Tính hiệu quả của kỹ thuật kích hoạt noãn trong thụ tinh ống nghiệm

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
-----------------------------------------------------

NGUYỄN THỊ TRÀ MY

TÍNH HIỆU QUẢ CỦA KỸ THUẬT KÍCH HOẠT
NỖN TRONG THỤ TINH ỐNG NGHIỆM

LUẬN VĂN THẠC SĨ
Chuyên ngành Công nghệ sinh học

Thái Nguyên – 2020


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
----------------------------------------------------

NGUYỄN THỊ TRÀ MY

TÍNH HIỆU QUẢ CỦA KỸ THUẬT KÍCH HOẠT
NỖN TRONG THỤ TINH ỐNG NGHIỆM
Ngành : Công nghệ sinh học
Mã số ngành: 84.20.20.1

LUẬN VĂN THẠC SĨ
Chuyên ngành Công nghệ sinh học

Người hướng dẫn khoa học:
PGS.TS. DƯƠNG VĂN CƯỜNG

Thái Nguyên -2020



i

LỜI CAM ĐOAN
Em xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu đề tài “ Tính hiệu quả của
kỹ thuật kích hoạt nỗn trong thụ tinh ống nghiệm” là trung thực, hoàn toàn
thực hiện tại Khoa Hỗ trợ sinh sản – Bệnh viện A Thái Nguyên. Ngoài ra, trong
bài báo cáo có sử dụng một số nguồn tài liệu tham khảo đã được trích dẫn rõ ràng
và được phép cơng bố.
Em xin hồn tồn chịu trách nhiệm về tính trung thực của các nội dung khác
trong đề tài của mình.
Học viên


ii

LỜI CẢM ƠN
Trong q trình học tập và hồn thành luận văn tốt nghiệp, em đã nhận được
sự giúp đỡ về nhiều mặt của các cấp lãnh đạo, các tập thể và các cá nhân.
Trước tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến giáo viên hướng dẫn
PGS.TS Dương Văn Cường đã ln tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt
q trình thực hiện và hồn thành luận văn này.
Em xin bày tỏ lời cảm ơn đến Bệnh viện A Thái Nguyên, Khoa Hỗ trợ sinh
sản cùng các cán bộ, quý đồng nghiệp đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn
thành đề tài nghiên cứu này.
Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới gia đình,

người thân và bạn bè đã động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và
thực hiện đề tài.
Em xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, tháng 11 năm 2020
Học Viên


iii

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................... ii
MỤC LỤC ............................................................................................................ iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT............................................................................ vi
DANH MỤC CÁC BẢNG.................................................................................. vii
DANH MỤC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ........................................................ viii
TRÍCH YẾU LUẬN VĂN ................................................................................... ix
MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1
1. Tính cấp thiết của đề tài ............................................................................... 1
2. Mục tiêu nghiên cứu ...................................................................................... 3
2.1. Mục tiêu chung ........................................................................................ 3
2.2. Mục tiêu cụ thể......................................................................................... 3
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn ....................................................................... 3
3.1. Ý nghĩa khoa học ..................................................................................... 3
3.2. Ý nghĩa thực tiễn ...................................................................................... 3
CHƯƠNG 1........................................................................................................... 4
TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................................... 4
1.1. Cở sở khoa học của vấn đề nghiên cứu .................................................... 4
1.1.1. Thụ tinh tự nhiên ................................................................................ 4
1.1.2. Tiếp xúc màng trong suốt ................................................................... 4

1.1.3. Phản ứng cực đầu............................................................................... 5
1.1.4. Xuyên màng trong suốt....................................................................... 7
1.1.5. Sự hịa nhập tinh trùng và nỗn ......................................................... 7
1.1.6. Hoạt hóa nỗn .................................................................................... 8


iv

1.2.7. Phản ứng vỏ và các cơ chế ngăn chặn đa thụ tinh ............................. 10
1.2.8. Sự hình thành và hịa nhập của hai tiền nhân .................................... 11
1.2. Thụ tinh trong ống nghiệm ..................................................................... 12
1.2.1. Kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bào tương nỗn (ICSI).......................... 12
1.2.2. Hoạt hóa nỗn nhân tạo ................................................................... 16
1.3. Tổng quan kết quả nghiên cứu tại Việt Nam và thế giới........................ 17
CHƯƠNG 2......................................................................................................... 19
ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19
2.1. Đối tượng, phạm vi nghiên cứu ................................................................ 19
2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................ 19
2.3. Trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất nghiên cứu ........................................... 19
2.3.1. Trang thiết bị....................................................................................... 19
2.3.2. Dụng cụ ............................................................................................... 19
2.3.3. Hóa chất nghiên cứu ........................................................................... 20
2.4. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 20
2.5. Phương pháp ............................................................................................. 20
2.5.1. Phương pháp kích hoạt nỗn .............................................................. 20
2.5.2. Các phương pháp đánh giá................................................................. 20
2.5.3. Phương pháp thu thập số liệu ............................................................. 25
2.5.4. Phương pháp xử lý số liệu .................................................................. 25
2.6. Quy trình ................................................................................................... 26
2.6.1. Chuẩn bị .............................................................................................. 26

