(Luận văn thạc sĩ) xác định một số đặc tính sinh học của parvovirus gây tiêu chảy ở chó nuôi tại thủ đô viêng chăn CHDCND lào

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

SOUKSAVANH SISAMOUTH

XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC
CỦA PARVOVIRUS GÂY TIÊU CHẢY Ở CHĨ NUÔI
TẠI THỦ ĐÔ VIÊNG CHĂN - CHDCND LÀO

Ngành:

Thú y

Mã số:

8640101

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Lê Văn Phan

NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2019


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu riêng của bản thân. Các kết quả
nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng
bảo vệ để lấy bất kỳ học vị nào.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám ơn
và các thơng tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày

tháng

năm 2019

Tác giả luận văn

SoukSaVanh Sisamouth

i


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn tác giả đã nhận được sự giúp đỡ và tạo điều kiện của rất
nhiều người, sau đây là lời cảm ơn chân thành của tác giả:
Trước hết, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Lê Văn Phan người đã trực
tiếp hướng dẫn tơi trong suốt q trình nghiên cứu và hồn thành luận văn. Nhờ có sự
hướng dẫn nhiệt tình và những ý kiến đóng góp quý báu của thầy mà luận văn của tơi đã
được hồn thành
Tơi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám đốc Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Ban
Quản lý đào tạo, Chủ nhiệm khoa Thú y, Bộ mơn Vi sinh vật truyền- nhiễm, Phịng Thí
nghiệm trọng điểm cơng nghệ sinh học Thú y, cùng tồn thể các thầy, cô giáo và cán bộ
của Khoa Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam, đã trang bị cho tôi những kiến thức
quý báu và giúp đỡ tơi hồn thành cơng trình nghiên cứu luận văn.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn tới bạn bè, đồng nghiệp, người thân trong
gia đình và cơ quan đang cơng tác đã tạo điều kiện về thời gian, động viên, chia sẻ tinh
thần, giúp đỡ tơi trong q trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn.

Hà Nội, ngày

tháng

năm 2019

Tác giả luận văn

SoukSaVanh Sisamouth

ii


MỤC LỤC
Lời cam đoan .................................................................. Error! Bookmark not defined.
Lời cảm ơn ...................................................................... Error! Bookmark not defined.
Mục lục ........................................................................................................................... iii
Danh mục bảng ................................................................................................................ vi
Danh mục hình ảnh ......................................................................................................... vii
Danh mục chữ viết tắt .................................................................................................... viii
Trích yếu luận văn ........................................................................................................... ix
Thesis abstract ................................................................................................................. xi
Phần 1. Mở đầu ............................................................................................................... 1
1.1.

Tính cấp thiết của đề tài ..................................................................................... 1

1.2.

Mục tiêu của đề tài ............................................................................................. 2

Phần 2. Tổng quan tài liệu ............................................................................................. 3
2.1.

Tình hình nghiên cứu bệnh viêm ruột tiêu chảy do Parvovirus ......................... 3

2.1.1.

Tổng quan về bệnh viêm ruột tiêu chảy do Parvovirus ...................................... 3

2.1.2.

Tình hình nghiên cứu bệnh viêm ruột tiêu chảy do Parvovirus gây ra trên
thế giới ................................................................................................................ 3

2.1.3.

Tình hình dịch bệnh viêm ruột tiêu chảy do Parvovirus gây ra tại Lào ............. 4

2.2.

Đặc điểm sinh học của parvovirus ..................................................................... 5

2.2.1.

Đặc điểm hình thái, cấu trúc hệ gen của Parvovirus .......................................... 5

2.2.2.

Phân loại và phân bố các type Parvovirus .......................................................... 6

2.2.3.

Sức đề kháng của Parvovirus ............................................................................. 7

2.2.4.

Đặc tính ni cấy................................................................................................ 8

2.2.5.

Đặc tính kháng nguyên ....................................................................................... 8

2.2.6.

Khả năng miễn dịch ............................................................................................ 8

2.2.7.

Đường xâm nhập và cách truyền bệnh ............................................................... 9

2.2.8.

Triệu chứng ...................................................................................................... 10

2.2.9.

Các phương pháp chẩn đốn ............................................................................ 12

2.3.

Phịng bệnh ....................................................................................................... 15

2.4.

Tổng quan tế bào .............................................................................................. 17

2.4.1.

Một số đặc điểm của tế bào động vật ............................................................... 17

iii


2.4.2.

Thành phần dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy tế bào ................................. 17

2.4.3.

Điều kiện nuôi cấy ............................................................................................ 18

2.4.4.

Sự tạp nhiễm và cách hạn chế .......................................................................... 19

2.5.

Phân lập VIRUS ............................................................................................... 19

2.5.1.

Khái quát về phân lập virus .............................................................................. 19

2.5.2.

Phân lập Parvovirus phục vụ nghiên cứu sản xuất Vaccine vô hoạt ................ 20

2.6.

Giải trình tự gen................................................................................................ 21

2.7.

Cây phát sinh chửng loại (Phylogenetic Tree). ................................................ 21

Phần 3. Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu .......................................................... 22
3.1.

Đối tượng nghiên cứu ....................................................................................... 22

3.2.

Địa điểm nghiên cứu ........................................................................................ 23

3.3.

Nội dung nghiên cứu ........................................................................................ 23

3.4.

Nghiên vật liệu ................................................................................................. 23

3.4.1.

Hóa chất ............................................................................................................ 23

3.4.2.

Trang thiết bị máy móc .................................................................................... 23

3.5.

Phương pháp nghiên cứu ............................................................................... 24

3.5.1.

Phường pháp lấy mẫu ....................................................................................... 24

3.5.2.

Phương pháp tách DNA tổng số ....................................................................... 24

3.5.3.

Phương pháp PCR ............................................................................................ 25

3.5.4.

Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm .......................................................... 26

3.5.5.

Phương pháp giải trình tự gen .......................................................................... 26

3.5.6.

Phương pháp mở giống tế bào CRFK .............................................................. 27

3.5.7.

Phương pháp cấy chuyển tế bào CRFK ........................................................... 27

3.5.8.

