Nghiên cứu chuyển gen CBF1 và đánh giá biểu hiện trên cây đậu tương (glycine max (l ) merill)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
--------------------------------------------

NGÔ THỊ BẢO OANH

NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN CBF1 VÀ ĐÁNH GIÁ BIỂU HIỆN
TRÊN CÂY ĐẬU TƯƠNG (GLYCINE MAX (L.) MERRILL)

LUẬN VĂN THẠC SĨ
CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái Nguyên, năm 2020


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
--------------------------------------------

NGÔ THỊ BẢO OANH

NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN CBF1 VÀ ĐÁNH GIÁ BIỂU HIỆN
TRÊN CÂY ĐẬU TƯƠNG (GLYCINE MAX (L.) MERRILL)
Ngành: Công nghệ sinh học
Mã số ngành: 8.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. NGUYỄN TIẾN DŨNG
2. GS.TS. NGƠ XN BÌNH

Thái Ngun, năm 2020


i

LỜI CẢM ƠN
Trang đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu nhà trường, Ban
chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm cùng các thầy
cô giáo trong Khoa đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề tài nghiên
cứu này.
Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc, gửi lời cảm ơn chân thành
tới GS.TS. Ngơ Xn Bình và thầy giáo TS. Nguyễn Tiến Dũng, giảng viên
khoa Công nghệ Sinh học và Cơng nghệ Thực phẩm đã tận tình chỉ bảo, giúp
đỡ và hướng dẫn em trong thời gian thực hiện luận văn.
Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới gia đình,
người thân và bạn bè đã động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và
thực hiện đề tài.
Em xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, ngày tháng năm 2020
Học viên

Ngô Thị Bảo Oanh


ii

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... i
MỤC LỤC ......................................................................................................... ii
DANH MỤC BẢNG BIỂU ............................................................................. iv

DANH MỤC HÌNH ẢNH ............................................................................... vi
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................... vii
MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài. .......................................................................................... 1
2. Mục tiêu nghiên cứu...................................................................................... 3
3. Những đóng góp mới của đề tài. ................................................................... 3
4. Ý nghĩa Khoa học và thực tiễn của đè tài luận án. ....................................... 3
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................... 4
1.1. Nguồn gốc và phân loại cây đậu tương. ..................................................... 4
1.2. Đặc tính chống chịu của cây đậu tương ..................................................... 5
1.3. Tình hình sản xuất đậu tương trong nước và trên thế giới. ........................ 6
1.3.1. Trên thế giới. ........................................................................................... 6
1.3.2. Tại Việt Nam. .......................................................................................... 8
1.4. Đặc điểm của gen CBF1 .......................................................................... 10
1.4.1. Đặc điểm gen CBF1 .............................................................................. 10
1.4.2. Các nghiên cứu về gene CBF1 .............................................................. 10
1.5. Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và quá trình chuyển gen vào cây
trồng ................................................................................................................ 12
1.5.1 Đặc điểm chung của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens .................. 12
1.5.2 Cấu trúc và chức năng của Ti-Plasmid .................................................. 13
1.5.3. Cấu trúc và chức năng T-DNA ............................................................. 13
1.5.4 Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens 14


iii

Chương 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .. 16
2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 16
2.1.1. Vật liệu thực vật .................................................................................... 16
2.1.2. Vật liệu di truyền ................................................................................... 16

2.1.3. Hóa chất................................................................................................. 16
2.1.4. Thiết bị thí nghiệm ................................................................................ 17
2.2. Địa điểm nghiên cứu ................................................................................ 18
2.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 18
2.4. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 18
2.5. Phân tích, đánh giá cây sau chuyển gen ................................................... 21
2.6. Chọn lọc dòng chuyển gen bằng phun chất diệt cỏ Basta ................ Error!
Bookmark not defined.24
2.7. Các chỉ tiêu đánh giá ................................................................................ 24
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 25
3.1. Kết quả biến nạp gen CBF1 vào giống đậu tương DT22, cọc chùm, Cúc Hà
Bắc thông qua vi khuẩn A. tumefaciens. ......................................................... 25
3.1.1. Kết quả biến nạp gen CBF1 vào giống đậu tương DT22. .................... 25
3.1.2. Kết quả biến nạp gen CBF1 vào giống đậu tương cọc chùm ............... 31
3.1.3. Kết quả biến nạp gen CBF1 vào giống đậu tương Cúc Hà Bắc ........... 37
3.2. Đánh giá đậu tương chuyển gen dương tính bằng sử dụng phương pháp
PCR. ................................................................................................................ 44
Chương 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...................................................... 47
4.1. Kết luận. ................................................................................................... 47
4.2. Đề nghị. ................................................................................................ 4847
TÀI LIỆU THAM KHẢO


iv

DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1. 1 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới những năm gần đây ...... 8
Bảng 1. 2 Tình hình sản xuất đậu tương tại Việt Nam những năm gần đây..... 9
Bảng 3. 1 Kết quả tạo đa chồi của các thí nghiệm chuyển gen CBF1 vào
cây đậu tương DT22 thông qua vi khuẩn A.