2.6.2. Thực hiện............................................................................................. 26
CHƯƠNG 3......................................................................................................... 28
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .................................................. 28
3.1. Đánh giá ảnh hưởng của phương pháp hoạt hóa nỗn đến tỉ lệ thụ tinh sau
ICSI .................................................................................................................. 28


v

3.2. Đánh giá ảnh hưởng của phương pháp hoạt hóa nỗn đến chất lượng phơi
hữu dụng ngày 3 .............................................................................................. 30
3.3. Đánh giá ảnh hưởng của phương pháp hoạt hóa nỗn đến tỉ lệ lên phôi
ngày 5 và chất lượng phôi ngày 5.................................................................... 34
3.4. Đánh giá ảnh hưởng của phương pháp hoạt hóa nỗn đến tỉ lệ có thai ... 39
KẾT LUẬN ......................................................................................................... 41
KIẾN NGHỊ ........................................................................................................ 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 43


vi

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Viết tắt

Tiếng anh

Tiếng việt

LH

Luteinizing hormone

Hormone tạo hồng thể

AOA

Assisted oocyte activation

Hỗ trợ kích hoạt nỗn

Ca2+

Calcium ion

Ion canxi

cAMP

Cyclic adenosine monophosphate

Adenosine monophosphate mạch vòng

DNA

Deoxyribonucleic acid

Axit deoxyribonucleic

EBP

Egg-binding protein

Protein liên kết noãn

GVBD

Germinal vesicle breakdown

Giai đoạn vỡ túi tinh

hCG

Human Chorionic Gonadotropin

Hormone thai kì

ICM

Inner cell mass

Khối tế bào nội mơ

ICSI

Intra cytoplasmic Sperm

Tiêm tinh trùng vào trong noãn

IP3

Inositol triphosphate

Inositol triphosphat

IVF

Invitro fertilizaton

Thụ tinh trong ống nghiệm

MAPK

Mitogen activate protein kinase

Mitogen kích hoạt kinase protein

mRNA

Messenger Ribonucleic acid

RNA thơng tin

NF

Normal forms

Dạng bình thường

OAT

Oligoasthenoteratozoospermia

Tinh trùng ít - yếu - dị dạng

PESA

PPIP2

Percutaneous epididymal sperm
aspiration
phosphatidylinositol (4,5)bisphosphate

Chọc hút mào tinh hoàn qua da

phosphatidylinositol (4,5) -bisphosphat

PLCζ

Phospholipase C zeta

Phospholipase C zeta

RNA

Ribonucleic acid

Axit ribonucleic

TE

Trophectoderm

Tế bào lá nuôi

WHO

World Health Organization

Tổ chức Y tế Thế giới

ZP

Zona pellucida

Màng trong suốt


vii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Đánh giá tinh dịch theo tiêu chuẩn WHO 2010 ................................. 21
Bảng 2.2: Tiêu chuẩn đánh giá chất lượng phôi ngày 3 dựa theo chuẩn đồng
thuận của ALPHA 2011 ...................................................................................... 23
Bảng 2.3: Tiêu chuẩn đánh giá chất lượng phôi ngày 5 dựa theo chuẩn đồng
thuận ALPHA 2011 ............................................................................................. 24
Bảng 2.4: Xếp loại chất lượng phôi ngày 5 dựa theo chuẩn đồng thuận ALPHA
2011 ..................................................................................................................... 25
Bảng 3.1: Các trường hợp bất thường tinh trùng trong nghiên cứu.................... 28
Bảng 3.2: So sánh tỉ lệ thụ tinh giữa 2 nhóm nỗn điều trị và nhóm đối chứng 29
Bảng 3.3: So sánh chất lượng phơi ngày 3 giữa nhóm bệnh nhân sử dụng

phương pháp AOA và đối chứng ........................................................................ 30
Bảng 3.4: So sánh tỉ lệ lên phôi ngày 5 giữa 2 nhóm nghiên cứu và đối chứng 35
Bảng 3.5: So sánh chất lượng phơi ngày 3 giữa nhóm bệnh nhân sử dụng
phương pháp AOA và đối chứng ........................................................................ 38
Bảng 3.6: So sánh giữa 2 nhóm AOA và đối chứng ........................................... 39


viii

DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ
Hình 1.1: Phản ứng cực đầu ................................................................................. 6
Hình 1.2: Q trình hoạt hóa nỗn của tinh trùng ................................................ 9
Hình 1.3: Các đợt tăng Ca2+ sau khi tinh trùng xâm nhập ................................. 10
Hình 1.4: Nỗn thụ tinh ....................................................................................... 12
Hình 1.5: Tiêm tinh trùng vào bào tương nỗn ................................................... 14
Hình 3.1: Sự phát triển của phơi giai đoạn phân chia ......................................... 32
Hình 3.2. Hình ảnh phơi nang ............................. Error! Bookmark not defined.
Đồ thị 3.1: Chất lượng phôi ni ngày 5 giữa 2 nhóm nghiên cứu và đối
chứng...................................................................................................................34


ix

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
Nghiên cứu nhằm đánh giá hiệu quả sử dụng phương pháp hoạt hóa nỗn bằng
calcium ionomycin trong các trường hợp thụ tinh trong ống nghiệm sử dụng
phương pháp tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (ICSI) do tinh trùng ít, yếu và
dị dạng nặng, tinh trùng từ phẫu thuật thủ thuật.
Phương pháp: Nghiên cứu so sánh hai giá trị trung bình. Nỗn được chia thành
2 nhóm: Nhóm 1 gồm 30 bệnh nhân được thực hiện hỗ trợ hoạt hóa nỗn (AOA)