Phương pháp phân lập Parvovirus trên tế bào CRFK ...................................... 28

3.5.9.

Phương pháp thu virus ...................................................................................... 29

3.5.10. Phương pháp đếm số lượng tế bào ................................................................... 29
3.5.11. Phương pháp xác định hiệu giá virus ............................................................... 30
3.5.12. Phương pháp phân tích phả hệ ......................................................................... 32
Phần 4. Kết quả và thảo luận....................................................................................... 33
4.1.

Kết quả chẩn đoán canine parvovirus bằng phương pháp PCR ....................... 33

4.2.

Kết quả xây dựng cây phả hệ (Phylogenetic Tree)........................................... 35

4.2.1.

Kết quả phân tích sự tương đồng của Nuclotide của các chủng
Parvovirus đã nghiên cứu ................................................................................. 35

iv


4.2.2.

Kết quả phân tích sự tương đồng của Amino acid của các chủng
Parvovirus đã nghiên cứu. ................................................................................ 39

4.2.3.

Kết quả xây dựng cây phả hệ. .......................................................................... 42

4.3.

Kết quả phân lập chủng Parvovirus trên môi trường nuôi cấy tế bào CRFK ............43

4.3.1.

Kết quả nuôi cấy tế bào CRFK ......................................................................... 43

4.3.2.

Kết quả phân lập Parvovirus ............................................................................ 44

4.4.

Kết của xác định hiệu giá của Parvovirus trên môi trường tế bào ................... 45

4.5.

Kết quả xác định đường cong sinh trưởng ....................................................... 46

4.5.1.

Kết quả bệnh tích tế bào tại các thời điểm thu virus ........................................ 46

4.5.2.

Kết quả chuẩn độ hiệu giá virus ở từng thời điểm thu hoạch khác nhau ................ 48

4.5.3.

Đường cong sinh trưởng của virus ................................................................... 48

Phần 5. Kết luận và kiến nghị...................................................................................... 50
5.1.

Kết luận ............................................................................................................ 50

5.2.

Kiến nghị .......................................................................................................... 50

Tài liệu tham khảo .......................................................................................................... 52

v

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1. Thông tin các mẫu phân nghi mắc bệnh parvovirus .................................... 22
Bảng 3.2. Thành phần của phản ứng PCR.................................................................... 25
Bảng 3.3. Thông tin cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR (Canio Buonavoglia
et al., 2001) .................................................................................................. 25
Bảng 3.4. Chu trình nhiệt độ của phản ứng PCR ......................................................... 25
Bảng 3.5. Sơ đồ thí nghiệm xác định TCID50 .............................................................. 31
Bảng 4.1. Thông tin mẫu bệnh phẩm và kết quả chẩn đoán Parvovirus bằng
phản ứng PCR .............................................................................................. 34
Bảng 4.2. Kết quả chẩn đoán Parvovirus bằng phản ứng PCR .................................... 35
Bảng 4.3. Tỷ lệ (%) tương đồng về trình tự nt của các chủng Parvovirus trong
nghiên cứu này với nhau và với các chủng Parvovirus tham chiếu
khác. ............................................................................................................. 38
Bảng 4.4. Tỷ lệ (%) tương đồng về trình tự aa của các chủng Parvovirus trong
nghiên cứu này với nhau và với các chủng Parvovirus tham chiếu
khác. ............................................................................................................. 41
Bảng 4.5. Kết quả xác định hiệu giá Parvovirus trên đĩa nuôi cấy tế bào 96
giếng sau 96 giờ gây nhiễm ......................................................................... 45
Bảng 4.6. Bệnh tích tế bào tại các thời điểm thu virus ................................................. 46
Bảng 4.7. Kết quả chuẩn độ TCID50 của các chai gây nhiễm thu hoạch ở các
thời điểm khác nhau ..................................................................................... 48

vi


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 2.1. Cấu tạo của Parvovirus ................................................................................. 5
Hình 2.2. Sự phân bố của CPV-2a\2b\2c trên thế giới .................................................. 6

Hình 2.3. Tỷ lệ phần trăm và sự xuất hiện của các chủng CPV-2/CPV-2-like,
CPV-2a, CPV-2b, và CPV2C ....................................................................... 7
Hình 2.4. Cơ chế sinh bệnh của Parvovirus trên chó .................................................. 10
Hình 2.5. Chó bị tiêu chảy cấp, nơn mửa do Parvovirus ............................................ 12
Hình 2.6. Kit thử nhanh Canine Parvovirus (CPV) Ag .............................................. 14
Hình 4.1. Kết quả chạy PCR với cặp mồi định tính 555forc/555revc (Canio
Buonavoglia et al.,2001). Sản phẩm có kích thước theo dự kiến là
583bp ........................................................................................................... 33
Hinh 4.2.

Sự tương đồng về nucleotide giữa các chủng Parvovirus nghiên cứu
với một số chủng virus Parvovirus trên thế giới ......................................... 37

Hinh 4.3. Sự tương đồng về amino acid giữa các chủng Parvovirus nghiên cứu
với một số chủng virus Parvovirus trên thế giới ......................................... 40
Hình 4.5. Tế bào CRFK sau ni cấy 24h, 48h, 72h, 96h ........................................... 43
Hình 4.6. Hình ảnh đối chứng tế bào CRFK không gây nhiễm virus sau khi nuôi
cấy 24, 48, 72, 96 giờ .................................................................................. 44
Hình 4.7. Hình ảnh tế bào CRFK sau khi gây nhiễm virus 24, 48, 72, 96 giờ ............ 44
Hình 4.8. Hình ảnh bệnh tích tế bào và đối chứng âm của Parvovirus gây nhiễm
trên tế bào CRFK các thời điểm 12, 24, 36, 48, 72, 96 giờ ........................ 47
Hình 4.9.

