MỞ đầu CÁCH THẢO LUẬN đề TÀI về xây DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG nấm LINH CHI

MỞ ĐẦU CÁCH TẢO LUẬN ĐỀ TAI VỀ XÂY DỰNG
QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG NẤM LINH CHI


MỤC LỤC


3

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết
Ngày nay xu hướng sử dụng các thảo dược thiên nhiên để trị bệnh đã
trở nên phổ biến, việc tìm kiếm khả năng chữa trị bệnh từ các loại nấm
dược liệu đã được tiến hành ở nhiều nơi trên thế giới: Nhật Bản, Trung
Quốc, Đài Loan, Malaysia, Thái Lan, …. Trong số đó, nấm linh chi là đối
tượng được nhiều quốc gia quan tâm nghiên cứu và ứng dụng [1].
Các chất chống oxy hóa bao gồm polyphenol, carotenoid, vitamin C
và vitamin E … trong nấm linh chi có hiệu quả hữu ích trong việc phịng
chống viêm khớp, viêm phế quản, hen suyễn, viêm loét dạ dày, và cải thiện
hiện tượng mất ngủ insomnia [34], [50]. Ngoài ra, các hợp chất
polysaccharides, peptide phức tạp, β-glucans, lectin, germanium hữu cơ,
adenosine, triterpenoids và nucleotide là những hợp chất có hoạt tính sinh
học với khả năng hữu ích làm tăng cường các chức năng của hệ thống miễn
dịch và điều trị các bệnh về suy giảm miễn dịch (nhiễm virus, ung thư), dị
ứng, nhiễm vi sinh vật gây bệnh, chống đơng máu [27], [39]. Thêm vào đó,
nấm linh chi cịn có tác dụng làm giảm cholesterol, chữa cao huyết áp, tiểu
đường, nâng cao hoạt động của gan, chống HIV, HIV-1 và chống HIV-1
protease [4], [36], [44].
Hiện nay, có nhiều loại nấm linh chi được khai thác và sử dụng.
Nhưng trên thực tế vẫn cịn nhiều loại nấm có giá trị kinh tế cao, giá trị
dược liệu trong tự nhiên chưa được nghiên cứu ni trồng [51]. Một trong

số đó khơng thể bỏ qua nấm linh chi Cổ cò (Ganoderma lucidum (Curtis) P.
Karst), loại nấm được xem là thảo dược y học cổ truyền thuộc nhóm thuốc
bổ thượng phẩm, nó được sử dụng trong nhiều loại thực phẩm chức năng
và thuốc phòng bệnh ở các nước Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc.... Dịch


4
chiết nấm linh chi Cổ cò được xem là nguyên liệu quý dùng chống khối u
[37]. Một số báo cáo còn chỉ ra rằng dịch chiết nấm linh chi Cổ cị có khả
năng ức chế sự phát triển khối u trong tuyến tiền liệt của con người và các
dòng tế bào ung thư bàng quang, ức chế sự tăng sinh tế bào và cảm ứng
apoptosis trong cơ thể người [38]. Bên cạnh đó, dịch chiết nấm cịn có tác
dụng lên ung thư biểu mơ ruột và các dịng tế bào ung thư vú [38]. Một số
triterpenes có trong nấm linh chi Cổ cò cũng được chứng minh ức chế sự
tăng trưởng của các tế bào gan bất thường bằng cách thay đổi con đường
phosphoryl hóa nội bào [32], [41]. Gần đây, nấm linh chi Cổ cị đã được
cho rằng có khả năng ức chế sự gia tăng của các dòng tế bào máu khác
nhau như K562, HL1-60, U937, Blin-1, Nalm-6 [26]. Khơng dừng lại ở
việc có giá trị dược liệu q mà nấm linh chi Cổ cị cịn có nhiều nghiên
trên cứu cho thấy trong nấm có thành phần dinh dưỡng rất phong phú bao
gồm các nhóm acid amin, protein, chất béo, đường khử, hợp chất phenol,
và nguyên tố khác như Ag, Fe, Na, Cu,...là nguồn thực phẩm tốt cho sức
khỏe của con người [6]. Chính vì thế hiện nay, nấm linh chi Cổ cò được
khai thác rất nhiều và trở thành nguồn kinh tế chính của người dân vùng
đệm vườn quốc gia trên nước ta. Nhưng việc khai thác của người dân đã
một phần làm tác động tiêu cực đến hệ sinh thái của các vườn quốc gia nói
chung và nấm linh chi Cổ cị nói riêng, làm cho số lượng nấm linh chi Cổ
cò giảm mạnh qua từng năm và đang trên nguy cơ cạn kiệt trong tự nhiên
do việc khai thác q mức.
Vì những lí do nêu trên chúng tơi chọn đề tài “Xây dựng quy trình

nhân giống nấm linh chi Cổ cò (Ganoderma lucidum (Curtis) P. Karst)
được thu hái tại vườn quốc gia KonKaKinh tỉnh Gia Lai”.


