QUY TRÌNH THU NHẬN CAO CHIẾT PHÂN đoạn CHỨA POLYPHENOL từ THỰC vật

SVTH: Đỗ Thị Mai Trinh

QUY TRÌNH VÀ PHƯƠNG PHÁP ĐỂ THU
NHẬN CAO CHIẾT PHÂN ĐOẠN CHỨA
POLYPHENOL TỪ THỰC VẬT
Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC


SVTH: Đỗ Thị Mai Trinh

MỤC LỤC
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN HỢP CHẤT POLYPHENOL........................1
CHƯƠNG 3: ỨNG DỤNG CAO POLYPHENOL TRIẾT XUẤT TỪ LÁ
SAKÊ TRONG TRÀ TÚI LỌC...................................................................17


SVTH: Đỗ Thị Mai Trinh

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN HỢP CHẤT POLYPHENOL
1.1

Hợp chất Polyphenol
Polyphenol là các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên và tồn tại trong thực vật được chứng

minh là có khả năng chống oxy hóa vơ cùng hiệu quả. Polyphenol có thể bảo vệ cơ thể, giúp
cơ thể chống lại nhiều loại bệnh khác nhau do gốc tự do gây ra. Đặc điểm chung của chúng là
trong phân tử có vịng thơm (vịng benzen) chứa một hay hai, ba... hoặc nhiều nhóm hydroxyl

(OH) gắn trực tiếp vào vịng benzen. Tùy thuộc vào số lượng và vị trí tương hỗ của các nhóm
OH với bộ khung hóa học mà các tính chất lý hố học hoặc hoạt tính sinh học thay đổi.
Dựa vào đặc trưng của cấu tạo hóa học người ta chia các hợp chất polyphenol thành ba
nhóm chính:
Nhóm hợp chất phenol C6 – C1: Acid Galic.
Nhóm hợp chất phenol C6 – C3: Acid Cafeic.
Nhóm hợp chất phenol C6 – C3 – C6 : Catechin, Flavonoid

Hình 1: Hợp chất polyphenol

Tính chất: Các polyphenol có chứa gốc Pyrocatechic hoặc Pyrogalic nên chúng có thể
tham gia phản ứng oxy hóa – khử, phản ứng cộng và ngưng tụ.
Phản ứng oxy hóa – khử: Dưới tác dụng của enzyme polyphenol oxydase, các
polyphenol bị oxy hóa tạo thành các Quinon.

1


SVTH: Đỗ Thị Mai Trinh

Phản ứng cộng: Khi có mặt các acid amin thì các Quinon này sẽ tiến hành phản ứng cộng
với acid amin để tạo thành các octoquinon tương ứng.
Phản ứng ngưng tụ: Các octoquinon này dễ dàng ngưng tụ với nhau để tạo thành các sản
phẩm có màu gọi chung là Flobafen.
1.2

Chức năng của các polyphenol
Polyphenol được chú ý đến bởi khả năng chống oxy hóa của chúng. Chúng có khả năng

chuyển electron trong chuỗi hơ hấp bình thường định cư trong ti thể. Chúng có được khả năng

đó là do chúng có khả năng tạo phức bền với các kim loại nặng, do đó làm mất hoạt tính xúc
tác của chúng, đồng thời chúng có khả năng nhận các gốc tự do tức là có khả năng dập tắt các
quá trình tạo ra các gốc tự do.
Ngồi ra polyphenol cịn có khả năng ức chế sự phát triển của vi nấm.
Nhiều polyphenol có hoạt tính vitamin P, nghĩa là có khả năng làm tăng độ đàn hồi và
chuẩn hóa tính thẩm thấu của vi ti huyết quản.
Hiện nay nhiều tài liệu nghiên cứu polyphenol có khả năng chống và ức chế các tế bào
ung thư và sự hấp thụ các tia UV.

2


SVTH: Đỗ Thị Mai Trinh

CHƯƠNG 2: QUY TRÌNH VÀ PHƯƠNG PHÁP THU CAO POLYPHENOL TỪ LÁ
SAKÊ
2.1

Các yếu tố khảo sát quy trình trích ly và thu nhận polyphenol từ thực vật
Nghiên cứu được tiến hành trên cơ sở xác định điều kiện tối ưu của các biến phụ thuộc

ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly Polyphenol. Các yếu tố khảo sát bao gồm: Nồng độ dung
môi (H2O, Cồn 50o, 60o, 70o, 80o, 96o), tỷ lệ dung mơi trích ly (1:5, 1:10, 1:15, 1:20, 1:25,
1:30), nhiệt độ trích ly (30, 40, 50, 60, 70 ,80 oC), thời gian trích ly (30, 60, 90, 120, 150, 180
phút), điều kiện môi trường (pH) (5.5, 5, 4.5, 4, 3.5, 3), hiệu suất trích ly ( 1, 2, 3, 4 lần).
2.2

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình trích ly và thu nhận polyphenol từ thực vật
a) Khảo sát q trình trích ly
Trích ly là nhằm mục đích tách polyphenol ra khỏi thực vật bằng cách sử dụng dung mơi

để hồ tan dựa trên cơ sở chênh lệch nồng độ.
Phương pháp khảo sát: khi khảo sát một yếu tố nào đó (nhiệt độ, thời gian… ) thì các yếu
tố cịn lại được cố định. Yếu tố nào khảo sát xong thì sẽ được cố định ở giá trị tối ưu để tiếp
tục khảo sát đến các yếu tố khác.
Trong q trình trích ly cần khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình như sau:
Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của dung mơi trích ly:
•
•

Khối lượng mẫu cho mỗi thí nghiệm là 10g.
Chuẩn bị 6 mẫu thí nghiệm theo các nồng độ dung mơi trích ly như sau: H 2O, cồn 500,
600, 700, 800, 960.