Biểu đồ đường cong sinh trưởng của Parvovirus trên tế bào CRFK................. 49

vii


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Nghĩa tiếng Việt

PCR

Polymerase chain reaction

FPV

Panleucopenie feline

DICT

Dose Infectieuse Culture de Tissu

MDCK

Madin Darby Canine kidney

CRFK

Crandell Rees Feline Kidney

HI

Haemagglutination Inhibition

ELISA

Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay

cs

cộng sự

CPV2

Canine Parvovirus type 2

HA

Haemagglutination

IHC

Immunohistochemistry

Tm

Melting temperature

dNTP

Deoxynucleotide Triphosphate

PBS

Phosphate Buffered Saline

P: C: I

Phenol-chlorofrom-isoamyl-alcohol

MEGA

Molecular Evolutionary Genetics Analysis version

µl

Microlit

CPE

Cyto Pathogenic Effect

DNA

Deoxyribonucleic acid

RNA

Ribonucleoic acid

PBS

Phosphate buffered saline

TBE

Tris/Borate/EDTA

RT-PCR

Reverse Transcriptase Polymerase Chain React

nt

Nucleotide

aa

Amino acid

viii


TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
Tên tác giả: SoukSaVanh SISAMOUTH
Tên luận văn: ―Xác định một số đặc tính sinh học của Parvovirus gây tiêu chảy ở chó
ni tại Thủ đơ Viêng Chăn - CHDCND Lào‖
Mã số: 8640101

Ngành: Thú y
Tên cơ sở đào tạo: Học Viện Nơng nghiệp Việt Nam
Mục đích nghiên cứu

Nghiên cứu đặc tính sinh học của Parvovirus ở chó ni tại thủ đô Viêng ChănCHDCND Lào.
Phƣơng pháp nghiên cứu đƣợc sử dụng
- Phương pháp lấy mẫu
- Phương pháp tách DNA tổng số

- Phương pháp PCR.
- Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm
- Phương pháp giải trình tự gen
- Phương pháp phân lập parvovirus trên môi trường tế bào CRFK
- Phương pháp xác định hiệu giá virus (TCID50/ml);
- Phương pháp xác định đường biểu biễn sự nhân lên của virus;
- Phương pháp xử lý số liệu
Kết quả chính và kết luận
Kết quả chẩn đoán bằng phương pháp PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu
(555forc/555revc) (Canio Buonavoglia et al.,2001) cho thấy trong 24 có 22 mẫu dương
tính với Parvovirus chiếm tỷ lệ (92%).
Kết quả phân tích trình tự gen VP2 cho thấy 4 chủng virus trong nghiên cứu này
có mức độ tương đồng về nt và aa với nhau là 99 - 99,6% nt và 97,1 - 98,8% aa. Trong
đó 2 chủng L04 và chủng L12 có mức độ tương đồng cao về nt và aa với nhau tương
ứng là 99,6% và 98,8%. Kết quả phân tích về trình tự nt và aa suy diễn của đoạn gen
VP2 cho thấy chủng L04 có 7 aa sai khác với 3 chủng L05, L12, L14. Các vị trí aa sai
khác gồm vị trí 318 (CH), 320 (GA), 322 (TA), 380 (FS), 414 (RW), 429
(VG) và 430 (LS).
Kết quả phân tích cây phả hệ dựa trên trình tự nt gen VP2 của các chủng

ix


Parvovirus cho thấy 4 chủng L04, L05, L12, L14 đều nằm trên cùng 1 nhánh phát sinh
với các chủng Parvovirus gây bệnh trên chó có mối quan hệ gần gữi với các chủng nằm
trên Genotype 2c của Trung Quốc (GenBank: MF347723, KT156832, MF347725) và
chủng của Việt Nam (Genbank: LC214969).
Đã phân lập thành công parvovirus trên môi trường tế bào CRFK.
Chủng virus phân lập được có hiệu giá 106.13 TCID50/ml.

x


THESIS ABSTRACT
Master candidate: SoukSaVanh SISAMOUTH
Thesis title: Identify some biological characteristics of Parvovirus causing diarrhea in
dogs in Vientiane Capital - Lao PDR
Major: Veterinary

Code: 8640101

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA)
Research Objectives
Research on parvovirus biological characteristics isolated in dogs in Vientiane,
Lao PDR.
Materials and Methods used in the study
- Sampling methods
- Methods for DNA extraction
- PCR method.
- DNA electrophoresis method
- Methods for gene sequencing
- Method for parvovirus isolation on CRFK cells
- Methods for viral titration (TCID50 / ml)
- Methods for determination virus growth curve
- Data processing methods
Main findings and conclusions
Diagnostic results by PCR using specific primers (555forc / 555revc) (Canio
Buonavoglia et al., 2001) showed that in 24 samples, 22 were positive with Parvovirus (92%).
The results of the VP2 gene sequence analysis showed that the 4 virus strains in this
study have high nt and aa similarity with each other, ranging from 99 - 99.6% nt and 97.1 98.8% aa. In this, two strains L04 and L12 have higher similarity with each other, sharing

99,6% nt and 98,8% aa. Analysis based on the deduced aa of the VP2 gene showed that L04
strain had 7 aa difference with 3 strains L05, L12, L14 including positions 318 (CH), 320
(GA), 322 (TA), 380 (FS), 414 (RW), 429 (VG) and 430 (LS).
Phylogenetic tree analysis based on the VP2 gene sequence of Parvovirus strains
showed that 4 strains L04, L05, L12, and L14 belonged to the same branch of Genotype
2c, the same as Chinese strains (GenBank: MF347723, KT156832, MF347725) and
Vietnamese strain (Genbank: LC214969).
Parvovirus strain has been successfully isolated on CRFK cells.
Virus strain isolated with titer was 106.13 TCID50 / ml.

