Luận văn ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên quá trình lên men cellulose của vi khuẩn acetobacter xylinum

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH
KHOA KỸ THUẬT THỰC PHẨM VÀ MÔI TRƯỜNG

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài:

ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ CƠ CHẤT LÊN ĐỘNG
HỌC LÊN MEN CELLULOSE CỦA VI KHUẨN
ACETOBACTER XYLINUM

Sinh viên thực hiện : Hoàng Thị Lệ Hoa
Chuyên ngành

Tp.HCM, tháng 12 năm 2019

: Công nghệ thực phẩm


TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH
KHOA KỸ THUẬT THỰC PHẨM VÀ MÔI TRƯỜNG
ab

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài:

ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ CƠ CHẤT LÊN ĐỘNG
HỌC LÊN MEN CELLULOSE CỦA VI KHUẨN
ACETOBACTER XYLINUM
Sinh viên thực hiện : Hoàng Thị Lệ Hoa

Mã số sinh viên

: 1511539376

Lớp

: 15DTP1A

Chuyên ngành

: Công nghệ thực phẩm

Giáo viên hướng dẫn: ThS. Nguyễn Quốc Duy

Tp.HCM, tháng 12 năm 2019


TRƯỜNG ĐH NGUYỄN TẤT THÀNH
KHOA KỸ THUẬT THỰC PHẨM & MƠI TRƯỜNG

CỘNG HỊA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

Tp. Hồ Chí Minh, ngày 25 tháng 11 năm 2019

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
Họ và tên sinh viên: Hoàng Thị Lệ Hoa

Mã số sinh viên: 1511539376

Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm

Lớp: 15DTP1A

1. Tên đề tài:
ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ CƠ CHẤT LÊN ĐỘNG HỌC LÊN MEN
CELLULOSE CỦA VI KHUẨN ACETOBACTER XYLINUM
2. Nhiệm vụ luận văn
˗

Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên sự thay đổi pH và độ acid tổng của
dịch lên men sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum.

˗

Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên sự thay đổi số lượng vi khuẩn của
dịch lên men sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum.

˗

Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên sự thay đổi hàm lượng glucose và
cellulose của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn Acetobacter
xylinum.
3. Ngày giao nhiệm vụ luận văn: 15/6/2019
4. Ngày hoàn thành nhiệm vụ luận văn: 15/11/2019
5. Người hướng dẫn:

Họ và tên

Học hàm, học vị

Đơn vị

Phần hướng dẫn

Nguyễn Quốc Duy ..... Thạc sĩ .......................... BM CNTP...................... 100%
Nội dung và yêu cầu của luận văn đã được thông qua bộ môn.
Trưởng Bộ môn

Người hướng dẫn

(Ký và ghi rõ họ tên)

(Ký và ghi rõ họ tên)

ThS. Nguyễn Thị Vân Linh

ThS. Nguyễn Quốc Duy


LỜI CẢM ƠN
Để có được thành cơng như ngày hơm nay, em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ,
hỗ trợ của thầy cơ, gia đình và bạn bè. Trước hết, em xin cảm ơn giáo viên hướng dẫn
của em, thầy Nguyễn Quốc Duy về những hướng dẫn và lời khuyên có giá trị. Em cảm
thấy có động lực hơn trong suốt ba tháng làm thí nghiệm. Thầy đã truyền cảm hứng cho
em rất nhiều để hoàn thành dự án này. Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong
Khoa Kỹ thuật Thực phẩm và Môi trường đã cung cấp cho em những thông tin, hướng
đi và nền tảng kiến thức cần thiết cho em đạt được những mục đích học tập của mình.
Em muốn cảm ơn các anh chị trong phịng thí nghiệm đã giúp đỡ em trong khoảng
thời gian qua. Nếu khơng có sự hiểu biết của anh chị về các thiết bị thì việc hồn thành

dự án của em sẽ rất khó khăn. Cuối cùng, em dành một sự cảm ơn đến gia đình, bạn bè
cho một tình yêu thương và giúp đỡ ấy.
Em xin kính chúc Q thầy cơ Khoa Kỹ thuật Thực phẩm và Môi trường và thầy
Nguyễn Quốc Duy dồi dào sức khỏe, niềm tin để tiếp tục sứ mệnh trồng người cao đẹp
của mình là truyền đạt kiến thức cho thế hệ mai sau.

iv


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan kết quả của đề tài “Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên quá
trình lên men cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum” là công trình nghiên cứu
của cá nhân tơi đã thực hiện dưới sự hướng dẫn của ThS. Nguyễn Quốc Duy. Các số
liệu và kết quả được trình bày trong luận văn là hồn tồn trung thực, khơng sao chép
của bất cứ ai, và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình khoa học của nhóm
nghiên cứu nào khác cho đến thời điểm hiện tại.
Nếu không đúng như đã nêu trên, tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm về đề tài của
mình và chấp nhận những hình thức xử lý theo đúng quy định.
Tp.HCM, ngày 25 tháng 11 năm 2019
Tác giả luận văn
(Ký và ghi rõ họ tên)