Tumefaciens………………………27
Bảng 3. 2 Kết quả chọn lọc mẫu biến nạp của các thí nghiệm chuyển gen CBF1
vào cây đậu tương DT22 thông qua vi khuẩn A. Tumefaciens. ...................... 28
Bảng 3. 3 Kết quả chuyển cây đậu tương sau biến nạp ra bầu đất của các thí
nghiệm chuyển gen CBF1 vào cây đậu tương DT22 thông qua vi khuẩn A.
tumefaciens ...................................................................................................... 29
Bảng 3. 4 Kết quả chuyển gen CBF1 vào cây đậu tương DT22 thông qua vi
khuẩn A. tumefaciens ...................................................................................... 30
Bảng 3. 5 Kết quả tạo đa chồi của các thí nghiệm chuyển gen CBF1 vào cây
đậu tương Cọc chùm thông qua vi khuẩn A. tumefaciens ............................... 33
Bảng 3. 6 Kết quả chọn lọc mẫu biến nạp của các thí nghiệm chuyển gen CBF1
vào cây đậu tương cọc chùm thông qua vi khuẩn A. tumefaciens. ................. 34
Bảng 3. 7 Kết quả chuyển cây đậu tương sau biến nạp ra bầu đất của các thí
nghiệm chuyển gen CBF1 vào cây đậu tương cọc chùm thông qua vi khuẩn A.
tumefaciens ...................................................................................................... 35
Bảng 3. 8 Kết quả chuyển gen CBF1 vào cây đậu tương cọc chùm thông qua vi
khuẩn A. tumefaciens ...................................................................................... 36
Bảng 3. 9 Kết quả tạo đa chồi của các thí nghiệm chuyển gen CBF1 vào cây
đậu tương Cúc Hà Bắc thông qua vi khuẩn A. tumefaciens............................ 38
Bảng 3. 10 Kết quả chọn lọc mẫu biến nạp của các thí nghiệm chuyển gen CBF1
vào cây đậu tương Cúc Hà Bắc thông qua vi khuẩn A. tumefaciens .............. 40


v

Bảng 3. 11 Kết quả chuyển cây đậu tương sau biến nạp ra bầu đất của các thí
nghiệm chuyển gen CBF1 vào cây đậu tương Cúc Hà Bắc thông qua vi khuẩn
A. tumefaciens ................................................................................................. 41
Bảng 3. 12 Kết quả chuyển gen CBF1 vào cây đậu tương Cúc Hà Bắc thông
qua vi khuẩn A. tumefaciens............................................................................ 42

Bảng 3. 13 Kết quả tách chiết DNA tổng số của các cây chuyển gen T0 ...... 44
Bảng 3. 14 Đánh giá biểu hiện gen ở cây chuyển gen T0 bằng PCR ............. 45


vi

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1. Sơ đồ cấu trúc Ti-plasmid dạng octopyne ......................................... 13
Hình 2 Sự tương tác giữa Agrobacterium với tế bào thực vật và cơ chế chuyển
T-DNA ............................................................................................................ 15
Hình 3. Sơ đồ quy trình biến nạp gen vào đậu tương ..................................... 19
Hình 4. Một số hình ảnh quá trình biến nạp gen CBF1 vào giống đậu tương
DT22 thơng qua vi khuẩn A. tumefaciens. ...................................................... 26
Hình 5. Hình ảnh cây chuyển gen tái sinh trên môi trường SEM (A) và ra ... 28
Hình 6. Cây đậu tương chuyển gen thu được sau quá trình biến nạp gen CBF1
vào giống đậu tương DT22 thông qua vi khuẩn A. tumefaciens. .................... 30
Hình 7. Kết quả biến nạp – tái sinh chồi chuyển gen CBF1 vào giống đậu tương
cọc chùm thông qua vi khuẩn A. tumefaciens. ................................................ 32
Hình 8. Kết quả mẫu biến nạp kéo dài chồi và ra rễ ....................................... 34
Hình 9. Cây đậu tương chuyển gen thu được sau quá trình biến nạp gen CBF1
vào giống đậu tương cọc chùm thơng qua vi khuẩn A. tumefaciens............... 36
Hình 10. Kết quả biến nạp – tái sinh chồi chuyển gen CBF1 vào giống đậu
tương Cúc Hà Bắc thông qua vi khuẩn A. tumefaciens .................................. 39
Hình 11. Kết quả mẫu biến nạp kéo dài chồi và ra rễ ..................................... 40
Hình 12. Cây đậu tương chuyển gen thu được sau quá trình biến nạp gen CBF1
vào giống đậu tương Cúc Hà Bắc thông qua vi khuẩn A. tumefaciens........... 42
Hình 13. Hình ảnh sàng lọc cây chuyển gen sau 3 ngày bằng Basta ............. 43
Hình 14. Kết quả phân tích PCR cây chuyển gen T0 ..................................... 46

vii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
CCM

Cocultivation medium - Môi trường đồng nuôi cấy

cDNA

Complementary DNA

CTAB

Hexadecyltrimethylammonium bromide

LB

Luria-Bertani

OD600

Mật độ vi khuẩn đo ở bước sóng 600 nm bằng quang phổ kế

PCR

Polymerase Chain Reaction

PCR

Polymerase Chain Reaction

RM

Rooting medium - Môi trường ra rễ

SEM

Shoot elongation medium - Môi trường kéo dài chồi

SIM

Shoot induction medium - Môi trường tạo đa chồi


1

MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài.
Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) thuộc họ Đậu (Fabaceae) là loại
cây trồng có giá trị dinh dưỡng và giá trị kinh tế cao. Các giống đậu tương trồng
ở Việt Nam thuộc giống phụ G. Soja, chi Glycine. Hiện nay, đậu tương trồng ở
Việt Nam có hai nguồn gốc, đó là các giống địa phương và các giống nhập nội
[1], [2].
Hạt đậu tương có hàm lượng protein từ 32% - 52%, chứa nhiều amino
acid không thay thế (lysin, triptophan, metionin, leucin...) và các vitamin (B1,
B2, C, D, E, K...) cần thiết cho cơ thể người và động vật. Ngoài giá trị dinh
dưỡng trong hạt, đậu tương còn là cây trồng lý tưởng trong hệ thống luân canh
do có khả năng cải tạo đất. Sản phẩm từ cây đậu tương được sử dụng rất đa
dạng như dùng trực tiếp hạt thô hoặc chế biến thành đậu phụ, ép thành dầu đậu