xi


PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Xã hội ngày càng phát triển và kèm theo đó là nhu cầu của con người
ngày càng tăng lên. Khi đã đạt được một mức độ ổn định cuộc sống thì việc
thỏa mãn đời sống tinh thần là cần thiết. Ngoài những trị chơi giải trí, thì việc
ni thú cưng cũng là một xu hướng mới. Khi động vật được đưa vào cuộc
sống nhiều hơn thì khi đó sức khỏe của chúng cũng được đề cao hơn, nhu cầu
chăm sóc sức khỏe, làm đẹp cũng tăng. Đặc biệt Lào có truyền thống ni chó
từ xa xưa, chó giống như là một người bạn trung thành. Với đặc thù bộ não
phát triển, thơng minh, nhanh nhẹn, giác quan nhạy bén, chó cịn có thể làm
nhiệm vụ phát hiện ma túy, thuốc nổ, trinh sát, bảo vệ biên giới lãnh thổ,... Vì
vậy, việc chẩn đốn phát hiện bệnh và cách phịng trị bệnh cho động vật là vô
cùng cần thiết. Đặc biệt ở chó bệnh do Parvovirus gây thiệt hại nặng nề với
khả năng lây nhiễm nhanh và gây nên tỷ lệ chết ở chó cao, thêm vào đó là đặc
thù khí hậu nóng ẩm mưa nhiều, rất thuận lợi cho vi sinh vật phát triển, làm
tăng nguy cơ bội nhiễm.
Bệnh viêm ruột tiêu chảy do Canine Parvovirus (CPV) là bệnh truyền

nhiễm cấp tính và thường gây tử vong cao ở chó, đặc biệt chó con dưới 1 năm
tuổi. Canine parvovirus (CPV) phát hiện vào năm 1978, nhưng chỉ trong vòng
hai năm sau đó đã trở thành bệnh mới ở chó trên tồn thế giới. CPVs là những
virus nhỏ, không vỏ được nhân lên bằng cách phân chia tế bào rất nhanh. Sự
nguy hiểm của bệnh là do khả năng lây lan rất nhanh và mạnh. Sự lây lan không
chỉ do tiếp xúc trực tiếp giữa vật mang bệnh và vật khỏe, mà cịn thơng qua các
hình thức gián tiếp khác. Parvovirus có 3 chủng: CPV 2a (phân lập 1984), CPV
2b (phân lập 1984), CPV 2c (phân lập 2000). Qua phân lập từ năm 1979 đến
1984, các nhà khoa học đã xác định phần lớn chó nhiễm hai chủng virus CPV 2a
và CPV 2b. Hiện tại, CPV 2a là chủng gây bệnh chủ yếu tại Ý và Đức, trong khi
CPV 2b phổ biến ở Mỹ, Đài Loan và Nhật Bản (Battilani et al.,2001; Martella et
al.,2004). Chủng CPV 2c có sự thay đổi (Asp426Glu) trên protein VP2, đây là
protein chịu trách nhiệm về tính kháng nguyên của chủng CPV 2b, đã được phát
hiện ở Việt Nam, Ý, Tây Ban Nha, Đức, Anh và Nam Mỹ (Decaro et al., 2007;
Nakamura et al., 2004).

1


Parvovirus nhiễm vào lớp biểu mô ruột non gây ra hiện tượng chết của
các nang cùng với sự mài mòn của lông nhung. Các động vật đã bị mắc bệnh
biểu hiện triệu chứng của trầm cảm, nôn mửa và tiêu chảy (giống như dịch nhày
ở viêm dạ dày- ruột gây xuất huyết), có thể dẫn đến cái chết trong vịng 1 vài
ngày. Bệnh xảy ra nhiều ở trên chó non từ 6-20 tuần tuổi với 2 thể bệnh hay gặp
là: Thể viêm cơ tim và thể kết hợp tim- ruột.
Theo kết quả nghiên cứu của (Nguyễn Văn Thanh và cs.,2016) cho thấy
bệnh viêm ruột tiêu chảy do Parvovirus có khả năng lây nhiễm nhanh, tỷ lệ chó
nhiễm và tỷ lệ chó chết khá cao, do đó cần phải tiến hành chẩn đốn nhanh và
chính xác, điều trị kịp thời bệnh viêm ruột tiêu chảy do Parvovirus gây ra để
giảm thiệt hại cho kinh tế, tinh thần, ngăn chặn dịch bệnh bùng phát. Những

nghiên cứu về Parvovirus gây bệnh trên chó còn rất hạn chế tại Lào, cho đến thời
điểm hiện tại chưa có nghiên cứu chuyên sâu về các đặc tính sinh học của các
chủng Parvovirus gây bệnh tại thực địa trên môi trường tế bào. Định hướng
nghiên cứu về phát triển chế phẩm điều trị và vaccine phòng bệnh viêm ruột tiêu
chảy do Parvovirus trên chó từ chính các chủng virus thực địa.
Xuất phát từ những vấn đề thực tế trên tôi thực hiện đề tài: ―XÁC ĐỊNH
MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA PARVOVIRUS GÂY TIÊU CHẢY
Ở CHĨ NUÔI TẠI THỦ ĐÔ VIÊNG CHĂN-CHDCND LÀO.‖
1.2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI
 Xác định một số đặc tính sinh học của chủng Parvovirus phân lập được
ngoài thực địa.
 Xác định một số đặc tính sinh học phân tử của chủng Parvovirus.

2


PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH VIÊM RUỘT TIÊU CHẢY DO
PARVOVIRUS
2.1.1. Tổng quan về bệnh viêm ruột tiêu chảy do Parvovirus
Là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm của lồi chó có tỉ lệ chết cao. Biểu hiện
lâm sàng đặc trưng là hiện tượng viêm dạ dày ruột có xuất huyết. Bệnh xảy ra
khắp nơi trên thế giới trong đó có Lào. Bệnh hay xảy ra với các giống chó:
Bergie, Labrador, Rottweiler, Dorberman, Yorshire terriers,...
Chó ở mọi lứa tuổi đều nhạy cảm với bệnh, thông thường hầu hết các
con trưởng thành đều có kháng thể, tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ tử vong trên chó
con từ 6-12 tuần tuổi rất đáng kể do có sự huỷ bỏ kháng thể mẹ truyền. Bệnh
có khả năng lây lan nhanh. Tỷ lệ mắc bệnh có thể lên đến 50%, tỷ lệ tử vong
trên chó con từ 50-100% (Bích, Thảo, Việt và Mai, 2013).
2.1.2. Tình hình nghiên cứu bệnh viêm ruột tiêu chảy do Parvovirus gây