Trích ly

H2O

Cồn 50o

Cồn 60o

Cồn 70 o

Đo OD
Chọn dung môi tối ưu

3

Cồn 80 o

Cồn 96o


SVTH: Đỗ Thị Mai Trinh

Tiến hành khảo sát tỷ lệ dung mơi trích ly: Chuẩn bị 6 mẫu thí nghiệm theo các tỷ lệ khối
lượng nguyên liệu: dung môi như sau: 1:5; 1:10; 1:15; 1:20; 1:25; 1:30.

Trích ly
1:5

1:10

1:15

1:20

1:25

1:30

Đo OD
Chọn tỷ lệ dung môi phù hợp
Tiến hành khảo sát nhiệt độ trích ly: Chuẩn bị 6 mẫu thí nghiệm theo các nhiệt độ như
sau: 30, 40, 50, 60, 70, 80 (0C)

Trích ly
o
30 C

o
50 C

o
40 C

o
60 C

o
70 C

80 oC

Đo OD
Chọn nhiệt độ tối ưu

Tiến hành khảo sát thời gian trích ly: Chuẩn bị 6 mẫu thí nghiệm theo các thời gian như
sau: 30, 60, 90, 120, 150, 180 (phút).

Trích ly
30

60

90

120

150

180

Đo OD
Đo OD

Chọn thời gian tối ưu
Tiến hành khảo sát điều kiện môi trường (pH) trích ly: Chuẩn bị 6 mẫu thí nghiệm theo
các pH như sau: 5.5, 5, 4.5, 4, 3.5, 3.

4


SVTH: Đỗ Thị Mai Trinh

Trích ly

5

5.5

4.5

3.5

4

3

Đo OD
Chọn pH tối ưu
Tiến hành xác định hiệu suất trích ly
•

Tiến hành trích ly mẫu ở điều kiện tối ưu đã khảo sát ở trên. Sau khi trích ly 1 lần
xong thì tiến hành lọc thu lấy dịch lọc. Phần bã tiếp tục được sử dụng để trích ly lại

•

(lần 2, 3, 4) ở các điều kiện tương tự như trích ly lần 1.
Việc trích ly được lặp lại 4 lần trên cùng một mẫu. Đo OD của dung dịch sau mỗi lần
trích ly. Từ đó so sánh với hàm lượng ban đầu để tính được hiệu suất trích ly.

Trích ly
1 Lần

2 Lần

3 Lần

4 Lần

Đo OD
Chọn số lần trích ly
b) Khảo sát q trình xử lý acid
Xử lý acid nhằm mục đích thuỷ phân và loại bỏ các thành phần protein và các hợp chất
cao phân tử có trong dịch trích ly dựa vào việc giảm pH và dùng tác nhân thủy phân acid HCl.
Tiến hành khảo sát tỷ lệ cao chiết 1/dung mơi
•

•

Khối lượng cao chiết sử dụng để khảo sát cho mỗi thí nghiệm là 5g
Chuẩn bị 4 mẫu thí nghiệm có tỷ lệ cao chiết 1/ dung môi như sau: 1/5; 1/10; 1/15;
1/20.

5


SVTH: Đỗ Thị Mai Trinh

Xử lý acid
1:5

1:10

1:15

1:20

Đo OD
Chọn tỷ lệ dung môi phù hợp
Tiến hành khảo sát nhiệt độ xử lý acid: Chuẩn bị 6 mẫu thí nghiệm theo các nhiệt độ như
sau: 30, 40, 50, 60, 70, 80 (0C)

Xử lý acid
30 oC

50 oC

40 o0C

60 oC

70 oôC

80 oC

Đo OD
Chọn nhiệt độ tối ưu
Tiến hành khảo sát thời gian xử lý acid: Chuẩn bị 5 mẫu thí nghiệm theo các thời gian
như sau: 15, 30, 45, 60, 75 (phút).

Xử lý acid
15

30

45

60

75

Đo OD
Chọn thời gian tối ưu
Tiến hành khảo sát thời gian lắng tủa: Chuẩn bị 4 mẫu thí nghiệm theo các thời gian như
sau: 12, 24, 36, 48 (giờ).

6

SVTH: Đỗ Thị Mai Trinh

Lắng tủa
12

24

36

48

Đánh giá cảm quan
(màu sắc, độ trong)
Đo OD
Chọn thời gian tối ưu
c) Khảo sát quá trình tinh sạch
Tinh sạch dung dịch sau khi lắng tủa nhằm mục đích thu nhận polyphenol tinh khiết, vì
khi cho dung dịch ethyl acetate vào dung dịch sau xử lý acid thì hỗn hợp sẽ chia thành 2 pha,
trong đó polyphenol sẽ hoà tan vào trong lớp ethyl acetate. Sau khi kết thúc, cô đặc để đuổi
ethyl acetate và thu lại sản phẩm cuối cùng là cao chiết polyphenol.

