinh trưởng của 2 chủng virus PED................................................ 40

4.3.4.

Kết quả xác định độc lực của 2 chủng PEDV...................................................... 42

4.3.5.

Kết quả phân tích giải trình tự gen S của 2 chủng PEDV.................................. 45

4.3.6.

Kết quả so sánh tương đồng về nucleotide và axit amin .................................... 47

Phần 5. Kết luận và kiến nghị............................................................................................ 51
5.1.

Kết luận...................................................................................................................... 51

5.2.

Kiến nghị.................................................................................................................... 51

Tài liệu tham khảo................................................................................................................... 53
Phụ lục....................................................................................................................................... 61

iv


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Nghĩa tiếng Việt

cDNA

Complementary deoxyribonucleic acid

DEPC

Diethyl pyrocarbonate

DMEM

Dulbecco's Modified Eagle's medium

DTT

Dithiothreitol

ELISA

Enzyme Linked Immunosorbent Assay

HY

Hưng Yên

MTV

Một thành viên

MOI

Multiplicity of infection

ORF

Open reading frame

PBS

Phosphate buffered saline

PDCoV

Porcine deltacoronavirus

PED

Porcine Epidemic Diarrhea

PEDV

Porcine Epidemic Diarrhea Virus

RNA

Ribonucleic acid

RT - PCR

Reverse transcription polymerase chain reaction

TCID50

Tissue culture infective dose 50

TCVN

Tiêu chuẩn Việt Nam

TGEV

Transmissible gastroenteritis virus

TN

Thái Nguyên

TNHH

Trách nhiệm hữu hạn

TSB

Trypto-casein soy broth

v


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 2.1. Chức năng của các loại protein cấu tạo PEDV.................................................. 5
Bảng 2.2. Danh mục các loại vắc - xin phòng bệnh PED đang lưu hành tại Việt
Nam hiện nay 17

Bảng 3.1. Thành phần và chu trình nhiệt phản ứng tổng hợp cDNA ............................. 22
Bảng 3.2. Trình tự mồi dùng trong nghiên cứu................................................................... 22
Bảng 3.3. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR.................................................................... 23
Bảng 3.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chuẩn độ hiệu giá virus PED .................................... 24
Bảng 3. 5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm kiểm tra tính độc các chủng PEDV phân lập .........25
Bảng 3.6. Trình tự mồi sử dụng giải trình tự gen S........................................................... 28
Bảng 3.7. Chu trình nhiệt của phản ứng RT - PCR nhân gen S...................................... 29
Bảng 4.1. Danh sách mẫu bệnh phẩm dương tính với PEDV thuộc hai tỉnh Hưng
Yên và Thái Nguyên

30

Bảng 4.2. Kết quả phân lập PEDV trên tế bào Vero......................................................... 32
Bảng 4.3. Kết quả kiểm tra tạp khuẩn và tạp nấm của 2 chủng PEDV......................... 34
Bảng 4.4. Kết quả kiểm tra tạp nhiễm virus ngoại lai...................................................... 35
Bảng 4.5. Khả năng gây bệnh tích tế bào của 2 chủng PEDV phân lập ........................36
Bảng 4.6. Kết quả theo dõi triệu chứng lâm sàng của lợn con sau khi uống PEDV
với các liều khác nhau 42
Bảng 4.7. Mức độ tương đồng (dưới) và số nucleotide khác nhau giữa 2 chủng
phân lập được và các chủng tham chiếu

47

Bảng 4.8. Mức độ tương đồng (dưới) và số amino acid khác nhau giữa 2 chủng
phân lập được và các chủng tham chiếu

vi

48

DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Sơ đồ tổ chức và cấu trúc hệ gen virus PED ....................................................... 4
Hình 3.1. Kỹ thuật kiểm tra PEDV bằng kít test nhanh.................................................. 27
Hình 4.1. Kết quả chạy điện di kiểm tra sản phẩm PCR................................................ 31
Hình 4.2. Biểu hiện bệnh tích tế bào của 2 chủng PEDV phân lập được và kết
quả giám định bằng kỹ thuật RT –PCR........................................................... 33
Hình 4.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra tạp nhiễm của 2 chủng PEDV
phân lập với một số loại virus gây tiêu chảy trên lợn khác .......................... 35
Hình 4.4. Bệnh tích tế bào của PEDV qua các đời cấy truyền ở 24 giờ sau gây nhiễm
37
Hình 4.5. Biểu đồ biểu thị hiệu giá chủng PEDV phân lập qua các đời cấy truyền ...39
Hình 4.6. Đường biểu diễn tốc độ sinh trưởng của hai chủng virus PED phân
lập theo thời gian................................................................................................. 40
Hình 4.7. Bệnh tích tế bào theo thời gian.......................................................................... 41
Hình 4.8. Một số dấu hiệu lâm sàng ghi nhận được trên lợn thí nghiệm ..................... 44
Hình 4.9. Hình ảnh mổ khám kiểm tra bệnh tích đại thể ở lợn thí nghiệm sau khi
gây nhiễm PEDV................................................................................................ 45
Hình 4.10. Mối quan hệ di truyền giữa chủng PEDV/TN8/2016 và chủng
PEDV/HY3/2015 với các chủng ham chiếu khác......................................... 46
Hình 4.11. Kết quả căn trình tự vùng COE.......................................................................... 49
Hình 4.12. Kết quả căn trình tự các vùng quyết định kháng nguyên ............................... 49

vii


TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
Tên tác giả: Trần Thị Nhàn
Tên luận văn: Phân lập và xác định một số đặc tính sinh học của chủng PEDV ở lợn
(Porcine Epidemic Diarrhea Virus) tại Thái Nguyên và Hưng Yên

Ngành: Thú y

Mã số: 8640101

Cơ sở đào tạo: Học Viện Nông nghiệp Việt Nam (VNUA)
Mục đích nghiên cứu
- Phân lập được virus PED để khẳng định chắc chắn sự lưu hành của loại virus
này tại Thái Nguyên và Hưng Yên.
- Xác định một số đặc tính sinh học của chủng virus PED phân lập được.

Phương pháp nghiên cứu
-

Phương pháp thu thập và xử lí mẫu.