ra trên thế giới
Đầu năm 1970, bệnh viêm ruột tiêu chảy do Parvovirus được phát hiện
trên chó con với các triệu chứng bệnh tích như sốt cao, nôn mửa, tiêu chảy,
phân lỏng lẫn máu, viêm dạ dày, viêm cơ tim,...quan sát được trên toàn thế
giới. Theo các nghiên cứu cho thấy CPV-2 là một virus sợi đơn DNA, khơng
có vỏ bọc, kích thước khoảng 5.2kp, bao gồm 2 khung đọc mở chính, một
khung là mã hóa 2 capsid protein [VP1] và [VP2] và một khung là mã hóa 2
protein khơng cấu trúc [NS1] và [NS2]. Sau đó, một loại Parvovirus mới đã
được phân lập trong nuôi cấy tế bào (Burtonboy et al., 1979; Johnson and
Spradbrow, 1979; Kelly, 1978). Loại virus này được đặt tên là Canine
Parvovirus loại 2 (CPV-2), để phân biệt nó với mơ tả trước Parvovirus
Canine Munite Virus (CMV hoặc CPV-1), đó là kháng nguyên không liên
quan đến CPV-2 (Carmichael & Binn, 1981).
Trong năm 1979 và 1980, một biến thể kháng nguyên của CPV được
xác định ở một vài quốc gia khác bằng việc sử dụng Monoclonal antibodies
(MAbs) và biến thể được cho là CPV loại 2a (Parrish, 1991). Giữa năm 1980,
virus thêm một biến đổi kháng nguyên, và biến thể mới này được gọi là CPV loại

3


2b (Parrish, 1991). Hiện nay, biến thể kháng nguyên của CPV đã thay thế hồn
tồn CPV-2 trước đó và được phân bố đa dạng ở khắp các lồi chó trên toàn thế
giới (Allen et al.,1998; D. Buonavoglia et al., 2000; MochizukI et al., 1993;
Steinel et al.,2000).
Sau khi bắt đầu và sự lây lan nhanh chóng của kháng nguyên các biến thể
2a và 2b, đã có rất ít bằng chứng về việc tiếp tục tiến hóa kháng ngun: phân
tích các dịng CPV phân lập từ các lồi mèo và chó trong nước hoặc mèo và chó
hoang dã đã chứng minh, khơng có hoặc một vài trường hợp ngoại lệ et al.,
2000; U Truyen et al.,2000), trong đó 15 năm qua, cả hai loại CPV 2a và 2b đều

giữ lại cấu tạo kháng nguyên được định nghĩa ban đầu (Parrish, 1991).
Hai biến thể kháng nguyên, CPV-2a và CPV-2b, hiện đang được phân phối
trên toàn thế giới (Uwe Truyen, 2006). Biến thể CPV thứ ba, có Glu-426 đột biến
và sau đó đặt tên thành CPV-2c, đã được phát hiện tại Ý năm 2000 (C.
Buonavoglia et al.,2001) và hiện đang lưu hành tại nước đó cùng với các loại
2a và 2b (Decaro et al., 2007; Martella et al., 2004). Các biến thể mới 2c cũng
đã được báo cáo trong Việt Nam bởi (Nakamura et al., 2004) những người đã
phát triển monoclonal antibodies (MAbs) có thể xác định cụ thể như một đột
biến (Ohshima et al.,2008), và gần đây tại Hoa Kỳ bởi (Hong et al., 2007) và
ở Nam Mỹ (Pérez et al., 2007). Gần đây, Minor Groove Binder (MGB) các
nghiên cứu đã được thiết lập để xác định đặc tính của các dịng CPV và sự có
mặt của các dạng đa hình nucleotide đơn trong bộ gen của các biến thể khác
nhau (Decaro et al.,2006). Các biến thể kháng nguyên khác với loại nguyên bản
CPV-2 đối với một vài amino acid trong protein VP2, trong khi sự khác biệt di
truyền giữa các biến thể chỉ được xác định bởi dư lượng 426, với các loại 2a, 2b,
và 2c hiển thị Asn, Asp và Glu, tương ứng (Parrish CR et al.,1991; Martella V,
Decaro N, Buonavoglia C) .
2.1.3. Tình hình dịch bệnh viêm ruột tiêu chảy do Parvovirus gây ra tại Lào
Ở Lào, cũng như ở các quốc gia khác ở châu Á, các chủng CPV-2a , CPV2b và CPV-2c khá phổ biến. Năm 2016 có một nghiên cứu về sinh học phân tử
của Parvovirus có tỷ lệ nhiễm khá cao 82.73%, và thuộc nhóm CPV-2a và CPV2c (Vannamahaxay et al.,2017). Mặc dù vậy, những thông tin về chủng này còn
khá hạn chế, do vậy, bài nghiên cứu này sẽ cung cấp thêm những thông tin về các
chủng phân lập ở CHDCND Lào.

4


2.2. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA PARVOVIRUS
2.2.1. Đặc điểm hình thái, cấu trúc hệ gen của Parvovirus
Parvovirus thuộc họ Parvovoridae, giống Parvovirus, lồi Canine
Parvovirus type 2.

Hình 2.1. Cấu tạo của Parvovirus
Nguồn: />
+Theo (Phạm Sỹ Lăng cs.,2006), Parvovirus là virus có kích thước nhỏ,
gây bệnh nhiều lồi thú (chó, mèo, chuột, lợn, trâu, bị). Parvovirus ở mỗi lồi
động vật là khác nhau. Chúng có kích thước 18– 24nm, nhân chứa DNA sợi đơn,
khơng có vỏ bọc, bộ gen 5323 nucleotide
+ Capsid có kích thước rất nhỏ (20nm), dạng khối đa diện, gồm 32
capsome với 60 tiểu đơn vị VP (viral protein) là VP1, VP2 (chiếm 90% tiểu đơn
vị protein) (Reed et al.,1988)
+ Lõi: DNA đơn, dạng thẳng. Hầu hết là DNA(-), ở hai đầu có đoạn
palindrom (đoạn DNA mạch kép có trình tự nucleotide trên mỗi sợi giống
nhau nhưng trái chiều nhau) tạo thành các nút kẹp tóc, có một đầu 3’-OH thay
cho mồi.