tương, nước tương, làm bánh kẹo, sữa đậu tương...đáp ứng nhu cầu đạm trong
khẩu phần ăn hàng ngày của người cũng như gia súc.
Việt Nam đứng thứ 3 thế giới, sau Trung Quốc, Thái Lan về lượng tiêu
thụ sữa đậu tương với khoảng 613 triệu lít/năm và thứ 7 thế giới tính theo bình
qn đầu người với 6,8 lít/người/năm. Theo Bộ Nơng nghiệp và Phát triển nông
thôn, đậu tương là một trong 4 loại cây trồng chủ lực, nhưng điều bất cập là
diện tích gieo trồng ngày càng giảm. Diện tích đất canh tác nơng nghiệp ngày
càng bị thu hẹp do sự phát triển của các ngành cơng nghiệp và dịch vụ. Bên
cạnh đó, nhu cầu về sản lượng hạt đậu tương để phục vụ cho phát triển chăn
nuôi, công nghiệp chế biến ngày một tăng. Sản lượng đậu tương không đáp ứng
đủ nhu cầu trong nước, do đó phải nhập khẩu từ các nước bên ngoài (Theo Tổng


2

cục Hải quan (GCO), trong 8 tháng đầu vụ Mùa 2016-2017, Việt Nam đã nhập
khẩu 919 nghìn tấn đậu tương trị giá 392 triệu USD).
Thêm nữa, tình trạng biến đổi khí hậu tồn cầu, hạn hán kéo dài, lượng
mưa khơng đều ở các vùng vào các thời điểm trong năm là một khó khăn lớn
cho sản xuất nơng nghiệp ở nhiều nước châu Á, châu Phi, Nam Mỹ… Ngoài
những tác động trực tiếp lên quá trình canh tác, biến đổi khí hậu cịn làm thu
hẹp diện tích. Sử dụng giống đậu tương biến đổi gen là một tiến bộ quan trọng
trong ngành sản xuất đậu tương của thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng.
Đậu tương được xem là cây trồng nhạy cảm với các biến đổi khí hậu.
Dưới điều kiện bất lợi của môi trường như: hạn, mặn, lạnh…sẽ làm giảm khả
năng điều hòa trao đổi chất, ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển
của cây, làm giảm năng suất cây trồng.
Gen CBF (C-repeat binding factor) là một nhóm gen có mặt trong nhiều
loại thực vật như: Arabidopsis, lúa mì, cà chua, cây cải… Có bốn thành viên
của họ CBF giữ vai trò quan trọng trong cây, giúp cây phản ứng với những

stresses phi sinh học, giúp các hoạt động trao đổi chất tiếp tục diễn ra không bị
ngừng trệ, làm tăng thời gian sinh trưởng và phát triển của cây. Dó đó sẽ góp
phần cải thiện năng suất cũng như chất lượng hạt. Ba gen CBF1, CBF2 và CBF3
nằm trên nhiễm sắc thể số 4 phản ứng với nhiệt lạnh [30] đã chứng minh vai
trò nâng cao tính chịu lạnh ở cây thơng qua cơ chế bảo vệ tế bào khi gặp điều
kiện bất lợi [31] trong khi gen CBF4 rất cần thiết cho phản ứng khi khơ hạn
xảy ra. Ngồi vai trị tăng cường khả năng chịu lạnh của thực vật gen CBF2 ở
Arabidopsis đã được chứng minh làm chậm q trình lão hóa của lá và kéo dài
tuổi thọ khoảng thời gian hai tuần [28].


3

Từ những lý do trên chúng tôi thực hiện đề tài luận án: “Nghiên cứu
chuyển gen CBF1 và đánh giá biểu hiện trên cây đậu tương (Glycine max
(L.) Merill)”.
2. Mục tiêu nghiên cứu.
 Nghiên cứu biến nạp gen CBF1 vào một số giống đậu tương của Việt Nam.
 Đánh giá biểu hiện của gen CBF1 trên cây đậu tương bằng phương pháp
PCR
3. Những đóng góp mới của đề tài.
- Kết quả đạt được của đề tài có giá trị khoa học và thực tiễn cao trong tiếp
cận nghiên cứu tạo dịng cây chịu stress, thích ứng với biến đổi khí hậu bằng
kỹ thuật chuyển gen ở thực vật.`
- Ứng dụng kĩ thuật PCR đã đánh giá được mức độ biểu hiện của gen
chuyển trong cây chuyển gen và bước đầu tạo được dòng đậu tương chuyển
gen mang gen .
4. Ý nghĩa Khoa học và thực tiễn của đề tài luận văn.
 Ý nghĩa về mặt khoa học:
Đề tài cho thấy một hướng đi mới trong công tác chọn tạo giống cây trồng

bằng phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens khác xa với
các phương pháp chọn giống truyền thống.
 Ý nghĩa thực tiễn:
Các giống đậu tương chuyển gen tạo ra từ kết quả của đề tài có thể sử
dụng làm vật liệu khởi đầu trong công tác chọn tạo giống chống chịu tốt với
điều kiện bất lợi của môi trường mang thương hiệu Việt Nam.


