Giải mã gen kháng nguyên h, phân tích đặc điểm phân tử và xác định phả hệ nguồn gốc của canine distemper virus gây bệnh care ở chó tại hà nội

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

ĐỖ ĐỨC THÀNH

GIẢI MÃ GEN KHÁNG NGUYÊN H, PHÂN TÍCH
ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ VÀ XÁC ĐỊNH PHẢ HỆ
NGUỒN GỐC CỦA CANINE DISTEMPER VIRUS
GÂY BỆNH CARE Ở CHÓ TẠI HÀ NỘI
Ngành: Thú y
Mã số ngành: 8.64.01.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ THÚ Y
Người hướng dẫn khoa học:
1. TS. Đặng Thị Mai Lan - Đại học Nông Lâm Thái Nguyên
2. TS. Đoàn Thị Thanh Hương - Viện Công nghệ sinh học

Thái Nguyên - 2020


i

LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi được thực
hiện với sự giúp đỡ của:
- Ths. Đỗ Thị Roan, Ths. Nguyễn Thị Khuê, Ths. Phạm Thị Khánh
Linh, KS. Nguyễn Thị Thu Hiền cùng các anh, chị, em Phịng Miễn dịch học Viện Cơng nghệ Sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
- Chủ các Phòng khám Thú y tại quận Hà Đông, Nam Từ Liêm, Cầu
Giấy - Hà Nội đã ln tạo điều kiện tốt nhất để tơi hồn thành luận văn.
Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được
ai công bố trong bất kỳ cơng trình nào khác.

Tơi xin cam đoan rằng các thơng tin trích dẫn trong luận văn đều đã
được chỉ rõ nguồn gốc.

Thái Nguyên, ngày

tháng

năm 2020

Tác giả

Đỗ Đức Thành


ii

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, cùng với sự nỗ lực, cố gắng của bản thân,
tôi xin được đặc biệt bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cơ giáo: TS. Đặng Thị
Mai Lan và TS. Đồn Thị Thanh Hương, người đã trực tiếp hướng dẫn và
truyền đạt nhiều kinh nghiệm q báu cho tơi trong q trình nghiên cứu và
hồn thành luận văn.
Tơi xin được chân thành cảm ơn tới Ths. Đỗ Thị Roan, Ths. Nguyễn
Thị Khuê, Ths. Phạm Thị Khánh Linh, KS. Nguyễn Thị Thu Hiền cùng các
anh, chị, em Phòng Miễn dịch học - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Khoa
học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tơi trong q
trình nghiên cứu và hồn thành luận văn này.
Nhân dịp này tôi cũng xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu nhà
trường, Ban Chủ nhiệm Khoa Chăn nuôi Thú y, các thầy cô, các anh chị em
đồng nghiệp khoa Chăn ni Thú y, Chủ các Phịng khám Thú y tại quận Hà

Đông, Nam Từ Liêm, Cầu Giấy - Hà Nội đã luôn tạo điều kiện tốt nhất để tơi
hồn thành luận văn.
Lời sau cùng, xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới những người
bạn, người thân trong gia đình và nhất là bố, mẹ đã luôn kịp thời động viên và
tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất để tơi hồn thành luận văn.
Xin trân trọng cảm ơn tất cả sự giúp đỡ quý báu này.

Thái Nguyên, ngày tháng năm 2020

Đỗ Đức Thành


iii

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................. i
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................. ii
MỤC LỤC ....................................................................................................... iii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................... vi
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU ................................................................. vii
DANH MỤC CÁC HÌNH ............................................................................ viii
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
1. Tính cấp thiết của đề tài ................................................................................ 1
2. Mục tiêu nghiên cứu ...................................................................................... 2
3. Ý nghĩa của đề tài .......................................................................................... 3
3.1. Ý nghĩa khoa học ....................................................................................... 3
3.2. Ý nghĩa thực tiễn ........................................................................................ 3
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 4
1.1. Cơ sở khoa học của vấn đề nghiên cứu ...................................................... 4
1.1.1. Nguyên nhân gây bệnh ............................................................................ 4

1.1.2. Con đường xâm nhập và cách lây lan ..................................................... 4
1.1.3. Cơ chế gây bệnh ...................................................................................... 5
1.1.4. Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích ......................................................... 6
1.1.5. Chẩn đốn và phịng, trị bệnh ................................................................. 8
1.2. Cơ sở pháp lý của vấn đề nghiên cứu ...................................................... 14
1.2.1. Đặc điểm sinh học của virus Canine Distemper (CDV) ....................... 14
1.2.2. Tầm quan trọng của việc giải mã hệ gen virus Care ............................. 17
1.3. Tổng quan về tình hình nghiên cứu trên thế giới ..................................... 20
1.4. Tổng quan về tình hình nghiên cứu ở Việt Nam ........................................ 22
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU ............................................................................................... 24


iv

2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ............................................................ 24
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................ 24
2.1.2. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................... 24
2.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ......................................................... 24
2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 24
2.2.1. Tình hình chó mắc bệnh Care tại một số quận trên địa bàn Hà Nội ..... 24
2.2.2. Thu nhận mẫu bệnh phẩm nhiễm CDV ................................................ 24
2.2.3. Thu nhận gen kháng nguyên H bằng kỹ thuật PCR .............................. 24
2.2.4. Giải trình tự nucleotide và amino acid của gen H ................................ 24
2.2.5. So sánh tỷ lệ đồng nhất về nucleotide và amino acid của chủng CDV
Việt Nam với các chủng của thế giới .............................................................. 24
2.2.6. Xác định phả hệ nguồn gốc của các chủng CDV Việt Nam .................... 24
2.3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu ....................................................... 25
2.3.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................... 25
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu....................................................................... 26