5


2.2.2. Phân loại và phân bố các type Parvovirus

Hình 2.2. Sự phân bố của CPV-2a\2b\2c trên thế giới
Nguồn: />
Từ bản đồ sự phân bố của các chủng CPV-2a/2b/2c trên toàn thế giới ta
có thể nhận thấy Parvovirus phân bố trên khắp thế giới với các chủng khác
nhau. Cụ thể, chủng CPV-2a phân bố nhiều ở khu vực Châu Á và Nam Phi
một phần ở vùng Nam Mỹ, chủng CPV-2b có thể thấy xuất hiện ở hầu hết các
châu lục, riêng chủng CPV-2c thì tập trung nhiều ở châu Mỹ Latinh và Châu
Âu. Chủng CPV2/ 2-like lại xuất hiện ở khu vực Bắc Mỹ, Đông Âu và Đông
Á với số lượng thấp.

6


Hình 2.3. Tỷ lệ phần trăm và sự xuất hiện của các chủng CPV-2/CPV-2-like,
CPV-2a, CPV-2b, và CPV2C
Nguồn: />
Parvovirus xuất hiện (1979) cho đến năm 1984 chỉ có 2 chủng virus là
CPV-2/2-like, CPV-2a. Đến năm 1984 trở đi thì có thêm sự xuất hiện của chủng
CPV-2b. Trong khoảng thời gian 1986-1996 thì chủng CPV-2a lưu hành chính. Từ
sau năm 1996 có thêm sự xuất hiện của chủng CPV-2c và cho đến nay chủng
CPV-2/2-like đã dần biến mất, chủng CPV-2b có xu hướng giảm, các chủng CPV2a và CPV-2c đang thịnh hành trên thế giới (Zhou, Zeng, Zhang, & Li, 2017).
2.2.3. Sức đề kháng của Parvovirus
Parvovirus đề kháng mạnh với môi trường bên ngồi. Trong phân thì
virus có thể tồn tại hơn 6 tháng ở nhiệt độ phịng. Nó đề kháng với tác động của
ete, chloruaform, axit và nhiệt độ (56oC trong 30 phút). Dễ bị tiêu diệt bởi ánh

7


sáng mặt trời, tồn tại kéo dài vào mùa đông (ơn đới). Theo (Du và Giao, 2006),
virus có thể tồn tại 1 – 2 tuần ở nhiệt độ 15 – 25oC.
2.2.4. Đặc tính ni cấy
Virus chỉ nhân lên trong nhân tế bào và gây bệnh tích tế bào trên tế bào
tim chó con cịn bú hay trên tế bào ruột. Theo (Du và Giao, 2006), virus phát
triển tốt trên môi trường tế bào thận chó, thận khỉ, chúng gây bệnh tích tế bào nên
người ta thường phân lập virus từ ni cấy trên các mơi trường.
2.2.5. Đặc tính kháng ngun
Sự nhân lên của Parvovirus ở chó làm xuất hiện kháng thể gây ức chế
phản ứng ngưng kết hồng cầu và phản ứng trung hoà huyết thanh. Kháng thể ức
chế phản ứng ngưng kết hồng cầu xuất hiện vào ngày thứ hai hoặc ngày thứ ba

sau khi nhiễm. Phản ứng này được sử dụng trong chẩn đoán huyết thanh học.
Phản ứng trung hồ huyết thanh rất khó thực hiện trong phịng thí nghiệm
(Nguyễn Như Pho, 2003).
2.2.6. Khả năng miễn dịch
Sau khi nhiễm bệnh, chó có miễn dịch kéo dài trong 3 năm, hiệu giá
kháng thể trung hòa hay ngăn trở ngưng kết hồng cầu trên những chó này sẽ lên
rất cao. Những chó con sinh ra trong khoảng thời gian này cảm nhiễm lúc 9 - 12
tuần tuổi. Sau 2 - 3 năm thì hiệu giá kháng thể sẽ giảm thấp, chó con sinh ra có
thể cảm nhiễm Parvovirus sớm hơn vào lúc 5 - 6 tuần tuổi.
Miễn dịch thụ động ở chó con có được do kháng thể mẹ truyền cho, kháng
thể này tồn tại khoảng 9 ngày và thường sẽ giảm đi vào khoảng tuần thứ 10 hay
11 sau khi sinh.
Ở chó con cịn bú có một thời kỳ nhạy cảm với sự xâm nhiễm virus nhưng
lượng kháng thể cịn sót lại đủ để trung hồ virus vaccine đưa vào. Ở ―thời kỳ
khủng hoảng‖ này, chó con khơng thể được tiêm chủng hiệu quả trong khi nó
cảm thụ hồn toàn với sự xâm nhiễm tự nhiên.
Một số kháng nguyên tương đồng giữa những dòng Parvovirus khác nhau
ở thú thịt như virus Panleucopenie feline (FPV), virus gây viêm ruột ở chồn
(MEV). Sự tương đồng này có thể được phát hiện bởi phản ứng trung hoà và
phản ứng HI. Mặc dù có sự tương đồng kháng nguyên nhưng nó có những giới
hạn riêng biệt trong tự nhiên, FPV chỉ gây nhiễm cho mèo, MEV chỉ gây nhiễm
cho chồn và CPV chỉ gây nhiễm cho chó (Zhou et al., 2017).

