DI TRUYỀN PHÂN TỬ VÀ KỸ THUẬT DI TRUYỀN

MỤC LỤC
MỤC LỤC
CHƯƠNG I: GENE, GENOME VÀ DỰ ÁN GENOME NGƯỜI...............................1
1.1

Khái niệm Gene................................................................................................................................1

1.2

Cấu trúc genome..............................................................................................................................1

1.3

Dự án genome..................................................................................................................................1

CHƯƠNG II: NGUYÊN LÝ VÀ ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT PCR......................4
2.1

Kỹ thuật pcr (Polymerase Chain Reaction).....................................................................................4

2.2

Nguyên tắc của kỹ thuật PCR..........................................................................................................4

2.3

Các ứng dụng kỹ thuật PCR.............................................................................................................6

CHƯƠNG III: NGUYÊN LÝ VÀ ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT ĐIỆN DI...........10
3.1

Điện di............................................................................................................................................10

3.2

Phương pháp điện di......................................................................................................................10

3.3

Điện di DNA trên gel.....................................................................................................................12

3.4

Ứng dụng kĩ thuật điên di:.............................................................................................................16

CHƯƠNG IV: NGUYÊN LÝ VÀ ỨNG DỤNG CỦA CÁC PHƯƠNG PHÁP GIẢI
TRÌNH TỰ GENE.........................................................................................................17
4.1

Giải trình tự là gì ?.........................................................................................................................17

4.2

Các phương pháp giải trình tự gene...............................................................................................17

4.2.1

Phương pháp hóa học giải trình tự DNA..............................................................................17

4.2.2

Phương pháp enzyme giải trình tự DNA...............................................................................20

4.2.3

Giải trình tự bằng máy tự động (automated sequencer).......................................................22

4.3

Ứng dụng........................................................................................................................................26

CHƯƠNG V: CÁC PHƯƠNG PHÁP LAI ACID NUCLEIC.....................................27
5.1

Phương pháp Southern blot............................................................................................................27

5.2

Phương pháp Northern blot............................................................................................................28

5.2

Lai tại chỗ.......................................................................................................................................28

5.3

Lai trên khuẩn lạc...........................................................................................................................29

5.4

Lai trên nhiễm sắc thể....................................................................................................................29

5.5

Lai trên tế bào và mô......................................................................................................................29

5.6

Phạm vi sử dụng của phương pháp................................................................................................30

CHƯƠNG VI: CÔNG NGHỆ DNA TÁI TỔ HỢP......................................................31
6.1

DNA tái tổ hợp...............................................................................................................................31

6.1.1

Khái niệm DNA.....................................................................................................................31

6.1.2

Khái niệm DNA tái tổ hợp.....................................................................................................32

6.2

Một số phương pháp đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ.............................................................45

6.3

Kỹ thuật tách dòng (tạo dòng).......................................................................................................48

6.4

Tạo DNA tái tổ hợp (Vector tái tổ hợp).........................................................................................49

6.5

Ngân hàng gen................................................................................................................................54

6.6

Ngân hàng cDNA...........................................................................................................................55

6.6.1

Thiết kế ngân hàng cDNA.....................................................................................................55

6.6.2

Sàng lọc ngân hàng cDNA....................................................................................................56

6.7

Ứng dụng của công nghệ DNA tái tổ hợp.....................................................................................56

6.7.1

Công nghệ DNA tái tổ hợp với việc nghiên cứu bộ gene.....................................................56

6.7.2

Công nghệ DNA tái tổ hợp với y-dược học..........................................................................58

6.7.3

Ứng dụng kỹ thuật di truyền trong chẩn đốn và điều trị gene............................................60

6.7.4

Kỹ thuật di truyền với hình pháp học và một số vấn đề xã hội khác....................................61

6.7.5
Kỹ thuật di truyền với các sinh vật biến đổi gene (genetically modified organisms =
GMOs) ................................................................................................................................................62

CHƯƠNG VII: NGUYÊN LÝ VÀ ỨNG DỤNG CỦA HỆ THỐNG SỬA CHỮA
GENE-CRISPR-CAS SYSTEM....................................................................................65
7.1

Giới thiệu........................................................................................................................................65

7.2

Cấu trúc của CRISPR trong genome vi khuẩn..............................................................................65

7.3

Cơ chế hoạt động CRISPR-Cas9 và ứng dụng trong chỉnh sửa hệ gene (genome editing).........68

7.4

Ứng dụng và tiềm năng của hệ thống CRISPR/Cas9....................................................................73