bằng calcium ionomycin 10 μM sau khi ICSI và nhóm 2 là nhóm đối chứng
(nghiên cứu hồi cứu) không thực hiện AOA sau ICSI. Tỉ lệ thụ tinh, tỉ lệ tạo phơi
có chất lượng khá/tốt, tỉ lệ lên phơi ngày 5 và tỉ lệ có thai được so sánh giữa hai
nhóm.
Kết quả: Nhóm 1 (ICSI + AOA) có 284 nỗn từ 30 chu kỳ điều trị ICSI do bất
thường tinh trùng nặng từ tháng 8 /2019 đến tháng 8/2020, nhóm 2 (ICSI) có 1445
nỗn từ 176 chu kỳ đã điều trị tại Bệnh viện A Thái Nguyên. Có sự gia tăng đáng
kể về tỉ lệ thụ tinh ở nhóm 1 so với nhóm 2 (93% so với 89%, P<0,05), sự khác
biệt này có ý nghĩa thống kê.
Các tỉ lệ khác có sự khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê giữa hai nhóm.
Kết luận: Phương pháp AOA có thể là tăng tỉ lệ thụ tinh của phương pháp ISCI
đối với các trường hợp bất thường tinh trùng nặng.


1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Năm 1978, sự kiện em bé thụ tinh trong ống nghiệm đầu tiên ra đời đánh dấu
bước ngoặt trong ngành y học thế giới [44]. Đến nay, ước tính đã có hơn 8 triệu
trẻ em ra đời từ IVF, hàng năm trên toàn thế giới có hơn 2 triệu trường hợp IVF
và các kỹ thuật tương đương được thực hiện. Ở các nước phát triển, có từ 1-5%
trẻ em ra đời từ IVF. Người ta ước tính mỗi năm số trường hợp thực hiện IVF trên
thế giới tăng khoảng 10%.
Thụ tinh trong ống nghiệm (IVF - Invitro Fertilizaton) ra đời kết hợp với Kỹ
thuật tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (ICSI – Intra cytoplasmic Sperm
Injection) đã giúp tỉ lệ thành công của IVF tăng đáng kể. Đây là một kỹ thuật rất
hiệu quả được sử dụng ở các cặp vợ chồng được chẩn đốn có bất thường tinh
trùng nghiêm trọng.
Mặc dù tỷ lệ thành công cao, thất bại thụ tinh sau ICSI vẫn xảy ra ở 1- 3% các

cặp vợ chồng. Tỉ lệ thụ tinh thường dao động trong khoảng 70-80%, trong đó có
các chu kì thất bại thụ tinh hồn tồn. Kết quả này có thể do nỗn khơng được
hoạt hóa hay bất thường nhiễm sắc thể (NST) của noãn hoặc tinh trùng. Sau ICSI,
nỗn khơng thụ tinh có thể chứa đầu tinh trùng cịn cơ đặc, tinh trùng cịn ngun
hay bị đẩy ra khỏi nỗn, tình trạng này phải chiếm 12% trong tổng số nỗn khơng
thụ tinh. Ngồi ra khoảng 7% nỗn trưởng thành chứa đầu tinh trùng có nhân chưa
được giải nén, DNA của tinh trùng hiện diện ở trạng thái NST chưa trưởng thành,
cịn cơ đặc. Chỉ có một vài xét nghiệm chẩn đốn hiện có sẵn để đánh giá lý do
thất bại trong thụ tinh ICSI. Việc thất bại thụ tinh dẫn đến giảm số lượng hoặc
không có phơi để chuyển là một thử thách cho những bệnh nhân thực hiện thụ tinh
trong ống nghiệm.
Những tinh trùng bất thường nặng, cụ thể là trường hợp chỉ có vài tinh trùng
trong mẫu (cryptozoospermia) hay tinh trùng đầu tròn (globozoospermia) khơng
có thể cực đầu, dẫn đến trong q trình di chuyển dễ thất thoát zeta (PLCζ) làm


2

giảm khả năng hoạt hóa nỗn từ đó dẫn đến nỗn khơng thể vượt qua giai đoạn
nghỉ trong phân bào, kết quả là thất bại thụ tinh [39]. Để giải quyết vấn đề thất bại
trong việc hoạt hóa nỗn, người ta đã nghiên cứu nhiều phương pháp để khởi phát
quá trình hoạt hóa nỗn. Hoạt hóa nỗn (AOA - Assisted oocyte activation) đang
ngày càng được áp dụng trong sinh sản có sự trợ giúp của con người để khơi phục
tỷ lệ thụ tinh và tỷ lệ mang thai ở các cặp vợ chồng có tiền sử thất bại trong thụ
tinh ICSI [22], [52]. Từ cuối những năm 1990 [35], nhiều trung tâm đã thực hiện
AOA trong nhóm bệnh nhân hiếm gặp này, cho tỉ lệ của thụ tinh và tỷ lệ mang
thai khả quan hơn ở nhiều cặp vợ chồng.
Hiện nay, nhiều phương pháp hoạt hóa nỗn nhân tạo khác nhau được sử dụng
như hoạt hóa bằng dịng điện, vật lý hay hóa học. Trong đó, phương pháp phổ
biến nhất là hoạt hóa nỗn sử dụng chất hóa học, bao gồm calcium ionophores,