4

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Nguồn gốc và phân loại cây đậu tương.
Đậu tương là một trong những loại cây trồng mà loài người đã biết sử
dụng và trồng trọt từ lâu đời, vì vậy nguồn gốc của cây đậu tương cũng sớm
được xác minh. Những bằng chứng về lịch sử, địa lý và khảo cổ học đều công
nhận rằng đậu tương có nguyên sản ở Châu Á và có nguồn gốc từ Trung Quốc.
Cây đậu tương được thuần hóa ở Trung Quốc qua nhiều triều đại và được đưa
vào trồng trọt và khảo sát ở triều đại Shang (năm 1700 – 1100 B.C) trước công
nguyên.
Đậu tương [Glycine max (L.) Merrill.] là một trong những cây trồng có
vị trí quan trọng trong sản xuất nơng nghiệp. Ngồi giá trị dinh dưỡng trong
hạt, đậu tương còn là cây trồng lý tưởng trong hệ thống luân canh do có khả
năng cải tạo đất. Diện tích cây đậu tương ở nước ta 5 năm gần đây chỉ trên
170.000 ha, năng suất bình quân xấp xỉ 1,5 tấn/ha, sản lượng hạt trên 210 nghìn
tấn, thấp hơn nhiều so với năng suất bình quân của thế giới [32].
Nguyên nhân chính là do năng suất của giống không cao, tổn thất do sâu
bệnh hại trên đồng ruộng và sau thu hoạch lớn (hàng năm, ước tính thiệt hại về
số lượng sau thu hoạch đối với đậu tương khoảng 6,2 - 14%).
Chi Glycine từng được Carl Linnaeus đưa ra năm 1737 trong ấn bản đầu

tiên của quyển Genera Plantarum. Từ glycine có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp –
Glykys (ngọt) và có thể đề cập đến chất ngọt của củ ăn được sản xuất ở Bắc
Mỹ có dạng cây đậu thân leo, Glycine apios, nay là Apios Americana. Đậu
tương được trồng được xuất hiện đầu tiên trong quyển Species Plantarum của
Linnaeus, với tên gọị Phaseolus max L. Việc kết hợp Glycine max (L.) Merr.,


5

theo đề nghị của Merrill năm 1917, đã trở thành tên gọi chính thức được cơng
nhận của lồi này. [3], [33].
Cũng giống như các lồi cây trồng khác có thời gian thuần hóa lâu dài,
mối quan hệ giữa các lồi đậu tương hiện đại và các lồi mọc hoang có thể
khơng cịn dấu vết ở bất kỳ mức độ chắc chắn nào.
1.2. Đặc tính chống chịu của cây đậu tương
- Tính chịu lạnh của đậu tương
Nhiệt độ dưới 15oC có ảnh hưởng xấu đến nảy mần của hạt và sự hút
nước. Nhiệt độ dưới 13 - 15oC, giảm ra hoa, đậu quả và ảnh hưởng tới quang
hợp và bộ máy quang hợp. Tổn thương do lạnh thường gây hại màng tế bào, do
màng tế bào khơng có khả năng giữ cấu trúc của nó ở nhiệt độ thấp. Các mơ,
chẳng hạn như hạt phấn đang lớn dễ nhạy cảm với nhiệt độ thấp hơn các mô
khác và dẫn đến sự bất dục ở cây đậu tương.
- Tính chịu hạn của đậu tương
Các cây họ đậu nói chung, cây đậu tương nói riêng là cây có nhu cầu về
nước cao hơn các loại cây khác. Đó chính là do đậu tương có hàm lượng protein
và lipit cao, để tổng hợp 1 kg chất khơ cần 500-530 kg nước. Trong q trình
nảy mầm nhu cầu về nước của đậu tương chiếm 50% khối lượng hạt, trong khi
đó ở ngơ chỉ là 30%, lúa là 26% [3] [4].
Khi nghiên cứu các đặc tính chịu hạn của cây đậu tương về phương diện
sinh lý và di truyền đã cho thấy các đặc tính này liên quan liên quan chặt chẽ

đến đặc điểm hoá keo của nguyên sinh chất, đặc điểm của quá trình trao đổi chất.
Khả năng chịu hạn của cây đậu tương mang tính đa gen [4]. Chúng thể hiện ở
nhiều khía cạnh khác nhau như: sự phát triển của bộ rễ [11], [12], thời gian sinh
trưởng [13], cũng như bản chất di truyền của từng giống. Căn cứ vào đặc điểm
này, đậu tương được chia thành hai nhóm:


6

- Nhóm chịu được sự mất nước trong từng giai đoạn phát triển của cây.
- Nhóm chịu được sự thiếu nước trong tất cả giai đoạn phát triển của cây.
Trong những năm gần đây các nhà khoa học đã có nhiều thành cơng khi
nghiên cứu sâu hơn về tính chịu nóng, chịu hạn của cây đậu tương. Maitra và
Cushman (1994) đã phân lập được cDNA của LEA (late embryogeis abudant
protein) nhóm D-95 từ lá và rễ cây đậu tương khi bị hạn. Các tác giả khác đã
nghiên cứu khả năng chịu nóng, chịu hạn của cây đậu tương, tiêu biểu là cơng
trình đánh giá khả năng chịu hạn của các giống đậu tương nhập nội của Nguyễn
Huy Hoàng (1992) [4], nghiên cứu phân lập, xác định trình tự gen chaperonin
tế bào chất từ giống đậu tương đột biến M103; phân lập gen dehydrin liên quan
đến khả năng chịu hạn của cây đậu tương của Trần Thị Phương Liên (1999) [6],
Nguyễn Thu Hiền và cộng sự (2005) [5]. Nâng cao tính chịu hạn của cây đậu
tương bằng phương pháp đột biến thực nghiệm của Chu Hồng Mậu (2001) [7].
1.3. Tình hình sản xuất đậu tương trong nước và trên thế giới.
1.3.1. Trên thế giới.
Công tác tuyển chọn giống đậu tương trên thế giới hiện nay được tổ chức
bởi các tổ chức nghiên cứu quốc tế như INTSOY (Chương trình Nghiên cứu
Đậu tương Quốc tế), Trung Tâm nghiên cứu Nông nghiệp Quốc tế Australia
(ASIAR), Viện Quốc tế Nông nghiệp nhiệt đới (IITA), Mạng lưới Đậu đỗ và
Ngũ cốc Châu Á (CLAN). Với sự phát triển mạnh mẽ của di truyền học và công
nghệ sinh học, các hướng nghiên cứu và thành tựu nổi bật cải biến giống đậu