7.5

Kết luận..........................................................................................................................................73


CHƯƠNG I: GENE, GENOME VÀ DỰ ÁN GENOME NGƯỜI
1.1 Khái niệm Gene
Gene là một đoạn ADN mang thông tin mã hoá cho một sản phẩm xác định (chuỗi
polipeptit hay ARN).
1.2 Cấu trúc genome
Genome (hệ gene, bộ gene) là thuật ngữ được dùng với các nghĩa khác nhau như sau:
- Nguyên liệu di truyền của một cơ thể: 1) nhiễm sắc thể trong tế bào vi khuẩn (hoặc
một trong mỗi loại nhiễm sắc thể nếu hơn một loại có mặt, ví dụ: các nhiễm sắc thể
lớn hoặc bé của Vibrio cholerae), 2) DNA hoặc RNA trong một virion, 3) nhiễm sắc
thể cùng với mọi plasmid được kết hợp (ví dụ: nhiễm sắc thể và hai plasmid nhỏ
trong vi khuẩn Buchnera).
- Tất cả các gene (khác nhau) trong tế bào hoặc virion.
- Bộ nhiễm sắc thể đơn bội hoặc genome đơn bội trong tế bào.
Chuỗi genome hồn chỉnh (nghĩa là trình tự hồn chỉnh của các nucleotide trong
genome) đã được cơng bố cho một số lồi vi khuẩn. Các trình tự khác cũng đã được
cơng bố, ví dụ genome của cây cúc dại (Arabidopsis thaliana) và genome người.
Genome chứa tồn bộ thơng tin di truyền và các chương trình cần thiết cho cơ thể
hoạt động. Ở các sinh vật nhân thật (eukaryote), 99% genome nằm trong nhân tế bào
và phần còn lại nằm trong một số cơ quan tử như ty thể và lạp thể. Đa số genome vi
khuẩn và phần genome chứa trong các cơ quan tử thường có kích thước nhỏ và ở
dạng vịng khép kín. Ngược lại, phần genome trong nhân thường rất lớn và phân bố
trên các nhiễm sắc thể dạng thẳng.

1.3 Dự án genome
Là dự án xác định cấu trúc di truyền chính xác của một genome cơ thể sống, nghĩa
là trình tự DNA của tất cả các gen của nó. Dự án genome của một số sinh vật mô
1


hình (model organisms) đã được hồn thành như sau:
- Các genome vi khuẩn. Các trình tự hồn chỉnh của genome Escherichia coli đã
được xác định theo phương thức tổ hợp/tập hợp (consortium) của các phịng thí
nghiệm. Năm 1995, hai trình tự genome hoàn chỉnh của vi khuẩn Haemophilus
influenzae và Mycoplasma genitalium cũng được hồn thành. Lồi M. genitalium có
một genome đơn giản (khoảng 580.067 base), do nó dựa vào vật chủ để vận hành
nhiều bộ máy trao đổi chất của mình. Lồi H. influenzae là một vi khuẩn đặc trưng
hơn, và có genome khoảng 1.830.121 base với 1.749 gene.
- Chuỗi genome hoàn chỉnh của nấm men Saccharomyces cerevisiae đã được hồn
chỉnh trong năm 1996, nhờ một consortium của các phịng thí nghiệm. Genome của
chúng dài 12.146.000 base.
- Các dự án genome ở động vật như: chuột, cừu, lợn, giun tròn (Caenorhabditis
elegans), ruồi giấm (Drosophila melanogaster)…, hoặc ở thực vật như: lúa nước, lúa
mì, ngơ, táo, cúc dại…, mà nổi bật nhất trong số đó là dự án genome người cũng đã
được thực hiện.
- Ngày 12. 2. 2001 genome người đã được cơng bố với khoảng 30.000 gen, ít hơn
nhiều so với dự kiến trước đây (hàng trăm ngàn gen), và chỉ gấp hai lần giun tròn
hoặc ruồi giấm. Người ta đã xác định hệ gen người giống 98% so với tinh tinh và có
đến 99% là giống nhau giữa các dân tộc, các cá thể. Do đó, vấn đề hình thành và phát
triển nhân cách, chỉ số thông minh... phải chủ yếu trên cơ sở xã hội và sự rèn luyện
của từng người để phát triển tiềm năng sinh học của bản thân.
- Trình tự genome của những sinh vật mơ hình rất có ý nghĩa trong những nghiên cứu
của một chuyên ngành khoa học mới đó là genome học (genomics). Dựa vào đây, các
nhà sinh học phân tử có thể phân tích cấu trúc, hoạt động và chức năng của các gen,

