KIỂM NGHIỆM bài sắc kí lớp MỎNG

Sắc ký lớp mỏng

Biên soạn: PGS TS Võ thị Bạch Huệ
3/2012

1


1/- Mở đầu
Các kỹ thuật tách sắc ký là những phương pháp
tách trong đó các thành phần của mẫu được phân
bố vào hai pha: một pha tĩnh và một pha động.
Pha tĩnh có thể là một chất rắn,
cũng có thể là một chất lỏng
được giữ trên một chất rắn hay
một gel. Pha tĩnh có thể được
nhồi vào một cột, hoặc trải
thành một lớp, hay phân tán
thành một lớp phim v.v.. Pha
động có thể là chất khí, chất
lỏng hay chất lưu siêu tới hạn
(còn được gọi là chất lỏng siêu
tới hạn).

/>
2


1/- Mở đầu

Sự tách sắc ký có thể dựa trên các cơ chế khác

nhau như
- hấp phụ,
- phân bố khối lượng (hay phân chia),
- trao đổi ion,
- hoặc dựa trên sự khác nhau về các tính chất lý
hố của các phân tử như kích thước, khối lượng,
thể tích, v.v…

3


2/- Lịch sử
Nhà thực vật học người Nga Mikhail Tswett (Mikhail
Semyonovich Tsvet) phát minh ra kĩ thuật sắc kí vào
năm 1903 khi ông đang nghiên cứu về chlorophyll.

4


1/- Mở đầu

Khi cho dung dịch các sắc
tố thực vật trong ether
dầu hỏa lên một cột được
nhồi bởi bột mịn calci
carbonat, ông nhận thấy
sắc tố bị hấp phụ trên
đầu cột. Khi cho dung
môi nguyên chất (ether
dầu hỏa) lên cột, các sắc

tố di chuyển trong cột và
tách thành những vòng
màu xếp chồng lên nhau.
Phương pháp này sau đó
được đặt tên là sắc ký

1/- Mở đầu
(Chromatography: Sắc ký nghĩa
là ghi màu, trong tiếng Hy Lạp
chữ chroma có nghĩa là màu;
nó vừa là tên của Tsvet trong
nghĩa tiếng Nga vừa là màu
của các sắc tố thực vật ơng
phân tích lúc bấy giờ, cịn
graphein là viết). Tên này vẫn
tiếp tục được dùng dù các
phương pháp này cịn được sử
dụng để tách các chất khơng
màu.
5


Các kỹ thuật
1938 Izmailov và Schraiber đã xây dựng và sau đó
năm 1958 Stahl đã hồn thiện phương pháp sắc ký
lớp mỏng.

6

Các kỹ thuật
Sắc ký tiếp tục phát triển không ngừng nhờ vào

những kết quả nghiên cứu của Archer John Porter
Martin và Richard Laurence Millington Synge trong

suốt những năm thập niên 40 và 50 của thế kỷ 20.
Hai ông đã đưa ra những nguyên tắc và kỹ thuật cơ

bản của sắc ký phân bố làm động lực cho sự phát
triển của nhiều phương pháp sắc ký khác nhau như

sắc ký giấy (PC), sắc ký khí (GC) và sắc ký lỏng cao
áp (HPLC).

7


3/- Nguyên tắc sắc ký lớp mỏng:
Sắc ký lớp mỏng là một kỹ thuật tách các chất được
tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh
trên đó đã đặt hỗn hợp các chất cần tách.

8


3/- Nguyên tắc sắc ký lớp mỏng:
Pha tĩnh là chất hấp phụ được chọn phù hợp theo
từng yêu cầu phân tích, được trải thành lớp mỏng
đồng nhất và được cố định trên các phiến kính hoặc

phiến kim loại.

9


Solvent

3/- Nguyên tắc sắc ký
lớp mỏng:
Pha động là một hệ dung
môi đơn hoặc đa thành
phần được trộn với nhau
theo tỷ lệ quy định trong
từng chuyên luận. Trong
quá trình di chuyển qua
lớp hấp phụ, các cấu tử
trong hỗn hợp mẫu thử
được di chuyển trên lớp
mỏng, theo hướng pha
động, với những tốc độ
khác nhau. Kết quả, thu
được một sắc ký đồ trên
lớp mỏng.