tương chống chịu các điều kiện bất lợi như: sâu bệnh, ngập úng, hạn hán, tình
trạng chua mặn và đất nghèo dinh dưỡng (FAO - Rapa, 2002).
Năm 2006, trạm Thử nghiệm Nông Nghiệp thuộc Đại học Bắc Dakota
(NDSU) đã phát triển giống đậu tương chuyển gen “G7008RR” kháng thuốc
trừ cỏ Roundup năng suất 6 tấn/ha. Đang nghiên cứu đưa vào sản xuất giống


7

Đậu tương có tính chịu hạn (Hiệp hội Hạt giống Mỹ, 2006), chịu sâu (Mosanto,
2006).
Trong tình hình biến đổi khí hậu tồn cầu như hiện nay, khơ hạn gây ảnh
hưởng bất lợi đến sự sinh trưởng và năng suất cây trồng. Trong các điều kiện
hạn, cây trồng thường có những phản ứng sinh lý chung, phức tạp để thích nghi
và tồn tại. Thực vật có cơ chế điều tiết chống chịu sự phân giải nước trong các
cơ quan có chức năng quang hợp. Riêng với các cây đậu đỗ trong đó có cây đậu
tương, một đặc tính bất lợi khi gặp khơ hạn là khí khổng khơng đóng kín hồn
tồn, làm trầm trọng sự thiếu nước của cây. Để thích ứng, loài cây này dựa vào
một loại protein gọi là Betta được cảm ứng tiết ra khi cây gặp hạn.
Bộ Nông nghiệp Mỹ, tháng 6/2004 đã thiết lập một dự án nghiên cứu làm
tăng vị trí cạnh tranh của đậu tương Mỹ trên thị trường thế giới dựa vào đa dạng
di truyền và tạo giống (Dự án nghiên cứu: Tăng cường vị thế cạnh tranh về đậu
tương trên thị trường tồn cầu thơng qua sự đa dạng di truyền và nhân giống
cây trồng. Trong dự án này, chọn tạo các dịng giống đậu tương có khả năng
chịu hạn là một trong những mục tiêu chính. Dự án đã thành lập đội ngũ nghiên
cứu tính chịu hạn gồm 3 lĩnh vực nghiên cứu chính: Sinh lý học – tìm hiểu và
đánh giá khả năng chịu hạn; Chọn giống - thực hiện các phép lai di truyền và
thử nghiệm đồng ruộng; Di truyền phân tử - sử dụng chỉ thị ADN để xác định
vị trí lập bản đồ các gen chịu hạn.
Tại Mỹ, nước sản xuất đậu tương lớn nhất thế giới, các nghiên cứu cơ bản,

các hướng chiến lược chọn tạo, cải thiện giống đậu tương rất được quan tâm.
Ngân hàng dữ liệu đã được thành lập, hộp tra cứu cho các nhà chọn giống đậu
tương, đây là các kết quả nghiên cứu liên kết giữa các nhà nghiên cứu di truyền
và sinh học phân tử đậu tương dùng để tra cứu, cập nhật, liên kết nghiên cứu
cơ bản phục vụ chọn giống đậu tương đang thực hiện. Chương trình Soybean


8

genomics, đồng thời đưa ra Chiến lược chọn giống đậu tương trong những năm
tới, hy vọng sẽ có nhiều kết quả nghiên cứu ứng dụng có tính chất đột phá về
cây đậu tương như được cải thiện rõ rệt về năng suất, tính chống chịu và chất
lượng.
Bảng 1. 1 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới những năm gần
đây
Diện tích

Năng suất

Sản lượng

(triệu ha)

(tạ/ha)

(triệu tấn)

2014

117,74

26,02

306,34

2015

120.90

26,74

323.30

2016

121,64

27,59

335,61

2017

123,89

28,49

353,02

2018

124,92

27,91

348,71

Năm

(Nguồn: FAOSTART,2020)
Qua số liệu bảng 1.1 cho thấy:
Về diện tích từ năm 2014- 2018 có tăng lên nhưng dao động trong khoảng
117,74 – 124,92 (triệu ha). Cao nhất năm 2018 tăng 7,18 (triệu ha).
Về năng suất và sản lượng không ngừng tăng trưởng cao nhất vào năm
2017 đạt 353,02 (triệu tấn). Trong vòng 5 năm từ 2014 – 2018 sản lượng tăng
42,40 (triệu tấn). Sản lượng tăng như vậy là do diện tích trồng trong những năm
gần đây tăng lên và đã được sử dụng các tiến bộ khoa học tiên tiến vào sản xuất.
1.3.2. Tại Việt Nam.
Công tác chọn tạo giống đậu tương ở Việt Nam hiện do 8 cơ quan
nghiên cứu tham gia: Viện Di truyền Nông nghiệp, Trung tâm Nghiên cứu
Đậu đỗ- Viện Cây lương thực và Cây Thực phẩm, Viện Khoa học Kỹ thuật