như ionomycin và calcimycin (A23197), hoặc là tổ hợp protein tổng hợp như 6dimethylaminopurine (6-DMAP).
Bên cạnh việc thiếu hụt PLCζ dẫn đến khơng thể hoạt hóa nỗn, vẫn còn nhiều
nguyên nhân khác dẫn đến giảm tỉ lệ thụ tinh. Vì vậy, việc hoạt hóa nỗn nhân
tạo được cho rằng không phải phù hợp với tất cả trường hợp thất bại thụ tinh, mà
chỉ có hiệu quả với trường hợp tiền sử thất bại thụ tinh do tinh trùng bất thường
nặng khơng thể hoạt hóa nỗn [14], [48].
Sử dụng phương pháp hoạt hóa nỗn hiện nay được cho là phương án tối ưu
nhất đối với những trường hợp bất thường tinh trùng nặng nhằm cải thiện tỉ lệ thụ
tinh sau ICSI. Tuy nhiên, vẫn chưa có nhiều bằng chứng khoa học về tính an tồn
và hiệu quả về sử dụng phương pháp hoạt hóa nỗn nhân tạo nên kỹ thuật này vẫn
chưa thể được coi là một phương pháp điều trị thường quy.


3

2. Mục tiêu nghiên cứu
2.1. Mục tiêu chung
Đánh giá hiệu quả của phương pháp hỗ trợ hoạt hóa nỗn bằng hóa học trong
thụ tinh ống nghiệm.
2.2. Mục tiêu cụ thể
Đánh giá hiệu quả của phương pháp hỗ trợ hoạt hóa nỗn bằng ionomycin tới
tỉ lệ thụ tinh, chất lượng phơi ngày 3, tỉ lệ lên phôi ngày 5, chất lượng phơi ngày
5 và tỉ lệ có thai của các trường hợp làm thụ tinh trong ống nghiệm.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
3.1. Ý nghĩa khoa học
Cung cấp thêm cơ sở khoa học cho áp dụng kỹ thuật hoạt hóa nỗn trên các
trường hợp bệnh nhân vơ sinh hiếm muộn bất thường tinh trùng.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở để tư vấn, áp dụng từ đó nâng cao
được tỉ lệ thụ tinh, có thai cho bệnh nhân đến khám và điều trị.

Xây dựng quy trình chuẩn để áp dụng thường quy đối với những bệnh nhân
bất thường tinh trùng.


4

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.Cở sở khoa học của vấn đề nghiên cứu
1.1.1. Thụ tinh tự nhiên
Sự thụ tinh là hiện tượng kết hợp giữa tinh trùng và noãn để tạo thành hợp tử
có bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội. Trong invivo, quá trình thụ tinh thường xảy ra ở
1/3 ngồi của vịi trứng. Sự thụ tinh diễn ra bên trong ống sinh dục nữ phụ thuộc
vào hai cấu trúc: cực đầu của tinh trùng và màng trong suốt của nỗn. Ba sự kiện
chính liên quan đến sự tương tác của tinh trùng và noãn gồm: 1) tinh trùng gắn
vào màng trong suốt; 2) tinh trùng xảy ra phản ứng cực đầu, phóng thích các
enzyme phân hủy và lộ ra màng cực đầu bên trong; 3) màng tinh trùng tương tác
với màng bào tương của nỗn và hai màng hịa vào nhau [49].
Để phát triển đầy đủ các đặc điểm cần thiết cho quá trình thụ tinh, sau khi xuất
tinh tinh trùng cần di chuyển đến hệ thống ống sinh dục nữ để trải qua các biến
đổi về phân tử, sinh hóa và sinh lý [38]. Các thay đổi được khởi phát bởi các tín
hiệu từ mơi trường, sự tương tác của tinh trùng với noãn và các yếu tố ngoại bào.
Sự biến đổi của tinh trùng bao gồm biến đổi trong độ di động, hoạt hóa, phản ứng
cực đầu, sự xâm nhập vào màng trong suốt, gắn kết với nỗn và sự hịa màng. Ở
người, sự thụ tinh có thể chia làm 6 giai đoạn:
- Tiếp xúc giữa tinh trùng và màng trong suốt
- Phản ứng cực đầu
- Xâm nhập qua màng trong suốt
- Hòa màng bào tương của nỗn
- Hoạt hóa nỗn

- Sự hình thành và hịa nhập ở hai tiền nhân
1.1.2. Tiếp xúc màng trong suốt
Sự gắn sơ cấp đầu là tương tác vật lý đầu tiên của các giao tử liên quan đến
nhận diện đặc trưng loài của cấu trúc và phân tử. Theo nguyên tắc, một phân tử