Các mẫu bệnh phẩm được thu thập theo phương pháp hồi cứu. Tức là chỉ sử
dụng những mẫu đã được chẩn đốn dương tính với PEDV tại hai tỉnh Hưng n và
Thái Nguyên từ năm 2015 -2017 bằng kỹ thuật RT – PCR và hiện đang cịn lưu trữ tại
Phịng thí nghiệm của Công ty TNHHMTV Avac Việt Nam.
Mẫu được chọn, trước khi sử dụng cho phân lập virus đều được kiểm tra lại
tình trạng mẫu bằng kỹ thuật RT –PCR để giám định lại sự có mặt của PEDV trong
mẫu bệnh phẩm. Sau đó mẫu được nghiền hoặc đồng nhất thành huyễn dịch 10%, ly
tâm và lọc qua màng lọc 0,45µm và sử dụng cho phân lập PEDV.
-

Phương pháp phân lập PEDV trên tế bào Vero

-

Phương pháp kiểm tra vô trùng thuần khiết

+ Phuơng pháp kiểm tra vô trùng theo TCVN 8684:2011
+ Phương pháp kiểm tra sự thuần khiết sử dụng kỹ thuật RT – PCR

-

Phương pháp chuẩn độ virus (TCID50/ml)

-

Phương pháp xác định đường cong sinh trưởng của virus

-

Phương pháp xác định tính độc của virus

-

Phương pháp giải trình tự gene

-

Phương pháp dựng cây sinh phát sinh chủng loại.

Kết quả chính và kết luận
- Sau 5 đời cấy truyền mù trên môi trường tế bào vero, đã phân lập thành công 2
chủng virus PED (PEDV/TN8/2016 và PEDV/HY3/2015) trong tổng số 22 mẫu bệnh

viii

6

6,5

phẩm thực địa. Hiệu giá virus thu được dao động từ 10 - 10 TCID50/ml. Cả 2 chủng
virus đều đạt tiêu chuẩn vô trùng và thuần khiết không tạp nhiễm bất cứ vi sinh vật
ngoại lai nào.
- Kết quả nghiên cứu về đường cong sinh trưởng của hai chủng PEDV phân lập
được trên môi trường tế bào cho thấy, với liều gây nhiễm MOI = 0,01, hiệu giá virus
thu được đạt cao nhất sau 36 – 48 giờ gây nhiễm.
- Kết quả nghiên cứu về độc lực của virus trên động vật thí nghiệm cho thấy cả
2 chủng PEDV phân lập được đều có khả năng gây bệnh cho lợn thí nghiệm với
những triệu chứng lâm sàng và bệnh tích đặc trưng của PED.

Kết quả phân tích về phả hệ (phylogenetic tree) cho thấy cả hai chủng PEDV
phân lập được đều nằm trong nhóm G2b, có mối quan hệ gần gũi với các chủng PEDV
tham chiếu khác đã được công bố ở Việt Nam trong những năm gần đây. Hai chủng
PEDV phân lập được trong nghiên cứu này có mức độ tương đồng về trình tự
nucleotide (nt) và axit amin (aa) rất cao khi so sánh với 2 chủng PEDV HUA/PED114
và HUA/PED118 tham chiếu khác của Việt Nam đã được công bố trước đây, tỷ lệ
tương đồng về nt và aa tương ứng là 99% và 98%. Tuy nhiên, khi phân tích so sánh
với một số chủng PEDV tham chiếu khác trên thế giời cho thấy mức độ tương đồng về
nt (92,6 – 93,2%) và aa (91,2 – 92,9%) khá thấp.
-

Như vậy, nghiên cứu này đã phân lập thành công 2 chủng PEDV từ thực địa và
hai chủng virus này đã được nghiên cứu về các đặc tính sinh học và sinh học phân tử.
Hai chủng virus phân lập được từ thực địa này sẽ là nguồn nguyên vật liệu vơ cùng
quan trọng phục vụ cho các cơng trình nghiên cứu sản xuất vắc - xin phòng bệnh tiêu
chảy cấp trên lợn (PED) trong tương lai gần.

ix


THESIS ABSTRACT
Master candidate: Tran Thi Nhan
Thesis title: Isolation and characterization of PEDV (Porcine Epidemic Diarrhea
Virus) collected from piglets in Thai Nguyen and Hung Yen Province
Major: Veterinary

Code: 8640101

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA)
Research Objectives:
- Isolation of PEDV to confirm the circulation of PED virus in Thai Nguyen and
Hung Yen province.
-

Characterization of isolated PEDV strains.

Materials and Methods
- Collection and preparation of specimens from the field: Specimens used in the
study were collected from pigs in Hung Yen and Thai Nguyen province during 2015 2017 and diagnosed as PEDV- positive samples by RT-PCR (Reverse transcription
polymerase chain reaction). These specimens were stored at Research and
Development Laboratory of AVAC Vietnam Company Ltd.,.
Before using these samples for PED virus isolation, they were confirmed again by
RT-PCR. Samples were homogenized in MEM to produce a 10% suspension. The
suspension was then clarified by centrifugation and filtrated by 0.45µl syringe filter
before inoculation into Vero cell.
- In this study Vero cell was used for isolation of PEDV

- Isolated PEDV strains were tested for sterility and purity following Vietnamese
standard as TCVN 8684:2011 and RT-PCR method. Other methods were also used in this
study including titration of PED virus by TCID 50 (50% Tissue culture Infective Dose)
assay, Construction of growth curve of PED virus, Assessment of virulence of isolated 2
PEDV strains on animal model, Gene sequencing and Phylogenetic Tree.
Main findings and conclusions
- After 5 blind passages in cell culture, two field strains of PEDV
(PEDV/TN8/2016 và PEDV/HY3/2015) were successfully isolated from 22 PEDV6

6.5

positive samples. The titer of isolated virus strains was expressed as 10 -10
TCID50/ml. Both 2 strains of PED virus were passed the sterility and purification tests.
- Results of growth curve of virus showed that with MOI (Multiplicity of
infection) of 0.01, the titer of the two PED virus strains was reaching the peak 36h48h post infection.

x


- Results of virulence test showed that both PED virus strains have capacity of
infection over piglets and caused typical clinical symptoms.

The nucleotide (nt) and amino acid (aa) sequences of 2 PEDV strains in this
research were analysed and compared with those of other conference PEDV isolates.
Results of phylogenetic tree analysis showed that both isolated PEDV strains belonged
to G2b group and closely related to reference PEDV strains isolated in Vietnam in
recent years. In detail, the present PEDV strains were high similarity to other two
Vietnamese strains of HUA/PED114 and HUA/PED118, sharing about 99% in nt and
98% in aa similarity. However, when compared with other PEDV strains in the world,
present PEDV strains showed low nt and aa similarity, sharing 92 - 93% in nt and 91.2

