Tài liệu Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy chủng Lactobacillus plantarum NT1.5 bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP. HỒ CHÍ MINH

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP
Tên đề tài:

TỐI ƯU HỐ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
CHỦNG Lactobacillus plantarum NT1.5
BẰNG PHƯƠNG PHÁP
QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
CHUYÊN NGÀNH: VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ

GVHD: ThS. DƯƠNG NHẬT LINH
SVTH : TRẦN THỊ KIỀU
MSSV : 1053012348
KHỐ: 2010 – 2014

Tp.Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2014


LỜI CẢM ƠN
Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến:
Cô Dương Nhật Linh và thầy Nguyễn Văn Minh – giảng viên khoa Công nghệ
Sinh học Trường Đại Học Mở Tp Hồ chí Minh, cơ thầy là người đã tận tình hướng dẫn,
tạo điều kiện, truyền đạt kiến thức để em có thể hồn thành tốt đề tài.
Chân thành cảm ơn các thầy, cô khoa Công nghệ Sinh học trường Đại Học Mở
Tp Hồ Chí Minh đã tận tình giảng dạy, truyền đạt cho em những kiến thức cơ bản làm
nền tảng để em có thể hồn thành đề tài.
Thầy Đan Duy Pháp, chị Võ Ngọc Yến Nhi, chị Phạm Thị Minh Trang, chị
Nguyễn Thị Mỹ Linh, anh Nguyễn Đạt Phi là người đã truyền đạt những kinh

nghiệm, động viên giúp đỡ em vượt qua những khó khăn trong thời gian thực hiện đề
tài.
Xin cảm ơn đến các anh/ chị, các bạn và các em Phịng thí nghiệm Cơng nghệ Vi
sinh đã giúp đỡ, động viên em trong thời gian qua.
Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến Ba, Mẹ, gia đình đã ln bên cạnh ủng hộ
tạo điều kiện tốt nhất cho con hoàn thành tốt việc học tập của mình.
Chân thành cảm ơn!
Bình Dương, ngày tháng năm 2014
TRẦN THỊ KIỀU

SVTH: TRẦN THỊ KIỀU

i


TỔNG QUAN TÀI LIỆU

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 4
1.1.

TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN LACTIC ........................................................ 5

1.1.1.

Giới thiệu ................................................................................................. 5

1.1.2.

Con đường biến dưỡng của vi khuẩn lactic ........................................... 7

1.1.3.

Tổng quan về Lactobacillus plantarum................................................... 8

1.2.

TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGỒI NƯỚC VỀ

LACTOBACILLUS ................................................................................................... 10
1.2.1.

Các nghiên cứu trên thế giới ................................................................ 10

1.2.2.

Các nghiên cứu trong nước .................................................................. 11

1.3.

QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM .................................................................. 12

1.3.1.

Phương pháp quy hoạch thực nghiệm ................................................. 12

1.3.2.

Thí nghiệm sàng lọc .............................................................................. 14

1.3.3.

Thí nghiệm tối ưu hóa ........................................................................... 16

1.4.

PHẦN MỀM QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM MINITAB 16.2.0............... 20

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 23
2.1.

THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGIÊN CỨU .................................................. 24

2.2.

VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU............................................................................ 24

2.2.1.

Đối tượng nghiên cứu ........................................................................... 24

2.2.2.

Mơi trường – hóa chất .......................................................................... 24

2.2.3.

Dụng cụ ................................................................................................. 24

2.2.4.

Trang thiết bị ........................................................................................ 24

2.3.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................. 25

2.3.1.

Hoạt hóa chủng ..................................................................................... 25

2.3.3.

Xây dựng đường cong tăng trưởng của L. plantarum NT 1.5 ............. 26

SVTH: TRẦN THỊ KIỀU

i


TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.3.4.

Khảo sát nhiệt độ, pH thích hợp cho sự tăng trưởng của L. plantarum

NT1.5

............................................................................................................... 27

2.3.5.

Sàng lọc các yếu tố dinh dưỡng ............................................................ 28

2.3.6.

Thiết kế thí nghiệm tìm yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men tăng

sinh khối theo thiết kế Plackett- Burman ................................................................ 30
2.3.7.

Thí nghiệm khởi đầu............................................................................. 32

2.3.8.

Tìm khoảng tối ưu của các yếu tố ảnh hưởng chính bằng phương

pháp leo dốc .............................................................................................................. 32
Thí nghiệm bề mặt chỉ tiêu xác định giá trị tối ưu của các yếu tố ảnh

2.3.9.

hưởng chính. ............................................................................................................. 33
2.3.10.

Xác định thời gian tăng trưởng của chủng L. plantarum NT1.5 trên

môi trường tối ưu...................................................................................................... 33
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................................ 34

3.1

KẾT QUẢ XÂY DỰNG ĐƯỜNG TƯƠNG QUAN GIỮA MẬT ĐỘ TẾ

BÀO VI KHUẨN VÀ GIÁ TRỊ OD610 ..................................................................... 35
3.2

KẾT QUẢ XÂY DỰNG ĐƯỜNG CONG TĂNG TRƯỞNG CỦA L.