5

trên tinh trùng sẽ nhận diện và gắn với phân tử bổ sung trên vỏ của nỗn. Cấu trúc
chính liên quan đến sự gắn kết giữa các giao tử tương tự ở tinh trùng của các lồi
khác nhưng có sự khác biệt ở noãn. Cơ chế nhận diện giao tử ở động vật có vú
dựa trên tương tác protein – carbohydrate giữa tinh trùng và noãn.
Màng trong suốt (ZP – Zona pellucida) được cấu tạo chủ yếu bởi các
glycoprotein, đây là một cấu trúc đàn hồi được hình thành bởi mạng lưới sợi và
tơ trong đó bao gồm 4 lớp glycoprotein là ZP1, ZP2, ZP3 và ZP4. ZP3 chính là
nơi tinh trùng sẽ gắn kết và có nhiệm vụ khởi phát phản ứng cực đầu [25], [24],
[58] . ZP1, ZP3, ZP4 có vai trị hoạt hóa tinh trùng và khởi phát phản ứng cực
đầu. Sau khi xảy ra phản ứng cực đầu, ZP2 sẽ thay thế ZP3 tiếp tục giữ cho tinh
trùng gắn kết vào, để từ đó tinh trùng dễ dàng chui qua màng trong suốt để vào
khoang quanh nỗn. Trong khi đó, ZP1 chủ yếu là cầu nối để kết nối ZP2 và ZP3
với nhau.
Nhiều nghiên cứu cho thấy việc tiếp xúc và gắn kết với ZP3 của tinh trùng có
tính đặc hiệu lồi, nghĩa là chỉ có tinh trùng và màng trong suốt của nỗn cùng
lồi mới gắn kết được với nhau [43]. Như vậy, chức năng đầu tiên rất quan trọng
của màng trong suốt, đó là thực hiện vai trò như một rào cản hữu hiệu ngăn chặn
hiện tượng đa thụ tinh.
1.1.3. Phản ứng cực đầu
Thể cực đầu (acrosome) nằm ở phần đầu của tinh trùng, chiếm 1/2 đến 2/3 thể
tích đầu tinh trùng. Thể cực đầu tương đối rộng, có nguồn gốc từ thể golgi và là
một tiểu thể giống lysosome. Đây là nơi chưa những enzyme quan trọng giúp cho

tinh trùng có hể tiêu hủy và xuyên qua màng trong suốt để vào noãn. Thể cực đầu
có 2 lớp màng, màng ngồi nằm ngồi ngay dưới màng bào tương và màng trong
áp sát vào màng nhân tinh trùng, nơi chứa thông tin di truyền.


6

Khi tinh trùng vừa gắn với ZP3, phản ứng cực đầu sẽ xảy ra. Đây là một phản
ứng quan trọng cần thiết cho sự thụ tinh của tinh trùng vì chỉ những tinh trùng nào
đã xảy ra phản ứng cực đầu mới có thể xâm nhập qua màng trong suốt và hịa
nhập với màng bào tương nỗn. Tuy nhiên, để phản ứng cực đầu có thể xảy ra,
tinh trùng cần trải qua q trình hoạt hóa trước đó. Đây là q trình nhằm làm
thay đổi cấu trúc và tính bền vững của tế bào tinh trùng và là tiền đề cho phản ứng
cực đầu xảy ra. Trong in-vitro, hoạt hóa có thể xảy ra trong q trình chuẩn bị tinh
trùng. Khi phản ứng cực đầu được khởi phát, màng ngoài của cực đầu sẽ hòa với
bào tương của tinh trùng, giúp giải phóng các enzyme bên trong cực đầu. Trong
số đó quan trọng nhất là hyaluronidase và acrosin. Acrosin được dự trữ dưới dạng
tiền enzyme là pro-acrosin được chuyển hóa sang dạng hoạt động khi được phóng
thích nhờ phản ứng cực đầu. Cả hai enzyme này đều đóng vai trị quan trọng trong
sự xâm nhập của tinh trùng vào lớp vỏ quanh nỗn, nhưng cơ chế thực sự mà
chúng đóng góp vào việc này chưa được xác định rõ, bởi lẽ mạng lưới của tế bào
hạt chủ yếu chứa carbonhydrate hơn là acid hyaluronic, và các enzyme khác khác
của cực đầu như aryl sulphatase có thể cũng có vai trị kết hợp giúp tinh trùng xâm
nhập vào nỗn. Vì vậy, cần có thêm nhiều nghiên cứu để xác định vai trị của các
enzyme được phóng thích trong phản ứng cực đầu.

Hình 1.1. Phản ứng cực đầu [16]