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .................... 34
3.1. Kết quả về tình hình chó mắc bệnh Care tại một số Quận trên địa bàn
Hà Nội ............................................................................................................. 34
3.1.1. Tình hình chó mắc bệnh Care tại một số Quận ở Hà Nội ..................... 34
3.1.2. Tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo giống..................................................... 35
3.1.3. Tỷ lệ mắc bệnh Care theo lứa tuổi ........................................................ 37
3.1.4. Tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo mùa ....................................................... 39
3.1.5. Tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo nhóm đã được tiêm phịng và chưa
được tiêm phòng vaccine ............................................................................... 40
3.1.6. Những triệu chứng lâm sàng của chó mắc bệnh Care .......................... 42
3.2. Kết quả về số mẫu xét nghiệm và thu nhận gen H của chó mắc bệnh Care ...... 43
3.3. Kết quả phản ứng PCR và giải trình tự nucleotide, amino acid của
gen H ............................................................................................................... 45


v

3.4. Kết quả phân tích gen H và so sánh với các chủng của thế giới.............. 49
3.5. Kết quả phân tích phả hệ nguồn gốc của các chủng CDV Việt Nam ...... 55
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................ 58
1. Kết luận ........................................................................................................ 58
2. Đề nghị......................................................................................................... 59
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 60


vi

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

CDV:

Canine Distemper Virus

bp:

base pair (cặp base)

DNA:

Deoxyribonucleic acid

RNA:

Ribonucleic acid

CPE

Cyto pathogenic Effect

ELISA

Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay

IHC

Immunohistochemistry

IF

Immuno Fluorescent test

RT-PCR

Reverse Transcription Polymesase Chain Reaction

RT

Reverse Transcriptase

msf

multiple sequence file

dNTPs:

deoxynucleotide triphosphate

MEGA

Molecular Evolutionary Genetics Analysis

Epp:

Eppendorf

NCBI:

Ngân hàng gen

PCR:

Polymerase Chain Reaction


vii

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
Bảng 2.1. Bộ mồi thu nhận gen H ................................................................... 25
Bảng 2.2: Các bước tách chiết RNA tổng số .................................................. 27
Bảng 2.3: Thành phần phản ứng chuyển đổi cDNA từ RNA tổng số ............ 28
Bảng 2.4: Thành phần của phản ứng PCR ...................................................... 28
Bảng 2.5: Các bước tinh sạch sản phẩm PCR................................................. 31
Bảng 3.1. Tỷ lệ chó mắc bệnh Care tại 3 Quận ở Hà Nội............................... 34
Bảng 3.2. Tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo giống .............................................. 36
Bảng 3.3. Tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo lứa tuổi ........................................... 37
Bảng 3.4. Tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo mùa ................................................ 39
Bảng 3.5. Tỷ lệ chó mắc bệnh theo nhóm đã được tiêm và chưa được tiêm
phịng vaccine.................................................................................................. 40
Bảng 3.6. Triệu chứng lâm sàng chủ yếu của chó mắc bệnh Care ................. 42
Bảng 3.7. Các mẫu virus CDV sử dụng trong nghiên cứu ............................. 44
Bảng 3.8. Nồng độ RNA tổng số được đo bằng máy Nanodrop .................... 45
Bảng 3.9. Danh sách các chủng CDV của Việt Nam và thế giới
sử dụng trong nghiên cứu ................................................................................ 49
Bảng 3.10. Tỷ lệ đống nhất về nucleotide và amino acid giữa các chủng CDV
nghiên cứu và các chủng của thế giới ............................................................. 53


viii

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Mơ hình cấu trúc của virus Canine Distemper (CDV) .............................15
Hình 1.2. Hình thái của virus Canine Distemper ......................................................16
Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu ......................................................................................26
Hình 2.2: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR ...........................................................29
Hình 3.1. Biểu đồ tỷ lệ chó mắc bệnh Care tại 3 Quận ở Hà Nội .............................34
Hình 3.2. Biểu đồ tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo giống ............................................36
Hình 3.3. Biểu đồ tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo lứa tuổi .........................................38
Hình 3.4. Biểu đồ tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo mùa...............................................39
Hình 3.5. Biểu đồ tỷ lệ chó mắc bệnh theo nhóm đã được tiêm và chưa được tiêm
phịng vaccine............................................................................................................41
Hình 3.6. Sản phẩm điện di RNA các chủng CDV thu thập được ............................43
Hình 3.7. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân gen H của 2 mẫu CDV
nghiên cứu .................................................................................................................45
Hình 3.8. Trình tự nucleotide và amico acid (suy diễn) của gen H chủng
CDVHN7 ...................................................................................................................47
Hình 3.9. Trình tự nucleotide và amino acid (suy diễn) của gen H chủng
CDVHN6 ...................................................................................................................48
Hình 3.10. Sai khác nucleotide ở cuối gen H dẫn đến sự khác biệt của chủng virus
vaccine so với chủng virus nghiên cứu .....................................................................54
Hình 3.11. Cây phả hệ thể hiện mối quan hệ nguồn gốc giữa các chủng CDV nghiên
cứu và các chủng của thế giới ...................................................................................56


1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Bệnh Care hay cịn được gọi là bệnh sài sốt ở chó là một bệnh truyền
nhiễm cấp tính do virus Canine Distemper (Canine Distemper Virus - CDV)
gây ra. Đặc trưng của bệnh là sốt cấp tính, rối loạn tiêu hóa, hơ hấp và rối loạn