5

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ GIÁ TÍNH DƯỢC LIỆU CỦA NẤM
LINH CHI CỔ CO
3.1.1. Định lượng hợp chất polysacchride trong nấm Cổ co
Polysaccharides trong linh chi Cổ cò được chiết trong nước ấm 60 0C
và dùng sóng siêu âm hỗ trợ chiết trong 30 phút, sau đó lọc lấy dịch. Tiếp
theo cơ quay thành cặn, cuối cùng dùng phương pháp so màu để xác định
hàm lượng polysaccharides chiết được. Kết quả định lượng polysaccharides
thô được thể hiện ở bảng 3.1

Ghi chú: Những số trong cùng một hàng có chữ cái theo sau giống nhau thì
khơng có ý nghĩa thống kê với nhau, các chữ cái khác nhau thì có sự khác biệt
với nhau về mặt thống kê với độ tin cậy α =0,05

Qua kết quả ở bảng 3.1 cho thấy polysaccharides phân
tán trên toàn bộ quả thể nấm linh chi Cổ Cò với hàm lượng
chiếm 10,1%, chúng tỏ nấm linh chi Cổ cò là loại nấm co
hoạt tính sinh học cao. Kết quả phù hợp với nghiên cứu của
Poh-Guat Cheng và cộng sự (2013) trong dịch chiết bằng
nước

nong

từ

nấm

linh

chi

Cổ

cò

co

hàm

lượng


6
polysaccharides là 12,6% đã gop phần mạnh mẽ thúc đẩy
quá trình chữa lành vết thương ở cḥt gây ra bởi
streptozotocin

[29].

Cũng

nghiên

cứu

về

hợp

chất

polysaccharides trong nấm linh chi Phạm Bảo Trương (2015)
cho thấy nhiệt độ 1300C và thời gian trích ly 30 phút cho hàm lượng
polysaccharides trong nước linh chi cao nhất (684,1 ± 14,5 mg/l) và trong
nghiên cứu của Sheng-quan Huang và cộng sự (2010) sử dụng UMAE chiết
polysaccharides cho năng suất cao hơn.
Đặc biệt với hàm lượng polysaccharides cao, nấm linh chi Cổ cị có
thể nói là loại nấm có tiềm năng lớn trong khả năng sử dụng làm dược liệu
ức chế các khối u và ngăn ngừa ung thư. Điều này được thể hiện vào năm
2011 trong nghiên cứu của Xu.Z và cộng sự xem xét vai trò tiềm năng của
polysaccharides trong Ganoderma lucidum trong điều trị khối u và các cơ
chế có liên quan. Nghiên cứu cho thấy các hoạt động chống khối u của
polysaccharides được trung gian bởi các hiệu ứng miễn dịch, chống
angiogenic, và cytotoxic, ức chế sự phát triển của khối u hoặc ức chế sự
phát triển của khối u [49]. Hay nghiên cứu của Mau JL (2002) chiết xuất
polysaccharides bằng thủy phân có các hợp chất phenolic ở dạng tự do có
khả năng chống oxy hóa, ức chế peroxidation lipid rất cao [31].
3.1.2. Định lượng hàm lượng protein có trong nấm Cổ co
Dựa vào cơ sở tạo phức chất đồng với protein khi khử với hỗn hợp
phophomolipden – phophovonphramat tạo phức màu xanh có độ hấp thụ ở
bước sóng 660nm. Kết quả định tính protein ở hình 3.2 cho thấy.


7

Hình 3.2 Dãy nồng độ đường chuẩn protein và mẫu thử nghiệm (a)

Hình 3.3. Phương trình đường chuẩn BSA
Mẫu thử nghiệm(OD=0,534, 12,1%)

Mẫu kiểm chứng (OD=0,488, 11%)

Từ đường chuẩn ở hình 3.3 và hình 3.2 ta tính được hàm lượng protein
trong nấm linh chi Cổ cò đạt 12,1%, chứng tỏ nấm linh chi Cổ cị có hàm
lượng protein khá cao so với các nấm dược liệu khác, protein ngồi vai trị
cung cấp dinh dưỡng cịn có tác dụng trong điều trị bệnh cho con người.
Kết quả phù hợp với một số nghiên cứu trên thế giới như: vào năm 2006,


8
Wang H đã phân lập từ nấm Ganoderma lucidum một loại protein kháng
nấm 15 kDa, có tên là Ganodermin bằng phương pháp sử dụng sắc ký trên
DEAE-cellulose, Ganodermin ức chế sự phát triển của nấm Botrytis
cinerea, Fusarium oxysporum và Physalo;spora piricola với giá trị IC50 là
15,2 microM, 12,4 microM và 18,1 microM [33]. Một nghiên cứu khác của
Du.M và cộng sự (2008) nói rằng nấm linh chi đã biến đổi từ 20-30% Selen
vô cơ từ chất nền thành các dạng hữu cơ bằng cách ưu tiên kết hợp selen
với protein. Hợp chất liên kết này lại có khả năng chống oxi hóa rất tốt.
Thêm vào đó các thành phần axit amin trong protein từ nấm linh chi đóng
vai trị quan trọng và trực tiếp trong việc tăng cường các hoạt động chống
oxi hóa [30]. Tiếp sau đó vào năm 2014 Hao-Jan Lin cùng cộng sự đã điều
tra hiệu quả của một protein điều hòa miễn dịch (Ling Zhi-8, LZ-8) trên
việc làm lành vết thương trong các mô gan chuột sau khi phẫu thuật điện
cực đơn cực và chứng minh LZ-8 làm tăng tốc q trình lành vết thương