9

Nông nghiệp Miền Nam, Viện Lúa Đồng bằng Sông Cửu Long, Viện
Nghiên cứu Ngô, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Đại học Cần Thơ, Viện
nghiên cứu dầu và cây có dầu. Thành tựu về việc Chọn tạo giống đậu
tương chuyển gen có khả năng chống chịu cao, thích ứng rộng.
Bảng 1. 2 Tình hình sản xuất đậu tương tại Việt Nam những năm gần

đây
Diện tích

Sản lượng

Năng suất

(nghìn ha)

(ngàn tấn)

(tấn/ha)

2014

109,4

156,5

1,43

2015

100,8

146,4

1,45

2016

99,6

160,7

1,61

2017

68,4

101,7

1,49

2018

53,3

80,8

1,52

Năm

(Nguồn: Tổng cục Thống kê (GSO), Bộ Nông nghiệp và Phát triển
nông thơn, 2020)
Về diện tích: Diện tích gieo trồng đậu tương của nước ta chiếm tỉ lệ nhỏ
trong tổng diện tích gieo trồng và ngày càng có xu hướng giảm xuống. Nếu tính
từ năm 2014 thì đến năm 2018 diện tích đã giảm xuống 56,1 nghìn ha

Về mặt năng suất: tuy số lượng chưa đáp ứng đủ so với nhu cầu ngày một
tăng của nhu cầu trong nước, nhưng nhờ áp dụng những tiến bộ khoa học trong
việc chọn tạo giống và các biện pháp canh tác, năng suất đậu tương trong năm
năm gần đây đã tăng từ 1,43 tấn/ha (2014) lên 1,52 tấn/ha (2018) trong khi diện
tích gieo trồng giảm hơn nửa.
Hiện nay Bộ Tài nguyên và Môi trường đang ban hành qui định khung
(regulatory framework) đánh giá và xét duyệt các giống cây trồng chuyển gen


10

và sử dụng chúng trong thực phẩm và thức ăn chăn ni. Bộ cũng đang xây
dựng qui trình (Circular on the Procedure) chứng nhận an toàn sinh học cho các
sản phẩm chuyển gen, đây cũng là khung pháp lý cơ bản để khảo nghiệm đánh
giá và hợp thức hóa các cây trồng chuyển gen như: bông vải, đậu tương, bắp…
Bộ Nông nghiệp và PTNT cũng xây dựng các thông tư hướng dẫn xét duyệt
các sản phẩm chuyển gen (Circulars on the approval of GMO) được phép sử
dụng làm thực phẩm và thức ăn chăn nuôi
1.4. Đặc điểm của gen CBF1
1.4.1. Đặc điểm gen CBF1
Hoạt chất phiên mã liên kết với yếu tố điều hòa DRE / CRT và gây ra sự
biểu hiện gen COR (lạnh được điều hòa) làm tăng khả năng chịu lạnh của cây
trồng. Nó mã hóa một thành viên của họ DREB A-1 của họ hệ số phiên mã
ERF/AP2 (CBF1). Protein chứa một tên miền AP2. Có bốn thành viên của họ
CBF đáp ứng với stress phi sinh học của cây. Ba gen đầu tiên là CBF1, CBF2
và CBF3 rất cần thiết cho phản ứng với nhiệt độ lạnh, trong khi gen CBF4 rất
cần thiết cho phản ứng khi có khơ hạn xảy ra. Gen CBF1 này liên quan đến
phản ứng với nhiệt độ thấp và axit abscisic [36].
Ngồi vai trị trong việc tăng cường khả năng chịu lạnh của thực vật, sự
biểu hiện quá mức của gen CBF trong cây Arabidopsis đã góp phần làm chậm

quá trình khởi phát của lá lão hóa và kéo dài tuổi thọ của cây. Sự biểu hiện của
gen CBF cũng có thể ảnh hưởng đến sự biểu hiện của gen yếu tố phiên mã và
gen liên quan đến chuyển hóa protein, suy thoái và biến đổi sau dịch mã [28].
1.4.2. Các nghiên cứu về gen CBF1
Để khai thác tốt chức năng khác nhau giữa CBF1 (StCBF1) của khoai tây
trồng và CBF1 (ScCBF1) của khoai tây hoang dại Commerson, nhóm nghiên
cứu của Jian Li thuộc Đại học Nông nghiệp Sơn Đông đã cho biểu hiện thành


11

cơng hai gen này trong cây Arabidopsis với hai dịng khác nhau. Tất cả cây
chuyển gen ấy đều biểu hiện kiểu hình lùn, trổ bơng muộn, lá dầy hơn và điểm
những chấm hồng. Tuy nhiên, dòng chuyển gen ScCBF1 biểu hiện sự chống
chịu đáng kể đối với lạnh giá và khơ hạn hơn dịng chuyển gen StCBF1. Mức
độ thể hiện của nhiều gen liên quan đến chịu lạnh và phát triển, bao gồm các
gen ức chế cây tăng trưởng và trổ bông muộn, cũng cao hơn trong tất cả các
cây chuyển gen.
Kết quả cho thấy hai gen CBF1 có vai trò quan trọng trong phản ứng của
cây đối với stress phi sinh học, tăng trưởng và phát triển. Tuy nhiên, ScCBF1
có chức năng rõ hơn StCBF1 [37].
+ Nhóm tác giả: Li Y, Song Y, Xu B, Xie J, Zhang D, Cooke J thuộc
trường đại học khoa học và công nghệ sinh học, Đại học Lâm nghiệp Bắc Kinh,
Bắc Kinh, Trung Quốc đã tiến hành nghiên cứu “Hoạt động đặc biệt của gen
CBF1 cây dương trong một mạng lưới điều hòa lạnh tích hợp”. Các yếu tố liên
kết C-repeat (CBFs), cũng được gọi là thành viên nhóm protein yếu tố phản
ứng mất nước (DREB1), đóng vai trị quan trọng trong việc thu nhận khả năng
chịu stress, nhưng trong cây, các cơ chế cơ bản của khả năng chịu stress vẫn
cịn khó nắm bắt. Để hiểu rõ hơn về các cơ chế này, nhóm nghiên cứu đã phân
lập năm orthologs CBF1 từ bốn phần cây dương (Populus spp). Và đánh giá biểu