Tiến hành khảo sát tỷ lệ dịch sau xử lý acid/ ethyl acetate:
•

Sau q trình xử lý acid, dung dịch được lọc trong và sử dụng 100ml cho mỗi lần khảo

•

sát.
Chuẩn bị 5 mẫu thí nghiệm có tỷ lệ dịch polyphenol/ ethyl acetate như sau: 1/1, 2/1,
3/1, 4/1, 5/1.

Tinh sạch

1:1

2:1

3:1

4:1

5:1

Đo OD
Chọn tỷ lệ dung môi phù hợp
Tiến hành khảo sát thời gian tinh sạch: Chuẩn bị 5 mẫu thí nghiệm khảo sát theo các thời
gian như sau: 30, 45, 60, 75, 90 (phút).

7


SVTH: Đỗ Thị Mai Trinh

Tinh sạch
30

45

60

75

90

Đo OD
Chọn thời gian tối ưu
Tiến hành xác định hiệu suất tinh sạch:
•

Tiến hành tinh sạch dịch cao chiết 1 ở điều kiện tối ưu đã khảo sát ở trên. Tinh sạch
lần 1 xong thì tiến hành gạn lọc thu lấy dịch trong (pha ethyl acetate). Phần dịch cao
chiết (pha nước) còn lại tiếp tục được cho ethyl actetate vào để tinh sạch lại (lần 2, 3,

•

4, 5) ở các điều kiện tương tự như tinh sạch lần 1.
Việc tinh sạch được lặp lại 5 lần trên cùng một dung dịch cao chiết. Đo OD của dung
dịch ethyl acetate sau mỗi lần tinh sạch. Từ đó so sánh với hàm lượng ban đầu để tính
được hiệu suất tinh sạch.

2.3 Xác định hợp chất polyphenol trong lá sakê
2.3.1 Tác dụng dược lý của lá sakê
Theo các cơng trình nghiên cứu trên thế giới người ta phát hiện ra rằng ngồi các thành
phần khống chất, vitamin và một số chất vi lượng chúng có hàm lượng cao các hợp chất
polyphenol.
Trong lá sakê có chứa:
•

5 hợp chất loại geranyl dihydrochalcone (2, 4, 5, 8, 9)

8


SVTH: Đỗ Thị Mai Trinh

•

Hình 2: Các hợp chất geranyl dihydrochalcone
4 loại geranyl flavonoids (1, 3, 6, 7)

Hình 3: Các hợp chất geranyl flavonoids
Lá sakê từ lâu đã được những cư dân vùng tân Guinea và một số quốc gia như Ai Cập,
Malaysia, Indonesia sử dụng như là một loại thảo dược dùng để trị bệnh hoặc phối hợp với
các loại thuốc khác để chữa các bệnh về ngoài da, tiêu chảy, bệnh gút, viêm da, ho, viêm gan,
giải độc gan….
Tuy nhiên những nghiên cứu mới đây chỉ ra rằng các hoạt chất polyphenol trong lá sakê
có tác dụng trị được nhiều loại bệnh khác nhau như bệnh về đường tim mạch, đái tháo đường,
bệnh parkison, bệnh béo phì, bệnh sỏi thận và đặc biệt theo các tài liệu mới đây chỉ ra rằng
các hoạt chất polyphenol trong lá sakê có tác dụng ức chế và ngăn ngừa các tế bào ung thư ở

9


SVTH: Đỗ Thị Mai Trinh

người loại SPC-A-1, SW 480,SMMC-7721 (Phytochemistry Số 68-2007); Quercetin,
Campherol).

Tác dụng ngăn chặn và chữa bệnh ung thư của polyphenol được nghiên cứu rất mạnh mẽ
trong những năm gần đây. Nhiều cơng trình nghiên cứu đã cho thấy polyphenol có khả năng
tương tác ngăn chặn và hạn chế các quá trình khơi mào, hình thành và phát triển các tế bào
ung thư. Trong giai đoạn khơi mào các polyphenol trung hịa các tác nhân kích hoạt bởi
cytorchom P450 enzyme, các tác nhân này có khả năng tương tác làm thay đổi cấu trúc của
AND, ngăn chặn sự tạo thành Nitrosamine là một nhóm các hợp chất phát sinh từ khói thuốc
lá, các amin dị vịng trong thịt, cá nấu chín – các tác nhân được cho là gây ung thư.
Trong giai đoạn bắt đầu của tế bào ung thư, các polyphenol có khả năng ức chế AP-1 một
dẫn xuất truyền khơi mào cho sự phát triển của tế bào ung thư da, thể hiện khả năng ngăn
chặn protein kinase, enzyme kích hoạt tế bào trong giai đoạn phát triển của tế bào ung thư, ức
chế hoạt động của Telomerase, làm giảm thời gian sống của tế bào ung thư.
Khi q trình ung thư diễn ra, polyphenol có thể can thiệp, ức chế hoạt động của
urokinase, enzyme đóng vai trị quan trọng trong q trình phát triển và biến đổi của tế bào
ung thư, phá hủy các dạng biến đổi đặc thù của tế bào gây ra do sdevirus, hay ngăn chặn quá
trình tổng hợp AND trong tế bào ung thư hepatoma, leukemia, ung thư phổi. Ngoài ra cịn có
một số cơng bố chưa chính thức cho rằng polyphenol có khả năng ngăn chặn một số loại ung
thư như: ung thư vú, ung thư vòm họng, ung thư đường tiêu hóa, giảm khối u…
2.3.2
•

Tác dụng chống oxy hóa của polyphenol trong lá sakê
Q trình oxy hóa và ngun nhân gây bệnh do mất cân bằng oxy hóa.