PLANTARUM NT 1.5 ............................................................................................... 36
3.3

KẾT QUẢ KHẢO SÁT NHIỆT ĐỘ, pH THÍCH HỢP CHO SỰ TĂNG

TRƯỞNG CỦA L. PLANTARUM NT1.5. ............................................................... 38
3.4

KẾT QUẢ SÀNG LỌC YẾU TỐ DINH DƯỠNG ....................................... 39

3.4.1.

Nguồn nitơ ............................................................................................. 39

3.4.2.

Nguồn cacbon ........................................................................................ 41

3.4.3.

Nguồn khoáng ....................................................................................... 42

3.5

KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG CHÍNH THEO

THIẾT KẾ THÍ NGHIỆM PLACKETT- BURMAN ............................................. 44
3.6

KẾT QUẢ THIẾT KẾ THÍ NGHIỆM KHỞI ĐẦU .................................... 48

SVTH: TRẦN THỊ KIỀU

ii


TỔNG QUAN TÀI LIỆU

3.7

KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM LEO DỐC .......................................................... 50

3.8

KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM BOX-BEHNKEN ............................................... 52

3.9. KẾT QUẢ KHẢO SÁT SỰ TĂNG TRƯỞNG CỦA L. PLANTARUM NT1.5
TRÊN MÔI TRƯỜNG TỐI ƯU .............................................................................. 57
4.1

KẾT LUẬN .................................................................................................... 61

4.2

KIẾN NGHỊ ................................................................................................... 62

TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 63
PHỤ LỤC ................................................................................................................. 68

SVTH: TRẦN THỊ KIỀU

iii


TỔNG QUAN TÀI LIỆU

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
ANOVA

One-way analysis of variance

CFU

Colony forming unit

Cs.

Cộng sự

L. plantarum

Lactobacillus plantarum

MRS

Deman, Rogosa and Sharpe

Nm

nanomet

OD

Optical Density

P-B

Plackett-Burman

WHO

World Health Organization

BSH

Bile salt hydrolase

SVTH: TRẦN THỊ KIỀU

iv

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1 Streptococcus ...................................................................................... 6
Hình 1.2 Lactobacillus ........................................................................................ 6
Hình 1.3 Lactobacillus plantarum dưới kính hiển vi điện tử (Reichelt J., 2013)
............................................................................................................................. 9
Hình 1.6 Hộp đen trong hệ thống điều khiển một quá trình. ......................... 13
Hình 1.8 Ma trận bố trí thí nghiệm theo thiết kế Box – Behnken (Box và
Behnken, 1960) ................................................................................................. 20
Hình 1.9 Giao diện phần mềm Minitab 16.2.0 ................................................ 22

SVTH: TRẦN THỊ KIỀU

v


TỔNG QUAN TÀI LIỆU

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Các nguồn nitơ khảo sát .................................................................. 28
Bảng 2.2. Các nguồn cacbon khảo sát ............................................................. 29
Bảng 2.3. Các nguồn khoáng khảo sát ............................................................ 30
Bảng 3.1: Giá trị đo OD610 và mật độ tế bào (Log(N/mL) .............................. 35
Bảng 3.2. Giá trị OD610 theo thời gian ............................................................. 36
Bảng 3.3. Mật độ tế bào Lactobacillus plantarum NT1.5 (Log (N/ mL)) tại mỗi
giá trị nhiệt độ và độ pH khảo sát ................................................................... 38
Bảng 3.4. Giá trị log (N/ mL) của các nguồn nitơ khảo sát ............................ 40
Bảng 3.5. Giá trị log (N/ mL) của các nguồn cacbon khảo sát ....................... 41

Bảng 3.6. Giá trị log (N/ mL) của các nguồn muối khoáng khảo sát ............. 43
Bảng 3.7. Mức ảnh hưởng của từng yếu tố ..................................................... 44
Bảng 3.8: Kết quả thí nghiệm Plackett- Burman ........................................... 45
Bảng 3.10 Bảng tính toán bước chuyển động của các yếu tố ảnh hưởng chính
........................................................................................................................... 50
Bảng 3.11 Kết quả thí nghiệm leo dốc ............................................................. 51
Bảng 3.12 Bảng giá trị các biến số thí nghiệm Box-Behnken ......................... 53
Bảng 3.13 Bảng biến số các giá trị thí nghiệm Box-Behnken ......................... 53
Bảng 3.14 Kết quả giá trị tối ưu của các yếu tố .............................................. 56
Bảng 3.15 Giá trị OD theo thời gian ................................................................ 57

SVTH: TRẦN THỊ KIỀU

i


TỔNG QUAN TÀI LIỆU

DANH MỤC ĐỒ THỊ
Đồ thị 3.4. Kết quả khảo sát nguồn nitơ .......................................................... 40
Đồ thị 3.5. Kết quả khảo sát nguồn Cacbon.................................................... 42
Đồ thị 3.6. Kết quả khảo sát nguồn muối khoáng ........................................... 43
Đồ thị 3.7. Đồ thị các ảnh hưởng chính (Main Effects Plot) ........................... 47
Đồ thị 3.1 Đồ thị đường mức biểu diễn mối quan hệ giữa mật độ tế bào với
các cặp biến khác nhau .................................................................................... 55
Đồ thị 3.2 Đồ thị bề mặt biểu diễn mối quan hệ giữa mật độ tế bào với các
cặp biến khác nhau .......................................................................................... 56
Đồ thị 3.9 Đường cong tăng trưởng của L. plantarum NT 1.5 theo thời gian
trên môi trường tối ưu ..................................................................................... 58