- 92.9% in aa.
-

In conclusion, two strains of PEDV were successfully isolated in this study and
their biology and molecular biology characterizations were reported. These isolated
PEDV strains will be the crucial materials for other studies such as PEDV vaccine
production in future.
-

xi


PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Tiêu chảy cấp trên lợn (PED) là bệnh truyền nhiễm ở đường tiêu hóa có tốc
độ lây lan cao ở lợn. Bệnh này được đặc trưng bởi hiện tượng tiêu chảy nặng, nôn
mửa, mất nước trầm trọng và tử vong, tỷ lệ tử vong cao từ 90% -100% ở lợn con
mới sinh nhỏ hơn 7 ngày tuổi. PED cũng có thể gây ra tiêu chảy, hoại tử, và chu kỳ
sinh sản bất thường ở lợn nái mang thai. Mặc dù PED lần đầu tiên được xác định ở
châu Âu vào năm 1971 sau đó virus lan rộng khắp châu Âu. Tuy nhiên, trong
những năm 1980 và 1990, số vụ dịch PED đã giảm rõ rệt trong khu vực. Chỉ có
một vài đợt dịch bùng phát nghiêm trọng đã được báo cáo kể từ những năm 1980 ở
châu Âu. Sau đó, PED đã trở thành một bệnh lưu hành ở các nước chăn nuôi lợn ở
Châu Á như Hàn Quốc, Trung Quốc, Việt Nam, Nhật Bản, Philippines, Đài Loan
và Thái Lan. Tỷ lệ chết ở lợn con theo mẹ có thể lên đến 100% (Carvajal et al.,
1995, Kim et al., 2001, Penseart and Yeo, 2006, Puranaveja et al., 2009) dẫn đến
tổn thất kinh tế đáng kể trong ngành chăn ni lợn tồn cầu. Tại Việt Nam, vào
cuối năm 2008, dịch tiêu chảy cấp được phát hiện đầu tiên ở Đồng Nai, sau đó
bệnh lây lan khắp các địa bàn trong tỉnh cũng như nhiều tỉnh thành khác. Bệnh lan
rộng ở các tỉnh miền Đông Nam Bộ, gây ảnh hưởng đến kinh tế chăn nuôi lợn do

làm tăng tỷ lệ bệnh, tỷ lệ chết cao đặc biệt trên lợn con theo mẹ (Nguyễn Tất Toàn
và cs., 2012).
Hiện nay, trên thế giới đã nhiều nước nghiên cứu và phát triển loại vắc-xin
phòng bệnh tiêu chảy cấp trên lợn (PED) như: Mỹ, Hàn Quốc, Nhật Bản.. và phân
phối rộng rãi trên thị trường các nước trong đó có Việt Nam. Tuy nhiên, khi vắcxin nhập về Việt Nam sử dụng trên đàn lợn nhưng hiệu quả phòng bệnh chưa cao,
đã tiêm phòng nhưng dịch vẫn bùng phát trở lại gây thiệt hại kinh tế cho người
chăn nuôi. Nguyên nhân sâu xa của vấn đề này chính là chủng virus trong vắc-xin
và chủng virus đang lưu hành ngồi thực địa nước ta tương đồng kháng ngun
khơng cao. Bên cạnh đó, do chăn ni tại nước ta cịn ở quy mơ nhỏ, phân tán,
khơng áp dụng các biện pháp an toàn sinh học một cách triệt để, chưa quản lý tốt
việc vận chuyển buôn bán lợn nên nguy cơ dịch tái phát, nổ ra ở bất cứ địa phương
nào, thời điểm nào là rất lớn, đặc biệt khi thời tiết thay đổi tạo điều kiện thuận lợi
cho virus PED và các mầm bệnh khác phát triển gây bệnh. Vì vậy, vấn đề đặt ra
cho các nhà nghiên cứu cũng như các Công ty sản xuất vắc –

1


xin trong nước phải nghiên cứu phân lập được chủng PEDV từ thực địa và phát
triển thành vắc – xin như vậy mới cho hiệu quả phòng bệnh cao. Do đó, cùng với
sự giúp đỡ của Phịng thí nghiệm nghiên cứu và Phát triển sản phẩm vắc - xin Công ty TNHH MTV Avac Việt Nam, tôi thực hiện đề tài nghiên cứu “Phân lập
và xác định một số đặc tính sinh học của chủng PEDV (Porcine Epidemic
Diarrhea Virus) ở lợn nuôi tại Thái Nguyên và Hưng Yên”.
1.2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI
Đề tài nghiên cứu với mục tiêu phân lập được virus PED từ thực địa, trên cơ
sở đó xác định một số đặc tính sinh học của chủng PEDV phân lập. Chỉ ra những
ưu điểm và nhược điểm của chủng PEDV phân lập được so với các chủng PEDV
tham chiếu. Trên cơ sở đó đưa ra ứng cử viên (chủng PEDV) tiềm năng cho nghiên
cứu tạo vắc - xin phòng bệnh tiêu chảy cấp (PED) trong tương lai.
1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU

Các mẫu bệnh phẩm của lợn con bị tiêu chảy cấp (phân, ruột) được chẩn
đốn dương tính bằng kỹ thuật RT – PCR từ năm 2015-2017 tại hai tỉnh Hưng Yên
và Thái Nguyên đang được lưu trữ tại Phịng thí nghiệm Cơng ty TNHH MTV
Avac Việt Nam.
1.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI, Ý NGHĨA KHOA HỌC HOẶC THỰC TIỄN
CỦA ĐỀ TÀI
-

Nội dung nghiên cứu thành công sẽ tạo ra nguồn giống virus phục vụ cho
những nghiên cứu sản xuất vacxin phòng bệnh do PEDV gây ra trong tương
lai.

-

Là cơ sở dữ liệu cho các nhà nghiên cứu khoa học phân tích, so sánh, đánh
giá với các chủng virus PED khác đang lưu hành tại Việt Nam.

2


PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ VIRUS GÂY DỊCH TIÊU CHẢY CẤP TRÊN
LỢN (PEDV)
Virus gây tiêu chảy cấp ở lợn (PEDV) là một virus RNA sợi đơn dương tính
thuộc họ Coronaviridae, phân họ Coronavirinae, và chi Alphacoronavirus (Wang Y,
2015b). Virus này có thể lây nhiễm cho lợn ở mọi lứa tuổi và gây ra tiêu chảy, nôn
mửa, mất nước, tỷ lệ chết cao ở lợn con sơ sinh gây tổn thất kinh tế nặng nề.
Bệnh lần đầu tiên xuất hiện vào đầu những năm 1970 tại Anh và Bỉ. Đến năm
1977 mới được phân lập và được xác định là một Coronavirus mới (Pensaert,
1978; Wang, 2015a). Trong suốt những năm 1970 và 1980, virus lây lan khắp châu