MF
MW

o

Bp ( C)

Density (g/mL)

Hazards*

Dipole

Hexane
CH3(CH2)4CH3

C6H14
86.17

68.7
0.659

Flammable
Toxic

0.08

Elution
Stength
()
0.01

Toluene
C6H5CH3

C7H8
92.13

110.6
0.867

Flammable
Toxic

0.31

0.22

Diethyl ether
CH3CH2OCH2CH3

C4H10O
74.12

34.6
0.713

Flammable
Toxic, CNS
Depressant

1.15

0.29

Dichloromethane
CH2Cl2

CH2Cl2
84.94

39.8
1.326

Toxic, Irritant
Cancer suspect

1.14

0.32

Ethyl Acetate
CH3CO2CH2CH3

C4H8O2
88.10

77.1
0.901

Flammable
Irritant

1.88

0.45

Acetone
CH3COCH3

C3H6O
58.08

56.3
0.790

Flammable
Irritant

2.69

0.43

Butanone
CH3CH2COCH3

C4H8O
72.10

80.1
0.805

Flammable
Irritant

2.76

0.39

1-Butanol
CH3CH2CH2CH2OH

C4H10O
74.12

117.7
0.810

Flammable
Irritant

1.75

0.47

Propanol
CH3CH2CH2OH

C3H8O
60.09

82.3
0.785

Flammable
Irritant

1.66

0.63

Ethanol
CH3CH2OH

C2H6O
46.07

78.5
0.789

Flammable
Irritant

1.70

0.68

Methanol
CH3OH

CH4O
32.04

64.7
0.791

Flammable

Toxic

1.7

0.73

Water
HOH

H2O
18.02

100.0
0.998

1.87

>1

10


4/- Cơ chế
của sự chia tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bố,
trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng
thời của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất của
chất làm pha tĩnh và dung môi làm pha động.

/>
11

5/- Cách tiến hành
5.1/- Dụng cụ

- Bình triển khai, thường bằng thuỷ tinh trong suốt
có kích thước phù hợp với các phiến kính cần dùng
và có nắp đậy kín.

12


- Ðèn tử ngoại, phát các bức xạ có bước sóng ngắn
254 nm và bước sóng dài 365 nm.
- Dụng cụ để phun thuốc thử.
•Dụng cụ để phun th́c thử.
Bình phun thuốc thử hình trụ

Bình phun thuốc thử hình tam giác

13


- Tủ sấy điều nhiệt để hoạt hóa và sấy bản mỏng và
sắc ký đồ, hoặc để sấy nóng đối với một số phản
ứng phát hiện.
- Tủ hút hơi độc.
- Máy sấy dùng để sấy khô sắc ký đồ và cho phép
chấm nhanh nhiều lần những dung dịch pha loãng
chất cần phân tích.

- Một máy ảnh thích hợp (với ống kính Macro) có
thể chụp lưu giữ sắc ký đồ ở ánh sáng ban ngày với
khoảng cách 30-50 cm.
- Tủ lạnh để bảo quản những thuốc thử dễ hỏng.
- Micropipet nhiều cỡ từ l, 2, 5, 10 đến 20 ml, các
ống mao quản hoặc dụng cụ thích hợp.
- Bản mỏng tráng sẵn chất hấp phụ có chất phát
14
quang thích hợp.


5.2/- Chuẩn bị bình khai triển:
Các bình khai triển thường là bình thủy tinh, hình hộp hay
hình trụ, có nắp đậy kín, kích thước thay đổi tùy theo yêu
cầu của các bản mỏng sử dụng. Bão hịa hơi dung mơi trong
bình bằng cách lót giấy lọc xung quanh thành trong của
bình, rồi rót một lượng vừa đủ dung mơi vào bình, lắc rồi để
giấy lọc thấm đều dung mơi. Lượng dung môi sử dụng sao
cho sau khi thấm đều giấy lọc còn lại một lớp dày khoảng 5
mm đến 10 mm ở đáy bình. Ðậy kín nắp bình và để yên 1
giờ ở nhiệt độ 20 - 25oC.

15


5.2/- Chuẩn bị bình khai triển:
Muốn thu được những kết quả lặp
lại, ta chỉ nên dùng những dung
môi thật tinh khiết, loại dùng cho
sắc ký. Những dung môi dễ bịến

đổi về hóa học chỉ nên pha trước
khi dùng. Nếu sử dụng những hệ
pha động phức tạp phải chú ý đến
những thành phần dễ bay hơi làm
thay đổi thành phần của hệ pha
động dẫn đến hiện tượng không
lặp lại của trị số Rf.
16


5.3/- Chấm chất phân tích lên bản mỏng:
Lượng chất hoặc hỗn hợp chất đưa lên bản mỏng có
ý nghĩa quan trọng đối với hiệu quả tách sắc ký, đặc
bịệt ảnh hưởng rất lớn đến trị số Rf.