SVTH: TRẦN THỊ KIỀU

ii


TỔNG QUAN TÀI LIỆU

ĐẶT VẤN ĐỀ

SVTH: TRẦN THỊ KIỀU

1


TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Cholesterol trong máu tăng làm tăng nguy cơ bệnh tim và đột quỵ, một phần ba
bệnh tim thiếu máu cục bộ là do cholesterol cao. Nhìn chung, cholesterol tăng ước tính
gây ra 2,6 triệu ca tử vong (4,5% của tổng số) và 29,7 triệu người gánh hậu quả. Tổng
số cholesterol trong máu cao là nguyên nhân chính gây bệnh tật ở cả các nước phát triển
và đang phát triển như là một yếu tố nguy cơ bệnh tim thiếu máu cục bộ và đột quỵ
(WHO, 2013).
Việc giảm cholesterol là vấn đề rất quan trọng để ngăn ngừa bệnh tim mạch (Lim
và cs., 2004). Một trong những giải pháp đó là nghiên cứu vi khuẩn lactic vừa có hoạt
tính probiotic và vừa có hoạt tính làm giảm cholesterol là vấn đề thiết thực, được nhiều
nhà khoa học trên thế giới quan tâm và nghiên cứu.
Trong những năm gần đây có nhiều nghiên cứu chứng minh enzym thủy phân
muối mật (BSH) từ vi khuẩn lactic (Lactobacillus, Bifidobacterium, Enterococcus…)
có tác dụng làm giảm cholesterol (Lim, 2004; Liong, 2005). Ngoài ra, vi khuẩn lactic
cịn có khả năng giảm cholesterol bằng cách hấp thu trực tiếp vào màng tế bào (Ziarno,
2007).

Ngày nay việc sản xuất thực phẩm chức năng chứa vi khuẩn probiotic như
Lactobacilli có tầm quan trọng ngày càng tăng. Những vi khuẩn này có tác dụng
kháng khuẩn, làm tăng giá trị cảm quan, dinh dưỡng và mang lại lợi ích sức khỏe cho
người tiêu dùng (Shahravy, 2012).
Vi khuẩn Lactobacillus plantarum NT1.5 đã được chứng minh có khả năng làm
giảm cholesterol thông qua việc hấp thụ cholesterol qua màng tế bào và khả năng sinh
enzym BSH đồng thời có hoạt tính probiotic như: khả năng chịu pH dạ dày, kháng
muối mật, kháng khuẩn,… (Dương Nhật Linh, 2013). Vì vậy Lactobacillus plantarum
NT1.5 có thể được ứng dụng để sản xuất các chế phẩm probiotic có hoạt tính làm giảm
cholesterol.
Ngày nay, nhu cầu sử dụng thực phẩm lên men kết hợp với chế phẩm sinh học
ngày càng tăng. Để đáp ứng nhu cầu này, việc sản xuất lượng lớn sinh khối vi sinh vật
đang được quan tâm. Do đó, nghiên cứu phát triển môi trường nuôi cấy mới để tăng

SVTH: TRẦN THỊ KIỀU

2


TỔNG QUAN TÀI LIỆU
cường sản xuất sinh khối có thể dẫn đến việc sản xuất probiotic có hiệu quả kinh tế hơn
(Shahravy, 2012).
Vì vậy chúng tơi thực hiện đề tài “Tối ưu hóa mơi trường ni cấy chủng
Lactobacillus plantarum NT1.5 bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm”.
Nội dung thực hiện:
 Xây dựng được biểu đồ thể hiện mối tương quan giữa giá trị OD và nồng độ tế
bào tương ứng với từng giá trị OD.
 Xây dựng đường cong tăng trưởng của chủng L. plantarum NT1.5, xác định thời
gian tăng trưởng tối ưu của vi khuẩn.
 Khảo sát nhiệt độ, pH tối ưu cho sự phát triển của chủng L. plantarum NT1.5

 Chọn lựa nguồn cacbon, nitơ và các nguồn khống.
 Xác định các yếu tố ảnh hưởng chính đến quá trình tăng sinh khối của
Lactobacillus plantarum NT1.5 bằng thiết kế Plackett – Burman (P - B).
 Xác định giá trị tối ưu của các thành phần dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy
bằng phương pháp Box-Behnken.
 Nuôi cấy thử nghiệm.

SVTH: TRẦN THỊ KIỀU

3


TỔNG QUAN TÀI LIỆU

CHƯƠNG 1:
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

SVTH: TRẦN THỊ KIỀU

4


TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.

TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN LACTIC

1.1.1.