Hoàng Thị Lệ Hoa

v


TÓM TẮT LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
Trong nghiên cứu này, ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên quá trình lên men
cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum được khảo sát. Nồng độ cơ chất được thay

đổi ở các giá trị 50, 100, 200 g/L. Q trình lên men celulose được mơ tả dựa trên sự
thay đổi pH, độ acid tổng, hàm lượng glucose, số lượng vi sinh vật trong canh trường
lên men và hiệu suất sinh tổng hợp cellulose.
Với lượng đường ban đầu 100 g/L theo thời gian, hàm lượng acid tăng do vi khuẩn
A. xylinum sử dụng đường tham gia vào q trình chuyển hóa các ethanol thành acid
acetic khiến pH giảm và acid tăng, pH không thay đổi đáng kể trong 2 ngày đầu từ
(4.203–4.093); sau đó giảm đáng kể đến ngày 10 (3.346) và không thay đổi ở các ngày
cuối quá trình lên men. Hàm lượng đường giảm mạnh từ ngày 0–5 từ (95.189–43.643
g/L) là do vi sinh vật đang ở pha phát triển bắt đầu sử dụng đường.
Với lượng đường ban đầu 200 g/L hàm lượng đường giảm dần từ ngày 0–8 từ
(206.784–118.993 g/L) do vi sinh vật đang ở pha tăng trưởng nên nguồn cung cấp carbon
ban đầu giảm, vi khuẩn bắt đầu sử dụng acid gluconic trong quá trình trao đổi chất và
trong thời gian này độ kết tinh của màng BC tăng dần.
Khi hàm lượng đường giảm dẫn đến tổng hàm lượng vi sinh vật tăng và thời gian
lên men tăng thì tổng hàm lượng vi sinh vật tăng. Theo khảo sát cho thấy hàm lượng
glucose và màng BC tỷ lệ nghịch với nhau, glucose là nguyên liệu chính để tổng hợp
màng BC.

vi


MỤC LỤC
NHIỆM VỤ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ............................................................ iii
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................ iv
LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................... v
TÓM TẮT LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP .............................................................. vi
MỤC LỤC ............................................................................................................. vii
DANH MỤC HÌNH............................................................................................... ix
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................... xi
Chương 1.

MỞ ĐẦU ........................................................................................ 1

1.1 TÍNH CẤP THIẾT VÀ LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI....................................... 1
1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU ........................................................................ 1
1.2.1 Mục tiêu tổng quát .................................................................................. 1
1.2.2 Mục tiêu cụ thể........................................................................................ 2
1.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ........................................................................ 2
Chương 2.

TỔNG QUAN................................................................................ 3

2.1 VI KHUẨN ACETOBACTER XYLINUM............................................... 3
2.1.1 Đặc điểm hình thái .................................................................................. 3
2.1.2 Đặc điểm sinh lý ..................................................................................... 4
2.2 QUÁ TRÌNH LÊN MEN CELLULOSE ................................................... 4
2.2.1 Thành phần môi trường lên men ............................................................. 4
2.2.2 Phương pháp lên men ............................................................................. 4
2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng ............................................................................. 5
2.3 CELLULOSE VI KHUẨN .......................................................................... 6
Chương 3.

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........... 7

3.1 DỤNG CỤ – THIẾT BỊ – HÓA CHẤT ..................................................... 7
3.1.1 Dụng cụ - thiết bị .................................................................................... 7
3.1.2 Hóa chất .................................................................................................. 7

vii

3.2 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ............................................ 8
3.2.1 Thời gian nghiên cứu .............................................................................. 8
3.2.2 Địa điểm nghiên cứu ............................................................................... 8
3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................................................. 8
3.3.1 Quá trình nhân giống vi sinh vật............................................................. 8
3.3.2 Quá trình lên men sinh tổng hợp cellulose ............................................. 9
3.3.3 Bố trí thí nghiệm .................................................................................... 9
3.4 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH .................................................................. 9
3.4.1 Xác định hàm lượng cellulose sinh tổng hợp ......................................... 9
3.4.2 Xác định hàm lượng vi sinh vật .............................................................. 9
3.4.3 Xác định hàm lượng đường khử ............................................................. 9
3.4.4 Xác định độ acid tổng ........................................................................... 10
3.5 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU ......................................................... 10
Chương 4.

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ....................................................... 11

4.1 SỰ THAY ĐỔI pH VÀ ĐỘ ACID TỔNG ..................................................11
4.2 SỰ THAY ĐỔI SỐ LƯỢNG VI SINH VẬT ........................................... 13
4.3 SỰ THAY ĐỔI HÀM LƯỢNG GLUCOSE VÀ CELLULOSE ........... 15
Chương 5.

KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ ............................................ 19

5.1 KẾT LUẬN ................................................................................................. 19
5.2 KHUYẾN NGHỊ ........................................................................................ 19
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 20

viii

DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1 Tế bào vi khuẩn A. xylinum quan sát dưới kính hiển vi ................................. 4
Hình 3.1 Máy quang phổ UV-1800 (Shimadzu Schweiz GmbH) .................................. 7
Hình 3.2 Máy ly tâm 80-2 (Wincom Company Ltd.) ..................................................... 7
Hình 3.3 Cân phân tích PA (OHAUS Instruments Co.,Ltd.) ......................................... 8
Hình 3.4 Tủ sấy UN55 (Memmert GmbH + Co.KG)..................................................... 8
Hình 4.1 Sự thay đổi pH và độ acid tổng (g acid acetic/L) của dịch lên men sinh tổng
hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban
đầu 50 g/L ..................................................................................................................... 11
Hình 4.2 Sự thay đổi pH và độ acid tổng (g acid acetic/L) của dịch lên men sinh tổng
hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban
đầu 100 g/L ................................................................................................................... 12
Hình 4.3 Sự thay đổi pH và độ acid tổng (g acid acetic/L) của dịch lên men sinh tổng
hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban
đầu 200 g/L ................................................................................................................... 13
Hình 4.4 Sự thay đổi số lượng vi sinh vật (mật độ quang ở bước sóng 600 nm) của dịch
lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm
lượng glucose ban đầu 50 g/L ...................................................................................... 14
Hình 4.5 Sự thay đổi số lượng vi sinh vật (mật độ quang ở bước sóng 600 nm) của dịch
lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm
lượng glucose ban đầu 100 g/L .................................................................................... 14
Hình 4.6 Sự thay đổi số lượng vi sinh vật (mật độ quang ở bước sóng 600 nm) của dịch
lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm
lượng glucose ban đầu 200 g/L .................................................................................... 15
Hình 4.7 Sự thay đổi hàm lượng glucose (g/L) của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose
bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 50 g/L 16
Hình 4.8 Sự thay đổi hàm lượng glucose (g/L) và cellulose (g DW/L) của dịch lên men
sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng

glucose ban đầu 100 g/L ............................................................................................... 16

ix


Hình 4.9 Sự thay đổi hàm lượng glucose (g/L) và cellulose (g DW/L) của dịch lên men
sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng
glucose ban đầu 200 g/L ............................................................................................... 17

x


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

Từ viết tắt

Thuật ngữ tiếng Anh

Thuật ngữ tiếng Việt

BC

Bacterial cellulose

Cellulose vi khuẩn

BC_W

Width of bacterial cellulose layer

Chiều dày lớp cellulose

HS

Hestrin-Schramm medium

Môi trường Hestrin-Schramm

TA

Total acidity

Độ acid tổng

DW

On a dry weight

Theo chất khô

xi


Chương 1. MỞ ĐẦU
1.1 TÍNH CẤP THIẾT VÀ LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI
Cellulose là đại phân tử phong phú nhất trên trái đất và hầu hết cellulose được sản
xuất bởi thực vật. Cellulose bao gồm các homopolymer của -1,4-glucose. Mức độ trùng
hợp của cellulose thay đổi từ 100–15000 đơn vị glucose với sự kết tinh của các chuỗi
tuyến tính dài để tạo thành các vi sợi của một thực thể tinh thể duy nhất [1]. Khi cellulose
được xử lý bằng acid đậm đặc ở nhiệt độ cao thì cấu trúc của nó sẽ bị phân hủy thành

các đơn vị glucose [2]. Cellulose là thành phần cấu trúc chính tạo nên thành tế bào của
hầu hết các loại thực vật và nó chủ yếu được lấy từ các nguồn thực vật từ sợi lơng, gỗ
có chứa khoảng 40-90% là cellulose. Cellulose có giá trị thương mại trong sản xuất giấy,
sợi nano cellulose [3], [4].
Ngồi thực vật, cellulose cũng được tìm thấy trong nhiều vi sinh vật như nấm, vi
khuẩn và tảo. Báo cáo đầu tiên về cellulose được sản xuất từ vi khuẩn (bacterial cellulose
– BC), đặc biệt từ A. xylinum, được công bố vào năm 1996 [5]. Các nghiên cứu gần đây
đã tiết lộ rằng BC có thể được sản xuất bởi các vi khuẩn, bao gồm cả các loại vi khuẩn
Gram âm như Acetobacter, Rhizobium, Agrobacterium, Pseudomonas, Salmonella,
Alcaligenes, cũng như vi khuẩn Gram dương như Sarcina ventriculi.
Mặc dù quá trình hình thành cellulose của A. xylinum đã được nghiên cứu khá nhiều
trong các nghiên cứu trước đó, hầu hết các nghiên cứu đã giải quyết việc làm sáng tỏ
quá trình sinh tổng hợp cellulose, và hầu hết các chủng được nghiên cứu cho đến nay
chỉ tạo ra một lượng cellulose nhỏ [6]–[8]. Hơn nữa, một môi trường tiêu chuẩn được
sử dụng để canh tác các sinh vật sản xuất vi khuẩn như mơi trường Hestrin-Schramm
rất tốn kém và địi hỏi nhiều nguồn bổ sung dinh dưỡng trong quá trình nuôi cấy [9].
Nghiên cứu này được thực hiện để đánh giá ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên việc
sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn A. xylinum.
1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
1.2.1 Mục tiêu tổng quát
Nghiên cứu nguồn sinh tổng hợp cellulose từ vi sinh vật với nhiều ưu điểm so với
cellulose từ thực vật ứng dụng trong công nghiệp vật liệu và y học.