làm sáng tỏ được vai trò của DNA lặp lại, DNA không chứa mã di truyền, DNA nằm
giữa các gen... Điều đặc biệt có ý nghĩa là khi so sánh các genome với nhau, có thể
hiểu được hoạt động của genome trong các cơ thể sống, mối quan hệ giữa chúng, sự
đa dạng sinh học và mức độ tiến hóa. Kết quả bước đầu so sánh genome giữa các loài
2


sinh vật với nhau đã cho thấy có ba đặc điểm nổi bật: 1) các gen phân bố trong
genome không theo qui luật, 2) kích thước của genome thay đổi khơng tỷ lệ thuận
(tương quan) với tính phức tạp của loài, 3) số lượng nhiễm sắc thể cũng rất khác
nhau ngay giữa những loài rất gần nhau.

3


CHƯƠNG II: NGUYÊN LÝ VÀ ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT PCR

2.1 Kỹ thuật pcr (Polymerase Chain Reaction)
PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng
hợp – phản ứng khuếch đại gen).Kỹ thuật PCR là kỹ thuật của sinh học phân tử cho
phép nhân bản một đoạn DNA mong muốn từ hệ gen DNA của cơ thể sinh vật thành
nhiều bản sao, kỹ thuật này được nhà khoa học người Mỹ – Kary Mullis và cộng sự
phát minh năm 1985 tại công ty Cetus.
2.2 Nguyên tắc của kỹ thuật PCR
-

Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) là một phương pháp tổng hợp DNA
dựa trên mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số
lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme
polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này.

-

Primer là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch của
đoạn DNA khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn primer này được
kéo dài để hình thành mạch mới. Kỹ thuật PCR được hình thành dựa trên đặc tính
này của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai primer sẽ được khuếch đại
thành số lượng lớn bản sao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng
ethidium bromide và có thể thu nhận đoạn DNA này cho các mục đích khác nhau
bằng các thao tác trên gel. Như vậy, để khuếch đại một trình tự DNA xác định,
cần phải có những thơng tin tối thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự
base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo các primer bổ sung chuyên biệt (trích dẫn bởi
Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 2003).

4


-

Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lăp lại nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước
như sau :

Bước 1: (Biến tính tách đơi sợi DNA, denaturation) Giai đoạn này được thực hiện ở
nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử (94 – 95 0C) trong vòng 30 giây
đến 1 phút, làm cho phân tử DNA mạch kép tách thành 2 mạch đơn. Chính 2 mạch
đơn này đóng vai trị là mạch khn cho sự tổng hợp 2 mạch bổ sung mới.
Bước 2: (bắt cặp, annealing) Trong bước này ở nhiệt độ được hạ thấp hơn nhiệt độ
nóng chảy (Tm) của các primer, cho phép các primer bắt cặp với mạch khuôn. Trong
thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 55 – 65 0C. Tùy thuộc vào Tm của
các primer mà thời gian bắt cặp kéo dài từ 30 – 60 giây.

Bước 3: (kéo dài, elongation – extension) Nhiệt độ được tăng lên 72 0C giúp cho
DNA polymerase hoạt động tốt nhất. Dưới tác động của DNA polymerase, các
nucleotide lần lượt gắn vào primer theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn.
Thời gian của giai đoạn này tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA khuếch đại,
thường kéo dài từ 30 giây đến vài phút.
Sự khuếch đại này có thể được tính như sau:
Tổng lượng DNA khuếch đại = m x 2n
m: Là số bản sao của chuỗi mã hóa.
n: Là số chu kỳ.
Như vậy, qua một chu kỳ nhiệt, một DNA đích đã được nhân bản thành hai bản sao;
và nếu chu kỳ này được lặp đi lặp lại liên tục 30 đến 40 lần thì từ một DNA đích đã
nhân bản được thành 230 đến 240 bản sao, tức là đến hàng tỷ bản sao.

5


Hình 2.1. Nguyên tắc phản ứng PCR (nguồn Andy Vierstraete, 1999)
2.3

Các ứng dụng kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau, từ nghiên

cứu khoa học đến sản xuất và đời sống xã hội. Những ứng dụng chính của kỹ thuật
PCR là:Vân tay di truyền: vân tay di truyền là một kỹ thuật pháp y sử dụng để xác
định một người bằng cách so sánh DNA của người đó với mẫu đã có, ví dụ như, mẫu
máu thu được từ hiện trường vụ án có thể được so sánh di truyền với mẫu máu của
người tình nghi. Có thể chỉ cần một lượng nhỏ DNA thu từ máu, tinh dịch, nước bọt,
tóc… Về lý thuyết thì chỉ cần một mạch DNA đơn là đủ.