trong các mơ gan chuột, các chỉ số biểu hiện của NF-B, apoptosis, hoạt tính
của caspase-3 của mơ gan đều giảm ở 3,7 và 28 ngày sau khi phẫu thuật
[40].
Điều đó, chứng tỏ rằng protein trong nấm Ganoderma lucidum có hoạt
tính sinh học rất cao.
3.1.3. Định tính alkaloid trong nấm Cổ co
Kết quả định tính alkaloid trong nấm ở hai loại thuốc thử đều dương
tính được thể hiện ở hình 3.4.
Mẫu dịch chiết khi cho thuốc thử Mayer vào có kết tủa màu vàng nhạt
và kết tủa lắng xuống đấy ống nghiệm, còn sử dụng thuốc thử Dragendorff
cho kết tủa màu cam-nấu với lượng rất lớn. Chứng tỏ trong nấm linh chi Cổ
cò chứa hợp chất alkaloid có tác dụng giúp tăng năng lượng và giúp đẩy


9
nhanh q trình hàn gắn vết thương, điều hịa huyết áp và hỗ trợ điều trị các
bệnh ung thư.
Như vậy, nhiều loại nấm cùng chi với nấm linh chi Cổ cò được sử
dụng như một tài sản về thuốc ở nhiều nước do có hàm lượng alkaloid cao.

Hình 3.4. Kết quả định tính alkaloid trong nấm linh chi Cổ cò
(a)-Mẫu đối chứng, (b)-Mẫu thử với thuốc thử Mayer, (c)-Mẫu đối
chứng với thuốc thử Dragendorff, (d)-Mẫu thử với thuốc thử Dragendorff
3.1.4. Định tính hợp chất saponin trong nấm Cổ co
a. Định tính saponin trong nấm
- Thử nghiệm tạo bọt định tính saponin
Kết quả định tính cho thấy ống đối chứng khơng có bọt cịn ống
nghiệm chứa dịch chiết nấm sau 3 lần quan sát (sau 15, 30, 60 phút tiến
hành quan sát độ bền bọt) cho thấy dịch chiết tạo bọt bền hơn 60 phút cột
bọt cao 3 cm sau đó giảm dần xuống 1,5 cm sau 60 phút. Như vậy dịch

chiết từ quả thể nấm linh chi Cổ cị có chứa hợp chất saponin.


10

a

b

Hình 3.5. Kết quả định tính saponin trong nấm sau 60 phút thử hoạt tính:
ống (a) đối chứng (nước cất), ống (b) chứa dịch chiết nấm linh chi Cổ co
b. Định tính trierpenoid (phản ứng Liebermann-Burchard)
Sau khi định tính trong nấm linh chi Cổ cị có saponin chúng tơi định
tính hợp chất trierpenoid có hoạt tính sinh học cao.

a

b

c
lớp vàng nhạt

Hình 3.6. Kết quả định tính trierpenoid trong nấm linh chi Cổ co: (a)-Mẫu
nước, (b)-Mẫu đối chứng chứa H2SO4 và chloroform khơng có mẫu thử,
(c)-Mẫu đối chứng chứa H2SO4 và chloroform và có mẫu thử


11
Dịch chiết ether nấm linh chi Cổ cò thêm 1 – 2ml acid H 2SO4 đậm đặc
vào kết quả cho thấy nơi tiếp xúc giữa 2 lớp dung dịch có màu đỏ nâu đến

tím vậy trong nấm có trierpenoid (hình 3.6-c)
Ganoderma lucidum là một trong những loài nấm được nghiên cứu
rộng rãi nhất do nó có nhiều đặc tính dược lý do trong nấm có nhiều hợp
chất có hoạt tính sinh học như polysaccharides, sterol, lectins và một số
protein, đặc biệt là triterpenoind còn được gọi là thành phần chủ động khác
được tìm thấy trong Red Reishi là các phân tử triterpeniods, được gọi là
axit ganoderic [32].
Các nghiên cứu sơ bộ chỉ ra rằng triterpenoind giúp làm giảm dị ứng
thông thường bằng cách ức chế sự phóng thích histamine, cải thiện việc sử
dụng oxy và cải thiện chức năng gan [32]. Vào năm 2007, Horng-Huey Ko
và cộng sự cũng nghiên cứu về hợp chất này và cho rằng triterpenoid từ
quả thể nấm Ganoderma lucidum and Ganoderma tsugae có khả năng
chống viêm cũng như ức chế khả năng hoạt động của vi khuẩn [39].
Ngoài ra, nghiên cứu của Bingji Ma (2011) chỉ ra rằng triterpenoid
phân lập từ các bào tử Ganoderma có ý nghĩa chống HIV-1 protease, chống
khối u ác tính... [43].
Như vậy sự có mặt của trierpeniod trong nấm linh chi Cổ cị làm tăng
hoạt tính dược liệu và giá trị của nấm.
3.1.5. Xác định khả năng kháng khuẩn của nấm Cở co
Dịch được cơ quay chân được hịa lỗng với 10ml nước cất. Sử dụng
chủng vi khuẩn E.coli, tiến hành thử khả năng kháng khuẩn của dịch chiết
theo phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch với mẫu đối chứng là nước.