Âu. Tuy nhiên, trong những năm 1980 và 1990, tỷ lệ nhiễm PEDV giảm rõ rệt ở
châu Âu, chỉ xuất hiện những vụ dịch lẻ tẻ tại một số nước như Hà Lan (Pijpers,
1993), Hungary (Nagy, 1996). Bệnh tiêu chảy cấp (PED) lần đầu tiên xuất hiện ở
châu Á năm 1982 ( Takahashi et al., 1983; Kweon et al., 1999, Chen et al., 2008;
Puranaveja et al., 2009; Li et al., 2011) và từ đó đến nay nó đã gây thiệt hại đáng
kể về kinh tế các nước có bệnh lưu hành. Kể từ cuối năm 2010, dịch bệnh PED
nghiêm trọng nổ ra tại Trung Quốc gây tử vong cao ở lợn con, gây thiệt hại kinh tế
nghiêm trọng, mặc dù trước đây lợn đã được tiêm phòng vắc - xin vô hoạt hoặc
vắc - xin nhược độc (Sun, 2012; Wang Y, 2015). Phân tích cây phả hệ cho thấy các
chủng PEDV lưu hành tại Trung Quốc có độc lực cao hơn và là một biến thể mới.
2.1.1. Hình thái cấu trúc và bộ gen virus
Bộ gen của virus PED là sợi RNA đơn dương kích thước khoảng 28kb với
mũ 5’ và đuôi là polyA 3’. Bộ gen của virus gồm một vùng không dịch mã đầu
(UTR) 5’, một UTR đầu 3’, ít nhất 7 khung đọc mở (ORF) mã hóa cho 4 protein
cấu trúc gồm gai (S), vỏ (E), màng (M), và nucleocapsid (N) và 3 protein không
cấu trúc (enzyme tái bản replicase 1a, 1b và ORF3). Những khung đọc mở này
được sắp xếp theo trình tự: 5’-replicase (1a, 1b)-S-ORF3-E-M-N-3’. Protein cấu
trúc của PEDV tương tự như các coronavirus khác. Virus có một protein gai (S)
với trọng lượng phân tử khoảng 180-200 kDa, một protein màng (M) 27-32 kDa,

3


một protein nucleocapsid gắn với RNA nặng 57-58 kDa (Hình 2.1a) (Duarte et al.,
1994; Kocherhans et al., 2001; Lai et al., 2007).
A

B

Hình 2. 1. Sơ đồ tổ chức và cấu trúc hệ gen virus PED (Lee, 2015)

2A: Cấu trúc hệ gen RNA của PEDV; 2B: Mơ hình cấu trúc PEDV

2.1.2. Các loại protein cấu trúc của PEDV
Trong số các protien cấu trúc của virus, protein S của PEDV là loại
glycoprotein bao bọc chính của virus, có nhiệm vụ tương tác với thụ thể tế bào
trong quá trình xâm nhập virus và kích thích cảm ứng các kháng thể trung hịa
trong vật chủ tự nhiên (Jackwood et al., 2001; Lee et al., 2010). Sự tương tác này
rất quan trọng đối với sự xâm nhập của virus và liên quan đến việc tạo ra các
kháng thể trung hòa chống lại siêu vi khuẩn. Ngoài ra, những đặc điểm quan trọng
của protein S được biết đến là một gen virus thích hợp để xác định mối liên hệ di
truyền giữa các chủng PEDV và để phát triển các xét nghiệm chẩn đoán và vắc-xin
hiệu quả (Chen et al., 2014; Gerber et al., 2014; Oh et al., 2014). Do đó, các nhà
nghiên cứu PEDV đã bắt đầu phân tích các kiểu gen của PEDV sử dụng gen S.
Trong khi các gen khác, chẳng hạn như gen mã hóa protein M và gen mã hố trong
ORF3 đã được sử dụng cho phát sinh hoặc phân tử dịch tễ học nghiên

4


cứu. Protein E loại vỏ bọc nhỏ đóng một vai trị quan trọng trong q trình tạo ra
coronavirus, và sự biểu hiện của protein E và M có thể hình thành các virion giống
như coronavirus giống như spike-virus (Baudoux et al., 1998). Protein N có nhiều
chức năng trong nhân bản virus và sinh bệnh học trong coronavirology. Nói chung,
protein N của coronavirus tương tác với gen RNA virus và liên kết với các phân tử
protein N khác để bảo vệ bộ gen của virus, phục vụ như là cơ sở cho nucleocapsid
xoắn ốc trong quá trình lắp ráp coronavirus (McBride et al., 2014) (bảng 2.1).
Bảng 2.1. Chức năng của các loại protein cấu tạo PEDV
ORF

Cấu trúc và chức năng

ORF1a/b

Được gọi là polymerase (Pol). ORF 1 được chia thành hai ORF, 1a và 1b
bằng cơ cấu khung xương ribosome. ORF 1a chứa proteases vàORF 1b
chứa RNA phụ thuộc RNA polymerase, exonuclease, endoribonuclease
và methyltransferase

S

Đây là glycoprotein loại I với 1.383 axit amin có chứa các epitope trung
hịa. Protein này bao gồm 2 tên miền phụ, S1 và S2. Protein S có vai trò
quan trọng trong tương tác với thụ thể tế bào chủ và xâm nhiễm. Đặc biệt
miền S1 rất quan trọng đối với sự vơ hiệu hóa virus và sự đa dạng di
truyền.

ORF3

ORF3 được cho là có liên quan đến tính độc của PEDV
Protein E chịu trách nhiệm cho việc lắp ráp viron kết hợp với protein M.

E

Nó đóng vai trị của một kênh ion ảnh hưởng đến việc phát tán virus
Nó có thể gây interferon alpha sau khi xâm nhiễm. Protein M cũng có liên

M

quan với việc vơ hiệu hóa và sự lắp ráp virus.
Protein N là một phosphoprotein gắn với hệ gen của virus. Protein này rất

N

hữu ích cho việc chẩn đoán nhiễm trùng PEDV
Nguồn: Mc Bride et al (2014)

2.1.3. Đặc tính ni cấy của virus PED trên tế bào
Khả năng thích ứng của virus PED với tế bào ruột non trong điều kiện của
phịng thí nghiệm rất kém, trong khi đó phân lập được virus PED từ các ổ dịch
trong phịng thí nghiệm là một việc hết sức quan trọng đối với sự phát triển vắc -

5


xin. Q trình sinh trưởng của virus PED trên mơi trường ni cấy tế bào hết sức
khó khăn. Nếu các tế bào không được xử lý với trypsin hoặc dịch tụy thì khơng
thích hợp để virus nhân và virus có thể dần mất khả năng lây nhiễm khi cấy truyền
ở các đời xa hơn (Callebaut, 1981; Chen et al., 2014). Về khả năng sinh trưởng,
hiệu giá nuôi cấy virus đạt cao nhất 10