Giới thiệu

Vi khuẩn lactic acid (LAB) là nhóm vi khuẩn phổ biến trong tự nhiên được ứng
dụng trong nhiều ngành công nghiệp, là một chế phẩm sinh học an toàn cho con người
(David, 2013).
Theo khóa phân loại Bergey (2001), vi khuẩn lactic được sắp xếp:
Giới: Bacteria
Ngành: Firmicutes
Lớp: Bacilli
Bộ: Lactobacillales
Họ I: Lactobacillaceae
Giống I: Lactobacillus
Giống II: Pediococcus
Họ II: Enterococceae
Giống: Enterococcus
Họ III: Leuconoscaceae
Giống: Leuconostoc
Họ IV: Streptococcaceae
Giống I: Streptococcus
Giống II: Lactococcus
Vi khuẩn lactic là những vi khuẩn Gram dương, thường không di động, không
sinh bào tử, các phản ứng catalase âm, oxydase âm, nitratreductase âm. Những vi
khuẩn này có khả năng sinh tổng hợp nhiều hợp chất cần cho sự sống rất yếu, cho nên
chúng là những vi sinh vật khuyết dưỡng đối với nhiều loại acid amin, base nucleotic,
nhiều loại vitamin…, bình thường chúng khơng có cytochrome. Vì vậy, chúng được
xếp vào nhóm vi khuẩn kỵ khí tùy nghi, hoặc gọi là vi hiếu khí, có khả năng lên men
trong điều kiện vi hiếu khí cũng như kỵ khí.

SVTH: TRẦN THỊ KIỀU

5


TỔNG QUAN TÀI LIỆU

LAB có liên kết chặt chẽ với vi khuẩn có lợi trên niêm mạc ruột của người và
động vật. LAB bao gồm khoảng 20 chi trong đó chi Lactobacillus, Leuconostoc,
Pedicoccus và Streptococcus là những chi điển hình (Marcel, 2005).
Trong đó tế bào của chúng có dạng hình cầu như Streptococcus, Lactococcus,
Enterococcus, Leuconostoc, Pediococcus, hoặc hình que như Lactobacillus.

a

b

Hình 1.1 Streptococcus
a: Streptococcus dưới kính hiển vi điện tử
b: Streptococcus nhuộm Gram

a

b

Hình 1.2 Lactobacillus
a: Lactobacillus dưới KHV điện tử
b:Lactobacillus nhuộm Gram

SVTH: TRẦN THỊ KIỀU

6

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Bifidobacteria cũng được xem là một chi của lactic acid bacteria do có cùng đặc
điểm tiêu biểu và cách thức lên men đường.
1.1.2.

Con đường biến dưỡng của vi khuẩn lactic

Sự phân loại giữa các chi của vi khuẩn lactic dựa trên hình thái, cách thức lên
men đường, sự phát triển ở những nhiệt độ khác nhau, cấu trúc của sản phẩm acid
lactic, khả năng chịu muối, chịu acid hoặc kiềm (Mascel, 2005).
LAB có hai con đường lên men đường chính (Mascel, 2005):
 Glycolysis (Embden- Meyerhof- Parnas pathway): sản phẩm cuối cùng là acid
lactic hay còn gọi là con đường lên men lactic đồng hình.
 Con đường 6- phosphogluconate/ phosphoketolase: sản phẩm của q trình lên
men này ngồi acid lactic cịn có ethanol, acetate và CO2 hay cịn gọi là quá trình lên
men dị hình.
Dựa vào khả năng lên men đường người ta chia LAB thành LAB đồng hình và
LAB dị hình.
1.1.2.1 Lên men đồng hình
Vi khuẩn lactic lên men đồng hình gần như chuyển hóa hồn tồn đường chúng
sử dụng thành acid lactic. Trong điều kiện thừa glucose và oxy hạn chế lên men đồng
hình 1 mol glucose theo con đường chuyển hóa EMB (Embden – Meyerhoff – Parnas)
tạo 2 mol pyruvate. Sự cân bằng oxi hóa khử trong tế bào được duy trì thơng qua các
q trình oxi hóa của NADH, song song đó là sự khử pyruvat thành acid lactic. Các
phản ứng diễn ra trong phần nền tế bào chất. Các enzym đặc trưng trong q trình này
là aldolase và triozophosphateisomerase. Glucose khơng phải là đường duy nhất có thể
được sử dụng. Với hệ thống enzym thích hợp, các loại đường khác có thể được chuyển

đổi thành glucose hoặc một trong những chất trung gian trong quá trình như glucose6-phosphate (hoặc trong trường hợp đường pentose, ribulose-5-phosphate). Khả năng
sử dụng các loại đường khác nhau ở vi khuẩn lactic thay đổi theo loài. Đại diện cho

SVTH: TRẦN THỊ KIỀU

7


TỔNG QUAN TÀI LIỆU

kiểu lên men này là các giống Lactococcus, Streptococcus,Petiococcus và
Lactobacillus nhóm I. (Desantis và cs., 1989)
1.1.2.2

Lên men dị hình

Lên men dị hình sử dụng con đường pentose phosphate, cách gọi khác là con
đường phosphoketolase pentose. Một phân tử glucose-6-phosphate ban đầu bị khử
hydro thành 6- phosphogloconate và sau đó khử nhóm carboxyl hình thành một phân tử
CO2. Kết quả là pentose -5- phosphate bị chia ra thành một glyceraldehyde phosphate
(GAP) và một phân tử acetyl phosphate. GAP sau đó được chuyển hóa thành lactate
như trong lên men đồng hình, với acetyl phosphate bị biến đổi thành ethanol qua chất
trung gian là acetyl – CoA và acetaldehyde. Về mặt lý thuyết, sản phẩm cuối cùng (bao
gồm ATP) được sản xuất có số lượng bằng với sản phẩm từ q trình dị hóa một phân
tử glucose. Hai enzyme đặc trưng trong q trình này là transketolase xúc tác chuyển
hóa nhóm ketol-2C và transaldolase xúc tác chuyển hóa nhóm 3C. Quá trình này xảy ra
trong cytosol. Các LAB lên men dị hình bắt buộc gồm Leuconostoc oenococcus,
Weissella và Lactobacillus nhóm III. (Desantis và cs., 1989)
1.1.3.