12
Bảng 3.2. Khả năng kháng khuẩn của nấm linh chi Cổ cị trên E.coli
Đường kính Đường
kính
Vong vơ kh̉n
lỗ

khoan vong vơ khuẩn
D-d (mm)
d(mm)
D(mm)
Đối chứng (a)
Ô mẫu dịch chiết
nấm (b)
Ô mẫu dịch chiết
nấm pha loãng
20 lần (c)

12

12

0

12

40,2

28,8

12

12

0

b

a

c

Hình 3.7. Vong vơ khuẩn dịch chiết nấm linh chi Cổ co: (a)-Mẫu đối
chứng, (b)-Mẫu dịch chiết nấm (c)-Mẫu dịch chiết nấm pha loãng 20 lần
Nấm linh chi Cổ cị một loại nấm có khả năng kháng khuẩn tốt. Kết
quả bảng 3.2 và hình 3.7 cho thấy dịch chiết nấm có khả năng ức chế sự
sinh trưởng của vi khuẩn E.coli với vịng vơ khuẩn 28,8 mm ở mẫu khơng
pha lỗng, đối với mẫu pha lỗng 20 lần tuy khơng có vịng kháng khuẩn


13
nhưng qua q trình thực nghiệm cho thấy E.coli khơng thể phát triển được
trên mơi trường có dịch chiết nấm. Kết quả cho thấy trong dịch chiết nấm
linh chi Cổ cị có nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học như các hợp chất
polysacchrides, polyphenol, alkaloid, saponin đặc biệt là trierpenoid... có
khả năng ức chế và tiêu diệt vi sinh vật gây hại điển hình như E.coli. Kết
quả này phù hợp với nghiên cứu của Smania và cộng sự (1999) và nghiên
cứu của Yihuai và cộng sự (2003) các nấm có bản chất triterpenoid,
polisacchrides có khả năng chống lại nhiều loại vi khuẩn. Bên cạnh đó
nghiên cứu của Kleinwachter và cộng sự (2001) cho rằng dịch chiết nấm
Ganoderma lucidum có khả năng chống viêm, ức chế hoạt động của vi sinh
vật.
Ngồi ra, với nồng độ dịch chiết nấm (pha lỗng 20 lần) chứa một
phần nhỏ các hợp chất sinh học (polysacchrides, polyphenol, alkaloid) có
khả năng ức chế hoạt động của vi sinh vật. Điều này được thể hiện trong
nghiên cứu của Chai và cơng sự (1997) phân tích cho thấy khả năng kháng
khuẩn dịch chiết tạo nên do một lượng nhỏ polyphenol có trong dịch chiết
mà trong nấm linh chi [40].

Như vậy, nấm linh chi Cổ cị có chứa các hợp chất polysacchrides,
polyphenol, alkaloid... là hợp chất sinh học có hoạt tính sinh học kháng
khuẩn mạnh, rất tốt sức khỏe con người.
3.1.6. Khả năng kháng oxy hóa của nấm linh chi Cổ co
a. Khả năng oxy hóa của nấm bằng phương pháp Reducing power
Để khảo sát khả năng kháng oxy hoa của dịch chiết
nấm linh chi Cổ cò
chung tôi tiến hành thử hoạt tính bằng phương pháp
Reducing power.


14

năng kháng oxi hóa của nấm linh chi Cở co theo nồng độ dịch chiết tăng
dần
Kết quả hình 3.8 cho thấy khả năng kháng oxy hoa tăng
dần khi nồng độ dịch chiết tăng lên. Với chỉ số IC 50 = 63,35
của dịch chiết cồn nhỏ hơn IC50 = 165,74 của dịch chiết
nước cho thấy dịch chiết cồn co khả năng kháng oxy hoa
cao hơn dịch chiết nước. Nấm linh chi Cổ cò loại nấm dược
liệu co chứa nhiều hợp chất co khả năng kháng oxy hoa cao
như polysacchrides, polyphenol, alkaloid, trierpenoid... được thể hiện qua
khả năng khử Fe3+ thành Fe2+ co trong thí nghiệm (năng lực khử
thể hiện khả năng oxy hoa của dịch chiết). Qua chỉ số IC 50
cho thấy dịch chiết trong cồn co năng lực khử mạnh hơn
dịch chiết trong nước, vì cồn là dung mơi co khả năng phân
cực mạnh hơn nước nên các hợp chất co trong nấm được
tách chiết ra khỏi nấm với hiệu suất cao hơn làm tăng khả
năng oxy hoa của dịch chiết. Kết quả này phù hợp với
nghiên cứu của Nguyễn Thị Thu Hương và cộng sự nấm linh

chi co khả năng kháng oxy hoa mạnh với thể tích dịch từ
1500 đến 2000 (µl/2ml thể tích) [24]. Kshitij Agarwal (2002) cho
rằng các gốc tự do liên quan đến nhiều bệnh bao gồm tiểu
đường, viêm khớp, ung thư, lão hoa,… do đo liệu pháp
chống oxy hoa co một tầm quan trọng đặc biệt. Và dịch
chiết của nấm linh chi trong các dung môi khác nhau (nước