1


1.2.2 Mục tiêu cụ thể
Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên quá trình sinh tổng hợp cellulose của
vi khuẩn Acetobacter xylinum.
1.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên sự thay đổi pH và độ acid tổng của
dịch lên men sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum.
Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên sự thay đổi số lượng vi khuẩn của
dịch lên men sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum.
Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên sự thay đổi hàm lượng glucose và
cellulose của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum.

2


Chương 2. TỔNG QUAN
2.1 VI KHUẨN ACETOBACTER XYLINUM
Giới

: Bacteria

Ngành

: Proteobacteria

Lớp

: Alpharoteobacteria

Bộ

: Rhodospirillales

Họ

: Acetobacteraceae

Chi

: Acetobacter

Lồi

: Acetobacter xylinum

2.1.1 Đặc điểm hình thái
Acetobacter xylinum là một loại vi sinh vât Gram âm, hiếu khí được biết đến như
Gluconacetobacter xylinum, có đặc tính sinh tổng hợp cellulose. Độ dài của A. xylinum
nằm trong khoảng 2–10 µm, với chiều rộng nằm trong phạm vi 0.5–1 µm [6]. A. xylinum
thường phát triển ở độ pH từ 5.4-6.3 và nhiệt độ khoảng 28–31C và có thể tích lũy
4.5% acid acetic. Một tế bào A. xylinum có khả năng polymer hóa 200000 phân tử
glucose/giây tạo thành β-1,4-glucan và sau đó được bài tiết vào mơi trường xung quanh
tạo thành dạng sợi. A. xylinum được tìm thấy trên trái cây, ngũ cốc, trà thảo dược, rau
hư, đất, nước, hoa, trái cây và mật ong, nơi xảy ra quá trình lên men đường [10]. Sự tăng
trưởng của chúng có thể bị ảnh hưởng bởi các yếu tố vật lý và sinh hóa. Các yếu tố vật
lý bao gồm pH, nhiệt độ, oxy nồng độ, độ ẩm, áp suất (thủy tĩnh và thẩm thấu) và bức
xạ. Mặt khác, các yếu tố sinh hóa bao gồm sự sẵn có của carbon, nitrogen, lưu huỳnh,
phosphor, và vitamin [11].
Những vi khuẩn này còn được gọi là vi khuẩn acid acetic có khả năng tạo thành acid
từ glucose, rượu ethyl, rượu propyl chứ không phải oxy hóa acid thành carbon dioxide
và nước với sự có mặt của oxy. Đặc điểm nổi bật của vi khuẩn này là khả năng trùng hợp
glucose thành cellulose chỉ qua quá trình tổng hợp, những vi khuẩn này được hình thành
khi có sự kết hợp của 6 đến 8 tế bào và không tạo thành sắc tố nội bào.
A. xylinum có khả năng chống lại những thay đổi đột ngột như khi giảm lượng nước
hoặc khi có sự hiện diện của các chất độc hại và những sinh vật gây bệnh. Mặc dù thời

tiết không thuận lợi nhưng A. xylinum có thế phát triển và sản xuất cellulose trong màng
bao. Có 23% tế bào vi khuẩn được bao bọc cellulose tồn tại sau khi được
3


xử lý bằng bức xạ UV, loại bỏ các polysaccharide để có thể bảo vệ cellulose khỏi tế
bào vi khuẩn dẫn đến việc giảm mạnh tỷ lệ sống của vi khuẩn là 3% [12].

Hình 2.1 Tế bào vi khuẩn A. xylinum quan sát dưới kính hiển vi

2.1.2 Đặc điểm sinh lý
Vi khuẩn A. xylinum phát triển ở nhiệt độ từ 28–32C. Ở nhiệt độ 37C, hầu hết các
tế bào đều bị suy thối hồn tồn ngay cả ở mơi trường tối ưu. Tuy nhiên vẫn còn nhiều
khảo sát khác nhau về các yếu tố như nhiệt độ và pH tối ưu cho vi khuẩn A. xylinum
sinh trưởng và tạo màng. Vi khuẩn A. xylinum có thể chịu được pH thấp, do đó có thể
bổ sung acid acetic vào mơi trường nuôi cấy để hạn chế được sự nhiễm khuẩn lạ.
2.2 Q TRÌNH LÊN MEN CELLULOSE
2.2.1 Thành phần mơi trường lên men
Nước dừa được sử dụng tốt nhất trong sản xuất biocellulose, vì chứa nhiều amino
acid giúp tăng trưởng, phát triển hoạt động của A. xylinum. Để tăng trưởng và hoạt động,
A. xylinum đòi hỏi các yếu tố đa lượng và vi lượng. Các yếu tố đa lượng được làm từ
carbon và nitrogen. Ngồi carbohydrate và protein, trong nước dừa cịn chứa nhiều
khoáng chất cần thiết cho A. xylinum như: K, Na, Mg, Ca, P. Loại nước dừa tốt nhất có
thể được lấy từ trái dừa già. Mặt khác trong nước dừa non hầu như khơng chứa khống
chất cần thiết [13].
2.2.2 Phương pháp lên men
Trên môi trường thạch đĩa, vi khuẩn A. xylinum hình thành khuẩn lạc nhẵn, rìa mép
khuẩn lạc thường gợn sóng có màu trắng, khuẩn lạc lồi lên thuận tiện cho việc dễ tách
ra khỏi môi trường. Do vi khuẩn được nuôi cấy ở môi trường lỏng ở điều kiện

