Sản xuất chitin chitosan từ vỏ tôm

Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm

CHƯƠNG I
MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề
Chitin là một polysaccharide đứng thứ hai về lượng trong
tự nhiên chỉ sau cellulose. Chitin và các sản phẩm của
chúng hiện nay được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lónh vực
như: y học, sản xuất mỹ phẩm, bảo quản nông sản, xử lý
môi trường. Ngoài ra khi ta khử acetylene trong hợp chất chitin
sẽ tạo thành chitosan là đơn vị cao phân tử của glucosamine,
là một chất có ứng dụng rộng rãi trong các ngành công
nghiệp nhẹ, thực phẩm, nông nghiệp. Việc nghiên cứu và
tách chiết chitin từ vỏ giáp xác đã được thực hiện hơn một
thế kỷ nay.
Hiện nay, tôm là mặt hàng chế biến chủ lực của
ngành thuỷ sản Việt Nam, chủ yếu là tôm đông lạnh. Theo
báo cáo của Bộ thuỷ sản, sản lượng tôm năm 2003 là
193973 tấn, tuỳ thuộc vào sản phẩm chế biến và sản
phẩm cuối cùng, phế liệu tôm có thể lên tới 40 – 70%
khối lượng nguyên liệu. Tương ứng với sản lượng tôm hàng
năm sẽ có khối lượng phế liệu khổng lồ gồm đầu và vỏ
tôm được tạo ra. Hiện nay, ở nước ta nguồn phế liệu đầu
và vỏ tôm chưa được tận dụng trên quy mô lớn. Tình trạng
trên đặt ra yêu cầu cấp bách cho các nhà khoa học công
nghệ, cho ngành thuỷ sản là phải sử dụng hợp lý và hiệu
quả lượng phế liệu tôm rất lớn do các nhà máy chế biến
GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương 1
SVTH: Đặng Tiến Đông

Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
thuỷ sản tạo ra hàng ngày để sản xuất ra sản phẩm có
giá trị cao, chitin – chitosan.
Tuy nhiên, quy trình sản xuất chitin được sử dụng phổ
biến hiện nay là theo phương pháp hoá học, protein trong đầu
và vỏ tôm được loại bỏ bằng cách xử lý với NaOH. Như
vậy, vừa tốn một lượng hoá chất vừa có hại cho môi
trường, hơn nữa con đường xử lý hoá học làm giảm chất
lượng sản phẩm chitosan vì phản ứng với NaOH làm giảm đi
độ nhớt của chitosan.
Một trong những hướng giải quyết vấn đề trên là sử
dụng chế phẩm enzyme thuỷ phân protein trong vỏ tôm để
sản xuất ra sản phẩm chitin có chất lượng cao và vừa giải
quyết được vấn đề môi trường. Nhiều loại enzyme protease
đã được trích ly từ tự nhiên và được ứng dụng rộng rãi như:
protease từ nội tạng tôm cá, bromelaine từ dứa, papain từ đu
đủ, protease từ vi sinh vật ..vv.
Việc sử dụng enzyme vào sản xuất công nghiệp không
những đem lại hiệu quả cao mà còn có thể làm giảm chi
phí sản xuất bằng cách tái sử dụng lại enzyme. Để có thể
tái sử dụng được enzyme ta có thể tiến hành cố định
enzyme vào một chất mang bằng phương pháp nhốt và
chitosan là một chất được xem là có nhiều triển vọng trong
việc cố định enzyme và tế bào. Vớùi mong muốn góp phần
giải quyết những yêu cầu trên, chúng tôi đã thực hiện
đề tài “sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm”
1.2. Mục đích khoá luận
Sản xuất chitin – chitosan bằng cách sử dụng enzyme
protease thu được từ nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzae

GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương 2
SVTH: Đặng Tiến Đông


Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
bằng các nguyên liệu rẻ tiền, đồng thời nghiên cứu ứng
dụng chitosan thu được làm giá thể cố định enzyme
1.3. Nội dung
Thu nhận enzyme protease từ Aspergillus oryzae.
Khảo sát quá trình kết tủa của enzyme protease.
Sử dụng enzyme protease trong sản xuất chitin – chitosan
từ vỏ tôm. Khảo sát quá trình thuỷ phân.
ng dụng chitosan làm giá thể cố định enzyme protease.

CHƯƠNG II
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Nguồn gốc và sự tồn tại của chitin – chitosan trong
tự nhiên
Chitin – chitosan là một polysaccharide tồn tại trong tự
nhiên với sản lượng rất lớn đứng thứ hai sau cellulose. Trong
tự nhiên chitin tồn tại trong cả động vật và thực vật.
Chitin – chitosan là polysaccharide có đạm không độc, có
khối lượng phân tử lớn. Cấu trúc của chitin là tập hợp các
monosaccharide (N-acetyl-β-D-glucosamine) liên kết với nhau bởi
các cầu nối glucozit và hình thành một mạng các sợi có tổ
chức. Hơn nữa chitin tồn tại rất hiếm ở trạng thái tự do và
hầu như luôn luôn nối bởi các cầu nối đẳng trị (coralente)
với các protein, CaCO3 và các hợp chất hữu cơ khác.
Về mặt lịch sử, chitin được Braconnot phát hiện đầu

tiên vào 1821, trong cặn dịch chiết từ một loại nấm. Ông
GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương 3
SVTH: Đặng Tiến Đông


Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
đặt tên cho chất này là “Fungine” để ghi nhớ nguồn gốc
của nó. Năm 1823 Odier phân lập một chất từ bọ cách
cứng mà ông gọi là chitin hay “chiton”, tiếng Hy Lạp có nghóa
là vỏ giáp, nhưng ông không phát hiện ra sự có mặt của
nitơ trong đó. Cuối cùng cả Odier và Braconnot đều đi đến
kết luận chitin có dạng công thức giống như cellulose.
2.1.1 Cấu trúc hoá học của chitin
Chitin có cấu trúc tinh thể rất chặt chẽ và đều đặn.
Bằng phương pháp nhiễu xạ tia X. người ta có thể chứng
minh được chitin tồn tại ở 3 dạng cấu hình: α, β, γ- chitin.
Các dạng này của chitin chỉ do sự sắp xếp khác nhau
về hướng của mỗi mắt xích (N-acetyl-D-glucosamin) trong
mạch.
Có thể biểu diễn mỗi mắt xích này bằng mũi tên
chỉ nhóm –CH2OH, phần đuôi chỉ nhóm –NHCOCH 3, thì các
cấu trúc α, β, γ - chitin được mô tả như sau:

α – chitin

β- chitin

γ – chitin

α – chitin có cấu trúc các mạch được sắp xếp ngược

chiều nhau đều đặn, nên ngoài liên kết hydro trong một lớp
và hệ chuỗi, nó còn có liên kết hydro giữa các lớp do
các chuỗi thuộc lớp kề nhau nên rất bền vững. Do các
mắt xích sắp xếp đảo chiều, xen kẽ thuận lợi về mặt
không gian và năng lượng. Đây cũng là dạng phổ biến
trong tự nhiên.

GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương 4
SVTH: Đặng Tiến Đông


Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
β,γ- chitin da mắt xích ghép với nhau theo kiểu song song
(β- chitin ) và hai song song một ngược chiều (γ- chitin ), giữa
các lớp không có loại liên kết hydro. Dạng β- chitin cũng có
thể chuyển sang dạng α – chitin nhờ quá trình acetyl hoá cho
cấu trúc tinh thể bền vững hơn.
Qua nhiều nghiên cứu về sự thuỷ phân chitin bằng
enzyme hay acid HCl đậm đặc thì người ta thấy rằng chitin có
cấu trúc là một polymer được tạo thành từ các đơn vị Nacetyl-β-D-glucosamine liên kết với nhau bởi liên kết β- (1-4)
glucozit.
Công thức phân tử: [C8H13O5N]n
Phân tử lượng: Mchitin = (230.09)n

Hình 1 Công thức cấu tạo của chitin
Tên gọi: poly(1-4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucose
Poly(1-4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranose
GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương 5
SVTH: Đặng Tiến Đông

Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
2.1.2 Tính chất của chitin
Chitin ở thể rắn và có độ kết tinh cao do gốc –
NHCOCH3 ở vị trí cacbon thứ hai, làm tăng liên kết hydro giữa
các mạch và trong mạch với nhau
Chitin là một polysaccharide bền trong môi trường kiềm
nhưng kém bền trong môi trường acid
Chitin có màu trắng, không tan trong nước, trong acid
loãng, trong kiềm loãng, các thuốc thử Schweitzer và các
dung môi hữu cơ như rượu, este,. .. nhưng nó hoà tan trong một
số dung dịch như hydrochloride, acid đậm đặc (acid nitrit, formic,
acid khan). Đặc biệt nó còn hoà tan trong dung dịch đặc
nóng của muối thioxianat liti (LiSCN) và muối thixianat canxi
[Ca(SCN)2] tạo thành dung dịch keo
Chitin ổn định với các chất oxy hoá khử như KMnO 4,
H2O2, NaClO hay Ca(ClO)2, ... lợi dụng tính chất này để khử màu
chitin.
Khi đun nóng trong môi trường kiềm đậm đặc, chitin bị
khử bởi gốc acetyl tạo thành chitosan
2.1.3 Cấu trúc hoá học của chitosan
Trong các dẫn xuất của chitin thì chitosan là một trong
những dẫn xuất quan trọng vì nó có hoạt tính sinh học cao và
có nhiều ứng dụng trong thực tế.
Việc sản xuất chitosan tương đối đơn giản, không cần
dung môi, hoá chất độc hại, đắt tiền. Chitosan thu được
bằng phản ứng deacetyl hoá chitin, biến đổi nhóm N-acetyl
thành nhóm amin ở vị trí C2.

GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương 6

SVTH: Đặng Tiến Đông


Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
Do quá trình khử acetyl xảy ra không hoàn toàn nên
người ta qui ước nếu độ deacetyl hoá (degree of deacetylation)
DD > 50% thì gọi là chitosan, nếu DD < 50% gọi là chitin
Chitosan có cấu trúc tuyến tính từ các đơn vị 2-amino-2deoxy-β-D-glucosamine liên kết với nhau bằng liên kết β-(1-4)
glucozit.
Công thức phân tử chitosan [C6H11O4N]n
Phân tử lượng: Mchitosan = (161.07)n

Hình 2 Công thức cấu tạo của chitosan
Tên gọi khoa học: poly(1-4)-amino-2-deoxy-β-D-glucose
Poly(1-4)-2-amino-2-deoxy-β-D-glucopyranose.
Qua cấu trúc của chitin – chitosan ta thấy chitin chỉ có
một nhóm chức hoạt động là –OH ( H ở nhóm hydroxyl bậc
1 linh động hơn H ở nhóm hydroxyl bậc 2 trong vòng 6 cạnh)
còn chitosan có 2 nhóm chức hoạt động là –OH, -NH 2, do đó
chitosan dễ dàng tham gia phản ứng hoá học hơn chitin. Trong
thực tế chitin – chitosan đan xen nhau, vì vậy tạo ra nhiều sản
phẩm đồng thời, việc tách và phân tích chúng rất phức
tạp.
2.1.4 Tính chất của chitosan
GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương 7
SVTH: Đặng Tiến Đông


Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
Trọng lượng phân tử chitosan tuỳ thuộc vào điều kiện

sản xuất, thường nằm trong khoảng 10.000 – 1.000.000 Da với
mức độ deacetyl hoá thường là 70 – 90%
Chitosan ở thể rắn, màu trắng ngà, không mùi, không
vị, không tan trong nước, kiềm, aicd đậm đặc nhưng tan trong
acid loăng, tan tốt trong dung dịch acid acetic loãng (0.5 – 1.5%)
tạo thành dung dịch keo, trong suốt. Lợi dụng tính chất này
của chitosan để thực hiện cố định enzyme bằng phương pháp
nhốt
Chitosan là một polyamine, nó được xem như là một
polymer cationic có khả năng cho các ion kim loại nặng bám
dính vào các bề mặt tích điện âm tạo ra phức chất với kim
loại và tủa xuống, loại các ion kim loại nặng ra khỏi dung
dịch
Chitosan có tác dụng kháng khuẩn khá tốt, nhất là
trên các khuẩn gây bệnh như E.coli, Staphylococcus aureus,
Pseudomonas aeruginosa và tác dụng diệt nấm nhất là nấm
Candida albicans
Chitosan có nhiệt độ nóng chảy là 309 – 311 0C
Chitosan có cấu trúc siêu lỗ, dễ tạo màng, tạo hạt,
khả năng hấp phụ tốt, có tính chất cơ lý bền vững, ổn
định, thường được dùng cố định enzyme qua cầu nối
glutaradehyde.
Chitosan phản ứng với các acid đậm đặc tạo thành
muối khó tan, tác dụng với iod và acid sulfuric thành phản
ứng màu tím, có thể dùng trong phân tích định tính chitosan
Ngoài các tính năng trên của chitosan, nó còn được
xem là nguồn nguyên liệu vô cùng quý giá để cho ra các
GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương 8
SVTH: Đặng Tiến Ñoâng

Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
dẫn xuất chitosan rất hấp dẫn trong các lónh vực thực
phẩm, dược phẩm, sinh học và bảo vệ môi trường
2.1.5 Nguồn thu nhận chitin
Chitin có mặt ở khắp nơi trong tự nhiên trong đông vật,
thực vật và cả vi sinh vật
Trong động vật chitin là một thành phần quan trọng của
các vỏ một số động vật không xương sống như: cồn trùng,
nhuyễn thể, giáp xác và giun tròn. Trong động vật bậc cao
monome của chitin là một thành phần chủ yếu trong mô da
nó giúp cho sự tái tạo và gắn liền các vết thương ở da.
Trong

thực

vật

chitin

có

ở

thành

tế

bào

nấm

họ

zygenmyctes, và các sinh khối nấm mốc, một số loài
tảo .. .
Tuy nhiên trên thực tế vỏ tôm cua lại chiếm thành
phần chitin khá cao(14-35%). Với giá thành rẽ nên hầu hết
các cơ sở sản xuất chitin – chitosan đều từ vỏ tôm. Vì lý do
giảm thiểu ô nhiễm môi trường (sản xuất chitin – chitosan
chủ yếu bằng phương pháp hoá học). Nâng cao chất lượng
sản phẩm, tận thu các phế phẩm có giá trị (vỏ tôm từ
nhà máy).. vv góp phần giải quyết ô nhiễm mà còn đem
lại hiệu quả kinh tế cao.
Bảng 2.1: bảng biểu diễn thành phần hoá học
trong đầu tôm
Thành

m

Đạm

Protein

phần

độ

toàn

thô

73.22

phần
1.86

11.64

Hàm

Lipide

Calci

Phosphor

2.01

2.19

0.37

lượng
2.2 Phương pháp sản xuất chitin – chitosan
GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương 9
SVTH: Đặng Tiến Đông


Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm

Hiện nay sản xuất chitin – chitosan chủ yếu bằng phương
pháp hoá học và phải qua các quá trình sau:
a) Quá trình khử khoáng
Trong vỏ tôm thành phần chủ yếu là muối CaCO 3,
MgCO3 và rất ít Ca3(PO4)2. nên người ta thường dùng các loại
acid như HCL, H2SO4 .. để khử khoáng. Khi khử khoáng, nếu
dùng HCl thì cho hiệu quả cao hơn. Nếu dùng H 2SO4 sẽ tạo
muối khó tan nên ít sử dụng. Phản ứng của HCl để khử
khoáng như sau:
MgCO3 + 2HCl = MgCl2 + CO2 + H2O.
CaCO3 + 2HCl = CaCl2 + CO2 + H2O
Ca3(PO4)2 + 6HCl = 3CaCl2 + 2H3PO4
Trong quá trình rửa thì muối Cl- tạo thành được rửa trôi,
nồng độ acid HCl có ảnh hưởng lớn đến chất lượng của
chitosan thành phẩm, đồng thời có ảnh hưởng lớn đến
thời gian và hiệu quả khử khoáng. Nến nồng độ HCl cao
sẽ rút ngắn được thời gian khử khoáng nhưng sẽ làm cắt
mạch do có hiện tượng thuỷ phân các liên kết β- (1-4)
glucozit để tạo ra các polymer có trọng lượng phân tử trung
bình thấp, có khi bị thuỷ phân triệt để đến glucosamin.
Ngược lại nếu nồng độ HCl quá thấp thì quá trình khử
khoáng sẽ không triệt để và thời gian xử lý kéo dài ảnh
hưởng đến chất lượng sản phẩm.
Sau khi khử khoáng tiến hành rửa trung tính, công đoạn
này có tác dụng rửa trôi hết các muối, acid dư tan trong
nước. Quá trình rửa kết thúc khi dịch rửa cho pH = 7.
b) Quá trình loại protein

GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương 10
SVTH: Đặng Tiến Ñoâng

Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
Sau khi có vỏ tôm đã loại khoáng. Ta tiến hành loại bỏ
hoàn toàn protein bằng dung dịch NaOH 3%, protein bị kiềm
thuỷ phân thành các amin tự do tan và được loại ra theo quy
trình rửa trôi. Lượng NaOH 3% cho vào đến khi ngập toàn bộ
vỏ tôm và kiểm tra pH = 11 -12 là được để đảm bảo việc
loại bỏ protein được hoàn toàn. Đun ở nhiệt độ 90 -95 0C trong
3.5- 4 giờ (trong quá trình nung lưu ý vấn đề trào dung môi
do tạo bột nhiều và mùi bay ra khó chịu) sản phẩm sau khi
nung được rửa sạch bằng nước thường hoặc nước cất đến
pH = 7.
Tiếp đó chúng tôi tiến hành rửa trung tính, nhằm mục
đích rửa trôi hết các, muối natri, các amin tự do và NaOH dư.
Sấy khô ở 600C thu được chitin thô.
c) Quá trình tẩy màu (loại bỏ astaxanthin)
chitin thô có màu hồng nhạt do còn sắc tố astaxanthin.
Do chitin ổn định với các chất oxy hoá như thuốc tím (KMnO 4)
oxy già (H2O2) nước javen (NaOCl + NaCl), Na2S2O3, CH3COCH3 .. ..
lợi dụng tính chất này ta sử dụng KMnO 4 và H2O2 để khử
màu cho chitin.
d) Điều chế chitosan
quá trình điều chế chitin thành chitosan thực chất là
quá trình deacety hoá chitin, chuyển hoá nhóm –NHCOCH 3
thành nhóm NH2 và loại bỏ nhóm –CH 3CO, chuyển hoá
thành muối natri (CH3COONa. Để thực hiện được quá trình
deacetyl hoá hoàn toàn, người ta sử dụng NaOH đậm đặc
50% thời gian 4 giờ nhiệt độ ở 110 – 120C . ở đây dựa vào
tính chất chitosan tan được trong dung dịch acid loãng tạo thành

dung dịch keo trong suốt, trong khi chitin không tan do đó ta có
GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương 11
SVTH: Đặng Tiến Đông


Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
thể sơ bộ kiểm tra mức độ chuyển hoá chitin thành chitosan
bằng cách lấy một ít sản phẩm cho vào CH 3COOH 1%. Nếu
sản phẩm tan tạo thành dung dịch keo trong suốt là được. Sau
đó rửa trung tính và sấy khô, chitosan thu được có màu
trắng sáng. Quá trình điều chế chitosan tử chitin cho hiệu
suất tương đối cao (60 -75%)
2.3 Ứng dụng của chitin – chitosan
a) Trong công nghiệp thực phẩm
Chitosan dùng để bảo quản hoa quả và rau tươi, bảo
quản thực phẩm tươi sống.
Làm màng mỏng để bao gói bánh kẹo.
Chitosan và muối của nó được dùng như chất tinh luyện
nước ép từ trái cây như nước táo, cà rốt, chất này làm
thay thế các chất cũ như silicasol, gelatin, ...
b) Trong mỹ phẩm
Chitosan dùng làm chất phụ gia, làm kem bôi mặt,
thuốc làm mềm da, làm tăng khả năng hoà hợp sinh học
giữa kem thuốc và da, cấu tạo thuốc định hình tóc, kem bôi
da lột mặt, ...
c) Trong y tế
Chitosan dùng làm chất phụ gia rất tốt cho kỹ nghệ
bào chế dược phẩm (keo kết dính viên, tá dược độn, chất
tạo nang mềm, ...)
Chitosan là chất mang polymer sinh học để gắn thuốc

bằng liên kết cơ học hay hoá học nhằm tạo ra thuốc polymer
có nhiều tác dụng mới. Chitosan được coi là một hệ thống
vận tải thuốc khá lý tưởng.

GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương 12
SVTH: Đặng Tiến Ñoâng


Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
Bản thân chitosan và các dẫn xuất của nó được dùng
làm thuốc chữa bệnh: thuốc hạ cholesterol trong máu, thuốc
chữa trị các vết thương, vết bỏng. Thuốc chữa đau dạ dày,
thuốc chống đông tụ máu, thuốc dùng tăng cường miễn
dịch cơ thể và khả năng chống nhiễm HIV, ...
d) Ngành y
Chitosan là vật liệu cho y khoa rất tốt như: da nhân tạo,
mô ghép, chỉ khâu phẫu thuật tự tiêu, kem chữa bỏng,
thuốc chữa lành nướu sau khi nhổ răng, ..
e) Trong nông nghiệp
Chitosan được dùng như là một thành phần chính trong
thuốc phòng trừ nấm (đạo ôn, khô vằn, ..), dùng làm
thuốc kích thích sinh trưởng cho cây lúa, cây công nghiệp,
cây cảnh, cây ăn quả, ..
f) Trong công nghệ hoá học
Chitosan được dùng để xử lý nước thải công nghiệp,
có khả năng tạo phưc với các kim loại nặng độc hại, dùng
để lọc nước sạch tiêu dùng
g) Trong công nghệ sinh học
Chitosan được dùng làm chất nang để cố định enzyme
và các tế bào

2.4 Tình hình nghiên cứu sản xuất và ứng dụng trong
thực tế của chitin và chitosan ở việt nam và thế giới
Trước đây người ta đã thử tách chiết chitin từ thực vật
biển nhưng nguồn nguyên liệu không đủ để đáp ứng nhu
cầu sản xuất. Trữ lượng chitin phần lớn có nguồn gốc từ
vỏ tôm cua. Trong một thời gian các chất phế thải này
không được thu hồi mà lại thải ra ngoài gây ô nhiễm môi
GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương 13
SVTH: Đặng Tiến Đông


Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
trường. Năm 1977 Viện kỹ thuật Masachusetts (Mỹ), khi tiến
hành xác định giá trị của chitin và protein trong vỏ tôm, cua
đã cho thấy việc thu hồi các chất này có lợi nếu sử dụng
trong công nghiệp. Phần protein thu được sẽ dùng để chế
biến thức ăn gia súc, còn lại chitin sẽ được dùng làm như
một chất khởi đầu để điều chế các dẫn xuất có nhiều
ứng dụng trong lónh vực công nghiệp
Việc nghiên cứu chitin – chitosan và các ứng dụng của
chúng trong sản xuất phục phụ đời sống là một hướng
nghiên cứu tương đối mới mẻ ở nước ta. Vào những năm
1978 đến 1980 trường Đại học thủy sản nha trang đã công
bố quy trình sản xuất chitin – chitosan của kỹ sư Đỗ Minh
Phụng, như chưa có ứng dụng cụ thể trong sản xuất. Gần
đây trước yêu cầu xử lý phế liệu thuỷ sản đông lạnh
đang ngày càng cấp bách, trước những thông tin kỹ thuật
mới về chitin – chitosan cũng như tiềm năng thị trường của
chúng đã thúc đẩy các nhà khoa học của chúng ta bắt tay
vào nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất chitin –

chitosan ở bước cao hơn, đồng thời nghiên cứu các ứng
dụng của chúng trong các lónh vực sản xuất công nghiệp.
Hiện nay ở Việt Nam có nhiều cơ sở khoa học đang
nghiên cứu sản xuất chitin – chitosan như: Trường Đại Học
Nông Lâm – TPHCM. Trung tâm nghiên cứu polymer – Viện
Khoa Học Việt Nam, Viện Hoá thuộc phân Viện Khoa Học Việt
Nam tại TPHCM, Trung tâm công nghệ và sinh học Thuỷ sản Viện nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản 2.
miền Bắc, Viện Khoa Học Việt Nam đã kết hợp với xí
nghiệp thuỷ sản Hà Nội sản xuất chitosan và ứng dụng
GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương 14
SVTH: Đặng Tiến Ñoâng


Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
trong lónh vực nông nghiệp ở đồng lúa Thái Bình và đã thu
được một số kết quả đáng kích lệ.
miền Nam Trung tâm công nghệ và sinh học thuỷ
sản phối hợp với một số cơ quan khác: Đại Học Y Dược
TPHCM, phân Viện Khoa Học Việt Nam. Viện Khoa Học nông
nghiệp miền nam, .. . đang nghiên cứu sản xuất và ứng
dụng chitin – chitosan trong lónh vực nông nghiệp, y dược và
mỹ phẩm.
Trong nông nghiệp chitosan được sử dụng để bảo vệ
các hạt giống nhằm mục đích ngăn ngừa sự tấn công của
nấm trong đất, đồng thời nó còn có tác dụng cố định
phân bón, thuốc trừ sâu, tăng cương khả năng nảy mầm
của hạt
Qua nghiên cứu ảnh hưởng của chitosan và các
nguyên tố vi lượng lên một số chỉ tiêu sinh hoá của mạ
lúa ở nhiệt độ thấp thì kết quả nghiên cứu cho thấy

chitosan vi lượng làm tăng diệp lục và hàm lượng nitơ; đồng
thời hàm lượng các enzyme amylase, catalase hay peroxidaza
cũng tăng lên.
Ngày nay chitosan còn được dùng làm nguyên liệu bổ
sung vào thức ăn cho tôm, cá, cua để kích thích sinh trưởng.
Những ứng dụng của chitin – chitosan và những dẫn
xuất của chúng ngày càng phát triển. Một số đã được
ứng dụng như là: chỉ khâu tự huỷ, da nhân tạo, thấu kính
chiết xuất, và một số ứng dụng khác đang được nghiên
cứu như : tác động kích thích miễn dịch, chống sự phát triển
của khối u, đặc tính làm giảm cholesterol máu, trị bỏng
nhiệt .. ..
GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương 15
SVTH: Đặng Tiến Đông


Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
Da nhân tạo có nguồn gốc từ chitin, nó giống như một
tấm vải và được bọc ốp lên vết thương chỉ một lần đến
khi khỏi. Da nhân tạo bị phân huỷ sinh học từ từ cho đến
lúc hình thành lớp biểu bì mới. Nó có tác dụng giảm đau,
giúp cho các vết sẹo bỏng phục hồi biểu bì nhanh chóng.
Trường Đại Học Dược Hà Nội, Đại Học Y Dược Hà Nội, Trung
tâm khoa học tự nhiên và công nghệ quốc gia cũng đã chế
tạo thành công loại da nhân tạo này và bước đầu ứng
dụng hiệu quả.
Chitin – chitossan và các oligo của nó có đặc tính miễn
dịch do nó kích thích các tế bào giữ nhiệm vụ bảo vệ miễn
dịch với các tế bào khối u và các tác nhân gây bệnh.
Những nghiên cứu gần đây hướng vào các oligo, Nacetyl-glucosamin và glucosamin, các chất này có một số

tính chất của các polymer tương ứng nhưng lại có ưu thế là
tan tốt trong nước do đó dễ dàng được hấp thụ.
Hiện nay trên thế giới đã thành công việc sử dụng
chitosan làm chất mang để cố định enzyme và tế bào.
Enzyme cố định đã cho phép mở ra việc sử dụng rộng rãi
enzyme trong công nghiệp, y học và khoa học phân tích.
Enzyme cố định được sử dụng lâu dài, không cầc thay đổi
chất xúc tác. Nhất là trong công nghệ làm sạch nước, làm
trong nươc hoa quả, sử dụng enzyme cố định rất thuận lợi và
đạt hiệu quả cao. Chitosan thoả mãn yêu cầu đối với chất
mang có phân tử lượng lớn, bền vững không tan và ổn
định với các yếu tô hoá học.
Do có cấu trúc tương tự như cellulose nên chitosan được
nghiên cứu bổ sung vào nguyên liệu sẩn xuất giấy cũng
GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương 16
SVTH: Đặng Tiến Ñoâng


Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
tốt hơn. Trong sản xuất giấy qua nghiên cứu người ta thấy
nếu bổ sung 1% chitosan thì độ bền của giấy tăng lên khi bị
ướt hay tăng độ nét khi in.
Có thể thay hồ tinh bột bằng chitosan để hồ vải, nó
có tác dụng làm tơ sợi bền, mịn, bóng đẹp, cố định hình in,
chịu được acid hay kiềm nhẹ.
Chitosan được sử dụng để sản xuất kem chống khô da
do tính chất của chitosan là có thể cố định dễ dàng trên
biểu bì của da nhờ các nhóm –NH 4+ . các nhóm này liên
kết với các tế bào sừng hoá của da, nhà vậy các nhà
khoa học đã nghiên cứu sử dụng chitosan làm các loại kem

dưỡng da chống nắng.
Nhờ khả năng làm đông tụ các thể rắn lơ lửng giàu
protein và nhờ khả năng dính tốt các ion kim loại như Pb, Hg ..
. do đó chitin được sử dụng để tẩy lọc nguồn nước thải
công nghiệp từ các nhà máy chế biến thực phẩm.
Chitosan sử dụng để chống hiện tượng mất nước trong
quá trình làm lạnh, làm đông thực phẩm.
Do chitosan có tính chất diệt khuẩn, do đó nó được tạo
thành màng mỏng để bao gói thực phẩm chống ẩm mốc,
chống mất nước.
Đặc tính diệt khuẩn của chitosan được thể hiện trên
các mặt sau:
Khi tiếp xúc với thực phẩm chitin – chitosan sẽ lấy đi từ
các vi sinh vật này các ion thiết yếu, ví dụ như ion Cu 2+. Như
vậy vi sinh vật sẽ bị chết do sự mất cân bằng liên quan
đến các ion thiết yếu.
Ngăn chặn phá hoại chức năng màng tế bào.
GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương 17
SVTH: Đặng Tiến Đông


Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
Gây ra sự rò rỉ các phần bên trong tế bào.
Như vậy việc dùng chất chitosan bao bọc quanh bề mặt
thực phẩm có thể kéo dài thời gian bảo quản, giảm sự hư
hỏng do khả năng kháng nấm, kháng khuẩn của nó.
2.5 Một số quy trình sản xuất chitin và chitosan trên
thế giới và ở việt nam
Trên Thế Giới
a) Quy trình thuỷ nhiệt Yamasaki và Nacamichi (nhật

bản)
Nguyên liệu là vỏ cua đã khô, sạch được đem khử
khoáng bằng HCl 2N trong thời gian là 1 giờ (tác giả cho
rằng hiệu quả khử khoáng có thể đạt được 100%).
Sau đó đem rửa sạch và đem làm khô. Tiếp theo là
tiến hành kết hợp hai công đoạn khử protein và deacetyl
đồng thời trong dung dịch NaOH 15N ở nhiệt độ 150 0C trong 1
giờ, kết quả cho thấy protein được tách ra triệt để và độ
deacetyl đạt trên 70%. Sau thời gian 1 giờ đem rửa sạch và
làm khô sẽ thu được chitosan thành phẩm.
Phương pháp này có ưu điểm là quy trình đơn giản công
đoạn, rút ngắn đáng kể thời gian sản xuất so với các quy
trình khác. Hoá chất sử dụng ít (HCl và NaOH), chitosan thu
được có độ tinh thiết cao. Tuy nhiên cũng có nhược điểm là
sản phẩm chitosan thu được có độ nhớt thấp, tiêu tốn
nhiều năng lượng cho các khâu sản xuất.
b) Quy trình sản xuất chitin của Hackman
Vỏ tôm hùm được rửa sạch và sấy khô ở nhiệt độ
1000C tiếp theo được khử khoáng bằng HCl 2N với tỷ lệ w/v =

GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương 18
SVTH: Đặng Tiến Đông


Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
1/10 ở nhiệt độ phòng, sau thời gian 5 giờ đem rửa trung tính
và sấy khô ở 1000C và đem xay nhỏ.
Ngâm tiếp trong dung dịch HCl 2N với tỷ lệ w/v=1/2.5 ở
nhiệt độ phòng. Sau 48 giờ đem ly tâm thu phần bã và đem
rửa trung tính. Ngâm bã bột đã rửa trong dung dịch NaOH 1N

với tỷ lệ w/v=1/2.5 ở nhiệt độ 100 0C, sau 42 giờ đem ly tâm
thu phần bã. Sau đó lại tiếp tục ngâm trong NaOH 1N với tỷ
lệ và nhiệt độ trên, sau 12 giờ đem ly tâm thu phần bã.
Tiếp theo đó rửa trung tính và đem làm sạch bằng cách ly
tâm với các chất theo thứ tự: nước, etanol và ete. Sau đó
làm khô ta được sản phẩm dạng bột màu kem.
Với quy trình này thì có nhiều công đoạn tăng khả
năng khử khoáng, khử protein song do cồng kềnh, chỉ thích
hợp cho đối tượng là vỏ tôm hùm, tôm mũ ni và vỏ cua,
thời gian thực các công đoạn kéo dài, do đó quy trình
Hackman chỉ mang tính nghiên cứu thí nghiệm, không có tính
khả thi nếu sản xuất đại trà, quy trình mới chỉ dừng lại
đến sản phẩm là chitin.
c) Quy trình sản xuất chitosan của pháp
Nguyên liệu vỏ tôm sạch được đem đi hấp chín, phơi
khô, ta đem đi xay nhỏ. Khử protein bằng NaOH 3.5% với tỷ
lệ w/v=1/10, ở nhiệt độ 650C. sau 2 giờ vớt ra rửa trung tính,
tiếp đó ngâm trong HCl 1N với tỷ lệ w/v=1/10, ở nhiệt độ
phòng sau 2 giờ vớt ra tiến hành tẩy các chất màu hữu cơ
bằng aceton với tỷ lệ w/v=1/5, ở nhiệt độ phòng sau 30
phút vớt ra rửa sạch và tẩy màu lại bằng nước javen
(NaOCl + NaCl) 0.135%, tỷ lệ w/v=1/10, ở nhiệt độ phòng sau
6 phút với ra rửa trung tính, thu được chitin sạch. Sau đó tiến
GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương 19
SVTH: Đặng Tiến Đông


Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
hành deacetyl chitin bằng NaOH 40% với tỷ lệ w/v=1/4, ở
nhiệt độ 850C sau thời gian 4 giờ đem rửa trung tính thu được

chitosan.
Quy trình có ưu điểm là thời gian sản xuất ngắn, sản
phẩm có màu sắc đẹp, sạch do có hai bước khử sắc tố.
Tuy nhiên NaOCl là một chất oxy hoá mạnh, ảnh hưởng đến
mạch polymer, do đó độ nhớt sản phẩm giảm rõ rệt. Mặt
khác aceton có giá trị đắt tiền, tổn thất nhiều, giá thành
sản phẩm sẽ cao. Chưa kể các yếu tố trong an toàn sản
xuất, công nghệ này khó áp dụng trong điều kiện sản
xuất ở nước ta hiện nay.
d) Phương pháp điều chế chitin của Capozza
Cân 149g nguyên liêu vỏ tôm sạch cho vào bình khuấy
với một máy khuấy, thêm từ từ 825ml acid HCl 2N vào bình,
thực hiện phản ứng ở 40C trong thời gian 48 giờ. Sản phẩm
sau quá trình khử khoáng được rửa sạch bằng nước đến pH
= 7. xác định hàm lượng tro 0.4 -0.5%. sau đó sản phẩm được
khuấy ở nhiệt độ phòng với 1500ml acid fomic HCOOH 90%.
Để qua đêm. Hỗn hợp được lọc ly tâm lấy phần bã và rửa
lại với nước nhiều lần cho đến khi pH = 7. sản phẩm sạch
sau đó được ngâm được tráng rửa lại trong ethanol 96 0 và
ether, sấy khô ở 400C dưới áp suất giảm. Khối lượng chitin
thô sạch thu được là 66g hiệu suất 44,3%
Tại Việt Nam
a) Quy trình sản xuất chitosan của Đỗ Minh Phụng
Nguyên liệu là vỏ tôm khô được khử khoáng bằng
HCl 6N với tỷ lệ w/v=1/2.5. ở nhiệt độ phòng, sau 48 giờ
đem rửa trung tính, tiếp theo đun trong NaOH 8% với tỷ lệ
GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương 20
SVTH: Đặng Tiến Đông

Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
w/v=1/1.5, ở nhiệt độ 100 0C, sau 2 giờ khử protein rồi đem
rửa trung tính.
Tiến hành tẩy màu bằng KMnO4 1% trong môi trường
H2SO4 10% sau 1 giờ rửa sạch và khử màu phụ bằng Na 2S2O3
1.5% trong 15 phút, vớt ra rửa sạch thu được chitin.
Deacetyl chitin bằng NaOH 40% với tỷ lệ w/v=1/1, ở
nhiệt độ 800C sau 24 giờ đem rửa sạch và cuối cùng thu
được chitosan.
Sản phẩm có chất lượng khá tốt, chitin có màu trắng
đẹp. Song thời gian còn dài, sử dụng nhiều chất oxy hóa dễ
làm ảnh hưởng tới độ nhớt của sản phẩm.
b) Quy trình sản xuất chitosan ở trung tâm cao
phân tử viện khoa học Việt Nam
Nguyên liệu là vỏ ghẹ hay vỏ tôm sạch được khử
khoáng lần 1 bằng HCl 4% ở nhiệt độ phòng, sau thời gian
24 giờ đem rửa trung tính để làm giảm lượng NaOH tiêu hao
ở công đoạn sau.
Nấu trong NaOH 3% ở nhiệt độ 90 -950C sau 3 giờ đem
rửa trung tính, tiếp tục khử khoáng lần hai bằng HCl ở nhiệt
độ phòng 90 -950C sau 3 giờ đem rửa trung tính. Cuối cùng
nấu trong NaOH 40%, rửa trung tính và sấy khô thu được
chitosan.
Sản phẩm chitosan sản xuất theo quy trình này có màu
sắc không đẹp bằng sản phẩm theo quy trình của kỹ sư Đỗ
Minh Phụng, thời gian thực hiện quy trình kéo dài, nhiều công
đoạn.
c) Quy trình sản xuất chitin của xí nghiệp thủy sản
Hà Nội
GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương 21

SVTH: Đặng Tiến Đông


Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
Nguyên liệu là vỏ tôm khô hoặc tươi được loại bỏ hết
tạp chất, xử lý tách khoáng lần 1 trong HCl 4%, tỷ lệ
w/v=1/2, ở nhiệt độ phòng 24 giờ vớt ra rửa trung tính. Sau
đó dùng NaOH 2% để tách protein lần 1 với tỷ lệ w/v=1/2.8
ở nhiệt độ 90-950C, sau 3 giờ rửa và tiến hành khử khoáng
lần 2 cũng dùng HCl 4%, tỷ lệ w/v=1/2, ở nhiệt độ phòng
sau 24 giờ đem rửa trung tính. Để tách protein lần 2 cũng
dùng NaOH 2%, w/v=1/2.8, ở nhiệt độ 90-95 0C, sau 3 giờ rửa
trung tính và tiến hành khử khoáng lần 3 cũng giống như
lần khử khoáng trên. Sản phẩm đem làm khô thu được
chitin.
Chitin thu được có độ trắng cao mặc dù không có công
đoạn tẩy màu. Nhưng nhược điểm là thời gian sản xuất của
quy trình kéo dài, nồng độ hoá chất polymer trong môi
trường acid dẫn đến độ nhớt giảm.
d) Quy trình sản xuất chitosan theo phương pháp sinh
học kết hợp với hoá học.
Việc sản xuất chitosan theo phương pháp sinh học kết
hợp hoá học cũng thực hiện theo các bước: khử khoáng,
khử protein và deacetyl.
Công đoạn khử khoáng hiệu quả nhất và duy nhất
chỉ thực hiện bằng phương pháp hoá học.
Công đoạn khử protein và deacetyl có thể thay thế
bằng phương pháp sinh học, đó là khử protein bằng enzyme
protease và deacetyl bằng enzyme deacetylaza.
Vỏ tôm được ngâm trong HCl 10% tỷ lệ w/v =1/10, để ở

nhiệt độ phòng trong thời gian 5 giờ. Rửa sạch đến pH =
7.sau đó khử protein bằng papain 13% tỷ lệ w/v =1/5, pH = 5GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương 22
SVTH: Đặng Tiến Đông


Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
5,5, ở nhiệt độ 70 -800C trong thời gian 4 giờ. Rửa sạch, tẩy
màu sấy khô ở nhiệt độ 600C thu được chitin thô, trắng.
Deacetyl chitin bằng NaOH 35%, tỷ lệ w/v =1/10, ở 90 0C trong
thời gian 5,5 giờ. Rửa sạch và sấy khô thu được chitosan
sạch.
Chitosan thu được có màu sắc trắng, đẹp trong và mềm
mại. Quy trình papain cho sản phẩm có độ nhớt cao hơn các
quy trình khác. Tuy nhiên điều kiện khó khăn do việc tìm mua
hoặc sản xuất enzyem deacetylaza nên công đoạn deacetyl
được thực hiện bằng việc nấu NaOH đậm đặc.
e) Quy trình sản xuất chitin – chitosan theo phương
pháp sinh học
Trong vài năm gần đây đã có nhiều phát hiện mới
liên quan đến sản xuất chitin – chitosan bằng cách nuôi cấy
nấm móc Rhizopus azygosporus và nấm mốc Actinomucor
taiwanensis

và cô lập chitin – chitosan từ sự nuôi cấy đó.

Sau khi nuôi cấy tế bào nấm mốc được thu nhận từ canh
trường lên men và xử lý chúng với NaOH nồng độ 1N ở
1210C thời gian 15 phút. Sau đó trộn với nước cất đem đi ly
tâm rửa lại bằng nước cất hoặc cồn rồi tiếp tụ xử lý với
dung dịch acetic 2% ủ nhiệt độ 950C trong 12 giờ.

Kết quả hình thành dạng bùn sau đó cô lập bằng
cách ly tâm. Phần tan ở trên chứa chitosan phần cặn lắng
xuống chứa chitin.
Ưu điểm của phương pháp này là ít sử dụng hoá chất
ít gây ô nhiễm môi trường sản phẩm chất lượng cao. Nhược
điểm là giá thành cao quá trình thực hiện phức tạp hơn các
quy trình hoá học.
GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương 23
SVTH: Đặng Tiến Đông


Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
2.6 Nhu cầu sử dụng phương pháp sinh học kết hợp với
hoá học
Qua các quy trình sản xuất trên ta đã thấy rõ phương
pháp hoá học còn nhiều hạn chế, tiêu tốn nhiều hoá chất
gây ô nhiễm môi trường. Còn phương pháp sinh học giá
thành lại cao, do đó điều kiện cấp thiết là phải có một
quy trình sản xuất ít gây ô nhiễm và giá thành hợp lý vì
vậy ta sẽ thay thế quá trình thuỷ phân protein bằng enyzme
protease.
2.7 Các nguồn enzyme protease
a) Từ động vật
Protease động vật thường có ở t tạng, niêm mạc ruột
non, niêm mạc dạ dày, ….
Pancreatin: gồm trypsin, chymotrypsin và một số enzyme
khác có ở t tạng, chúng được tiết ra ngoài tế bào cùng
với dịch t.
Pepsin có ở niêm mạc dạ dày, được tiết ra ngoài tế
bào cùng với dịch vị.

Renin chỉ có ở ngăn thứ tư trong dạ dày bê non dưới 5
tháng tuổi, là enzyme đông tụ sữa điển hình trong công
nghệ sản xuất phomat.
b) Từ thực vật:
enzyme protease từ thực vật có ở các phần khác nhau
của cây như: thân, lá và đặc biệt có nhiều ở quả.
Enzyme này chủ yếu có ở một số cây vùng nhiệt
đới như: đu đủ, dứa, cây sung, articho và đậu tương.
Ví dụ:
Papain có trong mủ cây đu đủ, quả đu đủ còn xanh.
GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương 24
SVTH: Đặng Tiến Đông


Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
Bromelin có trong thân cây thơm và quả thơm xanh.
Ficin có trong mủ cây sung, quả sung, quả vả
c) Từ vi sinh vật
Nhiều loại vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh
protease. Các enzyme này có thể ở trong tế bào (protease
nội bào) hoặc được tiết vào trong môi trường nuôi cấy
(protease ngoại bào). Cho đến nay protease ngoại bào được
nghiên cứu kỹ hơn các protease nội bào. Một số protease
ngoại bào đã sản xuất ở quy mô công nghiệp và được sử
dụng rộng rãi trong nhiều ngành kỹ nghệ khác nhau trong
nông nghiệp và y dược.
Trong các loại protein, protein vi sinh vật từ nấm mốc là
được sử dụng rộng rãi nhất vì sản lượng lớn, dễ dàng thao
thác, dễ dàng nuôi cấy chủ động được nguồn protein cho
sản xuất. Enyzme có hoạt tính cao .. vv . do đó chúng tôi đã

chọn nấm mốc Aspergillus oryza vì enzyme protease từ nấm
mốc có hoạt tính cao, sinh sản nhanh, dễ dàng thu nhận chủ
động được trong quá trình sản xuất.
2.8

Đặc điểm chủng nấm mốc Aspergillus oryzae
a) Phân loại
Giới:
Ngành:

Fungi
Ascomycota

Ngành phụ:

Pezizomycota

Lớp:

Ascomycetes

Bộ:

Plectascales

Họ:

Aspergillusceae

Giống:

Aspergillus

Loài:

Aspergillus Oryzae

GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương 25
SVTH: Đặng Tiến Đông