17


Lượng chất quá lớn làm cho vết sắc ký lớn và kéo
dài, khi đó, vết của các chất có trị số Rf gần nhau sẽ
bị chồng lấp.
Lượng chất nhỏ quá có thể khơng phát hiện được do
độ nhạy của thuốc thử không đủ (thông thường độ
nhạy của các thuốc thử trên 0,005 mg). Lượng mẫu
thông thường cần đưa lên bản mỏng là 0,1 - 50 mg
ở dạng dung dịch trong ether, cloroform, nước hay
dung mơi thích hợp khác.

18

5.3/- Chấm chất phân tích lên bản mỏng:
Thể tích dung dịch từ 0,001 ml đến 0,005 ml đối với
trường hợp đưa mẫu lên bản mỏng dưới dạng
điểm và từ 0,l - 0,2 ml khi đưa mẫu lên bản mỏng
dưới dạng vạch như trong trường hợp sắc ký điều
chế.
Ðối với sắc ký điều chế thì lượng chất có thể lên tới
10 - 50 mg. Ðối với các dung dịch có nồng độ rất
lỗng thì có thể làm giàu trực tiếp trên bản mỏng
bằng cách chấm nhiều lần ở cùng một vị trí và sấy
khơ sau mỗi lần chấm.

19


5.3/- Chấm chất phân tích lên bản mỏng:
Ðường xuất phát phải cách mép dưới của bản mỏng
1,5cm - 2 cm và cách bề mặt dung môi từ 0,8 - 1
cm. Các vết chấm phải nhỏ, có đường kính 2 - 6
mm và cách nhau 15 mm. Các vết ở bìa phải cách
bờ bên của bản mỏng ít nhất 1 cm để tránh hiệu
ứng bờ.

20


5.3/- Chấm chất phân tích lên bản mỏng:

Khi làm sắc ký lớp mỏng bán định lượng, độ chính

xác của kết quả phân tích phụ thuộc rất nhiều vào

độ chính xác của lượng chất thử đưa lên bản mỏng,
tức là thể tích dung dịch chấm lên bản mỏng. Do

đó, với những trường hợp phân tích bán định lượng
phải dùng các mao quản định mức chính xác. Khi
khơng cần định lượng dùng micropipet hoặc ống
mảo quản thường.
21


Rf (A) =

2.0 cm
5.0 cm

= 0.40

Solvent Front

Rf (B) = 3.0 cm = 0.60
5.0 cm

Distance solvent
migrated = 5.0 cm
4.0 cm

Rf (C) = 0.8 cm = 0.16

Distance A
migrated = 3.0 cm

5.0 cm

Distance B
migrated = 2.0 cm

3.0 cm

Rf (D) = 4.0 cm = 0.80
5.0 cm

Distance C
migrated = 0.8 cm
Origen

x
A

x x x x
B U C D

0.8 cm

Rf (U1) = 3.0 cm = 0.60
5.0 cm

Rf (U2) =0.8 cm
5.0 cm

= 0.16

22


5.4/- Triển khai sắc ký:
Ðặt bản mỏng gần như thẳng đứng với bình triển
khai, các vết chấm phải ở trên bề mặt của lớp dung
mơi khai triển. Ðậy kín bình và để yên ở nhiệt độ
không đổi. Khi dung môi đã triển khai trên bản
mỏng được một đoạn theo quy định trong chuyên
luận, lấy bản mỏng ra khỏi bình, đánh dấu mức
dung mơi, làm bay hơi dung mơi cịn đọng lại trên
bản mỏng rồi hiện vết theo chỉ dẫn trong chuyên
luận riêng.

23


Quan sát các vết xuất hiện, tính giá trị Rf hoặc Rr và
tiến hành định tính, phát hiện tạp chất hoặc định
lượng như quy định trong chuyên luận riêng.
Việc sắc ký lớp mỏng được tiến hành trong điều
kiện chuẩn hoá cho kết quả có độ tin cậy cao hơn.
Hiện nay người ta thường tiến hành sắc ký với sự
giúp đỡ của hệ thống sắc ký lớp mỏng hiệu năng
cao
Ðại lượng đặc trưng cho mức độ di
chuyển của chất phân tích là hệ số

di chuyển Rf được tính bằng tỷ lệ
giữa khoảng dịch chuyển của chất
thử và khoảng dịch chuyển của
dung môi:

24


a là khoảng cách từ điểm xuất
phát đến tâm của vết mẫu
thử, tính bằng cm.
a’ là khoảng cách từ điểm
xuất phát đến tâm của vết
mẫu đối chiếu, tính bằng cm.
b là khoảng cách từ điểm xuất
phát đến mức dung môi đo
trên cùng đường đi của vết,
tính bằng cm.
Rf: Chỉ có giá trị từ 0 đến l

25