4


tĩnh nên chúng hình thành trên bề mặt một lớp màng cellulose. Trong điều kiện ni lắc,
cellulose hình thành những hạt nhỏ có kích thước khơng bằng nhau và phân tán trong
mơi trường tạo thành những đặc tính hình thái khác với cellulose được nuôi cấy ở điều
kiện tĩnh [14].
2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng
2.2.3.1 Nguồn carbon
Trong số các nguồn carbon, sucrose, glucose và mannitol là những nguồn carbon
tối ưu cho sự hình thành cellulose. Sucrose 60 g/L là hàm lượng cơ chất tối ưu cho sinh
tổng hợp cellulose trong khi 70 g/L là giá trị tối ưu cho glucose và mannitol với hiệu
suất sinh tổng hợp cellulose là 5.0 g/L. Ngoài ra, lactose, galactose, acid citric , tinh bột
và maltose cũng cho hiệu suất sinh tổng hợp celllulose là 2.0 g/L [15].
2.2.3.2 Nguồn nitrogen
Nguồn nitrogen có thể được sử dụng trong hợp chất hữu cơ hoặc vô cơ. Chiết xuất
men và casein là những sản phẩm tốt được sử dụng cho sự tăng trưởng và hình thành
biocellulose. Những nguồn nitrogen có thể được sử dụng bao gồm casein hydrolysate,
peptone, glutamate và ammonium sulfate [15]. Tuy nhiên, ammonium sulfate và
ammonium phosphate là những vật liệu phù hợp hơn được sử dụng về mặt kinh tế và
năng suất chất lượng của biocellulose [16].
Trong môi trường lên men chứa sucrose, việc bổ sung bột đậu nành hoặc ammonium
sulfate thu được ít cellulose hơn khi sử dụng peptone hay casein hydrolysate. Điều này
cho thấy rằng nguồn nitrogen cũng đóng góp vào việc cải thiện sự sinh tổng hợp
cellulose [15].
2.2.3.3 pH
A. xylinum là một loại vi khuẩn ưa acid có thể phát triển trong mơi trường pH thấp.
Nó có thể sống ở pH thấp tới 3.5 [17]. Độ pH tối ưu nằm trong khoảng từ 5.4–6.3 [18].
Các giá trị pH thuận lợi nhất cho sự hình thành cellulose của vi khuẩn ở pH 4.0 và 5.0
[10]. Những giá trị pH thúc đẩy tăng trưởng tối ưu và ảnh hưởng đến oxy hấp thu trong

quá trình lên men. Hầu hết các nhà nghiên cứu đã sử dụng pH 5.0 [17], [19].
2.2.3.4 Nhiệt độ
Nhiệt độ để A. xylinum phát triển tối ưu từ 28–31C. Ở nhiệt độ dưới 28C vi khuẩn
phát triển chậm trong khi ở nhiệt độ trên 31C bắt đầu gây ra thiệt hại cho A. xylinum
và có thể dẫn đến tử vong [16].

5


2.2.3.5 Oxy
Vi khuẩn A. xylinum là vi khuẩn hiếu khí do đó chúng rất cần oxy trong q trình
sinh trưởng, phát triển. Khi thiếu oxy vi khuẩn này sẽ bị gián đoạn tăng trưởng có thế
dẫn đến tử vong. Do đó những thùng chứa được sử dụng cho q trình lên men cần phải
được mở thoáng [16].
2.3 CELLULOSE VI KHUẨN
Cellulose tương đối tinh khiết được sản xuất bởi vi khuẩn A. xylinum. Vi sinh vật
này đã được nghiên cứu trong hơn 100 năm. Không giống như cellulose từ bột gỗ,
cellulose vi khuẩn khơng có các polysaccharide tạp khác như lignin và hemicellulose.
Ngoài ra, sự phân lập và tinh chế của nó tương đối đơn giản, khơng cần các q trình sử
dụng nhiều năng lượng hoặc hóa học [20]. Vi khuẩn này đã được sử dụng làm hệ thống
mơ hình trong việc khám phá các quá trình sinh học [21], [22]. Các vi sinh vật sản xuất
polysacchride rất đơn giản và có khả năng tạo nên một polymer từ các nguyên liệu đơn
giản có sẵn và các nguồn nguyên liệu thứ cấp. Các sản phẩm từ củ cải đường (mật đường,
syrup đường và sucrose), ngô (tinh bột, tinh bột thủy phân, syrup glucose và glucose),
và khoai tây (tinh bột thủy phân và tinh bột) có thể được sử dụng để sản xuất các polymer
như vậy. Các chất không ăn được như gỗ, chất thải sản xuất dextran, chất thải hóa dầu
và các sản phẩm, ethanol, methanol, glycerin và ethylene glycol thường phù hợp [23].
BC có hình thái, cấu trúc, tính chất và ứng dụng khác nhau tùy thuộc vào loại vi sinh
vật sinh tổng hợp ra chúng. Trong số các vi khuẩn đã nói ở trên, các vi sinh vật hiệu quả
nhất để sản xuất BC là A. xylinum, A. hansenii và A. pasteurianus. Trong số này, A.

