Bài giảng Nuôi cấy tế bào động vật, kỹ thuật và ứng dụng: Bảo quản đông lạnh tế bào

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TPHCM
KHOA SINH HỌC – CÔNG NGHỆ SINH HỌC
VIỆN TẾ BÀO GỐC

NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT: KĨ THUẬT VÀ ỨNG DỤNG

BẢO QUẢN ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO
CRYOPRESERVATION

Lê Thị Ngân Hà


TPHCM 03/2018


…"IwanttoliveandlivelongerandIthinkthatinthefuturetheymay
findacureformycancerandwakemeup,"the14-year-oldwrotetoa
Britishjudgebeforeherrecentdeath.
Shesaid"beingcryopreservedgivesmeachancetobecuredandwoken
up— eveninhundredsofyears'time.”…


o Tái lưu thông máu
o Thuốc hỗ trợ bảo vệ tế bào
o Thay máu và dịch lỏng
trong cơ thể bằng chất
chống đông
o Giảm nhiệt với tốc độ
0,5/giờ đến nhiệt độ nito
lỏng
o Bảo quản trong các tủ

đơng hình trụ.


Lịch sử
now

1987 Tạm dừng các bảo quản trứng.
1970s Phát triển các nghiên cứu về đông lạnh tinh trùng người.
1959 Lovelock,Bishop:DMSO– redbloodcell
1953 Sherman:đông lạnh tinh trùng người – rã đông
1949 Polge:glycerol– tinh trùng gà

1866 Mantagazza:ngân hàng tinh trùng cho tinh trùng người đông lạnh

1776 Spallanzani:tinh trùng người vẫn dichuyển khi gặp nhiệt độ thấp


Bảo quản đơng lạnh là gì?
Bảo quản: là quy trình sinh học nhằm đảm bảo •nh
ổn định về mặt di truyền và cấu trúc nguyên vẹn củ
a các tế bào sống; đảm bảo các thành phần như
nucleic acid và protein của tế bào không thay đổi.
Bảo quản lạnh là việc sử dụng nhiệt độ rất thấp để bảo
vệ tế bào và mơ sống cịn ngun vẹn trong một thời
gian dài


Vì sao phải bảo quản đơng lạnh tế bào?
Thuận
lợi bảo

tồn gen

Ngân
hàng tế
bào

Giảm rủi
ro
nhiễm

Tiết kiệm
thời gian
ngun
vật liệu

Thuận
lợi phân
loại,tạo
dịng

Ngăn
cản sự
biệt hố
/lão
hố
Dịng tế
bào quý
hiếm

Thuận

lợi vận
chuyển


Đáp ứng của tế bào với các stress khi đông lạnh
Tác nhân stress

Phản ứng của tế bào

Giảm nhiệt độ

Biến đổi lớp màng lipid,khử polymer
hoá bộ xương tế bào

Tăng nồng độ các chất hoà tan

Giảm áp suất thẩm thấu

Tăng nồng độ ion

Phản ứng trực tiếp trên màng bào
gồm tính tancủa màng protein

Khử nước

Mất ổn định lớp đơi phospholipid

Kết tủa muối

Khơng rõ

Hình thành bọt khí

Tổn thương cơ học lên màng và bộ
xương tế bào

Thay đổi pH

Biến tính protein

Tế bào bị chèn xếp khít lại

Tổn thương màng

Tính nhớt của mơi trường tăng

Q trình khuếch tán/thẩm thấu bị
hạn chế


NGUYÊNTẮC
Giảm thiểu sự hình thành tinh thể băng trong tế bào

(1) Đông lạnh “chậm”
(2) Sử dụng chất bảo quản đông lạnh
(3) rữ các tế bào ở mức nhiệt độ thấp nhất có thể để giảm thiểu tác động của nồng
độ muối cao lên sự biến đổi proteintrong TB.
(4) tanbăng nhanh chóng để giảm thiểu sự phát triển của tinh thể băng (tái kết tinh)