8


2.2.7. Đƣờng xâm nhập và cách truyền bệnh
Chất chứa căn bệnh: Dịch nôn, phân, nước tiểu, nước bọt nhưng nhiều
nhất là phân.
Cách truyền lây: Lây gián tiếp qua sự tiếp xúc với môi trường vấy bẩn

phân của động vật mắc bệnh hoặc trực tiếp từ chó bệnh sang chó khoẻ.
Đường xâm nhập: chủ yếu bằng đường hơ hấp, tiêu hóa.
Vật cảm thụ: Giống Parvovirus chỉ gây nhiễm cho họ chó: chó nhà, chó
sói... Chó ở mọi lứa tuổi đều mắc, chủ yếu là chó non từ 1 - 5 tháng tuổi mẫn
cảm nhất. Ở chó trưởng thành, thơng thường bệnh ít gây tác hại, nhưng đó là
nguồn dịch nguy hiểm trong tự nhiên (Du và Giao, 2006).
Tính cảm thụ: 100% đối với những quần thể chó chưa nhiễm. Bệnh
thường được biểu hiện trên chó con, gây chết hàng loạt cho chó con vì chó
trưởng thành được tiêm phịng hoặc cảm thụ tự nhiên. Bệnh có khả năng lây lan
nhanh. Tỷ lệ mắc bệnh cao, tỷ lệ tử vong trên chó con từ 50 - 100%.
Mùa mắc: Bệnh thường xảy ra quanh năm nhưng thường xuất hiện nhiều
khi thời tiết thay đổi đặc biệt mưa nhiều, độ ẩm cao.
Cơ chế sinh bệnh: Virus xâm nhập bằng đường miệng và mũi, thải ra
ngoài qua phân. Sau khi xâm nhập, đầu tiên virus nhân lên tại các mô lympho,
gây nhiễm trùng huyết. Trong quá trình gây nhiễm trùng huyết, virus đồng thời
nhân lên ở tế bào lympho và tế bào tuỷ xương dẫn đến giảm thiểu số lượng bạch
cầu, hậu quả là làm suy giảm miễn dịch. Virus nhân lên trong tế bào ruột dẫn đến
hoại tử biểu mơ ruột, bào mịn nhung mao ruột, gây viêm ruột, giảm hấp thu và
tiêu chảy rồi chết (Stanford university, 2000).
Theo Stephen J.E. et al. (1995), sự có mặt đồng thời của các virus như
Parvovirus, Care Adenovirus, Coronavirus, Rotavirus, Paramoyxovirus,... sẽ làm
tổn thương niêm mạc ruột, làm suy giảm sức đề kháng của cơ thể gây ra ỉa chảy
dạng cấp tính với tỉ lệ chết cao.
Ở những chó con khơng có kháng thể mẹ truyền, virus thường gây bệnh
tích trên cơ tim và gây ra bệnh ở dạng tim mạch.
Chỉ cần đưa một lượng nhỏ Parvovirus bằng 100 liều gây nhiễm mô nuôi
cấy DICT (Dose Infectieuse Culture de Tissue) đủ gây nhiễm cho chó. Điều này
cho thấy tác hại về mặt dịch tễ học do có lượng quá lớn virus trong phân (1 tỷ

9

DICT/g phân) chó mắc bệnh (Moraillon, 1993).
Qua đường miệng

Virus vào máu

Hạch bạch huyết và lách

Tuỷ xương

Ruột

Hoại tử những tế bào sinh lympho

Hoại tử biểu mô ruột

Giảm thiểu tế bào lympho

Viêm ruột/tiêu chảy

Chết

Khỏi bệnh

Hình 2.4. Cơ chế sinh bệnh của Parvovirus trên chó
Nguồn: Trần Thanh Phong, (1996)

2.2.8. Triệu chứng
Thời gian nung bệnh khoảng 5-7 ngày. Bệnh thường biểu hiện ở 3 dạng

chủ yếu như sau:
 Dạng điển hình (viêm dạ dày ruột xuất huyết):
Đây là dạng phổ biến nhất, thường mắc ở chó 6 - 12 tuần tuổi.
Virus gây thiệt hại nghiêm trọng đến đường ruột, chúng phân chia trong
các tế bào biểu mô ruột, gây hoại tử, viêm loét bong tróc các tế bào niêm mạc, vì
thế gây hiện tượng tiêu chảy - xuất huyết. Niêm mạc thường theo phân ra ngồi, .
Campylobacter và các ký sinh trùng khác có thể xâm nhập vào mạch máu nhiều
hơn qua những vùng niêm mạc bị bong tróc, từ đó tạo nên quá trình nhiễm trùng
thứ cấp.
Theo (Du và Giao, 2006), dạng này gặp phổ biến ở chó 6 tuần đến 1 năm
tuổi. Thời gian ủ bệnh ngắn từ 1 – 2 ngày. Lúc đầu, chó sốt nhẹ: 39 – 39,5ᵒC, cơn

10


sốt kéo dài 1 – 2 ngày, chó mệt, ăn kém hoặc bỏ ăn, uống nước nhiều, nôn
mửa liên tục. Sau đó, chó mệt lả vì ỉa chảy nặng và nhiều. Phân lỗng dần, có
nhiều máu đỏ nâu, màu hồng, có lẫn niêm mạc ruột lầy nhầy và có mùi tanh
khắm đặc trưng. Khi ỉa chảy cũng là lúc chó bị hạ nhiệt dưới mức bình thường
(37ᵒC). Chó gầy sút rất nhanh vì mất nước, mất máu, sốc do nội độc tố hoặc
nhiễm trùng thứ phát.
Huyết học: Chó bị bệnh thường bị mất nước trầm trọng, tăng thân nhiệt
(50%), giảm thiểu lượng bạch cầu (60 – 70% tổng số các trường hợp), chủ yếu
giảm bạch cầu trung tính và tế bào lympho đơi khi cịn ít hơn 400 – 500 bạch
cầu/mm3 trong những trường hợp nghiêm trọng (Du và Giao, 2006).
Thể quá cấp tính: Con vật chết sau 3 ngày do trụy tim mạch.
Thể cấp tính: Chết sau 5 – 6 ngày do hạ huyết áp và do tác động bội nhiễm
của vi khuẩn.
Tỷ lệ tử vong cao trên chó từ 6 – 10 tuần tuổi, chó đã qua 5 ngày mắc
bệnh thì thường có kết quả điều trị khả quan.