Theo các tài liệu nghiên cứu đã công bố, các bệnh như: ung thư, tim mạch, lão hóa… có
liên quan rất gần với các quy luật về q trình oxy hóa trong các tế bào sống. Các q trình
oxy hóa diễn ra dưới tác dụng của các gốc tự do trong tế bào là cần thiết để tạo ra năng lượng
hoặc trong các quá trình sinh tổng hợp của cơ thể. Gốc tự do là những hợp chất hoạt động
mạnh, được tạo ra trong cơ thể trong quá trình trao đổi chất hay được đưa vào từ bên ngoài do
virút, vi khuẩn… Các gốc tự do được tạo thành gồm các gốc có hoạt tính cao như Hydroxyl
(OH), Ion sắt( Fe2+O). Cu(OH)2 những gốc tự do có hoạt tính trung bình và yếu như Peroxyl

(ROO), Hydrogen Peroxde H2O2, Singlet Oxy (O1), Nitric oxide (NO), Ankoxyl ( RO)…
Gốc tự do là các nguyên tử khơng trọn vẹn, số điện tử vịng ngồi của nó là số lẻ nên
khơng bền vững, nó phải kết hợp với một nguyên tử khác để có số điện tử chẵn để bền vững.
Sự bền vững này chỉ trong chốc lát, chính nó lại tạo ra một ngun tử không trọn vẹn khác và
tiếp tục kết hợp với một nguyên tử khác rồi trở thành nguyên tử không trọn vẹn và tiếp tục
10


SVTH: Đỗ Thị Mai Trinh

chu kỳ bất tận như thế. Phản ứng hóa học của nó rất mãnh liệt và nó sẽ kéo theo một điện tử
của phân tử khác về nó, cho ra những phân tử khác bị hư hại hay bị oxy hóa. Một khi phân tử
bị oxy hóa rồi thì phân tử đó sẽ tự mất đi tất cả các chức năng vốn có của nó, tiếp đó chính nó
lại là tác nhân oxi hóa các phân tử chung quanh nó, làm hư hại các tế bào của các phân tử
xung quanh. Và quá trình này cứ tiếp tục như thế sẽ tạo thành các tế bào khơng bình thường
dẫn tới các loại bệnh như: xơ vữa động mạch, ung thư…
Thông thường các gốc tự do trong tế bào sinh ra trong quá trình sinh dưỡng được kiểm
sốt chặt chẽ thơng qua q trình kháng oxy hóa nội tại bằng các hợp chất như glutathione,
vitamin E, vitamin C và enzym superoxide dismutase. Ngồi ra cơ thể cịn có các tế bào như
neutrophil, monocyte, B-cell… có khả năng chống lại các yếu tố oxy hóa ngoại lai xâm nhập.
Tuy nhiên, trong các tế bào có thể xuất hiện hiện tượng các gốc tự do được tạo ra quá
nhiều do mất cân bằng trong hoạt động hoặc do các yếu tố bên ngoài như các chất độc, do
nhiễm vi sinh vật, do ozone, bức xạ, tia UV, nhiễm phóng xạ, do thuốc lá, môi trường ô
nhiễm… Các gốc tự do dư thừa trong khi cơ thể thiếu các yếu tố bảo vệ để ngăn chặn, có khả
năng tương tác, phá hủy màng lipid khơng bão hịa của tế bào, làm giảm khả năng bảo vệ các
tế bào dẫn đến sự xâm nhập các tác nhân gây bệnh từ bên ngồi oxy hố các nucleotid căn
bản làm thay đổi cấu trúc AND, dẫn đến các quá trình đột biến, phát sinh các khối u, ung thư,
làm hỏng cấu trúc protein hoặc hoạt hóa enzym trong các q trình trao đổi chất gây bệnh…
•

Tính kháng oxy hóa của nhóm hợp chất polyphenol trong lá sakê

Trong cơ thể con người có sẵn một vài enzyme dùng để bảo vệ và ngăn ngừa nhiều loại
gốc tự do làm nguy hại tế bào như: superoxide dismutase phân hóa nhiều trong các tế bào
hồng cầu và gan. Tuy nhiên với số lượng gốc tự do quá nhiều nên cơ thể phải nhờ đến các
chất chống oxy hóa từ bên ngồi như vitamin E, vitamin C… Tuy nhiên người ta đặc biệt chú
tâm tới khả năng chống oxy hóa của các hợp chất polyphenol có trong các loại thực phẩm
như: lá dâu tằm, trà xanh, lá sakê…
Cơng thức hóa học của các geranyl dihydrochalcone (2, 4, 5, 8, 9), geranyl flavonoids (1,
3, 6, 7) có mặt các hydrogen phenolic thể hiện khả năng kháng oxy hóa mạnh. Q trình
kháng oxy hóa của chúng được thể hiện bằng cách tác động trực tiếp lên các gốc tự do được
sinh ra trong cơ thể, chúng sẽ tương tác với các gốc tự do đưa chúng về trạng thái các chất
bền qua đó làm cho q trình oxy hóa bị loại bỏ thông qua các dạng phản ứng sau:
RO2* + AH

ROOH + A*

(1)