Nhiệt độ

CPA

Quy trình
Tốc độ làm lạnh
Yếu tố ảnh hưởng đến TB


TaeHoonJang,Cryopreservationanditsclinicalapplications,2017


CHẤT BẢO QUẢN ĐÔNG LẠNH – CRYOPROTECTANTS AGENT
CPA

Là các loại hố chất tan được trong nước, có khả năng xâm nhập vào bên
trong tế bào, được sử dụng với mục đích giúp tế bào ngăn ngừa các tổn
thương tế bào do đông lạnh.
Nguyên tắc:
(1) Thay thế nước trong tế bào à giảm hình thành tinh thể đá nội bào à
giảm tổn thương do tinh thể đá gây ra.
(2) Hạn chế tăng nồng độ các chất hoà tan nội bào
(3) Kết lên màng bào tương à bảo vệ tế bào.
Hoạt động: “khử nước” trong q trình đơng lạnh, “bù nước” trong q
trình giải đơng
VD: DMSO, glycerol, glycols, một vài amino acid (proline), …

Permeating

Non-permeating

Sucrose,dextran


Ảnh hưởng của CPA lên Tế bào

Nồng độ?


QUY TRÌNH BẢO QUẢN ĐƠNG LẠNH TẾ BÀO
CHUẨNBỊTẾBÀO
BỔSUNGCHẤTBẢOQUẢN
LÀMLẠNH
LƯUTRỮ
GIẢIĐƠNG- PHỤCHỒI
NITĂNGSINH


CHUẨN BỊ
Thiết bị
Kính hiển vi đảo ngược
• Tủ thao tác an tồn sinh h
ọc cấp II • Máy ly tâm
• Tủ ủ nuôi tế bào (370C, 5%
CO2)
• Tủ mát 2-80C
• Tủ âm 00C đến -200C
• Bình chứa nito lỏng
Bể ổn nhiệt

Dụng cụ – hoá chất

Dụng cụ nuôI cấy tế bào phù hợp
Trypsin/EDTA 0,25%
PBS không Ca2+ và Mg 2+ (PBS-)
Môi trường đông lạnh tế bào
Ống bảo quản đông lạnh (cryovial)
1,5-2 ml
Ống ly tâm 15ml hoặc 50 ml vô
trùng
Môi trường giải đông


CHUẨNBỊ


CHUẨNBỊTẾBÀO

ü Tình trạng tế bào:pha log
ü Số lượng tế bào?
ü Nhiễm?
ü Xác định tỷ lệ tế bào sống chết
ü Dán nhãn cryotube


BỔSUNGCHẤTBẢOQUẢN

Thànhphầnmôitrườngđônglạnhtếbào:
✓môitrườngcơbản:RPMI,DMEM/F12,IMDM…
✓huyếtthanhthaibò(FBS):40-50%
✓CPA:dimethylsulphoxide(DMSO):5-10%

LÀMLẠNH

Đơng lạnh
chậm
Đơng lạnh
theo
chương
trình,giảm
nhiệt theo
setuptrên
máy.

Đơng lạnh
nhanh 3
bước
4
-20
-80
-196

Đơng lạnh
cực nhanh

Đơng lạnh
insitu

Chuyển TB Đông lạnh
trực tiếp
khi tế bào

vào -196
vẫn giữ
trạng thái
tăng sinh
lúc nuôi cấy


LƯUTRỮ

Thời gian lưu trữ:

Bất kỳ một gián đoạn nào trong thời gian trữ đông đều ảnh
hưởng đến khả năng sống của Tbsau giải đông.

Nhiệt độ lưu trữ:

Nhiệt độ

Thời gian

4độ

Vài giờ

-20độ

Vài ngày

-80độ

Vài tháng

-196độ

Vài thế kỷ


GIẢIĐƠNG- PHỤCHỒI

Thao tác?

NITĂNGSINH

MTGĐ: môi trường cơ bản (RPMI,
DMEM/F12, IMDM...) bở sung 2030% huyết thanh thai bò (FBS), 1%
kháng sinh-kháng nấm
Kiểm tra sống/chết

+MTGĐ

Lytâm 5p
Tốc độ thấp

Thu
cặn TB


Chết TB

↓p/u

sinh
hoá

Giảm nhiệt
Tốc độ
làm lạnh

Tăng nhiệt
Loại CPA

CPA

Cryopreservation

Thawing