hệ thần kinh, đặc biệt bệnh có tỷ lệ chết rất cao (Nguyễn Như Pho, 2003).
Bệnh Care được phát hiện lần đầu tiên ở Peru từ thế kỷ XVIII và sau đó
lan ra tồn thế giới như Mỹ, Argentina, Brazil, Mexico, Nam Phi và nhiều
nước châu Âu. Ở châu Á, bệnh được ghi nhận tại Nhật Bản (Lan và cs.,
2006), Thái Lan (Kubo và cs.,2007), Hàn Quốc (Cha và cs.,2013) và Ấn Độ
(Swati và cs.,2015). Tại Việt Nam, bệnh xảy ra tương đối phổ biến và là một
trong những bệnh có tỷ lệ tử vong cao nhất ở chó. Chó mắc bệnh Care bao
gồm chó chưa được tiêm vaccine và cả những chó đã được tiêm vaccine (theo
ghi nhận của các phịng khám thú y).
Virus gây bệnh Care có hệ gen là RNA sợi đơn âm, có kích thước
khoảng 15.7kb, thuộc loài Canine morbillivirus, họ Paramixoviridae, chi
Morbillivirus. Hệ gen mã hóa cho 8 protein, gồm 2 protein khơng cấu trúc
(protein C và V) và 6 protein cấu trúc là nucleocapsid (N), matrix (M), fusion
(F), hemagglutinin (H), phospho (P) và large (L) protein. Trong đó, protein H
và protein F là 2 protein kháng nguyên, quyết định tính độc lực của virus. Đây
là các gen có nhiều biến đổi nhất giữa các chủng và giữa các genotype nên
được chọn là đối tượng chính cho nghiên cứu dịch tễ phân tử và nguồn gốc
phả hệ (Ke và cs.,2015).
Có ít nhất 14 genotype khác nhau của CDV đã được công bố, bao gồm:
Asia-1, Asia-2, Asia-3, Asia-4, Europe, European wildlife, Arctic, Rockbornlike, America-1, America-2, Africa, South America-1, South America-2 và
South America-3 (Espinal và cs., 2014; Guo và cs., 2013).


2

Ở châu Á, một số nước đã tiến hành nghiên cứu về đặc điểm phân tử và
xác định được nguồn gốc, genotype của các chủng CDV đang lưu hành. Một
số nghiên cứu cho thấy, các chủng CDV của Trung Quốc thuộc genotype
Asia-1, các chủng của Hàn Quốc thuộc về hai genotype Asia-1 và Asia-2 (An
và cs., 2008), trong khi các chủng CDV phân lập tại Ấn Độ lại tách riêng khỏi

nhóm Asia-1 và Asia-2, gần gũi với các chủng của Thụy Điển, Hungary và
Đức (Cheng và cs., 2015; Swati và cs., 2015). Gần đây đã phát hiện genotype
Asia-4 tại Trung Quốc và Thái Lan.
Gen H (mã hóa protein H) là một trong những gen biến đổi nhất được
dùng để xác định mối liên hệ di truyền giữa các chủng (Gámiz và cs., 2011).
Gen H có khả năng biến đổi cao, quyết định tính dinh dưỡng của tế bào và vật
chủ bằng cách liên kết với phân tử hoạt hóa tế bào lympho báo hiệu (SLAM)
và các thụ thể hoại tử -4 của vật chủ.
Tuy nhiên, nhiều sự kiện tiến hóa có thể đã tạo điều kiện cho CDV
thích nghi với các vật chủ khác nhau và phải được đánh giá bằng cách giải
trình tự bộ gen hồn chỉnh mới có khả năng xác định được (Duque-Valencia
J. và cs., 2019).
Xuất phát từ những điều kiện thực tiễn trên, tôi đã tiến hành nghiên
cứu đề tài: “Giải mã gen kháng nguyên H, phân tích đặc điểm phân tử và
xác định phả hệ nguồn gốc của Canine Distemper virus gây bệnh Care ở
chó tại Hà Nội”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Xác định được tình hình mắc bệnh Care trên chó tại một số quận trên
địa bàn Hà Nội.
- Nghiên cứu và xác định được gen kháng nguyên H, phân tích được
các đặc điểm phân tử, xác định được phả hệ nguồn gốc của virus CDV, xác
định genotype của chủng virus gây bệnh Care trên chó tại địa bàn Hà Nội.


3

3. Ý nghĩa của đề tài
3.1. Ý nghĩa khoa học
- Cung cấp tư liệu khoa học về gen kháng nguyên H, đặc điểm phân tử
và phả hệ nguồn gốc của virus CDV gây bệnh Care trên chó.

- Cung cấp thêm thông tin về thành phần, đặc điểm, cấu trúc gen kháng
nguyên H của virus CDV nhằm phát triển vắc xin tái tổ hợp.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
- Bổ sung thêm tư liệu về tình hình mắc bệnh Care trên chó tại Hà Nội
hiện nay.
- Là cơ sở khoa học để từ đó có thể lựa chọn vắc xin phịng, bệnh Care
có hiệu quả nhất.


4

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Cơ sở khoa học của vấn đề nghiên cứu
Bệnh Care được coi là bệnh cổ điển và phổ biến ở chó trên thế giới
cũng như tại Việt Nam. Bệnh gây thiệt hại rất lớn về kinh tế và là mối lo ngại
cho các nhà chăn ni và người ni chó. Ở Việt Nam trước đây, có thể nói
các bệnh về chó chưa được quan tâm đúng mức, ngoại trừ ở các trại nuôi và
huấn luyện chó nghiệp vụ. Tuy nhiên ngày nay, các bệnh này ngày càng được
quan tâm nhiều hơn do tầm ảnh hưởng của nó trong đời sống xã hội. Có rất
nhiều loại chó quý, đắt tiền đã được nhập về Việt Nam; nhiều bệnh viện, bệnh
xá thú y, phòng khám và các cơ sở chăm sóc chó mèo đặc biệt đã mọc lên trên
cả nước.
1.1.1. Nguyên nhân gây bệnh
Virus gây bệnh Care là một siêu virus có cấu trúc rất tinh vi thuộc
nhóm paramyxovirus.
Bệnh gây hại cho chó ở tất cả mọi lứa tuổi. Chó một tuổi trở xuống (2 6 tháng tuổi) dễ cảm thụ nhất, tỷ lệ mắc bệnh lên đến 70%. Chó đang bú mẹ ít
mắc bệnh, nếu chó mẹ có miễn dịch thì chó mẹ có thể truyền miễn dịch thụ
động cho chó con qua sữa đầu cho tới hơn 1 tháng, có khi tới 3 tháng.
1.1.2. Con đường xâm nhập và cách lây lan