xylinum đã được sử dụng để sản xuất BC thương mại do năng suất cao. Mặc dù cả
cellulose thực vật và BC đều được sản xuất trong tự nhiên, nhưng sự thay đổi đáng kể
đã được tìm thấy giữa chúng về độ tinh khiết, tính chất phân tử và đặc tính. So với
cellulose thực vật, BC có giá trị module Young cao [24]–[26], khả năng hấp thụ nước
cao [27] làm cho nó trở thành vật liệu hữu ích trong nhiều ngành cơng nghiệp, như thực
phẩm, sản xuất giấy và ứng dụng dược phẩm.

6


Chương 3. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 DỤNG CỤ – THIẾT BỊ – HÓA CHẤT
3.1.1 Dụng cụ - thiết bị
Cốc thuỷ tinh

Giá ống nghiệm

pH kế

Pipet

Erlen

Bình định mức

Nhiệt kế

Ống nghiệm

Bình định mức

Ống ly tâm

Cốc thuỷ tinh

Phễu

Micropipet

Đũa thuỷ tinh

3.1.2 Hóa chất
Chế phẩm enzyme cellulase (Viscozyme®L, Novozymes, Đan Mạch) dạng lỏng
có hoạt tính 100 FBG/g.
Glucose, peptone, chất chiết men, Na2HPO4, citric acid monohydrate, ammonium
sulfate, acid acetic, sodium acetate, nước cất… đều đạt chuẩn phân tích.

Hình 3.1 Máy quang phổ UV-1800
(Shimadzu Schweiz GmbH)

Hình 3.2 Máy ly tâm 80-2 (Wincom
Company Ltd.)

7


Hình 3.4 Tủ sấy UN55 (Memmert GmbH +
Co.KG)

Hình 3.3 Cân phân tích PA (OHAUS

Instruments Co.,Ltd.)

3.2 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
3.2.1 Thời gian nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện từ ngày 15 tháng 6 năm 2019 đến ngày 15 tháng 10 năm 2019.
3.2.2 Địa điểm nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện tại Phịng thí nghiệm Hóa phân tích, trường ĐH Nguyễn Tất Thành,
331 Quốc lộ 1A, Phường An Phú Đơng, Quận 12, Tp.HCM.
3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.1 Q trình nhân giống vi sinh vật
Trong nghiên cứu này, môi trường Hestrin-Schramm (HS) được sử dụng để nuôi
cấy vi khuẩn A. xylinum. Thành phần của môi trường HS bao gồm (g/L): glucose (20.0),
peptone (5.0), chất chiết men (5.0), Na2HPO4 (2.7), và citric acid monohydrate (1.15)
và pH được hiệu chỉnh về giá trị 5.0 [28]. Môi trường được bổ sung thêm ammonium
sulfate (4 g/L) để kích thích q trình tăng sinh khối.
Giống vi khuẩn được nhân giống cấp 1 tại cơ sở sản xuất thạch dừa (Sơn Phú, Giồng
Trôm, Bến Tre) trên mơi trường nước dừa già có bổ sung ammonium sulfate (4 g/L) và
diammonium phosphate (1 g/L) để kích thích tăng trưởng trong khoảng thời gian 3 ngày
ở nhiệt độ 30C.
Giống vi khuẩn hoạt hóa được nhân giống cấp 2 trên môi trường HS sử dụng tỷ lệ
giống cấy 10% ở nhiệt độ 30C trong 5 ngày. Sau 5 ngày nhân giống, giống vi khuẩn
được cấy vào môi trường nuôi cấy sinh tổng hợp cellulose ở tỷ lệ giống cấy 10% và

8


tiến hành lên men tĩnh ở nhiệt độ 30C trong 15 ngày. Sau mỗi ngày lên men, màng
cellulose (nếu hình thành) được tách trực tiếp ra khỏi môi trường và được xử lý trước
khi xác định khối lượng. Phần dịch lên men cịn lại được sử dụng để phân tích các chỉ
tiêu khác bao gồm: pH, độ acid tổng, hàm lượng đường khử, hàm lượng vi khuẩn.