Tổng quan về Lactobacillus plantarum

1.1.3.1. Phân loại
Theo Bergey và cộng sự, (1923) Lactobacillus plntarum được phân loại:
Giới (Kingdom): bacteria
Ngành (Division): Firmicutes
Lớp (Class): Bacilli
Bộ (Order): Lactobacillales
Họ (Family): Lactobacillaceae
Giống (Genus): Lactobacillus
Loài: L. Plantarum
1.1.3.2. Đặc điểm chung của vi khuẩn Lactobaciillus plantarum
Lactobacillus plantarum là một trong hơn 50 loài Lactobacillus. Lactobacillus
plantarum là vi khuẩn gram dương, catalase âm (Bujalence, 2006), hình trực khơng
SVTH: TRẦN THỊ KIỀU

8


TỔNG QUAN TÀI LIỆU

sinh bào tử được tìm thấy trong hệ tiêu hóa của người và động vật. Vi khuẩn này lần
đầu tiên được tìm thấy trong nước bọt của con người. (Waugh và cs., 2009)
Lactobacillus plantarum là một loại vi khuẩn có khả năng thích nghi cao, nó có
thể tồn tại ở phạm vi nhiệt độ rộng lớn (từ 1-600C) (Natural New, 2010), kị khí tùy
nghi. Trong chi Lactobacillus, L. Plantarum được xếp vào nhóm vi khuẩn lên men dị
hình, có thể sống trong nhiều mơi trường như thịt, cá, sữa, các quá trình lên men thực
vật, thực vật và trong nhiều loại pho mát. (Kohajdová, 2012).
L. plantarum có nhiều điểm khác biệt so với các loài lactobacillus khác ở những
điểm sau:

- Có bộ gen tương đối lớn nên có thể thích ứng với nhiều điều kiện khác nhau
(Kleerebezem và cs., 2003)
- Có thể lên men nhiều loại đường.
-Thích nghi cao với điều kiện acid, chịu pH thấp (Daeschel và Nes 1995).
- Có thể chuyển hóa acid phenolic (Barthelmebs và cs., 2000; Barthelmebs và cs.,
2001), phân giải muối tanat nhờ hoạt động của enzyme tannase (Vaquero và cs., 2004).

Hình 1.3 Lactobacillus plantarum dưới kính hiển vi điện tử (Reichelt J., 2013)
1.1.3.3. Lợi ích của vi khuẩn L. plantarum
Lactobacillus plantarum có nhiều trong nước bọt và đường tiêu hóa của con
người. Nó thường được sử dụng trong các q trình lên men thực phẩm và làm
probiotic. Các chế phẩm sinh học sử dụng L. plantarum ngày càng được công nhận trên
thị trường.

SVTH: TRẦN THỊ KIỀU

9


TỔNG QUAN TÀI LIỆU

L. plantarum có thể nâng cao tính toàn vẹn ruột, hoạt động trao đổi chất của các
tế bào đường ruột, kích thích phản ứng miễn dịch (Nissen và cs., 2009).
Giảm thiểu một số triệu chứng rối loạn tiêu hóa khi điều trị bằng kháng sinh
(Lonnermark và cs., 2009).
Theo nghiên cứu của nhóm Karlsson và cộng sự (2009) được tiến hành ở Thụy
Điển cho thấy uống trực tiếp L. plantarum có thể tăng tính đa dạng của hệ vi sinh vật ở
ruột kết.
Bảo vệ tế bào biểu mô khỏi sự gây hại của E. coli bằng cách thay đổi hình thái tế
bào chủ, giảm hình thành tổn thương, tăng sức đề kháng và khả năng thẩm thấu đơn

lớp phân tử (Qin và cs., 2009).
1.2.

TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC VỀ

LACTOBACILLUS
Các nghiên cứu về vi khuẩn lactic đã và đang được triển khai rộng rãi trên toàn
thế giới, trong đó đã có rất nhiều cơng trình nghiên cứu về Lactobacillus. Tuy nhiên ở
Việt Nam, số lượng các nghiên cứu về vi khuẩn lactic còn quá khiêm tốn và có rất ít
cơng trình nghiên cứu về tối ưu hóa mơi trường ni cấy Lactobacillus. Phần lớn các
nghiên cứu về Lactobacillus ở trong nước chỉ là nghiên cứu cơ bản về nhóm vi khuẩn
này như ở mức phân lập và định danh, tuyển chọn giống có hoạt tính tốt để làm
probiotic.
1.2.1.