1.1.2.1. Con đường xâm nhập
Virus CDV xâm nhập vào chó qua đường hơ hấp, tiêu hóa và da. Chó
thường bài thải virus sau 7 ngày cảm nhiễm, virus lẫn vào các hạt bụi trong
không khí và có thể tồn tại từ 6 - 22 ngày hoặc lâu hơn ngồi mơi trường.
Dịch chảy từ mắt, mũi trong cơn sốt đầu tiên của bệnh chứa rất nhiều virus.
Mầm bệnh được thải qua dịch tiết mắt, mũi, nước bọt, phân, nước tiểu…


5

1.1.2.2. Cách lây lan
Bệnh lây do tiếp xúc trực tiếp với con bệnh, con mắc thể ẩn tính, con
mang trùng hoặc gián tiếp do thức ăn, nước uống bị nhiễm những chất bài tiết
của con bệnh. Sự lây nhiễm nhanh hay chậm phụ thuộc vào mật độ chó ni
tại vùng đó và tỷ lệ chó được tiêm phịng. Đặc biệt, virus có thể xâm nhập vào
cơ thể qua da qua các vết thương hở (Nguyễn Vĩnh Phước và cs.,1978).
Mặc dù virus được bài tiết qua môi trường thông qua hầu hết các chất
dịch cơ thể, bệnh này ít có khả năng lây lan qua nước tiểu. Chất bài tiết qua
đường hơ hấp từ chó bị ho có thể gây bệnh (Hồ Đình Chúc và cs., 1993).
Thời gian ủ bệnh của CDV có thể thay đổi từ 1 đến 4 tuần. Ban đầu,
CDV lây nhiễm qua mô lympho đường hô hấp. Giai đoạn đầu virus nhân lên
và phân bố khắp các mơ bạch huyết của tồn thân, dẫn đến ức chế miễn dịch
và sốt. Giai đoạn thứ hai xảy ra từ 6 - 9 ngày sau khi nhiễm bệnh, các tế bào
nhu mô và biểu mô trên khắp cơ thể bị nhiễm trùng (Pope và cs., 2016).
1.1.3. Cơ chế gây bệnh
Khi vào cơ thể vật chủ, đầu tiên, virus nhân lên trong mô lymphoid của
hệ thống hô hấp, trong 24 giờ virus sẽ nhân lên ở đại thực bào và phát tán bởi
hệ lymphocyte tới hạch amydal và các hạch bạch huyết. 2 - 4 ngày sau số
lượng virus tăng lên nhanh chóng và xuất hiện trong máu, amydal, tuyến ức,
lá lách, hạch bạch huyết, tủy xương, mô bạch huyết. Trong 4 - 6 ngày tiếp

theo, lượng virus sẽ tăng lên nhiều lymphocyte ở lá lách, biểu mô dạ dày và
ruột, niêm mạc ruột và tế bào Kuffer trong gan. Sự lan truyền của virus trong
hệ bạch huyết gây ra cơn sốt đầu tiên, cùng lúc đó, virus tiếp tục phá hủy các
lympho bào (bạch cầu lymphô bào, bạch cầu lympho T) dẫn đến suy giảm
bạch cầu (Carter và cs., 1992).
Vào ngày 8 - 9 sau khi bị nhiễm, virus theo máu đến hệ thống thần
kinh trung ương và chó có biểu hiện thần kinh hay không phụ thuộc vào hệ
miền dịch dịch thể và miễn dịch tế bào cua vật chủ.


6

Ngày thứ 9 - 14 sau khi nhiễm trùng, hệ miễn dịch của chó bị suy giảm,
sức đề kháng kém, virus sẽ lan tràn trong các mô kể cả da, tuyến nội - ngoại
tiết, trong mô dạ dày, ruột, đường hô hấp, niệu quản. Virus tồn tại lâu dài
khiến triệu chứng lâm sàng của bệnh trở nặng tới khi con bệnh chết.
1.1.4. Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích
1.1.4.1. Triệu chứng lâm sàng
Canine distemper virus (CDV) là một bệnh rất dễ lây lan, chủ yếu liên
quan đến chó non và các động vật ăn thịt nhạy cảm khác với tỷ lệ mắc bệnh
và tử vong cao. Nhiễm trùng CDV được đặc trưng bởi tính chất dinh dưỡng
lympho, thần kinh và biểu mơ dẫn đến nhiễm trùng tồn thân với các dấu hiệu
lâm sàng nghiêm trọng và tử vong (Alessia Peserico và cs., 2019).
Biểu hiện bệnh và phụ thuộc vào độ tuổi của chó mắc bệnh, giống chó,
tình trạng sức khỏe, chế độ chăm sóc, ni dưỡng cũng như độc lực của mầm
bệnh (Greene và Appel, 1987).
Thời gian ủ bệnh chó mệt mỏi, ủ rũ, ít vận động, sốt cao 40 - 41°C kéo
dài 1 - 2 ngày, chó bỏ ăn, mắt đỏ, sau đó thân nhiệt trở về 38,5 - 39,5°C; chó
tỉnh táo hơn. 3 - 4 ngày sau, xuất hiện đợt sốt thứ 2 kèm theo chảy nước mắt,
nước mũi ban đầu lỗng sau đặc dần, đơi khi kèm mủ xanh hoặc máu đen.

Viêm niêm mạc miệng và hạch amidan. Chó ho do viêm thanh quản, viêm
phế quản rồi viêm phổi, ban đầu ho khan, sau ho ướt dẫn đến khó thở, nhịp
thở tăng rõ, suy nhược cơ thể, bỏ ăn, bạch cầu (lympho bào) giảm.
Chó có biểu hiện nôn khan, nôn liên tục, mệt lả, háo nước. Sau đó ỉa
chảy, lúc đầu phân lỏng có màu xám vàng lẫn bọt và niêm mạc dạ dày, ruột
lầy nhày kèm lẫn máu màu cà phê hoặc màu hồng nhớt như máu cá, có mùi
tanh khẳm điển hình, giai đoạn cuối phân sẽ gần như nước do virus CDV đã
làm hỏng hệ tiêu hóa. Chó mất nước và mất chất điện giải nên gầy sút nhanh,
mắt trũng, bụng hóp, đi lại không vững, nằm liệt một chỗ, nhiệt độ hạ, loạn
nhịp tim.