3.3.2 Quá trình lên men sinh tổng hợp cellulose
Quá trình lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum được thực hiện
trên môi trường HS như mô tả trong phần trên với nồng độ cơ chất ban đầu là 50, 100
và 200 g/L với tỷ lệ giống cấy 10%. Quá trình lên men tĩnh được thực hiện trong 15
ngày ở nhiệt độ 30C. Sau khi quá trình lên men kết thúc, dịch lên men và lớp màng
cellulose tạo thành được phân tích xác định các chỉ tiêu hóa lý.
3.3.3 Bố trí thí nghiệm

HS, Giống
o
10%, 30 C, 5
ngày

Cấy
10%

HS
(Glucose50g/L)

HS
(Glucose100g/L)

HS
(Glucose200g/L)

Lên men tĩnh
o
30 C, 15 ngày

Màng cellulose

Dịch lên men

Xử lý
pH
Xác định khối
lượng
9

Vi sinh
vật

Đường
khử

Acid tổng


3.4 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
3.4.1 Xác định hàm lượng cellulose sinh tổng hợp
Đầu tiên, màng cellulose được ngâm trong dung dịch NaOH 2% trong 30 phút ở
nhiệt độ 80C để loại bỏ các tạp chất và tế bào bám trên màng. Sau đó, màng được tiếp
tục ngâm trong dung dịch acid acetic 2% trong 30 phút ở nhiệt độ 80C để trung hòa
lượng base và được rửa bằng nước cất để đưa về pH trung tính. Màng cellulose sau khi
rửa sạch được sấy tới khối lượng không đổi ở 105C để xác định khối lượng khô. Hàm
lượng cellulose sinh tổng hợp được biểu diễn theo đơn vị g chất khô cellulose trong 1 L
dịch lên men [29].
3.4.2 Xác định hàm lượng vi sinh vật
Canh trường (2 mL) được định mức lên 10 mL sử dụng dung dịch đệm acetate 0.1
M (pH 5.0) có chứa cellulase 1% (v/v) và tiến hành quá trình thủy phân trong 2 giờ ở

50C. Sau quá trình thủy phân, hỗn hợp được lọc qua giấy lọc Whatman No.2 và hàm
lượng vi sinh vật được xác định bằng cách đo độ hấp thu ở bước sóng 600 nm [30].
3.4.3 Xác định hàm lượng đường khử
Hàm lượng đường khử được xác định bằng phương pháp dinitro salicylic acid
(DNS) [31]. Phương pháp này dựa trên phản ứng tạo phức có màu vàng giữa đường khử
và thuốc thử DNS có bước sóng hấp thu cực đại ở 540 nm. 2mL dịch lên men sau khi
pha loãng được bổ sung 1 mL thuốc thử DNS và đun sôi trong 10 phút. Sau khi làm
nguội về nhiệt độ phòng, mẫu được đo độ hấp thu ở bước sóng 540 nm. Hàm lượng
đường khử được tính tốn dựa vào đường chuẩn glucose và được biểu diễn bằng đơn vị
g/L
3.4.4 Xác định độ acid tổng
Độ acid tổng của dịch lên men được xác định bằng phương pháp chuẩn độ acidbase sử dụng dung dịch NaOH 0.05 N làm dung dịch chuẩn độ với chỉ thị màu
phenolphthalein. Độ acid tổng được biểu diễn theo đơn vị gam acid acetic trong 1 L dịch
lên men.
3.5 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
Dữ liệu thực nghiệm được phân tích bằng phần mềm SPSS 15 (SPSS Inc. Chicago,
U.S.A) sử dụng những kỹ thuật thống kê cơ bản. Phân tích phương sai một nhân tố (oneway ANOVA) được áp dụng để xác định sự khác nhau giữa các chế độ xử lý mẫu và
Tukey’s Multiple Range test được áp dụng để xác định sự khác biệt có ý nghĩa giữa các
giá trị trung bình ở mức ý nghĩa 5%. Tất cả thí nghiệm và những chỉ tiêu phân tích được
lặp lại 3 lần.
10


Chương 4. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
4.1 SỰ THAY ĐỔI pH VÀ ĐỘ ACID TỔNG
Trong nghiên cứu này, ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên quá trình lên men
cellulose của vi khuẩn A. xylinum được khảo sát. Nồng độ cơ chất được thay đổi ở các
giá trị 50, 100, 200 g/L. Q trình lên men cellulose được mơ tả dựa trên sự thay đổi
pH, độ acid tổng, hàm lượng glucose, số lượng vi sinh vật trong canh trường lên men và

5

9

4.5

8

4

7

3.5

6

pH

3
5
2.5
4

2

3

1.5
1

2

0.5

1

0

TA (g acetic acid/L)

hiệu suất sinh tổng hợp BC.

0
0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

Day
pH

TA

Hình 4.1 Sự thay đổi pH và độ acid tổng (g acid acetic/L) của dịch lên men sinh tổng hợp
cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 50 g/L.

Sự thay đổi pH và độ acid tổng của dịch lên men trong môi trường HS được biểu thị
qua Hình 4.1. Kết quả cho thấy rằng sự thay đổi pH của dịch lên men trong mơi trường
HS cũng có chiều hướng giảm và giảm mạnh từ ngày 0 đến ngày 7. Do pH giảm nên
lượng acid tổng của môi trường tăng.
Sự thay đổi của pH và hàm lượng acid tổng trong dịch lên men cellulose với nồng
độ cơ chất 100 g/L được thể hiện qua Hình 4.2. Kết quả này cho thấy khi pH giảm thì
hàm lượng acid tổng trong canh trường lên men tăng [32]. Theo thời gian, hàm lượng
acid tăng do vi khuẩn A. xylinum sử dụng đường tham gia vào quá trình chuyển hóa các
ethanol thành acid acetic khiến pH giảm và acid tăng [33]. pH không thay đổi đáng

11

kể trong 2 ngày đầu, sau đó giảm đáng kể đến ngày 10 và không thay đổi ở các ngày
cuối quá trình lên men.
5

14

4.5

12
10

3.5

pH

3

8

2.5
6

2
1.5

4

TA (g acetic acid/L)

4

1
2

0.5
0

0
0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

Day
pH

TA

Hình 4.2 Sự thay đổi pH và độ acid tổng (g acid acetic/L) của dịch lên men sinh tổng hợp
cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 100 g/L.