Các nghiên cứu trên thế giới

Năm 2012, Hu và cộng sự đã công bố nghiên cứu về tối ưu hóa mơi trường ni
cấy Lactobacillus plantarum YSQ khi sử dụng các sản phẩm nơng nghiệp có giá thành
thấp như bột đậu nành, bột ngơ, lúa mì và nước ép cà chua làm nguồn dinh dưỡng, từ
đó làm giảm giá thành sản phẩm khi lên men theo quy mô lớn.
Năm 2010, Magdalena và cộng sự đã công bố nghiên cứu về tối ưu hóa các yếu tố
dinh dưỡng như nguồn cacbon, nitơ, muối khoáng và các yếu tố tăng trưởng (vitamin
B, axit amin) khi dùng phương pháp bề mặt đáp ứng để tăng sinh khối vi khuẩn
Lactobacillus rhamnosus PEN.
SVTH: TRẦN THỊ KIỀU

10

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Năm 2006, Altaf và cộng sự đã tối ưu hóa mơi trường thu acid lactic cho chủng
Lactobacillus amylophilus GV6 bằng cách sử dụng các nguồn cacbon, nitơ rẻ tiền như:
bột bắp, bột đậu lăng đỏ thay thế cho pepton, glucose trong môi trường MRS bằng
phương pháp Plackett-Burman và đáp ứng bề mặt (RSM). Kết quả cho thấy
Lactobacillus amylophilus GV6 đạt được hiệu suất 78,4% và năng suất 96% (g acid
lactic/ g tinh bột được sử dụng).
Farooq và cộng sự (2012) đã sử dụng mật rỉ đường (phụ phẩm của q trình sản
xuất đường mía) làm nguồn cacbon trong môi trường tối ưu thu sinh khối của vi khuẩn
Lactobacillus delbrueckii.
Năm 1995, Oh và cộng sự đã công bố nghiên cứu về các giá trị tối ưu của trypton,
cao nấm men, glucose, nhiệt độ nuôi cấy cho sự tăng trưởng của Lactobacillus casei
YIT 9018. Kết quả giá trị tối ưu của các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của L.casei
YIT 9018 như sau: trypton, 3,04%; cao nấm men, 0,892%; glucose, 1,58%; nhiệt độ
nuôi cấy là 35oC.
Năm 2006, Zhong đã cơng bố nghiên cứu về tối ưu hóa môi trường nuôi cấy
Lactobacillus casei LC2W bằng phương pháp bề mặt đáp ứng để tăng cường sản xuất
exopolysaccharid. Kết quả tối ưu các điều kiện nuôi cấy để sản xuất exopolysaccharid:
nhiệt độ nuôi cấy là 32,5°C và thời gian nuôi là 26 giờ.
1.2.2.

Các nghiên cứu trong nước

Năm 1996, Nguyễn Đăng Diệp và cộng sự đã công bố nghiên cứu về mơi trường
ni vi khuẩn lactic tốt nhất. Mơi trường đó là sữa gầy hoàn nguyên với thời gian lên
men tốt nhất là 18-20 giờ, bổ sung giống 2-3%.
Trong công bố nghiên cứu của Nguyễn Thị Hồng Hà và cộng sự năm 2003 đã sử
dụng hai chủng Bifidobacteria bifidum và Lactobacillus acidophilus để sản xuất chế
phẩm probiotic. Tìm ra được ba mơi trường thích hợp ni cấy vi khuẩn Bifidobacteria

bifidum là môi trường thyoglycolat, môi trường nước chiết gan, môi trường nước chiết
thịt bị ở điều kiện ni cấy kỵ khí. Mơi trường thích hợp cho L. acidophilus là mơi

SVTH: TRẦN THỊ KIỀU

11


TỔNG QUAN TÀI LIỆU

trường MRS, môi trường nước chiết cà chua, môi trường nước chiết giá, môi trường
nước thải của Công ty sữa Vinamilk.
1.3.

QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM

Quy hoạch thực nghiệm là dạng nghiên cứu về mối quan hệ nguyên nhân – kết
quả. Trước hết, nhà nghiên cứu cần xác định các thơng số (hay các biến) cần và có thể
quan tâm rồi đưa ra các chiến thuật làm thực nghiệm từ giai đoạn đầu đến giai đoạn kết
thúc của quá trình nghiên cứu đối tượng (từ nhận thơng tin mơ phỏng đến việc tạo ra
mơ hình tốn, xác định các điều kiện tối ưu), trong điều kiện đã hoặc chưa hiểu biết
đầy đủ về cơ chế của đối tượng. (Nguyễn Văn Dự và cs., 2011).
1.3.1.