RO*

ROH

(2)

+ AH

+ A*

RO2* + A*

ROOA*

(3)

RO*

ROA

(4)

+ A*

11


SVTH: Đỗ Thị Mai Trinh

Các chất A* tạo ra trong các phản ứng (1) (2) khác với các gốc RO 2* , RO* vì chúng khơng
có khả năng lấy các ion H + từ các acid béo không no hay của các hợp chất trong cơ thể nên
không tạo ra các gốc tự do mới để tiếp tục khởi động q trình oxy hóa. Các sản phẩm tạo ra
trong phản ứng (3)(4) là những sản phẩm khá bền và kết quả là chuỗi phản ứng của các gốc tự
do sẽ kết thúc sớm hơn.
2.3.3

Quy trình trích xuất polyphenol từ lá sakê

Sơ đồ quy trình:

Ngun liệu

ä
Diệt
men

Xay nhỏ
Trích
ly
Lọc

Bã
Thu hồi Ethanol

Cơ đặc
ë
Cao chiết
á 1
1
Xử lý acid
Lắng, làm trong

Lọc

Cặn
ë

Pha nước

Tinh chế bằng Ethyl
acetate
Cô đặc

Thu hồi ethyl acetat

Cao Polyphenol

Hình 4: Sơ đồ quy trình trích ly và thu nhận cao polyphenol

12


SVTH: Đỗ Thị Mai Trinh

Thuyết minh quy trình:
•

Lựa chọn ngun liệu: Lá sakê dùng làm thí nghiệm là lá sakê đã chuyển màu vàng.
Lá được lựa chọn kỹ để loại bỏ lá hư, sâu, quá già khô, chọn lá không bị dập nát, chỉ
lấy các lá tốt còn nguyên vẹn. Sau đó đem đi cân lấy 10g/ mẫu. Cân theo số lượng

•

mẫu cần trích sau đó tiến hành diệt men.
Diệt men:
o Mục đích: Xử lý để làm mất hoạt tính của enzyme polyphenol oxydase, ngăn
chặn hoạt động của hệ enzyme này làm polyphenol bị oxy hóa.
o Cách thực hiện: Lá sakê được diệt men bằng nước nóng ở 100 0C, trong thời

•

gian 2 – 3 giây. Vớt ra để ráo, sau đó chuyển sang giai đoạn xay.

Xay nhỏ:
o Mục đích: Lá sakê sau khi diệt men được xay nhỏ để thuận tiện cho việc tiếp
xúc của nguyên liệu với dung môi, làm tăng khả năng khuyếch tán và thẩm
thấu của các chất vào trong dung môi, làm tăng khả năng trích ly.
o Cách thực hiện: Dùng máy xay thơng thường để thực hiện q trình xay nhỏ,
sau đó đem chia đều khối lượng cho các mẫu trích ly. Sau khi diệt men lá sẽ
hấp thụ một lượng nước nên khối lượng tăng 8 – 10%.

•

Trích ly: Dung mơi dùng để trích ly là cồn và nước.
o Mục đích: Trích ly polyphenol trong lá sakê nhờ dung môi cồn và nước. Cồn
và nước là 2 loại dung môi phân cực nên được sử dụng để trích ly các chất
phân cực có trong lá sakê, cụ thể là polyphenol.
o Thực hiện thí nghiệm nhiều lần với các dung môi là nước, cồn được thay đổi ở
các nồng độ khác nhau. So sánh lượng polyphenol có trong dịch trích từ đó
chọn loại dung mơi, nồng độ dung mơi thích hợp.

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến q trình trích ly, dựa theo các tài liệu công bố các yếu
tố ảnh hưởng đến q trình trích ly gồm có: Loại dung mơi, tỉ lệ ngun liệu/ dung mơi, nhiệt
độ trích ly, thời gian trích ly, pH.
•

Lọc: Để thu hồi dịch chiết cần phải qua khâu lọc thô để loại cặn lá lẫn trong dịch chiết,
thu dịch trong để chuẩn bị quá trình tinh chế.

13


SVTH: Đỗ Thị Mai Trinh

•

Cơ đặc: Nhằm thu hồi dung môi ethanol để tái sử dụng. Dịch sau cô đặc được chuyển
sang dung môi khác để loại bỏ tạp chất khác khơng mong muốn cũng như thực hiện
q trình tiếp theo. Cô đặc bằng cách đun cách thủy ở nhiệt độ 70 – 80 0C, sau đó tiến
hành q trình xử lý acid.
Xử lý bằng acid HCl
o Mục đích: Tạo mơi trường acid thích hợp cho sự tồn tại của polyphenol vì

•

polyphenol rất bền trong mơi trường acid. Đồng thời dùng acid để phá hủy cấu trúc
liên kết của các nhóm phức như đường, protein… với polyphenol để giải phóng
polyphenol tự do.
o Hướng nghiên cứu xử lý acid, dựa theo tài liệu công bố các yếu tố ảnh hưởng của
quá trình xử lý acid gồm có: pH, tỷ lệ dịch cao chiết/ dung mơi, nhiệt độ, thời
gian… Q trình được tiến hành trên nhiều mẫu và thí nghiệm được lặp lại nhiều
•

lần.
Lắng làm trong: Dịch trích sau khi xử lý acid thường có kết tủa vón, nhựa, có
protein… Do đó cần lắng để làm trong dịch.
o Cách thực hiện: Dịch sau khi xử lý acid xong, tiến hành khảo sát thời gian tối ưu