5.5

đám hoại tử (plaque forming unit) sau 15

giờ gây nhiễm tế bào (Hofmann and Wyler, 1988). Hiện nay, tế bào Vero là dịng
thích hợp nhất để phân lập và nhân giống virus PED trong phịng thí nghiệm (một
dịng tế bào tách từ tế bào thận khỉ xanh châu Phi). Ngoài ra, tế bào Marc -145
cũng được sử dụng để cấy truyền virus PED trên tế bào (Lawrence, 2014) hay
dòng tế bào TKSEK6 và IB-RS2 được sử dụng để nhân chủng virus PED (P-5V)
làm vắc - xin tại Nhật Bản (Kadoi et al., 2002). Tuy nhiên, sự sinh trưởng của

virus PED phụ thuộc vào sự có mặt của trypsin trong mơi trường ni cấy. Bởi
trypsin đóng một vai trị quan trọng đối với quá trình cảm nhiễm của virus lên tế
bào và giải phóng virus PED trong tế bào Vero bằng cách tách protein S thành các
tiểu đơn vị S1 và S2 làm tăng hiệu quả lan truyền PEDV trong phịng thí nghiệm
(Ge, 2012; Wicht, 2014,). Hiệu ứng bệnh tích tế bào điển hình được đặc trưng bởi
sự dung giải màng và hợp nhất tế bào thành đám chỉ chứa nhân tế bào. Ngồi ra,
một số dịng tế bào thích nghi với chủng virus nhược độc như SM98 – 1và 83P – 5
có thể lan truyền virus PED mà không cần trypsin (Nam and Lee, 2010; Kim and
Lee, 2013).
Một số chủng PEDV cổ điển đã được phân lập thành cơng trên tế bào Vero có
sử dụng trypsin trong mơi trường như CV777, KPEDV-9, và 83P-5.50–52. Gần
đây nhất nhất là chủng PEDV có độc lực cao Mỹ được cấy truyền 30 đời trên tế
bào Vero và hai biến thể Trung Quốc HN1303 và YN1 cũng được cấy truyền trên
tế bào Vero ở các đời cao hơn 130 và 200 đời tương ứng (Chen, 2014, Oka, 2014).
Tuy nhiên, tỷ lệ phân lập thành công PEDV thấp (0-14,3%) đã được báo cáo bởi
một số nhóm nghiên cứu (Chen, 2014; Oka, 2014; Wang, 2015b). Có nhiều yếu tố
ảnh hưởng đến tỷ lệ phân lập thành công virus như loại mẫu, độ tươi, các chất có
trong đường ruột, nồng độ virus trong mẫu, dịng tế bào Vero và điều kiện nuôi
cấy.
Năm 2018, Nguyễn Thị Hoa và cộng sự đã phân lập thành công 13 chủng
PEDV trong tổng số 83 mẫu bệnh phẩm chọn lọc trên tế bào Vero, sử dụng môi
trường DMEM bổ sung 10µg trypsin. Hiệu giá virus ở đời đầu tiên khi xuất hiện
bệnh tích tế bào đạt từ 10

3,4

TCID50/ml đến 10

6

5,7

TCID50/ml. Sau 4 đời cấy


chuyển liên tiếp hiệu giá virus có xu hướng tăng đạt từ 10
TCID50/ml (Nguyễn Thị Hoa và cs., 2018).

5,3

TCID50/ml đến 10

7,3

2.1.4. Tính khơng đồng nhất
PEDV được giả định là trải qua một q trình tiến hóa chậm tích lũy đột biến
hoặc tái tổ hợp các sự kiện cần thiết để phù hợp với virus (Kim et al., 2015). Di
truyền và phân tích phát sinh lồi sử dụng tồn bộ hệ gen hoặc một số gen riêng lẻ
đã được tiến hành để xác định sự đa dạng và mối quan hệ của các chủng PEDV
toàn cầu. Trong số này, gen S đầy đủ và phần S1 của nó (aa 1–735) đã được biết
đến là locus phù hợp cho trình tự để điều tra tính liên quan di truyền và phân tử
dịch tễ học của PEDV (Lee et al., 2010; Lee, 2014; Lee et al., 2014). Mặc dù chỉ
có một kiểu huyết thanh của PEDV đã được báo cáo,các nghiên cứu phát sinh lồi
của gen S đã chỉ ra rằng PEDVcó thể được tách ra về mặt di truyền thành 2
nhóm:genogroup 1 (G1; cổ điển) và nhóm genogroup 2 (G2;đại dịch, vùng dịch).
Mỗi genogroup có thể được chia thành các phân nhóm 1a và 1b, và 2a và 2b,
tương ứng. G1a bao gồm nguyên mẫu PEDV chủng CV77, chủng vắc-xin và các
chủng thích nghi ni cấy tế bào khác, trong khi G1b bao gồm các biến thể mới
được xác định lần đầu tiên Trung Quốc (Li et al., 2011), sau đó tại Hoa Kỳ (Wang
et al., 2014) và miền Nam Hàn Quốc (Lee et al., 2014), gần đây

ở các nước châu Âu (Grasland et al., 2015; Hanke et al., 2015). G2 được phân

cụm tiếp thành các phân nhóm 2a và 2b chịu trách nhiệm trước dịch bùng phát ở
châu Á và đại dịch gần đây bùng phát ở Bắc Mỹ và châu Á, tương ứng. Sự bùng
nổ dòng G2b độc lực trên toàn cầu dường như do đột biến điểm trong quần thể
nhóm G1a.
Gen S của hầu hết các dịng PEDV trong nhóm G2 bao gồm 4161 nucleotide
(nt) mã hóa 1386 amino acid (aa). Những gen này dài hơn 9-nt (3-aa) so với gen
tương đồng trong chủng CV777 nguyên mẫu. So với trình tự của CV777, các dịng
G2 PEDV có các dấu hiệu di truyền riêng biệt, S- chèn - xóa (S indels) có liên
quan đến 2 điểm đáng chú ý 4-aa và 1-aa ở vị trí 55 và 56 và vị trí 135 và 136, duy
nhất 2-aa bị xóa ở giữa vị trí 160 và 161 trong khu vực có thể thay thế N- đầu cuối
của protein S. Ngoài ra, mẫu indel S này trong các dòng G2 giống hệt với các biến
thể G2 mới, MF3809 [Gen- Bank: KF779469] và FL2013 [GenBank:KP765609],
được xác định ở Hàn Quốc và Trung Quốc, tương ứng, chứa một lượng lớn 204-aa
S bị xóa tại các vị trí 713–916 hoặc 7-aa S bị xóa trong C- đầu cuối, tương ứng.

7


Các biến thể mới trong G1b có sự khác biệt về mặt di truyền với các chủng
G1 và G2 PEDV. Mặc dù các chủng G1b đã được phân lập từ thực địa, nhưng
chúng khơng chứa các tín hiệu di truyền gen S điển hình cho các dịng G2. So sánh
trình tự của N- đầu cuối một phần ba gen S cho thấy rằng trình tự các chủng G1b
giống tới 95% các chủng cổ điển G1a, với các chủng nhóm G2 nhỏ hơn 89%.
Ngược lại, phân tích phần cịn lại của gen S chỉ ra rằng các chủng G1b giống tới
99% chủng G2 (Lee et al., 2014). Hơn nữa, toàn bộ phân tích di truyền phát sinh
lồi cho thấy rằng các chủng G1b được nhóm chặt chẽ với PEDVs của nhóm G2.
Nói chung, những dữ liệu này cho thấy các biến thể G1b mới xuất hiện là kết quả
từ sự kiện tái tổ hợp giữa G1a cổ điển và virus nhóm G2, có thể trong q trình