6

Kiểm tra huyết thống

Kỹ thuật pháp y xác định huyết thống, dấu vân tay được kí hiệu: (1) Bố; (2) Con;
(3) Mẹ.
Mặc dù các kết quả “dấu vân tay” là duy nhất (trừ cặp song sinh giống hệt nhau),
mối quan hệ di truyền, ví dụ, cha mẹ và con hoặc anh chị em ruột, có thể được xác
định từ hai hoặc nhiều dấu vân tay di truyền, có thể được sử dụng để thử nghiệm
quan hệ cha con. Một biến thể của kỹ thuật này cũng có thể được sử dụng để xác
định các mối quan hệ tiến hóa giữa các sinh vật, truy tìm dấu vết tội phạm.

7


Chẩn đoán bệnh di truyền
- Ứng dụng kỹ thuật PCR để phát hiện các bệnh di truyền trong một gen nhất định
là một q trình lâu dài và khó khăn, có thể được rút ngắn đáng kể bằng cách sử dụng
phương pháp PCR. Mỗi gen trong câu hỏi có thể dễ dàng được khuếch đại qua PCR
bằng cách sử dụng các loại sơn lót thích hợp và sau đó trình tự để phát hiện đột biến.
- Bệnh virus, cũng có thể được phát hiện bằng phương pháp PCR thông qua khuếch
đại của DNA của virus. Phân tích này là có thể ngay sau khi nhiễm trùng, có thể từ
vài ngày đến vài tháng trước khi các triệu chứng thực tế xảy ra. Chẩn đoán sớm như
vậy cho các bác sĩ dẫn quan trọng trong điều trị.
Tách dòng gene
Nhân bản một gen khơng nên nhầm lẫn với nhân bản tồn bộ một sinh vật-mơ tả q
trình cơ lập một gen từ một sinh vật và sau đó chèn nó vào sinh vật khác. PCR
thường được sử dụng để khuếch đại gen, mà sau đó có thể được chèn vào một vector
(vector là một phương tiện chèn một gen vào cơ thể) như một plasmid (một phân tử
DNA vịng) (Hình 5). DNA sau đó có thể được chuyển thành một sinh vật khác nhau,

nơi gen và sản phẩm của nó có thể được nghiên cứu chặt chẽ hơn. Thể hiện một gen
nhân bản (thể hiện một gen có nghĩa là để sản xuất các protein mà nó xác định sản
xuất) cũng có thể là một cách để sản xuất hàng loạt hữu ích ví dụ protein-cho, thuốc
men.
Gây đột biến điểm
Đột biến là một cách để làm thay đổi trình tự của các nucleotide trong DNA. Có
những tình huống trong đó một là quan tâm đến biến đổi (thay đổi) bản sao của một
chuỗi ADN nhất định, ví dụ, khi đánh giá các chức năng của một gen hoặc trong ống
nghiệm tiến hóa protein. Đột biến có thể được đưa vào trình tự DNA sao chép theo
hai cách cơ bản khác nhau trong quá trình PCR. Đột biến trang web hướng cho phép
người thử nghiệm để giới thiệu một đột biến tại một địa điểm cụ thể trên sợi DNA.

8


Thông thường, đột biến mong muốn được kết hợp trong các mồi sử dụng cho các
chương trình PCR. Đột biến ngẫu nhiên, mặt khác, dựa trên việc sử dụng các
polymerase dễ bị lỗi trong quá trình PCR. Trong trường hợp đột biến ngẫu nhiên, vị
trí và tính chất của đột biến khơng thể kiểm sốt. Một ứng dụng kỹ thuật PCR – đột
biến ngẫu nhiên là để phân tích các mối quan hệ cấu trúc chức năng của protein.
Bằng cách thay đổi một cách ngẫu nhiên một chuỗi DNA, người ta có thể so sánh các
protein kết quả với ban đầu và xác định chức năng của từng phần của protein.
Phân tích mẫu DNA cổ
Sử dụng PCR, nó sẽ trở thành có thể phân tích ADN đó là hàng ngàn năm tuổi. Kỹ
thuật PCR đã được sử dụng thành công trên động vật, chẳng hạn như một voi ma mút
bốn mươi ngàn năm tuổi, và cũng trên DNA của con người, trong các ứng dụng kỹ
thuật PCR khác nhau, từ việc phân tích các xác ướp Ai Cập đến việc xác định một Sa
hồng Nga.
Ngồi ra cịn một số ứng dụng kỹ thuật PCR có thể kể đến như sau:
 Nghiên cứu q trình tiến hố phân tử