•

của q trình kết lắng để chuẩn bị bước vào quá trình tinh chế polyphenol.
Lọc: Nhầm loại kết tủa sáp, nhựa, protein… để làm trong dịch. Sau khi lắng một thời
gian, một số thành phần bị kết tủa. Do đó cần phải lọc để thu lấy dịch trong. Dịch

trong này chứa các thành phần tan trong nước như polyphenol, đường, cafein…Quá

trình lọc thường lặp lại 3 lần cho đến khi thu được dịch trong.
• Chiết polyphenol:
o Mục đích: Để loại bỏ dần các tạp chất, thành phần không mong muốn như đường,
protein… nhằm làm tăng độ tinh sạch của chế phẩm polyphenol.
o Dùng dung môi là ethyl acetate để lơi kéo polyphenol có trong dung dịch. Sau khi
để yên, hỗn hợp phân tách thành 2 lớp, lớp bên trên là dịch ethyl acetate, bên dưới
là nước. Polyphenol sẽ nằm trong ethyl acetate. Đem cô đặc để thu hồi dung môi,
thu được cao dạng paste chứa chủ yếu là polyphenol.
o Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình này gồm: Tỷ lệ dung dịch polyphenol/dung
môi, thời gian…
o Pha Etyl acetate được xử lý nhiệt để thu hồi ethyl acetate và cao chứa polyphenol.

2.3.4 Định tính, định lượng polyphenol từ lá sakê
a) Phương pháp định tính
• Phương pháp ống nghiệm
o Phản ứng với hơi amoniac: nhiều flavonoid thay đổi màu khi gặp hơi NH3. Có thể
quan sát sự biến đổi màu này bằng mắt thường hoặc dưới ánh sáng tử ngoại .
14


SVTH: Đỗ Thị Mai Trinh

o Phản ứng với dung dịch sắt (III) clorid 5%: cho dịch chiết vào ống nghiệm, thêm
•

vài giọt dung dịch sắt (III) clorid 5%, lắc sẽ xuất hiện màu xanh đen.
Phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM): SKLM là một kỹ thuật tách các chất được
tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh, trên đó ta đặt hỗn hợp các chất cần

tách.
b) Định lượng polyphenol trong hợp chất:
• Xác định polyphenol tổng bằng phương pháp so màu (Phương pháp Folin – Denis).
Phương pháp Folin – Denis được xem là phép phân tích polyphenol tổng (A.O.A.C
1990) dựa trên đường chuẩn là acid tannic.
o Nguyên tắc: Thuốc thử Folin – Denis là một phức hợp của nhiều acid
phosphomolybdic và phosphotungstic. Khi thuốc thử này gặp polyphenol thì
chúng sẽ giải phóng ra các acid tạo thành phức Mo-W có màu xanh. Các
polyphenol chỉ hiện diện trong dung dịch kiềm, nhưng chất phản ứng và sản phẩm
tạo thành khơng chắc là những chất kiềm. Do đó ở mơi trường kiềm nhẹ và nồng
độ thuốc thử cao thì phản ứng có thể xảy ra.
Chuẩn bị hố chất: Dung dịch Na2CO3 bão hoà.
o Tiến hành:
o

Cân 40g Na2CO3 + 150ml nước cất, sau đó để hồ tan trong bóng tối 1giờ và
định mức tới 200ml bằng nước cất.
Thuốc thử Folin – Denis là một hỗn hợp bao gồm: 10g sodium tungstate + 2g
phosphomolybdic acid + 5ml phosphoric acid + 75ml nước cất và đun hồn
lưu trong 2giờ. Sau đó làm nguội và định mức đến 100ml bằng nước cất.
•

Cách tiến hành xác định polyphenol tổng
Hút 1ml dịch cần phân tích cho vào ống nghiệm + 0.5ml thuốc thử Folin –
Denis rồi để khoảng 3phút. Sau đó cho tiếp vào 2.5ml dung dịch Na 2CO3 bão
hoà, lắc nhẹ cho đều và để trong bóng tối 35phút.
Đem đo độ hấp thu (OD) của dung dịch ở bước sóng 760nm.
Từ kết quả đo OD, dựa trên phương trình đường chuẩn của acid Tannic thì suy
ra nồng độ của polyphenol có trong dịch cần phân tích.

15


SVTH: Đỗ Thị Mai Trinh

16


SVTH: Đỗ Thị Mai Trinh

CHƯƠNG 3: ỨNG DỤNG CAO POLYPHENOL TRIẾT XUẤT TỪ LÁ SAKÊ TRONG
TRÀ TÚI LỌC

3.1 Sơ đồ quy trình:

Ngun liệu
Làm héo
Vị
Ủ
Sấy sơ bộ
Cao Polyphenol
Pha lỗng

Nghiền
Phun

Sấy
Phối trộn

Cam thảo

Định lượng
Bao gói
Sản phẩm

3.2

Thuyết minh quy trình:
• Ngun liệu: Sử dụng lá sakê tươi, sạch, không bị hư tổn, sâu bệnh… Loại lá sử dụng
là lá sakê vàng vì có hàm lượng polyphenol cao và một số thành phần khoáng chất có
•

lợi sức khỏe.
Làm héo: Chủ yếu bằng phương pháp tự nhiên. Điều kiện của q trình là: độ ẩm mơi
trường từ 70 – 75%, nhiệt độ bình thường và thời gian làm héo từ 4 – 6giờ. Quá trình
này làm thay đổi về sinh lý và sinh hóa của nguyên liệu, q trình này có liên quan
đến độ ẩm trong lá và nhiệt độ môi trường. Yêu cầu của quá trình làm héo là giảm
17