Kết quả nghiên cứu này cũng được tìm thấy ở báo cáo của Kamide et al. (1990) về
ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy vi khuẩn A. xylinum trên sinh tổng hợp cellulose. Báo
cáo cho thấy rằng pH không thay đổi cho đến khi 64 giờ lên men và giảm tương đối
nhanh trong thời gian 1giờ tiếp theo. Sau đó, pH giảm chậm và gần như khơng đổi cho
đến 120 giờ và sau đó cho thấy một sự giảm nhanh chóng và khơng thay đổi cho tới 150
giờ lên men [34].
Vi khuẩn A. xylinum ưa thích mơi trường acid nhẹ để tổng hợp cellulose [35]. Do
đó, việc tăng giá trị pH môi trường lên men làm giảm đáng kể quá trình tổng hợp
cellulose do sự sinh trưởng của vi khuẩn kém trong điều kiện này cũng như việc ức chế
các enzyme tham gia vào quá trình hình thành cellulose [28].

Với mơi trường có nồng độ cơ chất 200 g/L, khi thời gian lên men tăng lên, có sự
gia tăng tổng lượng acid qua từng ngày, tổng lượng acid tăng dần đều trong 14 đầu lên
men và tăng mạnh trong ngày 15. Điều này là do A. xylinum có thể chuyển hóa
carbohydrate thành acid acetic bằng cách tổng hợp các sợi cellulose.
Q trình chuyển hóa là hơ hấp tế bào, bao gồm q trình oxy hóa ethanol thành
acid acetic và chuyển đổi glucose thành acid gluconic. Acid acetic là sản phẩm phụ của
cellulose và có ảnh hưởng đến sự giảm pH trong môi trường nuôi cấy [36]. Sự
12


giảm pH có ảnh hưởng lên cả sự sinh tổng hợp cellulose và sự sinh trưởng của vi sinh
vật [37]. Hình 4.3 cho thấy pH có xu hướng thay đổi khơng đáng kể từ ngày 0–4 do vi
khuẩn mới thích nghi với mơi trường và có xu hướng giảm từ ngày 4–6 do nồng độ acid
gluconic tăng. Kết quả là, nồng độ acid gluconic cao có thể thay đổi hoạt động của các
quá trình trao đổi chất [38]. Trong khoảng thời gian lên men 10–15 ngày, sự oxi hóa

5

18

4.5

16

4

14

3.5

12

pH

3

10

2.5
8

2

6

1.5
1

4

0.5

2

0

TA (g acetic acid/L)

glucose tạo thành gluconate đã dẫn đến giảm năng suất cellulose và giảm pH ức chế sự
tăng trưởng tế bào và sản xuất cellulose. Những nghiên cứu khác cũng cho rằng khi pH

giảm xuống dưới 4.0, quá trình lên men tĩnh tạo ra cellulose bắt đầu xảy ra [10].

0
0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

Day
pH

TA

Hình 4.3 Sự thay đổi pH và độ acid tổng (g acid acetic/L) của dịch lên men sinh tổng hợp
cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 200 g/L.

Việc điều chỉnh pH môi trường rất quan trọng để thu được hiệu suất thu hồi cellulose
cao [39], [40]. Sự oxy hóa glucose bởi enzyme glucose dehydrogenase liên kết màng tế
bào tạo nên acid gluconic và làm giảm pH môi trường. Nếu pH môi trường giảm xuống
dưới 3.0, quá trình tổng hợp cellulose bị ức chế [14].
4.2 SỰ THAY ĐỔI SỐ LƯỢNG VI SINH VẬT
Sự thay đổi số lượng vi sinh vật của dịch lên men trong môi trường HS với 50 g/L
cơ chất được biểu thị qua Hình 4.4. Kết quả cho thấy rằng số lượng vi sinh vật phát triển
liên tục từ ngày 0 đến ngày 7 nhưng từ ngày 8 thì giảm nhẹ và ngày 9 và ngày 10 thì vi
sinh vật không tăng nhiều nhưng từ ngày 11 đến ngày 13 thì vi sinh vật bắt đầu giảm.

13


0.12

0.1

OD600

0.08

0.06

0.04

0.02

0
0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

Day

Hình 4.4 Sự thay đổi số lượng vi sinh vật (mật độ quang ở bước sóng 600 nm) của dịch lên
men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng
glucose ban đầu 50 g/L.

0.12

0.1

OD600

0.08

0.06

0.04

0.02

0

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

Day

Hình 4.5 Sự thay đổi số lượng vi sinh vật (mật độ quang ở bước sóng 600 nm) của dịch lên
men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng
glucose ban đầu 100 g/L.

14