7

Gương mũi khơ và bong tróc, chảy nước mũi có màu xanh, thở khó, thở
khị khè. Da dầy lên, nổi các nốt chấm đỏ to bằng hạt đỗ xanh, hạt gạo ở
những vùng da mỏng, có thể loét, chảy mủ (gọi là các nốt sài) làm lông bết
lại, hôi hám, vết thương nhanh chóng lành, khơng hình thành sẹo. Màng kết
mạc sung huyết, mắt có nhiều ghèn, bị đục, có thể kèm thêm viêm giác mạc
mắt. Sau khi bị bệnh từ 10 đến 15 ngày, ở khoảng 80 - 90% số con bị bệnh, da
ở gan bàn chân, mõm có hiện tượng tăng sinh dày lên và cứng lại, có khi bị
nứt ra làm cho chó đi khập khiễng.
Một số trường hợp chó chạy lung tung khơng định hướng, sủa rống lên,
miệng chảy rãi rớt, ngã và dãy dụa, sau đó chó tỉnh táo lại nhưng rất mệt,
chệch choạng, co giật và run rẩy liên tục. Chó bài tiết tiểu tiện và đại tiện
không tự chủ. Cuối cùng nằm bệt, loạn nhịp tim, thân nhiệt hạ dẫn đến liệt
chân rồi chết.
Từ khi ủ bệnh cho tới khi xuất hiện các triệu chứng lâm sàng khoảng 14
- 18 ngày, chó thường sốt cao từ 3 - 6 ngày sau khi nhiễm. Carre thể thần kinh
khi chữa khỏi vẫn để lại di chứng (đi xiêu vẹo, mù và điếc, gầy còm....)

1.1.4.2. Bệnh tích
Theo Appel và Gillespie (1972), bệnh tích đại thể có thể gặp bao gồm
sừng hoá da ở mõm và gan bàn chân. Tuỳ theo mức độ kế phát các loại vi
khuẩn mà có thể thấy viêm phế quản phổi, viêm ruột hay mụn mủ ở da...
Tế bào thượng bì đường hô hấp, tiết niệu, lưỡi, mắt, hạch và tuyến
nước bọt có thể tìm thấy tiểu thể Lenst trong ngun sinh chất tế bào. Chó mẹ
có thai thời kỳ cuối mắc bệnh thì chó con sau khi sinh thường xuất hiện triệu
chứng tồn thân, tổn thương đường hơ hấp trên, viêm mũi, viêm phế quản,
viêm kết mạc mắt (Carter và cs., 1992). Viêm kẽ phổi lan toả mà đặc trưng là
sự tăng sinh và dày lên của biểu mô vách phế nang, lòng phế nang bao gồm
các tế bào long vách phế nang và đại thực bào.


8

Xác chết thường gầy, mắt trũng sâu, niêm mạc mũi, miệng viêm cata
đỏ mọng, sưng dầy lên, có nhiều chất nhớt. Phổi viêm, sung to, mầu đỏ thẫm,
khí quản - phế quản có nhiều bọt, nhiều vùng phổi chắc đặc, hạch lympho
sung và xuất huyết, trên vùng da mỏng có nốt sài, xoang bao tim, xoang ngực,
xoang bụng tích nước và não sung huyết. Ruột viêm cata xuất huyết khiến
thành niêm mạc bong ra lẫn máu với phân. Đây chính là nguyên nhân khiến
phân có mùi đặc trưng (Nguyễn Thị Huyền và cs., 2018).
Các biến đổi bệnh tích đại thể của chó nghi mắc Care chủ yếu thể hiện
ở hệ hơ hấp (phổi, họng), ở hệ tiêu hóa (ruột non), hạch là nhiều nhất. Các
bệnh tích đặc trưng của bệnh Care trên chó Phú Quốc như sau: Phổi có hiện
tượng viêm xuất huyết ở chó C1, C3, C4, sưng hay xốp dai, có trường hợp
phổi viêm dính với thành ngực. Bên cạnh đó, sung huyết mạch máu ruột và
xuất huyết ruột non ở hầu hết các chó nghiên cứu. Hạch lympho sưng to, xuất
huyết, mặt cắt của hạch lồi có dịch màu hồng chảy ra. Các cơ quan còn lại,
sung huyết, xuất huyết ở mạch máu, não, lách nhồi huyết, dạ dày sung huyết,

gan hơi sưng, túi mật sưng to, thận sưng và màng thận khó bóc (Nguyễn Thị
Lan và Khao Keonam, 2012).
1.1.5. Chẩn đốn và phịng, trị bệnh
1.1.5.1. Chẩn đoán bệnh
* Chẩn đoán dựa vào triệu chứng lâm sàng
Sốt cao, chán ăn hay bỏ ăn, chảy nước mũi, ho, khó thở, có gỉ mắt, nơn
mửa và ỉa chảy nặng đối với chó con, xuất hiện các triệu chứng thần kinh
trong thời kỳ cuối của bệnh, co giật cơ chân, cơ mắt, khơng đi được hoặc đi
lại khó khăn, lắc đầu, ho ở chó trưởng thành, có các nốt sài ở bụng, bẹn, ngực,
phía trong đùi.... có các triệu chứng trên đường tiêu hóa hoặc triệu chứng thần
kinh thì khả năng chó mắc bệnh Care là rất cao (Hồ Đình Chúc, 1993).
Chẩn đoán ban đầu chủ yếu dựa vào các dấu hiệu lâm sàng liên quan
đến nhiễm trùng. Tuy nhiên, hình thức chẩn đốn này cịn gặp nhiều khó