phiên mã mRNA của virus, mà có lẽ nhất là về mặt địa lý đã xảy ra ở Trung Quốc.
Các biến thể G1b của Mỹ đã được đặt tên là chủng S INDEL vì sự hiện diện của
chèn và xóa gen S so với trình tự của chủng PEDV gốc Hoa Kỳ (Vlasova et al.,
2014).
2.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC VÀ NƯỚC NGỒI
2.2.1. Nghiên cứu trong nước
Tại Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu báo cáo về tính hình dịch bệnh PED
xảy ra ở một số tỉnh thành trong cả nước. Việc sử dụng phương pháp nested RTPCR để chẩn đoán phân biệt virus gây viêm dạ dày – ruột truyền nhiễm (TGEV)
và virus dịch tiêu chảy cấp trên lợn (PEDV) trong các ổ dịch năm 2008-2010 tại
các tỉnh miền Đông Nam bộ. Với 284 mẫu ruột và phân thu được từ lợn con có
biểu hiện bệnh đặc trưng của dịch tiêu chảy, qua chẩn đoán bằng kỹ thuật nested
RT-PCR cho kết quả 41,90% số mẫu dương tính với PEDV, khơng phát hiện mẫu
dương tính với TGEV. Kết quả chẩn đốn cịn cho thấy tỷ lệ mẫu dương tính với
PEDV ở ruột (58,14%) cao hơn mẫu phân (16,96%) (Nguyễn Tất Toàn và cs.,
2012).
Nghiên cứu về một số yếu tố liên quan và đặc điểm bệnh học của bệnh PED
tại một số tỉnh phía Nam, qua khảo sát 110 trại đang xảy ra bệnh tiêu chảy cấp đặc
trưng trên lợn ở mọi lứa tuổi. Kết quả là tỷ lệ bệnh và tỷ lệ chết xuất hiện trên lợn
con theo mẹ là rất cao (tương ứng 93,94% và 81,67%). Hai tỷ lệ này giảm dần theo
lứa tuổi. Các yếu tố liên quan đến việc lan truyền dịch bệnh gồm có khoảng cách
đến với trại lợn bị bệnh, vệ sinh sát trùng, quy mô chăn nuôi và nguồn nước sử
dụng (Nguyễn Tất Toàn và Đỗ Tiến Duy, 2013). Triệu chứng lâm sàng của bệnh
PED: 100% tiêu chảy phân lỏng, 90,33% ói mửa. Bệnh tích

8


thường gặp: 94,42% có biểu hiện dạ dày căng phồng, chứa nhiều thức ăn không
tiêu và 86,33% là thành ruột mỏng, phồng to, chứa nhiều nước và dịch chất bên
trong. Cũng trong năm này, hai tác giả tiến hành nghiên cứu xác định đặc trưng

kiểu gen của virus gây bệnh và sự tương đồng với chủng trên thế giới để dự đốn
nguồn gốc virus và định hướng cho cơng tác phòng chống bệnh. Nghiên cứu thực
hiện trên 16 chủng virus PED thu thập từ các ổ dịch tiêu chảy cấp trên lợn được
khuyếch đại bằng kỹ thuật nested RT-PCR và giải trình tự theo phương pháp điện
di mao quản. Kết quả cho thấy, các chủng PEDV ở Việt Nam có sự tương đồng gen
rất cao với các chủng phân lập từ các nước láng giềng như Trung Quốc (JS-20042) và Thái Lan (07np01, Ku01cb08) với sự khác biệt rất nhỏ, lần lượt là 0,56 –
2,86%, 0,00 – 1,71%. Từ đó có thể thấy rõ nguy cơ lây lan dịch bệnh do vận
chuyển, mua bán động vật và sản phẩm động vật chưa qua kiểm dịch. Ngoài ra, sự
di chuyển của con người cũng góp phần quan trọng trong lây lan dịch bệnh giữa
vùng này sang vùng khác, quốc gia này qua quốc gia khác. Các chủng virus PED ở
Việt Nam bắt đầu hình thành sự đa dạng (đột biến điểm) ở các địa phương khác
nhau: Bình Dương, Đồng Nai và thành phố Hồ Chí Minh.
Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ và bệnh lý của bệnh tiêu chảy thành dịch
trên lợn ở một số tỉnh phía Bắc (Hưng Yên, Hải Dương, Bắc Giang, Bắc Ninh và
Hà Nội) (Nguyễn Văn Điệp, 2014), khảo sát ở 31 trại lợn có biểu hiện tiêu chảy ở
mọi lứa tuổi, điều trị bằng kháng sinh không hiệu quả, tỷ lệ chết tập trung ở lợn
con theo mẹ. Sử dụng phương pháp RT-PCR để chẩn đoán virus PED, TGE và
Rota. Kết quả nghiên cứu cho thấy có tới 83,9% dương tính với virus PED. Tỷ lệ
bệnh PED cao nhất ở lợn con theo mẹ (96%), lợn con sau cai sữa (86,2%) và thấp
nhất ở lợn đực giống. Tỷ lệ chết cao nhất ở lợn con theo mẹ (68,6%). Về bệnh lý:
phân có màu vàng, vàng xanh, hoặc phân màu xám, xám đen. Bệnh tích đại thể
chủ yếu quan sát thấy ở dạ dày (19,4%), ruột non (61,3%), ruột già (32,2%), hạch
bạch huyết (38,7%) và ở một số cơ quan nội tạng khác. Kết quả nghiên cứu bệnh
tích vi thể cũng thể hiện sự thay đổi ở các cơ quan nội tạng trên.
Nguyễn Thị Lan và cs. (2014) nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật RT-PCR chẩn
đoán bệnh tiêu chảy do virus PED gây ra cho lợn con theo mẹ tại huyện Văn Lâm,
tỉnh Hưng Yên. Nghiên cứu này đã được tiến hành trên đàn lợn con theo mẹ dưới
10 ngày tuổi. Những lợn con bị mắc PED thường có biểu hiện chán ăn, bỏ ăn, tiêu
chảy, phân nhiều nước, màu vàng, có sữa khơng tiêu, ruột non căng phồng, thành
ruột bị bào mỏng, chứa dịch màu vàng, hạch màng treo ruột sưng