SVTH: Đỗ Thị Mai Trinh

hàm lượng nước trong lá còn lại 60 – 62%, lá trở nên mềm dai, thể tích lá giảm đi. Vật
chất tăng lên do sự thủy phân các chất. Tuy nhiên cũng có một số chất mới được tạo
thành. Ở giai đoạn này tanin bị giảm đi, các chất màu được tạo thành, hương thơm
được hình thành (do polyphenol bị oxy hóa và kết hợp với một số thành phần khác).
Protein biến đổi để tạo thành các acid amin hòa tan. Một số chất khác như vitamin C,
•

diệp lục, tinh bột giảm đi.
Vị: Làm dập cấu trúc và tế bào của lá sakê để tạo điều kiện thuận lợi cho dịch tế bào
tiếp xúc với oxy để thực hiện tốt q trình oxy hóa, đồng thời cũng giải phóng một số
thành phần và kích hoạt các enzyme polyphenol oxydase thực hiện việc oxy hóa. Ở

•

giai đoạn này sự oxy hóa tăng lên nhiều so với quá trình làm héo.
Ủ: Đây là giai đoạn thực hiện quá trình lên men. Sự lên men này được hình thành từ
khi vị lá đến khi kết thúc q trình (khoảng 3 – 4giờ). Các quá trình xảy ra trong giai
đoạn này là: quá trình lên men, quá trình tự oxy hóa, sự tác động của vi sinh vật, nhiệt
độ. Qua giai đoạn này, các giá trị của sản phẩm như: mùi, vị, màu sắc nước pha sẽ

•

tăng lên rất nhiều.
Sấy: Dùng nhiệt độ1050C sấy trong khoảng thời gian 30 phút để đình chỉ các quá trình
lên men, tiêu diệt hệ enzyme và làm giảm độ ẩm của sản phẩm xuống cịn 9 – 10%.

•

Giai đoạn này giúp cố định phẩm chất cho sản phẩm
Nghiền: Làm nhỏ và đều cấu trúc của bán thành phẩm tạo điều kiện thuận lợi cho cơng

•

đoạn tiếp theo,việc đóng gói, trích ly và sử dụng sau này.
Pha loãng: Cao polyphenol được pha loãng vào nước với nồng độ 0.03%. Mục đích
của việc pha lỗng là làm cho polyphenol dễ thẩm thấu vào nguyên liệu, đồng thời tạo

•

sự phân bố đều trong q trình phun.
Phun: Đây là giai đoạn bổ sung polyphenol vào trong nguyên liệu do trong quá trình
xử lý, chế biến thì hàm lượng polyphenol trong nguyên liệu đã bị mất đi đáng kể, đồng
thời cũng nhằm mục đích làm tăng hàm lượng polyphenol trong sản phẩm. Quá trình
này làm tăng nồng độ hợp chất hòa tan vào trong sản phẩm, nâng cao chất lượng sản

•

phẩm.
Sấy: Sau khi phun độ ẩm của bán thành phẩm sẽ tăng lên ta sấy để đưa độ ẩm của sản

•
•

phẩm trở về 9->10%.
Phối trộn: cho Cam thảo vào với mục đích tăng giá trị cảm quan cho sản phẩm.
Định lượng: Tạo cho sản phẩm có độ đồng nhất về khối lượng theo yêu cầu cầu sản

phẩm hoặc quy trình cơng nghệ ( 20 g/gói).
• Bao gói: Sử dụng máy bao gói để cho trà vào túi lọc.
3.3 Phương pháp phân tích
a. Phương pháp xử lý số liệu
Xử lý số liệu theo phương pháp thống kê.
18


SVTH: Đỗ Thị Mai Trinh

Mỗi thí nghiệm đều tiến hành 3 lần, và kết quả là trung bình cộng của các lần thí
nghiệm.
Số liệu được xử lý để vẽ đồ thị trên excel.
b. Các chỉ tiêu kiểm tra
• Xác định hàm lượng nước
o Nguyên tắc: Dùng nhiệt độ cao để loại bỏ nước ra khỏi mẫu thử, hiệu số khối
lượng của mẫu thử trước và sau khi sấy khô là lượng nươc có trong mẫu thử.
o Dụng cụ: Chén cân có nắp mài, bình hút ẩm, cân phân tích độ chính xác 0.001g,
tủ sấy.
o Cách tiến hành: Cân chính xác 3 – 5g mẫu thử vào chén cân, cho tất cả vào tủ sấy.
Và sấy ở 60 – 800C trong hai giờ, sau đó nâng nhiệt độ lên 105 0C trong 3 giờ. Sau
đó lấy cốc ra để nguội trong bình hút ẩm rồi cân thấy khối lượng khơng đổi là q
trình kết thúc.
o Tính kết quả:
Hàm lượng nước được tính như sau:
G2 – G1
X=

(g)
m

Trong đó: m là khối lượng mẫu thử (g)
G1 là khối lượng chén cân, nắp và mẫu thử trước khi sấy (g)
G2 là khối lượng chén cân, nắp và mẫu thử sau khi sấy (g)
•