 Dạng viêm cơ tim:
Dạng này hay gặp ở chó con 4 – 8 tuần tuổi. Thể này ít phổ biến hơn thể
đường ruột.
Bệnh thường rất nặng, chó bị suy tim cấp do virus tấn công gây hoại tử cơ
tim. Con vật thường chưa biểu hiện triệu chứng gì đã lăn ra chết đột ngột do suy
hô hấp trong thời gian ngắn vì phổi bị phù. Do những biến đổi về bệnh tích ở van
tim và cơ tim, từ đó xuất hiện những tạp âm ở tim hay những biến đổi về điện tim
đồ (Nguyễn Như Pho, 2003).
Những trường hợp khác có thể thấy chó biểu hiện thiếu máu nặng, niêm
mạc nhợt nhạt, nhão. Lớp mỡ vàng và cơ tim có xuất huyết, chó chết nhanh từ 1
– 2 ngày (Phạm Sỹ Lăng và cs., 2006).
Chó con tồn tại được sẽ có sẹo trong cơ tim. Thể bệnh này có thể hoặc
không đi kèm với các dấu hiệu và triệu chứng của thể đường ruột. Tuy nhiên thể
này bây giờ đã hiếm trên thế giới.
 Dạng kết hợp tim – ruột:
Gặp ở chó 6 – 16 tuần tuổi. Con vật chết nhanh sau 24 giờ tính từ khi có
triệu chứng đầu tiên, do ỉa chảy nặng, thiếu máu, sốc tim và phù phổi.

11


Hình 2.5. Chó bị tiêu chảy cấp, nơn mửa do Parvovirus
Nguồn: Từ phịng khám tại thủ đơ Viêng Chăn.

2.2.9. Các phƣơng pháp chẩn đoán
 Chẩn đoán lâm sàng
Chẩn đoán bệnh trước tiên phải khám lâm sàng, dựa vào các triệu chứng
và yếu tố dịch tễ của bệnh: Mức độ gây nhiễm lớn; triệu chứng lâm sàng phần
lớn chó nhiễm bệnh có biểu hiện viêm ruột xuất huyết; sốt kéo dài từ khi phát
bệnh đến khi chó bị ỉa chảy nặng; nôn mửa, ủ rũ, bỏ ăn; đi ỉa chảy, phân thối

những ngày sau đó phân có màu hồng hoặc có lẫn máu tươi, có lẫn cả niêm mạc
ruột và chất keo nhầy, mùi tanh rất đặc trưng. Sau đó chó hôn mê, mất nước và
sút cân nhanh. Chết do ỉa chảy mất nước, mất cân bằng điện giải, sốc do nội độc
tố hoặc nhiễm trùng thứ phát.
Chất chứa virus: Phân, nước tiểu, nước bọt nhưng quan trọng nhất là phân.
Cần chẩn đoán phân biệt với các bệnh gây viêm ruột khác trên chó:
Viêm ruột do Coronavirus: Bệnh lây lan rất rộng nhưng khơng nguy hiểm
nhiều cho chó bệnh, tiêu chảy từ 6 – 14 ngày, con vật mất nước, tỷ lệ tử vong thấp.
Viêm ruột do Rotavirus: Bệnh gây tiêu chảy nhưng cách sinh bệnh chưa
được biết một cách rõ ràng.
Viêm ruột trong bệnh Care: Chó bệnh có triệu chứng hô hấp và thần kinh đặc
trưng, thường sốt cao trong nhiều ngày (40 – 410C), viêm phổi, viêm ruột (hiếm khi
có máu tươi), có thể gặp nhiều những nốt sài, mụn mủ ở vùng da ít lơng.

12


Viêm dạ dày ruột trong bệnh do Leprospira gây ra: Tiến trình bệnh xảy ra
nhanh với đặc điểm gây suy thận và nhiễm trùng huyết.
Ngồi ra cịn gặp các trường hợp viêm ruột ỉa chảy do ký sinh trùng (cầu
trùng trên chó, giun lươn, giun đũa, giun móc...).
 Phương pháp mổ khám
Khi virus vào trong cơ thể sẽ theo đường máu tới các cơ quan bộ phận và
gây tổn thương các cơ quan đó. Dựa trên cơ sở đó những ca bệnh chết khơng xác
định được ngun nhân có thể mổ khám quan sát bệnh tích đại thể chẩn đốn bệnh.
Tiến hành: Những con chết nghi mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do
Parvovirus sẽ được mổ khám để quan sát bệnh tích đại thể. Các bệnh tích đặc
trưng của bệnh bao gồm: Lách biến dạng, hạch màng treo ruột xuất huyết, ruột
xung huyết hay xuất huyết thành ruột non mỏng do có sự bào mịn của nhung mao
ruột, niêm mạc ruột bong tróc, gan có thể sưng, túi mật căng. Trong trường hợp mổ

khám quan sát thấy các bệnh tích đặc trưng như trên có thể chẩn đốn nghi con vật
nhiễm Parvovirus. Để chẩn đốn được chính xác chúng ta cần tiến hành phương
pháp hóa mơ miễn dịch.
 Phương pháp nhuộm hóa mơ miễn dịch
Nhuộm hóa mơ miễn dịch (Immunohistochemistry – IHC) là phương pháp có
độ chính xác cao cho phép phát hiện kháng nguyên tồn tại trong tổ chức. Phương
pháp này được thực hiện dựa trên nguyên lý là sự kết hợp giữa kháng nguyên và
kháng thể đặc hiệu và bằng chất chỉ thị màu theo nghiên cứu của Lan và cs. (2006).
 Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay- xét
nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme)
Nguyên lý: Phương pháp ELISA có rất nhiều dạng mà đặc điểm chung là
đều dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó
kháng thể được gắn với một enzyme. Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thường là
nitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một
chất có màu. Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng
thể với kháng nguyên và thông qua cường độ màu mà biết được nồng độ kháng
nguyên hay kháng thể cần phát hiện. Kĩ thuật này khá nhạy và đơn giản, cho
phép ta xác định kháng nguyên hoặc kháng thể ở một nồng độ rất thấp (khoảng
0,1 ng/ml). Trên thực tế người ta thường dùng test ELISA để chẩn đoán (Vương
Đức Chất và Lê Thị Tài, 2004)

13