7

Phản ứng cực đầu xảy ra với sự tham gia của ba thành phần chính là calcium
ion (Ca2+), sự hoạt hóa phospholipase và enzyme protein kinase [45]. ZP3 ban đầu
sẽ kích hoạt tyrosine kinase (dẫn đến sự gia tăng phosphoryl hóa protein tyrosine)
và sự tự phosphoryl hóa cụ thể G-protein dẫn truyền tính hiệu tương tác với các
enzyme gắn kết màng như phospholipase C và adenylate cylase. Sự hoạt hóa hai
enzyme dẫn đến sự gia tăng tín hiệu truyền tin thứ hai là cAMP, inositol
triphosphate (IP3) và diacylglycerol. Hậu quả của sự gia tăng tín hiệu truyền thứ
hai là sự hoạt hóa protein kinase như cAMP-dependent kinase và Ca2+
phospholipid dependent kinase với sự phosphoryl hóa protein. IP3 có thể làm tăng
nồng độ Ca2+ nội bào bằng cách phóng thích các Ca2+ từ nguồn dự trữ Ca2+ nội
bào. Sự gia tăng Ca2+ nội bào là hậu quả của sự kích thích thụ thể ZP3 do dịng
nhập vào từ mơi trường ngồi, phụ thuộc và sự hoạt hóa protein G, qua kênh Ca2+
và kèm theo sự xâm nhập của ion hydro dẫn đến sự gia tăng pH nội bào. Sự gia
tăng nồng độ Ca2+ cùng với nồng độ pH nội bào dẫn đến phản ứng cực đầu. Người
ta thấy rằng phản ứng cực đầu xảy ra trong suốt thời gian nồng độ Ca2+ tăng.
1.1.4. Xuyên màng trong suốt
Sau khi phản ứng cực đầu xảy ra, tinh trùng vẫn gắn với màng trong suốt tại
vị trí ZP2, tiếp theo tinh trùng sẽ phải xuyên qua màng trong suốt để đến và hòa
màng với màng bào tương noãn. Sự xâm nhập qua màng trong suốt xảy ra sau khi
tinh trùng trải qua hiện tượng tăng động và ly giải bằng enzyme. Hoạt động ly giải
bằng enzyme được thực hiện bởi một enzyme protease của thể cực đầu gọi là
acrosin. Nơi gắn kết của tinh trùng với ZP2 được cho là có vai trị tạo ra một vị
thế chắc chắn để tại đó tinh trùng chui qua màng trong suốt bằng một đường hẹp
tạo với bề mặt màng một góc 45 độ nhưng đơi khi cũng có thể xun vng góc
hoặc song song với bề mặt màng.
1.1.5. Sự hịa nhập tinh trùng và nỗn
Q trình hòa màng giữa các giao tử phụ thuộc vào nhiệt độ, pH và Ca2+. Sự
dung hợp xảy ra do dự hỗ trợ của các protein màng. Trong quá trình xâm nhập

8

vào màng trong suốt, tinh trùng mất dần cực đầu và chỉ màng cực đầu bên trong
là trực tiếp tương tác với màng trong suốt [9].
Bề mặt của màng noãn được cấu tạo bởi các vi lơng mao ngắn, có khoảng cách
đều nhau tạo thuận lợi cho sự dung hợp ở người, vi lơng mao hiện diện trên tồn
bộ bề mặt nỗn và khơng phân cực ở giai đoạn này. Màng bào tương tinh trùng
còn lại hòa với màng bào tương noãn và đánh dấu điểm xâm nhập. Tinh trùng thụ
tinh tiếp tục di chuyển một đoạn khoảng 20 giây sau khi gắn vào bề mặt nỗn [9].
1.1.6. Hoạt hóa nỗn
Sự trưởng thành tế bào chất: để có thể thụ tinh thành công va phát triển phôi
ở giai đoạn sớm, nỗn cần trưởng thành tế bào chất. Q trình này song song diễn
ra với q trình hoạt hóa tinh trùng gồm [9]:
- Nhân tố điều chỉnh pha M ( M – phase promoting factor – MPF) được biểu
hiện ở mức độ cao.
- Tăng nồng độ các nhân tố hiện diện trong noãn như c-mos, mitogen activate
protein kinase (MAPK) và hoạt động của p34cdc2.
- Trục xuất thể cực thứ nhất.
- Hầu hết quá trình phiên mã kết thúc trước GVBD và chuyển sang dự trữ
mRNA (Messenger Ribonucleic acid).
Các nhân tố hoạt hóa nỗn:
Trong q trình thụ tinh, sự xâm nhập tinh trùng vào nỗn ngồi việc cung
cấp các thành phần di truyền, còn gây một loạt các phản ứng sinh lý giúp nỗn
tiếp tục hồn tất q trình giảm phân và chuẩn bị cho q trình hình thành phơi
sau đó. Hiện tượng này gọi là hoạt hóa nỗn.
Sự kiện đầu tiên của q trình hoạt hóa nỗn là sự tăng các ion xuyên màng
bào tương. Ở người, tinh trùng tạo ra một dịng điện bên ngồi bằng cách hoạt hóa
kênh K+ được điều khiển qua cổng Ca2+.

9

Hình 1.2. Q trình hoạt hóa nỗn của tinh trùng [22]
Có ba giả thuyết cho sự hoạt hóa nỗn, trong đó giả thuyết dựa trên sự khuếch
tán các phân tử hiện diện trong bào tương tinh trùng được ủng hộ hơn cả. Các
phân tử này sẽ được chuyển vào bào tương nỗn khi dung hợp và kích hoạt các
sự kiện hoạt hóa [11]. Giả thuyết trên được gọi là mơ hình yếu tố hịa tan.
Đóng vai trị trung tâm trong sự huy động và phóng thích Ca2+ của sự thụ tinh
là phosphatidylinositol (4,5)-bisphosphate (PIP2). Sự gia tăng Ca2+ nội bào tự do
gần như là tín hiệu kích hoạt chuỗi các sự kiện dẫn đến sự hoạt hóa nỗn. Kết quả
của q trình hoạt hóa nỗn là nỗn vượt qua được giai đoạn block và phản ứng
vỏ xảy ra. Khi vừa xảy ra hiện tượng phóng nỗn, nỗn vẫn cịn đang ở giai đoạn
trung kì của giảm phân II. Sự xâm nhập của tinh trùng sẽ khởi phát hàng loạt các
hiện tượng nội bào giúp nỗn hồn tất giảm phân II để chuẩn bị hòa nhập nhân
với tinh trùng [6]. Trong vòng 1 đến 3 phút sau khi tinh trùng xâm nhập, trong tế
bào có sự gia tăng nồng độ Ca2+ nhờ vào sự phóng thích các nguồn dự trữ Ca2+ từ
lưới nội bào tương, với vị trí gia tăng đầu tiên là điểm tinh trùng xâm nhập. Các
đợt tăng Ca2+ thoáng qua đầu tiên sẽ được nối tiếp bởi hàng loạt những đợt tăng
Ca2+ tiếp theo ngắn hơn nhưng có cường độ cao, tạo nên những đợt sóng dao động
Ca2+. Khi quá trình thụ tinh đang tiếp diễn, cường độ và tần số các đợt sóng Ca2+
này giảm dần nhưng độ dài của chúng lại tăng lên cho đến khi hoàn toàn ngưng