15
nong, thủy phân, ethanol, chloroform và ete dầu hỏa) đều
co khả năng kháng oxy hoa rất mạnh, trong đo mạnh nhất
là chiết xuất trong nước nong và ethanol [23].
Kết quả cho thấy, dịch chiết nấm linh chi Cổ cò co chứa
các hợp chất co hoạt tính sinh học như polysacchrides,
polyphenol, alkaloid... có khả năng chống lại các gốc tự do.

b. Khả năng ức chế peroxy hóa lipid (thử nghiệm MDA)
Để đánh giá hiệu quả khả năng ức chế peroxy hóa lipid của dịch chiết
nấm linh chi Cổ cò thể hiện khả bắt dữ các gốc tự do như OH-, COO-....
Chúng tôi tiến hành thử nghiệm phản ứng MDA trên gan chuột kết quả
được thể hiện ở hình 3.10 và 3.11.

b

ĐC

c

d

d

Hình 3.10. Khả năng peroxy hóa lipid màng tế bào chuột của nấm linh
a

ĐC

b chi Cổ cò
c

d

d


16

Hình 3.11. Dãy ống nghiệm thể hiện mật độ quang khả năng peroxy hóa
lipid màng tế bào chuột của nấm linh chi Cở co: ĐC-đối chứng, (a)-tỉ lệ
pha lỗng 1/8 lần, (b)-1/4 lần, (c)- 1/2 lần và (d) mẫu không pha loãng
Kết quả xác định khả năng ức chế peroxy hóa lipid (thử nghiệm
MDA) ở hình 3.10 và 3.11 cho thấy nấm linh chi Cổ cị có khả năng ức chế
peroxy hóa lipid có trong gan chuột ở nồng độ pha lỗng dưới 1/8 lần. Vì
trong nấm linh chi Cở cò chứa polysaccharidess, alkaloid…
ức chế peroxy hoa hạn chế hình thành hàm lượng malonyl
dialdehyd (MDA), là sản phẩm của quá trình peroxy hoa
lipid màng tế bào, thể hiện qua khả năng phản ứng MDA
với acid thiobarbituric để tạo tành phức hợp trimethin màu
hồng. Điều này cho thấy dịch chiết nấm linh chi Cổ cò co
tác dụng chống khối u thông qua điều hòa miễn dịch và

chống co thắc mạch, hơn nữa hợp chất này co tác dụng bảo
vệ chống lại các gốc tự do. Kết quả nghiên cứu này phù hợp với kết
quả của Wong K.L (2004) chứng minh chiết xuất nước nóng của nấm
Ganoderma lucidum với liều 10, 25 và 50 mg / kg (p.o.) được dùng có tác
dụng chống oxy hóa góp phần vào bảo vệ tim khỏi những tổn thương do
peoxit gây ra [48]. Nghiên cứu khác của Sheena.N (2005) cũng cho kết quả
tương tự chiết xuất G. lucidum với methanol và etyl acetat có hiệu quả
trong việc ức chế lipid peroxidation gây ra bởi hệ thống Fe 2+ asorbat đồng
nhất trong gan chuột, làm cho hàm lượng malondialdehyde (MDA) và các


17
chất có liên quan phản ứng với axit thiobarbituric (TBARS) giảm đi đáng
kể [42]. Thêm vào đó, dựa vào IC50 thì nghiên cứu của Trương Thị Mỹ Chi
cho thấy rằng hoạt tính chống oxy hóa in vitro của nấm linh chi mạnh hơn
nấm vân chi. Các cao chiết cồn và cao nước của nấm linh chi và vân chi
vàng đều có tác dụng làm giảm sự gia tăng MDA trong gan gây bởi
cyclophosphamide. Do đó kết luận rằng nấm linh chi có tác dụng phục hồi
tổn thương gan theo hướng chống oxy hóa gây bởi độc tính của
cyclophosphamide cao hơn nấm vân chi [2].

Nấm linh chi Cổ cò là loại

nấm có khả năng chống hình thành gốc tự do rất tốt.