9


to. Kết quả xét nghiệm bằng kỹ thuật RT-PCR đã cho thấy tất cả những con lợn có
các biểu hiện triệu chứng lâm sàng, bệnh tích như trên đều mắc PED. Mẫu bệnh
phẩm được lấy từ phân, ruột và hạch ruột có thể dùng để chẩn đốn PED bằng kỹ
thuật RT-PCR cho kết quả tốt .
Năm 2015, Lê Văn Phan và cộng sự đã nghiên cứu một số đặc tính sinh học
phân tử của virus gây bệnh tiêu chảy cấp ở lợn tại một số tỉnh như: Thái Nguyên,
Quảng Trị, Thái Bình từ năm 2013- 2014. Kết quả nghiên cứu cho thấy, trong tổng
số 148 mẫu bệnh phẩm (phân, ruột) của lợn nghi mắc PEDV được chẩn đoán bằng
kỹ thuật RT – PCR có 57/148 (38,51%) dương tính với virus PED. Đồng thời khi
tiến hành giải mã phân tích đoạn gen S của các chủng virus thấy tương đồng về
(nt) và aa rất cao khi so sánh với các chủng virus PED tham chiếu khác trước đây
của Việt Nam, tỷ lệ tương đồng nt từ 94,8 - 98,6% và aa từ 93,5 - 98,8%. Trong đó
các chủng virus PED thu thập được ở 2 tỉnh Thái Bình và Thái Nguyên trong năm
2013 và 2014 có mối quan hệ gần gũi với các chủng virus PED phân lập được ở
Việt Nam trước đây và nằm trong cùng 1 nhánh, trong khi các chủng virus PED
thu thập được ở Quảng Trị trong năm 2014 nằm cùng nhánh với các chủng virus
PED mới được phân lập tại Trung Quốc trong năm 2011 - 2012 và đặc biệt là các
chủng virus được phân lập tại Mỹ và Hàn Quốc trong các đợt dịch PED nổ ra vào
năm 2013 và 2014. Do đó, dịch PED lưu hành tại miền Bắc và bắc Trung bộ có thể
tồn tại ít nhất 2 biến chủng thuộc nhóm phụ G1-1 (Lê Văn Phan và cs., 2015).
2.2.2. Nghiên cứu nước ngoài
Năm 1971, một nghiên cứu đã chỉ ra rằng bệnh tiêu chảy cấp xảy ra trên lợn
trong giai đoạn tăng trưởng và vỗ béo gây tổn thất cho nhiều trang trại chăn nuôi
vào Theo Oldham (1972), một bệnh mới gây tiêu chảy cấp trên lợn trong giai đoạn
tăng trưởng và vỗ béo vào năm 1971, dịch bệnh bùng phát rải rác suốt mùa đông ở
Anh, làm tổn thất đến nhiều trang trại chăn nuôi lợn. Các biểu hiện lâm sàng ở lợn

bệnh giống hệt như bị nhiễm virus gây viêm dạ dày-ruột truyền nhiễm (TGEV),
ngoại trừ một khác biệt quan trọng, đó là lợn con đang bú mẹ khơng mắc bệnh.
TGEV và các tác nhân gây bệnh đường tiêu hóa khác đã được xác định không phải
là nguyên nhân gây ra bệnh trên. Bệnh sau đó đã lan sang các nước Châu Âu và
được gọi là bệnh “tiêu chảy thành dịch do virus” (Epidemic viral diarrhea-EVD).
Năm 1976, bệnh tiêu chảy cấp tính giống với bệnh TGE lại xuất hiện, nhưng xảy
ra trên lợn ở tất cả các lứa tuổi, bao gồm cả lợn con đang

10


trong giai đoạn bú sữa mẹ (Wood, 1977), tuy nhiên khả năng TGEV và các tác
nhân gây bệnh đường tiêu hóa đã biết là nguyên nhân gây bệnh đã được loại trừ.
Lúc này, tên EVD loại 2 được đưa ra để phân biệt bệnh gây tiêu chảy ở thời điểm
này với EVD loại 1 là bệnh bùng phát năm 1971, sự khác nhau nằm ở chỗ lợn con
đang bú mẹ mắc bệnh EVD loại 2 mà không mắc EVD loại 1.
Năm 1978, Coronavirus đã được chứng minh là nguyên nhân gây ra các đợt
bùng phát EVD loại 2 (Chasey, 1978). Kết quả gây bệnh thực nghiệm cho lợn bằng
một chủng virus phân lập được (CV777) cho thấy bệnh tích đường tiêu hóa biểu
hiện điển hình trên cả lợn con và lợn vỗ béo (Debouck, 1980). Loại Coronavirus
đã được chứng minh chịu trách nhiệm cho sự bùng phát EVD loại 1 và loại 2, từ
đó tên bệnh đã được đổi thành “tiêu chảy thành dịch trên lợn” viết tắt theo tên
tiếng Anh là PED (Pensaert, 1981).
Nghiên cứu về sinh bệnh học PED, khi gây nhiễm trên lợn con 2-3 ngày tuổi
không được bú sữa đầu, bằng virus PED chủng CV777 qua đường uống. Sau 2236 giờ gây nhiễm lợn có biểu hiện tiêu chảy và có thể chết trong vịng 12 – 120
giờ. Các tế bào biểu mô hấp thu ở lông nhung ruột nhiễm virus bị phá hủy quan sát
rõ nhất sau 24-36 giờ gây nhiễm, tuy nhiên không quan sát thấy có sự phá hủy tế
bào biểu mơ ở kết tràng. Vị trí và sự nhân lên của virus được xác định thông qua
kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang và kính hiển vi điện tử. Virus PED nhân lên trong
bào tương của các tế bào lông nhung ruột, phá hủy các tế bào biểu mô và làm ngắn

lông nhung. Tác giả cũng cho rằng, đặc điểm sinh bệnh của PEDV ở ruột non của
lợn con rất giống với TGEV. Nhưng so với TGEV, sự nhân lên và lây lan trong
ruột non của PEDV diễn ra chậm hơn và thời gian nung bệnh lâu hơn (Ducatelle,
1982).
Nhiều nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng để phân lêp thành công PEDV thì
mơi trường phân lêp cần thiết phải có trypsin (Hofmann and Wyler, 1988,
Kusanagi et al., 1992, Chen Q, 2014).
Bằng phản ứng ELISA ức chế kháng thể đơn dòng và phản ứng miễn dịch
huỳnh quang gián tiếp (IFT) để phát hiện kháng thể kháng PEDV trong huyết
thanh lợn con được gây nhiễm thực nghiệm với chủng CV777 và lợn con phát
bệnh PED tự nhiên. Kết quả cho thấy, hai phương pháp này đều phát hiện được sự
có mặt của kháng thể kháng PEDV ở ngày thứ 7 và từ ngày 10 đến ngày 13 sau khi
gây nhiễm. Phương pháp ELISA ức chế phát hiện đáp ứng kháng thể sớm hơn
phương pháp miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (Carvajal et al., 1995).