Phương pháp quy hoạch thực nghiệm

Quy hoạch thực nghiệm là cơ sở phương pháp luận của nghiên cứu thực nghiệm
hiện đại. Đó là phương pháp nghiên cứu mới, trong đó cơng cụ tốn học giữ vai trị tích
cực. Cơ sở tốn học nền tảng của lý thuyết qui hoạch thực nghiệm là toán học xác suất
thống kê với hai lĩnh vực quan trọng là phân tích phương sai và phân tích hồi qui

(Giang Thị Kim Liên, 2009).
1.3.1.1. Khái niệm
Quy hoạch thực nghiệm là tập hợp các tác động nhằm đưa ra chiến thuật làm thực
nghiệm từ giai đoạn đầu đến giai đoạn kết thúc của quá trình nghiên cứu đối tượng (từ
nhận thơng tin mơ phỏng đến việc tạo ra mơ hình tốn, xác định các điều kiện tối ưu),
trong điều kiện đã hoặc chưa hiểu biết đầy đủ về cơ chế của đối tượng (Giang Thị Kim
Liên, 2009).
1.3.1.2. Đối tượng
Là một quá trình hoặc hiện tượng nào đó có những tính chất, đặc điểm chưa biết
cần nghiên cứu. Người nghiên cứu có thể chưa hiểu biết đầy đủ về đối tượng, nhưng đã
có một số thông tin tiên nghiệm dù chỉ là sự liệt kê sơ lược những thơng tin biến đổi,
ảnh hưởng đến tính chất đối tượng. Có thể hình dung chúng như một “hộp đen” trong
hệ thống điều khiển gồm các tín hiệu đầu vào và đầu ra (Giang Thị Kim Liên, 2009).

SVTH: TRẦN THỊ KIỀU

12


TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Hình 1.6 Hộp đen trong hệ thống điều khiển một q trình.
Các tín hiệu đầu vào được chia thành ba nhóm: (Giang Thị Kim Liên, 2009)
1)

Các biến kiểm tra được và điều khiển được, mà người nghiên cứu có thể

điều chỉnh theo dự định, biểu diễn bằng vectơ:
Z = [Z1, Z2, ..., Zk]
2)

Các biến kiểm tra được nhưng không điều khiển được, biểu diễn bằng

vectơ:
T = [T1, T2, ..., Th]
3)

Các biến không kiểm tra được và không điều khiển được, biểu diễn bằng

vectơ:
E = [E1, E2, ..., Ef]
Các tín hiệu đầu ra dùng để đánh giá đối tượng là vectơ Y = (y1, y2,..., yq).
Chúng thường được gọi là các hàm mục tiêu. Biểu diễn hình học của hàm mục tiêu
được gọi là mặt đáp ứng (bề mặt biểu diễn). Phương pháp toán học trong xử lý số liệu
từ kế hoạch thực nghiệm là phương pháp thống kê. Vì vậy các mơ hình biểu diễn hàm
mục tiêu chính là các mơ hình thống kê thực nghiệm. Các mơ hình này nhận được khi
có cơng tính nhiễu ngẫu nhiên.
1.3.1.3. Ưu điểm về quy hoạch thực nghiệm
Quy hoạch thực nghiệm đóng vai trị quan trọng trong khoa học kỹ thuật. Các mơ
hình lý thuyết, giải thuật, q trình mới luôn được kiểm nghiệm thực trước khi đem ra
SVTH: TRẦN THỊ KIỀU

13


TỔNG QUAN TÀI LIỆU

ứng dụng. Hơn nữa, quy hoạch thực nghiệm cịn có ý nghĩa bổ sung, hồn chỉnh các
kết quả nghiên cứu sáng tạo lý thuyết đã được phát triển (Giang Thị Kim Liên, 2009).
Có thể nói, lý thuyết quy hoạch thực nghiệm từ khi ra đời đã thu hút sự quan tâm

và nhận được nhiều đóng góp hồn thiện của các nhà khoa học. Những ưu điểm rõ rệt
của phương pháp này so với các thực nghiệm cổ điển là: (Giang Thị Kim Liên, 2009)
− Giảm đáng kể số lượng thí nghiệm cần thiết.
− Hàm lượng thơng tin nhiều hơn rõ rệt, nhờ đánh giá được vai trò qua lại giữa
các yếu tố và ảnh hưởng của chúng đến hàm mục tiêu. Nhận được mơ hình tốn học
thống kê thực nghiệm theo các tiêu chuẩn thống kê, đánh giá được sai số của quá trình
thực nghiệm theo các tiêu chuẩn thống kê cho phép xét ảnh hưởng của các yếu tố với
mức độ tin cậy cần thiết.
− Cho phép xác định được điều kiện tối ưu đa yếu tố của đối tượng nghiên cứu
một cách khá chính xác bằng các cơng cụ tốn học, thay cho cách giải gần đúng, tìm
tối ưu cục bộ như các thực nghiệm thụ động.
1.3.2.

Thí nghiệm sàng lọc

Thí nghiệm sàng lọc là thí nghiệm được tiến hành nhằm các mục đích sau:
Xác định đâu là yếu tố ảnh hưởng chính đến đối tượng hay quá trình cần khảo sát.
Đáng giá mức độ ảnh hưởng của các yếu tố.
Đánh giá mức độ ảnh hưởng tương tác giữa các yếu tố.
Thí nghiệm sàng lọc thường khai thác các dạng thí nghiệm tồn phần 2 mức khi
số yếu tố thí nghiệm khơng lớn hoặc thiết kế thí nghiệm riêng phần hay thiết kế thí
nghiệm Plackett – Burman (P-B).
1.3.2.1. Sơ lược về thết kế thí nghiệm tìm các yếu tố ảnh hưởng của PlackettBurman


Mục đích của thiết kế

Xác định các “yếu tố quan trọng” ảnh hưởng đến quá trình mục tiêu.