9

khăn vì cần tiến hành phân biệt với các bệnh khác có dấu hiệu hơ hấp, thần
kinh và/hoặc tiêu hóa, chẳng hạn như bệnh dại, giảm bạch cầu ở mèo,
coronavirus, toxoplasmosis, vi khuẩn enteritides và parvovirus (Angelika K
Loots và cs., 2017).
* Chẩn đốn trong phịng thí nghiệm
Bằng xét nghiệm sinh hóa và phân tích nước tiểu.
Xét nghiệm huyết thanh học có thể xác định các, kháng thể dương tính,
nhưng xét nghiệm này không thể phân biệt giữa các kháng thể tiêm chủng và
kháng thể được cơ thể con vật sản sinh ra khi tiếp xúc với virus độc hại.
Chụp X-Quang để xác định con vật có mắc bệnh viêm phổi hay khơng.
Chụp cắt lớp vi tính (CT) và chụp cộng hưởng từ (MRI) có thể được sử dụng
để kiểm tra não đối với bất kỳ tổn thương nào có thể phát triển.
Xét nghiệm tế bào để phát hiện sự hiện diện protein đặc hiệu của virus

hàm trong nguyên sinh chất, chủ yếu trên lớp tế bào biểu mơ (Chó cịn sống
lấy lớp màng nhầy biểu mô màng sinh dục hoặc niệu đạo. Chó đã chết lấy
mẫu sớm nhất ở các cơ quan: phổi, bàng quang, thận, não, hạch lâm ba…)
* Chẩn đoán virus học
Phân lập virus: bệnh phẩm máu, lách, phổi, nước và chất bài tiết của
con vật.
* Chẩn đoán bằng phương pháp phân lập virus trên môi trường tế bào
Mẫu bệnh phẩm đem nghiền thành huyễn dịch, xử lý kháng sinh, ly
tâm lấy nước trong và lọc qua màng lọc vi khuẩn rồi đem gây nhiễm lên môi
trường tế bào một lớp Vero-DST (tế bào thận khỉ xanh châu Phi có gắn
receptor đặc hiệu cho virus CDV), virus CDV chỉ có thể nhân lên và gây bệnh
tích tế bào (Cyto pathogenic Effect - CPE) khi gây nhiễm lên tế bào phù hợp.
Bệnh tích tế bào do CDV gây ra có thể quan sát được là những thể hợp bào.
Tế bào bị phá hủy màng và xuất hiện nhiều thể vùi. Ở trung tâm vùng tế bào
xuất hiện CPE. Sự xuất hiện nhiều hay ít, nhanh hay chậm của CPE phụ thuộc


10

vào số lượng, độc lực của virus và “tuổi” tế bào. Tế bào mới ni cấy thì virus
gây nhiễm dễ dàng hơn, CPE xuất hiện nhanh và nhiều hơn ở những tế bào đã
nuôi cấy nhiều ngày (Lan và cs., 2005).
* Chẩn đoán bằng phản ứng miễn dịch đánh dấu enzym (ELISA)
ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) là một phương pháp
xét nghiệm miễn dịch dựa trên cơ chế liên kết đặc hiệu giữa kháng nguyên và
kháng thể. Trên kháng thể có có gắn enzyme và chất phát quang nhằm phát
hiện ra sự kết hợp kháng nguyên-kháng thể (Nguyễn Bá Hiên và Trần Thị
Lan Hương, 2009).
* Chẩn đoán bằng phương pháp nhuộm hóa mơ miễn dịch
Nhuộm hóa mơ miễn dịch (Immunohistochemistry - IHC) là phương

pháp có độ chính xác cao cho phép phát hiện kháng nguyên tồn tại trong tổ
chức. Phương pháp này được thực hiện dựa trên nguyên lý là sự kết họp giữa
kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu và được phát hiện bằng chất chỉ thị màu
(Nguyễn Hữu Nam, 2010).
* Chẩn đoán bệnh bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang
Phản ứng miễn dịch huỳnh quang IF (Immuno Fluorescent test) có độ
sáng của bước sóng nhất định sẽ phát ra ánh sáng có bước sóng dài hơn.
Phương pháp này được thực hiện dựa trên nguyên lý: dùng kháng thể hoặc
kháng kháng thể đã được nhuộm bằng chất phát huỳnh quang, rồi cho kết hợp
với kháng nguyên - kháng thể khi soi dưới kính hiển vi huỳnh quang sẽ phát
sáng (Nguyễn Bá Hiên và Trần Thị Lan Hương, 2010).
* Chẩn đoán bằng phương pháp RT-PCR/PCR
Phương pháp RT-PCR (Reverse Transcription Polymesase Chain
Reaction) là sự kết hợp giữa phương pháp phiên mã ngược và phương pháp
PCR. Phương pháp này có thể phát hiện các RNA tồn tại với lượng rất thấp
mà khó có thể phát hiện bằng phương pháp khác. Do Taq polymerase sử
dụng trong PCR không hoạt động trên RNA nên trước hết cần chuyển RNA


11

thành cDNA, nhờ enzyme phiên mã ngược Reverse Transcriptase (RT). Sau
đó, cDNA này sẽ được khuếch đại nhờ Taq polymerase. Dấu hiệu xác định
bệnh là sản phẩm nhân bản một đoạn gen đặc hiệu của virus. Sự hiện diện
của sản phấm này thường được nhận biết qua điện di trên gel agarose (Lan
và cs., 2008).
Bên cạnh phương pháp RT-PCR, ngày nay phương pháp chuyển đổi
cDNA được sử dụng rất rộng rãi và hiệu quả trong nghiên cứu giải mã gen.
Hệ gen của virus RNA trước tiên được chuyển đổi thành DNA bổ sung
(cDNA) sử dụng mồi xác suất hecxamer, bộ hóa chất sinh phẩm của Hãng