11


Khảo sát trên ổ dịch tiêu chảy cấp-PED xảy ra trên đàn lợn con ở Nhật Bản,
Sueyoshie et al. (1995) nhận thấy biểu hiện đặc trưng của bệnh là tiêu chảy lỏng,
mất nước và tử vong cao trên lợn sơ sinh. Sử dụng kỹ thuật hóa mơ miễn dịch để
quan sát bệnh tích vi thể cho thấy, lơng nhung ruột non bị teo lại, hình thành các
khơng bào trong tế bào lông nhung ruột non. Tỷ lệ chiều cao giữa lông nhung với
tuyến ruột giảm rõ, biến động từ 1:1 tới 3:1. Với kỹ thuật Streptavidin-biotin
(SAB), phát hiện số lượng lớn Coronavirus có trong tế bào chất của tế bào ruột và
trong vi lông nhung của ruột non. Những tế bào nhiễm chủ yếu ở tế bào biểu mô
nhung mao của khơng tràng và hồi tràng, virus hiện diện ít hơn ở ruột già và các
biểu mô tuyến ruột. Tác giả cũng cho rằng, kỹ thuật SAB là hữu ích trong việc
chẩn đoán bệnh PED.
Sức đề kháng tự nhiên của lợn đối với virus PED được Shibata et al. (2000)

khảo sát trên lợn ở 5 độ tuổi: 1 tuần, 2 tuần, 4 tuần, 8 tuần và 12 tuần tuổi, tất cả
được gây nhiễm với virus PED qua đường uống. Virus PED đã được phân lập từ
ruột non của những lợn con bị nhiễm bệnh và được nuôi cấy trên môi trường tế
bào Vero, tế bào bàng quang và tế bào thận của lợn. Kết quả cho thấy sức đề kháng
tăng dần theo tuổi và lợn chỉ bị chết khi trong giai đoạn 2-7 ngày tuổi. Năm 2001,
Shibata nghiên cứu khả năng miễn dịch của sữa đầu. Sử dụng sữa đầu của bị cái
đã được tiêm chủng và khơng tiêm chủng trên lợn con 2-3 ngày tuổi, gây nhiễm
với virus PED chủng Z94P5. Cho thấy những lợn con được uống sữa đầu có miễn
dịch có tỷ lệ sống sót cao thậm chí 100% ở hiệu giá kháng thể 1:512, ngược lại là
0% đối với những lợn con được uống sữa đầu khơng có miễn dịch. Mổ khám bệnh
tích cũng cho thấy kết quả bệnh trầm trọng hơn ở những lợn con uống sữa đầu
khơng có miễn dịch: teo lơng nhung ruột, virus PED hiện diện
ở không tràng và hồi tràng sau 24 giờ gây nhiễm. Kết quả cho thấy sữa đầu có

miễn dịch bảo vệ lợn con chống lại virus PED lúc mới sinh (Shibata et al., 2000)
Khi sử dụng kỹ thuật (phản ứng RT-PCR, hóa mơ miễn dịch và lai tại chỗ) để
xác định sự có mặt của virus PED. Kết quả cho thấy bằng kỹ thuật RT-PCR xác
định sự có mặt của virus PED chính xác hơn các phương pháp khác (Kim et al.,
2001).
Jung et al. (2006) nghiên cứu tác động của virus PED lên các enyme tiêu hóa
ở ruột non trên lợn. Các lợn con được gây nhiễm virus PED và được mổ khám tại
các thời điểm 24, 36, 48, 60 và 72 giờ sau khi gây nhiễm. Kết quả cho thấy sự
nhân lên của virus PED làm hủy hoại nặng tế bào lông nhung ruột non dẫn đến làm
giảm đáng kể bề mặt biểu mô ruột và khả năng hoạt động của các

12


enzyme tiêu hóa. Lơng nhung ruột bị teo nhỏ và hoạt động của các enzyme tiêu
hóa cũng yếu đi là nguyên nhân tiêu chảy do rối loạn tiêu hóa và rối loạn hấp thu

dinh dưỡng trong sữa.
Martelli et al. (2008) nghiên cứu khảo sát dịch tiêu chảy xảy ra trên tất cả các
hạng lợn từ tháng 5/2015 đến 6/2006 ở Ý. Bằng kỹ thuật kính hiển vi điện tử, kính
hiển vi miễn dịch huỳnh quang, PCR và huyết thanh học, đã xác định nguyên nhân
gây ra dịch tiêu chảy này là PEDV. Ở chuồng nuôi lợn nái sinh sản, lợn nái và lợn
con theo mẹ có biểu hiện tiêu chảy, với tỷ lệ chết ở lợn con sơ sinh từ 34% trở lên.
Ở lợn sau cai sữa và lợn choai, tỷ lệ mắc bệnh trung bình từ 20-80%, nhưng tỷ lệ
chết khơng có hoặc có thì tỷ lệ này rất thấp. Tác giả cũng cho rằng, tùy vào quy
mô đàn và mơ hình chăn ni mà bệnh có thể kéo dài vài tuần hoặc vài tháng.
Qua nghiên cứu khảo sát trên các ổ dịch PED xảy ra trên lợn ở 8 tỉnh (24 trại)
tại Thái Lan trong khoảng thời gian từ tháng 12/2007-3/2008 cho thấy tỷ lệ chết
trên lợn sơ sinh rất cao 100% ở các ổ dịch xảy ra lần đầu tiên. Với 33 chủng virus
phân lập được có gene M và gene S tương đồng đến 99,7% và 98,6% với chủng
Trung Quốc, JS-2004-2 (Puranaveja et al., 2009).
Tháng 10/2010, dịch tiêu chảy cấp-PED đã xảy ra miền Nam Trung Quốc,
đặc trưng bệnh là tỷ lệ chết cao ở lợn sơ sinh. Dịch bệnh lây lan trên 10 tỉnh và
hơn 1.000.000 con lợn con bị chết. Đặc biệt trong ổ dịch tiêu chảy này, tất cả các
lợn con dưới 1 tuần tuổi đều bị mắc bệnh 100% và tỷ lệ chết từ 80 – 100%. Mổ
khám cho thấy bệnh tích điển hình là dạ dày căng phồng, chứa sữa bị vón cục, ruột
có xuất huyết nhẹ, thành ruột mỏng do niêm mạc ruột bị teo, dịch chứa bên trong
ruột màu vàng có bọt (Sun et al., 2012)
Ngày 29/4/2013, lần đầu tiên dịch tiêu chảy và nôn mửa xảy ra trên lợn mọi
lứa tuổi đã bùng phát tại 4 trang trại lợn giống ở bang Iowa, Mỹ. Với tỷ lệ chết cao
từ 90-95% trên lợn con sơ sinh. Trên lợn nái, 10-15% là biểu hiện biếng ăn và nôn
mửa, bằng phương pháp RT-PCR đã xác định nguyên nhân gây bệnh dịch này là
virus PED (Stevenson et al., 2013). Lợn con bị PED phân rất lỏng, màu vàng và
dính phủ lên mình lợn con. Lợn con chết do bệnh thể hiện sự mất nước rất rõ: xác
gầy, mắt trũng sâu, da không đàn hồi và dính sát vào mơ dưới da. Mổ khám bệnh
tích cho thấy dạ dày căng phồng, chứa sữa bị vón cục, ruột non và ruột già chứa
chất lỏng lợn cợn như sữa khơng tiêu hóa có màu từ trắng đến vàng, thành ruột

mỏng, trong suốt. Quan sát bệnh tích vi thể thấy các tế bào biểu

13