hiện của chúng trong điều kiện hạn hán, lạnh, nhiệt và muối.
Biểu hiện trên toàn phần gây ra trong phản ứng với lạnh gợi ý một mối
tương quan giữa biểu hiện CBF1 dương tính và việc thu nhận khả năng chịu
lạnh. Các phản hồi thay đổi giữa các phần có thể phản ánh các cơ chế chịu ứng
suất theo từng phần cụ thể, cho thấy ảnh hưởng của bối cảnh sinh thái đối với
sự phát triển khả năng chịu ứng suất trung gian CBF1 trong cây dương. Sau đó,
nhóm nghiên cứu đã sử dụng chiến lược tìm kiếm tồn bộ bộ gen trong Populus


12

trichocarpa để dự đoán 2263 gen mục tiêu CBF giả định; các gen được xác
định tham gia vào nhiều quá trình và con đường sinh học. Hầu như tất cả các
gen mục tiêu giả định có chứa nhiều yếu tố tác động cis mà trung gian phản
ứng với các tín hiệu môi trường và nội sinh khác nhau, phù hợp với vai trò quan
trọng của CBF1 trong một mạng lưới điều hịa lạnh tích hợp. Cuối cùng, phân
tích 528 cá thể của Populus simonii đã xác định sáu đa hình đơn nucleotide (tỷ
lệ phát hiện sai Q<0,10) đáng kể (P<0,005) kết hợp với sản xuất
malondialdehyde và rò điện phân, cho thấy tầm quan trọng tiềm năng của
PsCBF1 trong quy định một số chức năng liên quan đến màng tế bào. Phát hiện
của nhóm nghiên cứu cung cấp những hiểu biết mới về chức năng của PsCBF1
và làm sáng tỏ mạng lưới quy định trung gian CBF trong cây dương [38].
1.5. Vi khuẩn A. tumefaciens và quá trình chuyển gen vào cây trồng
1.5.1 Đặc điểm chung của vi khuẩn A. tumefaciens
A. tumefaciens là lồi vi khuẩn gram âm, có khả năng gây bệnh khối u cho
140 loài cây trồng [14] A. tumefacien là một trong hai loài vi khuẩn sống trong
đất gây ra bệnh khối u hình chóp (crown gall) ở các vị trí tổn thương của thực
vật hai lá mầm. Việc tạo thành khối u do quá trình tổng hợp amino acid mới và
các dẫn xuất của đường được biết chung là opine [15]; [16]. Loại opine tổng hợp
trong khối u như nopaline, octopine, agrocinopine, mannopine và agropine phụ

thuộc vào dịng Agrobacterium khởi đầu sự hình thành khối u. Octopyne và
nopaline là hai loại opine có nguồn gốc từ arginine và dễ dàng phát hiện nhất
trong mô khối u. Do đó nhiều dịng A. tumefaciens phổ biến được thiết kế theo
kiểu octopine hoặc nopaline. Agrobacterium chịu trách nhiệm đối với sự hình
thành khối u dị hóa một cách có chọn lọc opine mà nó tổng hợp được và sử dụng
opine như là một nguồn cacbon và nitơ.


13

1.5.2 Cấu trúc và chức năng của Ti-Plasmid
Ti-plasmid được phát hiện ở tất cả các chủng A. tumefaciens gây nhiễm và
tồn tại bền vững ở nhiệt độ dưới 30oC. Đây là một phân tử DNA dạng mạch
vòng, sợi kép và tồn tại trong tế bào như một đơn vị sao chép độc lập, có kích
thước khoảng 200 kb [17].
Trên Ti-plasmid, chỉ có vùng T – DNA được chuyển từ vi khuẩn sang
genome của các cây bị bệnh và tồn tại bền vững ở trong đó. Tuy nhiên, vùng
này lại khơng mã hóa những sản phẩm trung gian cho q trình chuyển T –
DNA mà cần có sự trợ giúp đặc biệt của các gen gây khối u nằm trên vùng gây
độc (Virulence Region – vùng Vir) và trên nhiễm sắc thể vi khuẩn. Vùng Vir
dài khoảng 40 kb đảm nhiệm chức năng gây nhiễm. Ở Ti-plasmid dạng octopin,
vùng Vir chứa tới 24 gen gây độc. Sản phẩm protein do các gen này mã hóa đã
kích thích sự tách biệt T – DNA, bao bọc che chở và giúp chúng tiếp cận với
genome cây chủ [18].