Fermentas. Tiếp theo sản phẩm cDNA được sử dụng làm khuôn cho phản ứng
PCR. Phương pháp này có ưu điểm là tiết kiệm được lượng khuôn ban đầu và
đỡ tốn kém hơn.
So với các phương pháp chẩn đoán khác, chẩn đoán bằng phương pháp
sinh học phân tử cho độ chính xác tuyệt đối, ngồi ra bằng giải trình tự gen có
thể xác định chính xác các type/genotype của virus gây bệnh.
* Chẩn đoán phát hiện bệnh Care bằng kit chẩn đoán nhanh
Về bản chất, đây là phương pháp xét nghiệm ELISA để phát hiện
kháng nguyên của virus Care trong máu, gỉ mắt và nước mũi của chó. Hai
kháng thể đơn dịng trong thiết bị sẽ kết hợp đặc hiệu với các nhóm quyết
định kháng nguyên khác nhau của virus Care. Sau khi cho bệnh phẩm vào vị
trí đệm cellulose của thiết bị, virus Care sẽ kết hợp với kháng thể đơn dòng
thứ nhất. Rồi phức hợp này kết hợp với kháng thể đơn dòng khác trong màng
nitơ - cellulose của thiết bị để tạo thành hợp chất kép hoàn chỉnh. Kết quả xét
nghiệm được biểu hiện qua các vạch do thiết bị sử dụng theo phương pháp
“sắc ký miễn dịch”.
Ưu điểm: có độ nhạy cao, có thế chẩn đốn bệnh sớm trong thời gian
đầu của bệnh, dễ dàng thực hiện với nhiều loại mẫu bệnh phẩm như huyết


12

tương, huyết thanh, gỉ mắt và nước mũi. Có thể đọc kết quả phản ứng sau 510 phút.
1.1.5.2. Phòng và trị bệnh
* Phòng bệnh
Tiêm vắc xin là biện pháp phòng bệnh phổ biến đối với các bệnh do
virus gây ra nói chung, trong đó có bệnh Care. Vắc xin được tiêm lần đầu cho
chó lúc 2 tháng tuổi. Mũi thứ 2 nhắc lại sau mũi đầu tiên 3 tuần, mũi thứ 3
nhắc lại sau mũi thứ 2 là 3 tuần. Sau đó, tiêm nhắc lại mỗi năm một lần đề
đảm bảo khả năng bảo hộ.

Thị trường thuốc thú y Việt Nam hiện nay, vắc xin phịng bệnh Care
cho chó khá phong phú về chủng loại do doanh nghiệp trong nước sản xuất và
nhập khẩu từ nước ngoài như Intervet - Hà Lan, Merial - Pháp, Biocan - Cộng
hòa Séc, Pfizer - Mỹ, Fort Dodge Animal Health - Mỹ. Thống kê từ danh mục
vắc xin và chế phẩm sinh học được phép nhập khẩu năm 2008 cho thấy có tới
17 loại vắc xin phòng Care và 1 loại kháng huyết thanh (Homoserum Merial, Pháp) để phịng và điều trị bệnh này.
Xí nghiệp thước thú y Trung ương (Vetvaco) đã chế tạo được vaccine
phịng bệnh Care từ chủng virus nhược độc đơng khô, sản xuất qua môi
trường tế bào xơ phôi gà một lớp, mỗi liều chứa tối thiểu 103 TCID50 virus.
Khi phát hiện chó nghi mắc bệnh Care phải cách ly triệt để, điều trị
bằng kháng huyết thanh hoặc xử lý đúng quy trình để tránh lây lan cho chó
khỏe mạnh. Chó chết do mắc bệnh phải được chơn sâu, rắc vôi bột. Chuồng
trại và môi trường nuôi thả phải được vệ sinh sạch sẽ, phun sát trùng đầy đủ
bằng Vim iodin hoặc Han iodin 5% hoặc nước vôi 10%.
* Trị bệnh
Hiện nay, chưa có loại thuốc kháng virus CDV nào đặc hiệu. Chủ yếu
là điều trị triệu chứng và chống phụ nhiễm, hỗ trợ mất nước và chất điện giải.
Nếu con vật chán ăn hoặc bị tiêu chảy, có thể dùng chất hỗ trợ tiêm, truyền


13

tĩnh mạch. Cầm ỉa chảy bằng cách cho uống thuốc đặc trị tiêu chảy Imodium
uống I viên/con, sau 12h mà con vật vẫn bị tiêu chảy thì uống tiếp viên thứ 2;
Bisepton: uống nửa viên đối với chó nhỏ, chó to uống 1 viên, uống cho tới khi
khỏi tiêu chảy; Hampiseptol: tiêm bắp 1ml/ 10kgP. Dùng kháng huyết thanh:
liều 15 - 30ml/con, tiêm sớm. Khi con vật đã có triệu chứng viêm phổi hay
triệu chứng thần kinh thì kháng huyết thanh khơng có tác dụng. Lấy gỉ khỏi
mắt và mũi con vật, sau đó làm sạch mắt mũi thường xuyên bằng cách nhỏ
nước muối sinh lý 0,9%. Giảm tình trạng con vật bị nôn bằng cách tiêm

Atropin hay Primeran tiêm dưới da. Bổ sung nước và chất điện giải bằng cách
cho uống Ozeron 5%, tiêm nước muối sinh lý 0,9% hay nước đường Glucoza
5% vào tĩnh mạch khoeo của chó.
Thuốc kháng sinh được sử dụng để kiểm soát các triệu chứng do nhiễm
khuẩn thứ phát, gentamycin (tiêm bắp) 8 - 10 mg/kg, 2 lần/ngày, streptomycin
(tiêm bắp) 10 - 20mg/kg, 2 lần/ngày. Meprobamat (an thần) cho chó nhỏ uống
1 viên/ngày, chó to 2 viên/ngày trong 3 ngày. Ngoài ra, phenobarbital và
kalibromua có thể được sử dụng để kiểm sốt các cơn co giật.
Điều trị nhiễm CDV thường điều trị triệu chứng và hỗ trợ vì khơng có
loại thuốc kháng virus cụ thể nào. Các nghiên cứu về tác dụng in vitro của các
hợp chất kháng virus trong điều trị CDV đang được tiến hành nhằm xác định
tính an tồn và hiệu quả của chúng trong việc điều trị (Angelika K Loots và
cs., 2017).
Krumm S. A. và cs. (2014) đã đánh giá một chất ức chế virus panmorbillivirus có sẵn bằng đường uống, ổn định trong thời hạn sử dụng khi
điều trị cho chồn bị nhiễm CDV bằng thuốc ức chế và nhận thấy những con
chồn này giảm lượng virus trong máu, khơng có triệu chứng và sẽ hồi phục
sau khi nhiễm bệnh trong khi các con chồn đối chứng không qua khỏi.
Các hợp chất khác như fucoidan, một polysaccharide sulfat được tìm
thấy trong tảo nâu, cũng đã được đánh giá về khả năng hoạt động như thuốc