3.2. XÂY DỰN QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG NẤM LINH CHI CỞ CO
3.2.1. Ảnh hưởng của mơi trường dinh dưỡng đến sự sinh trưởng của
sợi nấm phân lập
Qủa thể nấm linh chi Cổ cò được thu hái ở vườn quốc gia
KonKaKinh. Sau đó đưa về phịng thí nghiệm khoa Sinh - Môi Trường

phân lập trên 3 môi trường gồm môi trường Bán tổng hợp (BTH), môi
trường PDA cải tiến (PDA–CT) và môi trường Hansen (HS) để khảo ảnh
hưởng của môi trường dinh dưỡng đến quá trình phát triển của hệ nấm linh
chi Cổ cị. Kết quả nghiên cứu được trình bày ở bảng 3.3 và hình 3.12.

a

b

c

Từ kết quả bảng 3.3 cho thấy nấm linh chi Cổ cị có khả năng phát
triển trên cả ba môi trường BTH, PDA–CT, HS. Thời gian bắt hình thành
sợi tơ từ mơ thịt ở ba môi trường từ 2 đến 5 ngày sau khi phân lập. Hệ sợi


18
nấm linh chi Cổ cò phát triển tốt nhất trên môi trường Hansen với chiều dài
tơ sau 6 ngày, 14 ngày đều lớn hơn so với 2 mơi trường cịn lại. Đặc biệt
hơn thời gian hệ sợi nấm lan kín thạch trong ống nghiệm chỉ mất 16 ngày
trong khi môi trường BTH và PDA-CT cần đến 22 ngày mới lan kín ống
nghiệm. Mặt khác, tốc độ lan tơ của mơi trương Hansen lan rất nhanh
0,8cm/ngày gấp gần 1,5 lần so với 2 mơi trường cịn lại (0,56; 0,55
cm/ngày).
Về hình thái hệ sợi ở môi trường HS và PDA-CT sợi nấm dày, có màu
trắng sữa, phát triển tốt, riêng hệ sợi trên môi trường BTH rất mỏng và phát
triển yếu, nhanh bị già hóa. Thí nghiệm mơi trường Hansen với nguồn cũng
cấp đường cung cấp dinh dưỡng thiết yếu để cho nấm linh chi sử dụng đặc
biệt là các loài linh chi ở vùng nhiệt đới. Đặt biệt hơn với nguồn dinh
dưỡng từ dịch chiết khoai tây là hợp chất hữu cơ giúp hệ sợi nấm dễ hấp

thu và sử dụng. Thêm vào đó mơi trường Hansen cịn được bổ sung các
nhóm muối như MgSO4, KH2PO4, K2HPO4 được xem là thành phần cơ bản
trong môi trường nuôi cấy để khảo sát yếu tố dinh dưỡng ảnh hưởng đến
quá trình phát triển của hệ sợi. Như vậy, có thể nói mơi trường Hansen có
chứa đầy đủ dinh dưỡng cho hệ sợi nấm phát triển ở dai đoạn phân lập.
Kết quả này phù hợp với một số nghiên cứu như trong nghiên cứu của
Handra và Purkayastha (1977) đường glucose nguồn cung cấp dinh dưỡng
dễ hấp thu cho các loài linh chi ở vùng nhiệt đới. Hay nghiên cứu của
Garraway và Evans, 1984 cho thấy glucose giúp các q trình chuyển hóa
nhanh để tạo ra năng lượng cho sự hình thành vách tế bào sợi nấm.
Bên cạch đó, các nguồn nitơ tự nhiên từ dịch chiết khoai tây giúp hệ
sợi nấm hấp thụ tốt hơn so với nguồn nitơ vơ cơ [35]. Ngồi những yếu tố
cơ bản C, N, H được cung cấp cho nấm, theo nghiên cứu của Sim và cộng
sự (1997) môi trường Hansen cịn được bổ sung các nhóm muối như


19
MgSO4, KH2PO4, K2HPO4 được xem là thành phần cơ bản trong môi trường
nuôi cấy để khảo sát yếu tố dinh dưỡng ảnh hưởng đến quá trình phát triển
của hệ sợi. Kết quả này cũng được Carlos Andrés Zárate-Chaves và cộng
sự (2012) nghiên cứu, ông bổ sung các muối MgSO4, KH2PO4, K2HPO4 vào
q trình ni sinh khối nấm để thu hồi phenolic với hàm lượng cao hơn
sao với phương pháp truyền thống [25].
Vậy môi trường Hansen (glucose 50g, pepton 10g, K 2HPO4 3g,
MgSO4. 7H2O 2,5 g, cao nấm men 1g, agar 20g) là môi trường bổ sung đầy
đủ nguồn dinh dưỡng cũng như các hợp chất thiết yếu giúp nấm linh chi Cổ
cị hình thành sợi tơ từ quả thể và phát triển của sợi nấm về sau khi phân
lập.
3.2.2. Ảnh hưởng của môi trường đến khả năng phát triển của sợi nấm
trên môi trường nhân giống cấp I

Tiến hành nhân giống cấp I trên 5 môi trường khác nhau với 5 lần lặp
lại trên các nghiệm thức. Sự ảnh hưởng được đánh giá bằng khả năng lan
sợi và hình thái hệ sợi trên các mơi trường đĩa thạch, với kích thước mỗi
đĩa thạch có đường kính 9 cm, chứa 60 ml môi trường dinh dưỡng nhân
giống cấp I. Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của môi trường nhân giống cấp
I của nấm linh chi Cổ cị được trình bày ở bảng 3.4 và hình 3.13.
Ghi chú: Những số trong cùng một hàng có chữ cái theo sau khác nhau thì có
sự khác biệt với nhau về mặt thống kê với độ tin cậy α=0,05


20

Hình 3.13. Ảnh hưởng của mơi trường nhân giống cấp I đến hệ sợi
nấm linh chi Cổ cị