10

hẳn [23]. Sự khởi phát các sóng Ca2+ từ kho dự trữ nội bào được cho là nhờ sự
kích hoạt của IP3 – một chất được xúc tác qua enzyme phospholipase C đặc hiệu
của tinh trùng, enzyme này được gọi là PLC zeta (PLCζ), hiện diện ở phần vỏ
xung quanh nhân của tinh trùng [39]. Enzyme PLCζ chịu trách nhiệm cho sự ly

giải PIP2 ở màng. Nỗn được kích thích điện tích nhờ kênh ion trên màng bào
tương. Sự thay đổi điện tích của màng bào tương là sự kiện quan trọng trong q
trình hoạt hóa nỗn [50].

Hình 1.3. Các đợt tăng Ca2+ sau khi tinh trùng xâm nhập [19]
1.2.7. Phản ứng vỏ và các cơ chế ngăn chặn đa thụ tinh
Các đợt sóng dao động Ca2+ cịn tạo ra phản ứng vỏ và nhiều phản ứng khác
để ngăn chặn hiện tượng đa thụ tinh. Hiện tượng này gồm 2 pha: (1) pha nhanh
và (2) pha chậm. Ở pha nhanh, khi tinh trùng vừa xâm nhập vào màng trong suốt,
sẽ xuất hiện sự biến đổi điện thế dọc theo màng bào tương nỗn. Sự biến đổi điện
thế nhanh chóng trong vịng một phần nghìn giây ngay khi có sự xâm nhập của
tinh trùng đầu tiên, kéo dài khoảng 60 giây và có tác dụng ngăn chặn sự xâm nhập
của tinh trùng thứ hai. Sau 60 giây, điện thế màng sẽ khôi phục lại như trước khi
thụ tinh. Sau pha nhanh, pha chậm diễn ra để tiếp tục duy trì ngăn chặn đa thụ tinh
nhờ sự biến đổi của màng trong suốt (phản ứng vỏ) và sự tái cấu trúc của lớp chất
nền bao bên ngồi của nỗn. Biến đổi này phải diễn ra trước khi điện thế màng
khơng cịn tác dụng ngăn chặn sự xâm nhập của tinh trùng.
Phản ứng vỏ giúp ngăn chặn hiện tượng đa thụ tinh, diễn ra như sau: ở mặt
trong của màng trong suốt có chứa những hạt vỏ có chứa các túi bài tiết bên trong.


11

Các hạt vỏ được tổng hợp trong quá trình tạo nỗn và được phóng thích cùng với
hiện tượng phóng nỗn. Khi tín hiệu dẫn truyền Ca2+ xảy ra, các hạt vỏ sẽ nhanh
chóng phóng thích các thành phần bên trong ra mơi trường. Các thành phần này
làm thay đổi tính chất của mặt trong màng trong suốt, làm màng trong suốt trở
nên cứng chắc hơn, làm ngăn cản sự xuyên màng của các tinh trùng khác.
Đối với những tinh trùng đã xuyên màng trong suốt, hiện tượng đa thụ tinh sẽ
được ngăn chặn nhờ sự tái cấu trúc của lớp vỏ ngồi của nỗn. Lớp vỏ ngồi của

nỗn được cấu tạo từ 2 nhóm protein: nhóm cơ bản gồm 25 loại glycoprotein
chính có nguồn gốc từ lớp nỗn hồng của noãn chưa thụ tinh. Ngay khi thụ tinh
xảy ra, một nhóm các protein khác gồm khoảng 12 loại có nguồn gốc từ hạt vỏ sẽ
được bài tiết. Các protein này sẽ nhanh chóng gắn lên lớp nỗn hồng, cũng nhóm
protein cơ bản biến đổi lớp chất nền quanh noãn thành lớp vỏ ngoài bảo vệ giúp
ngăn chặn sự xâm nhập tiếp theo của tinh trùng.
1.2.8. Sự hình thành và hịa nhập của hai tiền nhân
Sau khi noãn bào được hoạt hóa, q trình giảm phân của nỗn sẽ được tiếp
tục đến kỳ sau (anaphase), dẫn đến sự tống xuất thể cực thứ hai và sự thành lập
tiền nhân cái. Sự thành lập tiền nhân đực thường xảy ra chậm hơn do tinh trùng
phải trải qua một số thay đổi trong cấu trúc ở phần đầu, dưới tác động của một số
chất có trong bào tương nỗn.
Ở tinh trùng trưởng thành, nhiễm sắc thể tinh trùng ở dạng nén chặt do có
nhiều cầu nối disulfide (-SS-) giữa các protamin với DNA (khác với histone ở các
tế bào khác). Ngay sau khi đầu tinh trùng vào nỗn, màng nhân tinh trùng tăng
tính thấm, phình to và các yếu tố ở bào tương noãn bào tác động các thành phần
bên trong nhân tinh trùng. Các cầu nối disulfide ở các protamin bị khử thành nối
sulfhydryl (-SH), các protamin nhanh chóng tách rời và nhiễm sắc thể tinh trùng
duỗi ra bên trong nhân (tiền nhân đực), sau đó histone sẽ gắn vào nhiễm sắc thể
tinh trùng. Ngồi ra, tinh trùng cịn cung cấp trung thể, hình thành nên các vi sợi
tơ. Dưới sự hỗ trợ của các sợi tơ, cả hai tiền nhân đều trải qua cử động giống như
xoay tròn trong bào tương nỗn và dần tiến đến gần nhau về phía trung tâm của