14

kháng virus chống lại CDV (Trejo-Avila và cs., 2014). Kết quả in vitro cho
thấy fucoidan có thể ức chế các bước ban đầu của chu trình nhân lên của
virus, ngăn chặn mạnh sự hình thành hợp bào trong các tế bào bị nhiễm bệnh.
Carvalho O. V. và cs. (2013) đã đánh giá hoạt tính kháng virus của một
số flavonoid (quercetin, morin, rutin và hesperidin) và các axit phenolic (axit
cinnamic, trans - cinnamic và ferulic), tập trung vào khả năng in vitro của
chúng để ức chế các giai đoạn của chu trình sao chép CDV. Tất cả các

flavonoid và axit phenolic đã chứng minh tác dụng kháng virus chống lại sự
lây nhiễm của CDV.
Ngoài ra, các phương pháp điều trị nhiễm CDV khác đã được xác định
bao gồm liệu pháp tế bào gốc trung mô và sử dụng chế phẩm dược phẩm thú
y chứa các hạt nano bạc (Angelika K Loots và cs., 2017).
1.2. Cơ sở pháp lý của vấn đề nghiên cứu
1.2.1. Đặc điểm sinh học của virus Canine Distemper (CDV)
1.2.1.1. Đặc điểm cấu trúc hệ gen của virus CDV
Virus CDV được bao phủ bởi các gai glycoprotein có kích thước 8 - 14
nm và chứa một nucleocapsid đối xứng xoắn ốc, có chiều dài 1μm và đường
kính 18nm (MacLachlan và Dubovi, 2011).
Hệ gen CDV là phân tử RNA sợi đơn âm, có kích thước khoảng 15.7
kb, khơng chứa đầu 5'-UTR và khơng có chuỗi poly (A) ở đầu 3'-UTR, nhưng
có các phân tử mã hóa thực hiện chức năng của vùng 5'-UTR và vùng 3'UTR. Hệ gen của virus mã hóa cho hai protein khơng cấu trúc (là C và V
protein) và 6 protein cấu trúc, gồm: large protein (L), haemagglutinin (H),
phosphoprotein (P), nucleocapsidprotein (N), fusion protein (F) và matrix
protein (M) (Diallo, 1990).


15

Hình 1.1. Mơ hình cấu trúc của virus Canine Distemper (CDV)
(Nguồn: www.veteriankey.com)
Protein khơng cấu trúc (C) được mã hóa từ một khung đọc mở khác ở
gen P (Lamb và Kolakofsky, 2001). Chức năng của protein C cho đến nay vẫn
chưa được xác định rõ ràng.
Protein N: là nucleocapsid, có khối lượng phân tử 58 kDa bao quanh và
bảo vệ cho hệ gen của virus. Protein này rất nhạy cảm với những chất phân
giải protein.
Protein P: là phosphoprotein, có khối lượng phân tử 54,9 - 66 kDa,

nhạy cảm với những yếu tố phân giải protein, đóng vai trị quan trọng trong sự
sao chép của RNA (Sidhu và cs., 1993).
M: Matrix, khối lượng phân tử 34 - 39 kDa, đóng vai trị quan trọng
trong sự trưởng thành của virus và nối nucleocapsid với những protein vỏ bọc
(Sidhu và cs., 1993).
F: Fusion là glycoprotein trên bề mặt của vỏ bọc, khối lượng phân tử 59
- 62 kDa, đóng vai trị trong sự kết hợp virus với thụ thể màng tế bào, dẫn đến
kết hợp nhiều tế bào cảm nhiễm (hợp bào).
H: Protein ngưng kết hồng cầu (Haemagglutinin) hay yếu tố kết dính, là
glycoprotein thứ hai của vỏ bọc virus, khối lượng phân tử 76 - 80 kDa, đóng
vai trị gắn virus vào tế bào đích, quyết định tính kháng nguyên của virus.


16

L: Large protein, có khối lượng phân tử lớn 180 - 200 kDa, do đó nó
thể hiện phần lớn các hoạt động của RNA polymerase (Diallo,1990).
Trong đó, protein H được mã hóa bởi gen H là protein kháng nguyên,
quyết định tính kháng nguyên và độc lực của virus. Độ dài gen H của các
chủng virus Care đã được công bố là 1824 bp. Đây là protein có vai trị quan
trọng nhất trong hệ gen của virus và thường được sử dụng trong phân tích xác
định genotype và nguồn gốc phả hệ của virus CDV.
1.2.1.2. Hình thái của virus CDV
Hình thái virus CDV quan sát được dưới kính hiển vi điện tử có hình
vịng trịn, hình bán nguyệt do các sợi tóc cuộn trịn hình thành. Dạng vịng
trịn này có đường kính từ 115 - 230 nm. Màng cuộn kép có độ dày từ 75 85Ao với bề mặt phủ các sợi xoắn ốc từ bên trong ra (Kennedy và cs., 1989).

Hình 1.2. Hình thái của virus Canine Distemper
(Nguồn: />1.2.1.3. Phân loại virus gây bệnh Care
Virus gây bệnh Care là Canine Distemper Virus - CDV, thuộc:

Loài: Cannine morbilivirus
Họ: Paramixoviridae
Giống: Morbillivirus
Là một virus có kích thước tương đối lớn, đường kính 150 - 250nm, cấu
trúc xoắn, nhân là một RNA sợi đơn, có vỏ Lipoprotein. Virus này chỉ có một