Hình 1. Sơ đồ cấu trúc Ti-plasmid dạng octopyne
1.5.3. Cấu trúc và chức năng T-DNA
T-DNA là nhân tố chính trong việc chuyển DNA ngoại lai vào tế bào thực
vật và hợp nhất với hệ gen nhân. Vị trí hợp nhất của T-DNA vào DNA thực vật
là hoàn toàn ngẫu nhiên [19], [21]. Các vùng tương đồng với T-DNA đã được

14

tìm thấy ở các Ti-plasmid khác nhau. Trong các dịng Agrobacterium
tumefaciens kiểu nopaline được sử dụng phổ biến. Vùng T-DNA có kích thước
khoảng 24 kb. T-DNA được giới hạn bởi đoạn trình tự lặp lại gần như hồn
tồn khoảng 25 bp gọi là đoạn biên [20].
Ở Ti-plasmid nopaline vị trí tmr mã hóa một enzyme liên quan đến hệ thống
cytokinin và sự đột biến ở đây dẫn đến sự tăng sinh rễ từ các khối u đã gây ra ở
một số lồi. Các vị trí tms 1 và tms 2 liên quan đến sự tổng hợp khơng điều hịa
của auxin và sự đột biến một trong hai vị trí gây nên sự tăng sinh chồi từ các khối
u ở nhiều loại thực vật. Vì vậy, T-DNA mang các gen (tms 1, tms 2 và tmr) mà
sản phẩm của chúng không chịu sự điều hịa bình thường của các con đường
chuyển hóa thực vật liên quan đến sự tổng hợp phytohormone. Do đó các gen
tms 1, tms 2 và tmr được xem là các gen gây khối u [22].
1.5.4 Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens
Các tế bào thực vật bị tổn thương sẽ tiết ra các hợp chất hóa học dẫn dụ vi
khuẩn như: bám vào thành tế bào chủ và chuyển T – DNA vào tế bào thực vật
[23], [25]. Quá trình này được sự trợ giúp đặc biệt của các gen Vir và RB, LB.
Cũng chính các hợp chất này, với vai trị cảm ứng, giúp cho các gen vùng Vir
hoạt động và tăng cường biểu hiện.
Hoạt động của các gen Vir sinh ra sợi đơn T – DNA làm xuất hiện bản
copy sợi bên dưới của T – DNA [24]. Chỉ đoạn sợi đơn DNA giữa hai trình tự
biên (LB và RB) của T – DNA mới được chuyển vào tế bào thực vật, và được
gắn vào genome của tế bào. Đó là yếu tố hoạt động cis của hệ thống vận chuyển
T – DNA. Protein Vir D1, D2 đóng vai trị là chìa khóa trong bước này, chúng
nhận ra trình tự biên T – DNA và cắt sợi bên dưới tại mỗi bên. Điểm cắt là điểm
đầu và kết thúc của sợi tái sinh. Sau đó, protein Vir D2 vẫn cịn gắn kết với đầu
cuối 5’ của sợi T – DNA và tế bào thực vật [23], [25]. Nếu gây đột biến hay

15

loại bỏ đoạn RB thì hầu như mất hồn tồn khả năng chuyển T – DNA, còn nếu
đột biến LB sẽ làm giảm hiệu quả chuyển T – DNA [26]. Điều đó chứng tỏ
tổng hợp sợi T – DNA là từ đầu 5’ đến 3’, được bắt đầu từ đoạn RB và kết thúc
ở LB.
Phức hợp sợi đơn T-DNA-vir D2 được bao bọc bởi protein vir E2 có trọng
lượng 96 kDa. Sự phối hợp này giúp ngăn cản sự tấn công của nuclease, hơn
nữa sợi đơn T-DNA duỗi thẳng làm giảm kích thước của phức xuống xấp xỉ
2nm, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình di chuyển qua các kênh dẫn truyền
trên màng tế bào. Protein vir E2 chứa đựng hai tín hiệu định vị trong nhân tế
bào thực vật và một protein vir D2 [27].
Protein vir D4 cũng là bắt buộc đối với sự vận chuyển phức ss-T-DNA.
Chức năng của protein vir D4 là liên kết với ATP độc lập với phức protein
cần thiết đối với quá trình di truyền T-DNA [23].
Mơ hình mơ tả các sự kiện xảy ra ở mức phân tử trong sự tương tác giữa
tế bào thực vật và Agrobacterium để hình thành khối u.

Hình 2 Sự tương tác giữa Agrobacterium với tế bào thực vật và cơ chế
chuyển T-DNA


16

Chương 2
VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Vật liệu thực vật

Giống đậu tương: sử dụng giống đậu tương trồng phổ biến ở khu vực miền
núi phía Bắc: DT22, Cọc chùm, Cúc Hà Bắc do Trung tâm Tài nguyên Thực
Vật cung cấp.
2.1.2. Vật liệu di truyền
- Vector chuyển gen pER10-pUBQ14:CBF1
- Chủng vi khuẩn chuyển gen: EHA105
- Mồi đặc hiệu:
Gen bar:
Bar-F: 5’- ATGAGCCCAGAACGACG-3’
Bar-R: 5’-TCAGATCTCGGTGACGG-3’
Gen CBF1:
CBF1-F: 5’- ATCAGCGGCCGCATGAACTCATTTTCAGCTTT-3’
CBF1-R: 5’- ATAACTAGTTTAGTAACTCCAAAGCGACACG-3’
Các vật liệu trên do phịng thí nghiệm Sinh học phân tử, khoa Công nghệ
Sinh học và công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Nông Lâm – Đại học Thái
Nguyên cung cấp.
2.1.3. Hóa chất
Các muối đa lượng, vi lượng, vitamin là thành phần nền khoáng B5, MS.
Chất dẫn dụ Acetosyringone (AS), chất bổ sung: Yeast extract, L-Cysteine,
trypton, sucrose, agarose… và các thành phần hóa chất trong phân tích sinh học
phân tử được liệt kê theo các hãng sản xuất sau đây:
- Merk: Na2EDTA, NaCL, Tris-HCL, CTAB, Acetosyringone.
- Wako: β-mercaptoethanol, Phenol: Cloroform: Izoamyl alcohol
(25: 24: 1), Cloroform: Izoamyl alcohol (24:1), Izopropanol, Ethanol.