Đặc điểm của thiết kế

SVTH: TRẦN THỊ KIỀU

14


TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Bắt nguồn từ ma trận đầy đủ (full - factorial matrices), sử dụng giả định rằng tất
cả các tương tác khơng có dấu hiệu liên quan đáng kể so với các yếu tố chính, thiết kế
Plackett – Burman dựa trên ma trận hai cấp cho mỗi yếu tố và sửa đổi nó để giảm thất
bại (Plackett và Burman, 1946).
Yếu tố tác động chính trong thiết kế Plackett - Burman thay thế tất cả các tương
tác của một ma trận đầy đủ. Tuy nhiên, điều này khơng có nghĩa là thông tin về sự
tương tác không thể được xác định từ thiết kế Plackett-Burman (Plackett và Burman,
1946).
Với một thiết kế Plackett - Burman gồm n thí nghiệm (với n là bội số của 4, n ≤
100, ngoại trừ n = 92 là chưa thể xác định) với số yếu tố k ≤ (n - 1).
Như vậy thiết kế Plackett – Burman là thiết kế tiết kiệm thời gian và số thí
nghiệm nhất với số yếu tố cần khảo sát là cao nhất. Thiết kế Plackett – Burman là một
thiết kế không thể thiếu khi đối tượng đang nghiên cứu chưa có nhiều thơng tin về các
yếu tố có khả năng ảnh hưởng chính đã được khảo sát (Plackett và Burman, 1946).
Việc chọn các ma trận mà sẽ phụ thuộc vào số yếu tố thí nghiệm trên cộng với
các phương pháp lựa chọn để xác định sai số thí nghiệm.
Có nhiều cách để xác định sai số thí nghiệm như (Plackett và Burman, 1946):
- Chọn điểm trung tâm và cho một số thí nghiệm tại điểm đó.
- Lặp lại tồn bộ ma trận thí nghiệm.
- Thực hiện nhiều phép đo độc lập trong tổ hợp.


Phân tích kết quả thí nghiệm

Sau khi thử nghiệm được tiến hành, dữ liệu từ thí nghiệm được sử dụng để tính
tốn các hiệu ứng và để xác định ý nghĩa thống kê của những hiệu ứng (Plackett và
Burman, 1946).
Để tính tốn các hiệu ứng, nhập các giá trị trung bình vào ma trận. Sau đó, so
sánh sự khác biệt giữa các đáp ứng trung bình ở mức cao và đáp ứng trung bình ở mức
thấp. Các ảnh hưởng của yếu tố luôn luôn thay đổi trong các phản ứng khi đi từ cấp độ
thấp đến cấp độ cao. (Plackett và Burman, 1946)
SVTH: TRẦN THỊ KIỀU

15


TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Xác định được mức độ để thiết lập các yếu tố phụ thuộc vào mục tiêu thử nghiệm
(Plackett và Burman, 1946):
Nếu mục đích là để tối đa hóa một phản ứng, tất cả các yếu tố có tác động tích
cực sẽ được thiết lập để hoạt động ở mức độ cao và tất cả các yếu tố có tác động tiêu
cực sẽ được thiết lập để hoạt động ở mức thấp.
Nếu mục tiêu là để giảm thiểu các phản ứng, tất cả các yếu tố có tác động tích cực
sẽ được thiết lập ở mức thấp và tất cả đều có một tác động tiêu cực sẽ được thiết lập ở
mức cao.
Nếu như ảnh hưởng của các yếu tố được kiểm tra có ý nghĩa thống kê thì yếu tố
đó là 1 yếu tố quan trọng…
1.3.3.

Thí nghiệm tối ưu hóa

Một trong những mục đích chính của nghiên cứu thực nghiệm trong kĩ thuật là
tìm giá trị cực trị hay tìm vùng tối ưu cho một quá trình hay các điều kiện tối ưu để vận
hàng một hệ thống. Lớp các bài toán nghiên cứu thực nghiệm về vấn đề tối ưu thường
được biết đến với tên gọi “phương pháp bề mặt chỉ tiêu” (Response Surface Method –
RSM) nhằm mục đích (Nguyễn Văn Dự và cs., 2011):
Chỉ ra tập giá trị các biến đầu vào (điều kiện vận hành, thực thi) sao cho tạo ra
ứng xử của đối tượng nghiên cứu là tốt nhất.
Tìm kiếm các giá trị biến đầu vào nhằm đạt được các yêu cầu cụ thể về ứng xử
của đối tượng nghiên cứu.
Xác định các điều kiện vận hành mới nhằm đảm bảo cải thiện chất lượng hoạt
động của đối tượng so với tình trạng cũ.
Mơ hình hóa quan hệ giữa đối tượng đầu vào và ứng xử của đối tượng nghiên
cứu, dùng làm cơ sở dự đốn hay điều khiển q trình hay hệ thống.
Tiến trình tối ưu hóa RSM thường gồm 3 giai đoạn:
Giai đoạn : Thí nghiệm khởi đầu.
Giai đoạn 2: Leo dố tìm vùng cực trị.
Giai đoạn 3: Thí nghiệm bề mặt chỉ tiêu.
SVTH: TRẦN THỊ KIỀU

16