Hình 3.15. Hệ sợi nấm linh chi Cổ co trên môi trường PDA-CÁM (a), môi
trường PDA-RƠM (b) và trên môi trường Bán tổng hợp (c)
Mơi trường PDA – C với có cơng thức gồm cao nấm men, pepton,
đường glucose và dịch chiết khoai tây - cám cung cấp đầy đủ nguồn
cacbon, nitơ và các hợp chất hữu cơ khác cho nấm phát triển. Hợp chất
dextrin có trong tinh bột khoai tây được xem là nguồn cacbon tốt nhất cho
sự phát triển của nấm. Ngoài các yếu tố cần thiết chủ yếu cho hệ sợi nấm
phát triển, mơi trường này cịn có nguồn dinh dưỡng hữu cơ chiết xuất từ
cám cung cấp thêm một lượng lớn tinh bột, đường, các loại muối, các axit
amin, các peptide và một số carbohydrate và đặt biệt vitamin (B1, B2, B5,
B12…) giúp cho sợi nấm phát triển mạnh hơn các môi trường khác. Theo


21
Sung và cộng sự (1993) vitamin B1 là hợp chất thiết yếu cho sự phát triển

của hệ sợi của một số chủng nấm Galidium lucidum với hàm lượng là 120
μg/lít.
Kết quả này cũng được thể hiện trong nghiên cứu của Cồ Thị Thùy
Vân (2015) đã chứng minh môi trường chuyển giống gốc sang giống cấp I
khi bổ sung thêm 20 μg vitamin B 1 trong 1000 ml nước giúp quá trình
bung sợi và lan nhanh hơn [19]. Vậy bổ sung cám vào môi trường nuôi cấy
giúp tăng lượng lớn chất thiết yếu cho sự phát triển hệ sợi. Thêm vào đó, hệ
sợi nấm linh chi Cổ cị trên mơi trường PDA-C hệ sợi có màu trắng sáng,
sợi dày, mọc đều giống hệ sợi nấm khi phân lập.
Kết quả nghiên cứu 5 môi trường nhân giống cấp I, môi trường PDAC là môi trường tốt nhất cho hệ sợi nấm linh chi Cổ cò. Việc bổ sung cám
gạo giúp rút ngắn được thời gian nhân giống cũng như tạo ra được nguồn
giống có hệ sợi phát triển mạnh.
3.2.3. Ảnh hưởng của cơ chất đến khả năng phát triển của sợi nấm trên
mơi trường nhân giống cấp II
Để tìm ra mơi trường tối ưu cho giai đoạn nhân nhanh
giống cấp II của nấm linh chi Cổ cò, chúng tôi tiến hành
nghiên cứu ảnh hưởng của 3 loại cơ chất nhân giống cấp II
bao gồm: nguyên liệu hạt thoc (MT 3), que sắn (MT 1) và lõi
ngô (MT 2) trong đo que sắn, lõi ngô là nguồn phế phụ
phẩm của nông nghiệp. Ba nguyên liệu đều được xử lí để
tiến hành nhân giống trong chai thủy tinh dài 11cm đường
kính 6 cm. Tiến hành khảo sát thời gian bung sợi, tốc độ lan
tơ sau 4, 12, 24 ngày và thời gian hệ sợi lan kín chai. Kết
quả nghiên cứu được trình bày ở bảng 3.5 và hình 3.16.


22

a

1

b

b

c

a

c

2
Hình 3.16. Hệ sợi nấm trên các môi trường nghiên cứu sau

12 ngày (1) và 20 ngày (2) trên ba ngun liệu hạt thóc (a),
lõi ngơ (b), que sắn (c)
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nguồn cơ chất đến quá trình nhân giống cấp II
Bảng 3.5 cho thấy hệ sợi nấm Cổ Cị phát triển tốt trên 3 mơi trường
nghiên cứu. Trong đó, trên mơi trường cơ chất que sắn hệ sợi nấm phát
triển mạnh nhất với thời gian lan kín 20 ngày đạt tốc độ lan tơ 0,54 cm/
ngày, riêng mơi trường nhân bằng hạt thóc và lõi ngơ sau 20 ngày chỉ lan
được 8,75 cm và 8,67 cm. Hai mơi trường có cơ chất là hạt thóc và lõi ngơ
cần đến 24 ngày sợi tơ mới lan kín bịch. Vì mơi trường que sắn có diện tích
tiếp xúc lớn giúp hệ sợi nấm thích nghi nhanh và phát triển mạnh, mặt khác
que sắn có khả năng hấp thụ nước kém nên có độ thống lớn khơng bị úng
nước làm cho sợi nấm không bị ảnh của độ ẩm lớn loại bỏ khả năng sợi
nấm bị ức chế do môi trường chứa nhiều nước. Theo nghiên cứu của kỹ sư
Võ Văn Ninh cho thấy việc sử dụng que sắn, 1 phế phụ phẩm nông nghiệp
giúp thời gian sinh trưởng của hệ sợi nấm nhanh hơn với tỉ lệ bịch phôi

được cấy giống bằng que sắn đạt từ 80 – 99%, trong khí đó việc sử dụng
nguồn ngun liệu cũ tỉ lệ chỉ đạt 50 – 90% và năng suất của phương pháp