Xác định hàm lượng tro
o Nguyên tắc: Sử dụng nhiệt độ cao lọai bỏ hết các chất hữu cơ có trong mẫu xác
định. Khi đó sản phẩm thu lại chỉ cịn các thành phần khống khơng tan.
o Dụng cụ: cốc nung bằng sứ , tủ sấy, cân phân tích độ chính xác là 0.0001g

o Cách tiến hành: Cân khỏang 10 đến 20 g mẫu (với độ chính xác 0.001g) trong cốc
nung đã chuẩn bị. Sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 105 0C cho đến khối lượng khơng đổi.
Sau đó đưa vào tủ nung ở nhiệt độ 550-6000C trong khỏang thời gian là 6 giờ. Sản
phẩm tro có màu trắng ngà. Làm nguội trong bình hút ẩm, sau đó mang cân lại khối
lượng.
o Tính kết quả
Hàm lượng tro được xác định như sau:

19


SVTH: Đỗ Thị Mai Trinh

m2 – m1
X =

(g)
m

Trong đó : m là khối lượng mẫu cân (g)
m1 là khối lượng cốc nung (g)

m 2 là

khối lượng cốc nung và tro (g)

•

Xác định hàm lượng chất khơ trong dịch trích ly: Sử dụng khúc xạ kế đo độ đường,
đơn vị % 0Brix ở 200C.

o Nguyên tắc: Khi đi từ môi trường khơng khí vào mơi trường chất lỏng, tia sáng sẽ
bị khúc xạ. Nếu chất lỏng là một dung dịch chất hịa tan, dựa trên độ lệch của tia
sáng ta có thể xác định được nồng độ chất khơ hịa tan trong dung dịch
o Tiến hành: Dùng dụng cụ khúc xạ kế hiệu Atago. Cần phải đem dịch lọc cho trong
rồi mới đo. Dùng nước cất trong bình tia rửa sạch mặt kính, dùng giấy thấm khơ.
Dùng ống nhỏ giọt lấy vài giọt dịch trong nhỏ lên mặt kính của khúc xạ kế và đậy
nắp nhựa lại. Đưa khúc xạ kế ra hướng có ánh sáng và nhìn vào ống kính ta thấy
hai vùng xanh và trắng. Vạch ngăn cách giữa hai vùng chỉ vào giá trị nào thì giá trị
đó chính là nồng độ chất khơ của dịch nước quả.

Hình 5: Brix kế
•

Xác định pH của dịch trích ly: Dùng máy đo pH để đo pH của dung dịch ở 200C.
o Tiến hành:
Mở máy bằng nút On/Off.
Rửa sạch điện cực bằng nước cất, dùng giấy mềm thấm khô đầu điện cực.
Lắc đều mẫu dịch quả rồi đặt điện cực vào (lưu ý điện cực phải được nhúng
ngập trong mẫu dịch) bấm nút “Read”.
Chờ cho màn hình hiện lên dấu hiệu báo chỉ số pH khơng thay đổi nữa thì ghi
nhận kết quả.

20


SVTH: Đỗ Thị Mai Trinh

Lấy điện cực ra khỏi mẫu, rửa sạch điện cực bằng nước cất, thấm khô bằng
giấy mềm và nhúng vào dung dịch bảo quản (KCl 1%).
Tắt máy bằng nút On/Off

Hình 6: Máy đo pH
•

Xác định polyphenol tổng có trong túi trà bằng phương pháp so màu (Phương pháp
Folin – Denis) dựa trên đường chuẩn là acid Tannic.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.

Nguyễn Lê Vương Bảo – Nghiên cứu quy trình sản xuất trà dược thảo – Luận
văn tốt nghiệp, Đại học Nông Lâm Tp. HCM, 2008.

2.

Võ Văn Chi – Từ điển cây thuốc Việt Nam – Nhà xuất bản Y học, 1999.

3.

Nguyễn Hải Hà – Nghiên cứu trích ly polyphenol từ trà Camellia sinensis (L) –
Luận văn thạc sĩ, Đại học Bách khoa Tp.HCM năm 2006.

4.

Tống Văn Hằng – Cơ sở sinh hóa và kỹ thuật chế biến trà – Nhà xuất bản Tp.
HCM, 1985.
21


SVTH: Đỗ Thị Mai Trinh

5.

Phạm Ngọc Thiện, Lê Ngọc Liễn – Chiết xuất, xác định hàm lượng polyphenol
và đánh giá tác dụng chống oxy hoá của các mẫu bột chiết lá dâu tằm – Tạp chí
nghiên cứu y học 38 (5), 2005.

6.

Nguyễn Minh Thông − Nghiên cứu cấu trúc, khả năng chống oxy hóa của một số
polyphenol và dẫn xuất trên nền fullerene (C 60) bằng phương pháp hóa tính tốn
– Luận án tiến sỹ hóa lý thuyết và hóa lý, Đại học Huế, 2016.

7.

Folin, O; and Denis – A colorimetric method for determination of phenols (and
phenol derivatives) in urine – Journal of biological chemistry, 1915.

8.

Peter J. Hernes and John I. Hedges – Geochemistry of Tanin: methods and
applycations – University of Washington.

9.

Hagerman, A.E - Method for determining tanin in plant extracts – Journal of
chemical ecology, 1987.

/>
22