12

noãn đã thụ tinh, cho đến khi sát vào nhau. Đồng thời, chromatin của tiền nhân và
các thể tiền hạt nhân (nucleolar precursor bodies – NPBs) được hình thành nhờ
những đợt sóng tổng hợp RNA (Ribonucleic acid) sớm. Sự tiếp xúc của cả hai
tiền nhân được thực hiện qua trung gian các vi thể được thành lập từ trung thể của

tinh trùng. Khi sự biệt hóa tiền nhân hồn tất, màng nhân rã ra và cả chất liệu di
truyền của hai tiền nhân hợp lại với nhau. Quá trình này gọi là sự hịa nhập nhân.
Sau đó q trình phân chia của hợp tử bắt đầu để hình thành phơi.

Hình 1.4. Nỗn thụ tinh
Nỗn thụ tinh có hình cầu, với 2 thể cực và 2 tiền nhân (pronuclei - PN) có
màng bao riêng biệt, kích thước bằng nhau, nằm sát nhau ở vùng trung tâm của
nỗn. Mỗi PN có số lượng và kích thước của các thể hạt nhân (NPB - nucleolar
precursor body) tương đương nhau, sắp xếp thẳng hàng tại vùng giao nhau của
màng 2PN.
1.2.Thụ tinh trong ống nghiệm
1.2.1. Kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (ICSI)
Giới thiệu kỹ thuật ICSI
Thụ tinh trong ống nghiệm (IVF – Invitro Fertilization) là sự kết hợp giữa
noãn và tinh trùng trong ống nghiệm để tạo thành phôi.
Kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (ICSI) được Palermo và cs. báo
cáo thành công lần đầu tiên trên người vào năm 1992, đánh dấu một bước tiến
quan trọng trong việc điều trị vô sinh nam. ICSI là phương pháp tiêm một tinh


13

trùng duy nhất vào bào tương noãn để chúng thụ tinh và phát triển thành phơi. Sau
đó phơi được chuyển vào tử cung người mẹ để tiếp tục phát triển bình thường.
Theo Nagy và cs. (1995), sự ra đời của kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bào tương
noãn (ICSI) đã giúp cho những bệnh nhân nam gặp các bất thường tinh trùng như
mật độ tinh trùng thấp, độ di động kém, hình dạng tinh trùng bất thường,.. được
điều trị vơ sinh một cách hiệu quả [30].
Trong quá trình ICSI, một tinh trùng duy nhất được tiêm trực tiếp vào bào
tương của một tế bào nỗn trưởng thành thơng qua q trình vi mơ. Đây là một

phương pháp hiệu quả để hỗ trợ sinh sản ở nam giới có các thơng số tinh dịch
dưới mức tối ưu, điển hình là tinh trùng phẫu thuật thủ thuật (PESA - percutaneous
epididymal sperm aspiration hay TESE – testicular sperm extraction), yếu ít – yếu
– dị dạng (OAT - oligoasthenoteratozoospermia) hoặc ở các cặp vợ chồng có tỷ
lệ thụ tinh thấp sau IVF cổ điển. Những lần mang thai đầu tiên sau ICSI đã được
báo cáo vào đầu những năm 1990 [35]. Với sự ra đời của ICSI, hầu như bất kỳ
loại tinh trùng nào cũng có thể thụ tinh tế bào nỗn, giúp cho đây trở thành phương
pháp điều trị vô sinh nam thành công nhất. Tỷ lệ thụ tinh lên tới 80% và tỷ lệ
mang thai lâm sàng lên tới 45% được theo dõi sau ICSI. Tỷ lệ thành công sau này
đã làm giảm nhu cầu xin tinh trùng hiến tặng ở các cặp vợ chồng bị vô sinh nam
nghiêm trọng [36].
Tinh trùng dùng cho ICSI có thể thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như tinh
dịch (xuất tinh tự nhiên) hay sử dụng các thủ thuật để lấy tinh trùng ở mào tinh,
mơ tinh hồn. Vì tinh trùng được tiêm trực tiếp vào bào tương nỗn, nên các bước
có tác dụng chọn lọc tinh trùng trong thụ tinh tự nhiên đều được bỏ qua như tinh
trùng di chuyển trong cơ quan sinh dục nữ, tinh trùng gắn với màng trong suốt,
tinh trùng tiếp xúc với màng bào tương và giải phóng DNA vào bào tương noãn.
Tinh trùng được chọn cho ICSI chủ yếu là tinh trùng có hình dạng bình thường và
khả năng di động cao.