23
truyền thống chỉ đạt 40%. Đặc biệt hơn que sắn là phế phụ phẩm nông
nghiệp nên giá thành rẻ giúp giảm chi phí sản xuất, giảm thời gian nhân
giống. Bên cạnh đó ở mơi trường nhân giống cấp II từ lúa và lõi ngô do
thừa nhiều chất dinh dưỡng nên vi sinh vật dễ phát triển ức chế sợi nấm
phát, điều này được thể hiện qua tỉ lệ nhiễm trên môi trường lúa -11,23%,
môi trường lõi ngô là 11,23% cao hơn nhiều so với môi trường que sắn.
Môi trường lúa và lõi ngơ có bề mặt tiếp xúc lớn nên hệ sợi khó thích nghi
hơn làm kéo dài thời gian lan sợi.
Sử dụng phương pháp đánh giá cảm qua cho điểm thông qua việc
quan sát hệ sợi trên 3 môi trường nhân giống được kết quả ở bảng 3.5. Mật
độ cảm quan hệ sợi có sự khác biệt giữa các cơng thức thực nghiệm. Trong
đó, mơi trường que sắn (MT 1) được đánh giá có hệ sợi dày và đẹp nhất với
4,8 điểm. Hệ sợi nấm khi được nhân giống bằng que sắn có màu trắng,
khỏe, sợi dài và dày, được liên kết chặt với nhau khi lan trên que sắn và sợi
nấm bám toàn bộ vào que sắn. Đối với sự phát triển của sợi nấm trên mơi
Mẫu
cị thu
vườn
KonKaKinh
trường
hạtnấm
thóclinh
kếtchi
quảCổđánh
giáhái

chotạithấy
sợiquốc
nấmgia
phát
triển yếu và chậm,
sợi nấm mảnh. Môi trường lõi ngô sợi nấm phát triển khơng đồng nhất, sợi
Mẫu
linhđều
chi tốc
Cổ độ
cị lan
được
háihơn
tại vườn
nấm
lannấm
không
tơthu
chậm
so vớiquốc
trên gia
môiKonKaKin
trường que sắn.
MT- Hansen
Phân Lập
Qua tốc độ phát triển hệ sợi trên môi trường nhân giốngBảo
và cảm
quảnquan
hệ
sợi- Hanse

nấm cho thấy. Môi trường que
sắnlậlà môi trường tối ưu nhất cho việc
MT
Phân
Giống gốc
nhân giống cấp II.
Bảo quả

3.2.4. Quy trình nhân giống nấm
cổ co
Giống
gố

MT – PDA Cám
Cấy chuyển
a. Sơ đồ quy trình nhân giống
MT – PDA CA

MT – Que sắn

Cấy chuyể
Giống cấp I
Cấy chuyển
Giống cấp
Cấy chuyể
Giống cấp I

MT - Que sắ
Giống cấp
Cấy chuyề

Bảo quả
Bảo quản
Bảo quả


Giống cấp I
24

Hình 3.17. Sơ đồ quy trình nhân giống nấm linh chi Cổ co


25

b. Thuyết minh quy trình nhân giống
Qủa thể nấm linh chi Cổ cò được thu hái tại vườn quốc gia
KonKaKinh tỉnh Gia Lai được bảo quản lạnh ở nhiệt độ 4 oC để vận chuyển
về phịng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học của khoa Sinh – Môi trường. Tiến
hành phân phập trên môi trường Hansen chúng ta thu được giống nấm gốc
được phân lập từ mô của quả thể nấm. Giống gốc phải ổn định về các đặc
tính di truyền, đảm bảo năng suất và hiệu quả kinh tế. Thực hiện cấy
chuyền giống gốc sang môi trường thạch PDA - CAM cấp I, hệ sợi nấm sẽ
sinh trưởng tạo thành các ống giống hoặc đĩa giống cấp I. Ta tiến hành lựa
chọn các ống giống cấp I đạt tiêu chuẩn để sử dụng nhân giống cấp II trên
môi trường que. khi ăn kín đáy chai, hình thành các chai giống cấp II. Sau
đó tiến hành cấy vào bịch phơi để tiến hành lan tơ cho ra quả thể.

Danh mục tài liệu tham khảo
Tiếng Việt
[1] Đỗ Huy Bình (2004), "Cây th́c và động vật làm thuốc

ở Việt Nam – tập II", Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật
Hà Nội 2004.
[2] Trương Thị Mỹ Chi, Nguyễn Thị Thu Hương "Nghiên cứu
tác dụng chống oxy hoa in vitro và in vivo của một số
loài nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) và nấm vân chi
(Trametes Versicolor))", Trung tâm Sâm và Dược liệu
Tp. HCM – Viện Dược liệu, tr. 135-141.
[3] Nguyễn Thượng Dong (2005), "Nghiên cứu một số tác
dụng sinh học của ba loài nấm linh chi Ganoderma
applanatum (Pers.) Pat.; G. lobatum (Schw.) Atk. vaf G.
lucidum (Leyss. ex Fr). Karst".