 Xác định các đoạn trình tự cần nghiên cứu
 Phục hồi các gen đã tồn tại hàng triệu năm
 Chọn giống vật nuôi, cây trồng
 Lựa chọn các cặp cha mẹ thuần chủng trong thời gian ngắn
 Xác định các loài mới, các loài đặc hữu bằng phưng pháp di truyền phân tử Y
học – Khoa học hình sự.
 Pháp y, quan hệ huyết thống,…

9


 Chuẩn đốn chính xác các bệnh nhiễm trùng từ vi khuẩn, nấm, virus
 Chuẩn đoán sớm các bệnh gây ra do ung thư, các bệnh di truyền


Là kỹ thuật nền cho các kỹ thuật khác như: RAPD, SSR…

10


CHƯƠNG III: NGUYÊN LÝ VÀ ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT ĐIỆN DI
3.1

Điện di
Điện di là sự dịch chuyển của các thành phần tích điện về hướng các điện cực tích

điện trái dấu trong dung dịch dưới tác dụng của điện trường. Các phần tích điện
dương chuyển tới cực âm và các phần tích điện âm chuyển về cực dương. Tốc độ dịch
chuyển thay đổi theo hình dạng và kích thước phân tử. Kĩ thuật này có thể dùng để
tách hoặc phân tích các phân tử như DNA, RNA hay prơtein dựa trên các đặc điểm vật

lý của chúng như kích thước, hình dạng. Kĩ thuật này sử dụng một dung dịch đệm
(buffer) để dẫn điện và tạo một điện trường đều, một bản gel (thường là agarose hay
polyacrylamide) đóng vai trò là thể nền để phân tách các phân tử và các chất nhuộm
khác nhau (Ethidium bromide, bạc, xanh Coomassie) để phát hiện vị trí các phân tử
trên gel sau khi điện di.
3.2

Phương pháp điện di
Phương pháp này được sử dụng rộng rãi trong phân tích định tính và trong việc

thu nhận mẫu axit nucleic hiển thị trực tiếp.
a) Nguyên tắc điện di: Điện di là kĩ thuật được sử dụng trong thí nghiệm để phân tích
các đại phân tử tích điện. Trong phịng thí nghiệm sinh học phân tử người ta thường
sử dụng phương pháp điện di để tách ly, phát hiện phân tử DNA nguyên vẹn, DNA bị
cắt hạn chế và DNA của sản phẩm PCR.
- Dựa vào đặc tính cấu tạo của các axit nucleic, các axit nucleic là các đại phân tử tích
điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác động của điện trường chúng sẽ di
chuyển từ cực âm sang cực dương. Tính linh động của phân tử phụ thuộc vào hai chỉ
tiêu là khối lượng phân tử tức là số lượng nucleotic hay cặp nucleotic và nồng độ các
chất cấu thành gel.
- Hai loại gel được sử dụng trong axit nucleic là gel polyacrylamide và gel agaroza.

11


Việc chọn loại gel cũng như nồng độ các chất tạo thành gel phụ thuộc kích thước
trung bình của các đoạn axit nucleic. Trên cùng một bảng gel, có cùng một dòng điện
những phân tử DNA khác nhau về trọng lượng nên khác nhau về điện tích và chạy
được những quãng đường khác nhau sau một gian như nhau. Sau khi phân tách bằng
điện di, để phát hiện phân tử DNA, người ta dùng phương pháp làm hiện hình. Đối

với gel agarose, người ta nhuộm bằng ethidi bromua (C21H20BrN3). Chất này sẽ gắn
xen các bazơ của phân tử DNA và phát quang dưới tia tử ngoại. Như vậy dễ dàng cho
phép phát hiện vị trí các đoạn DNA trên gel và có thể phân biệt được phân tử DNA
trên cùng một bảng gel. Đối với gel polyacrylamid, các phân tử thường được đánh
dấu bằng đồng vị phóng xạ và vị trí của chúng sẽ được phát hiện bằng kĩ thuật phóng
xạ tự ghi. Trong điện di người ta sử dụng thang DNA chuẩn, thường là DNA người,
khi điện di cho chạy cùng với mẫu nghiên cứu, qua đó có thể so sánh với DNA mẫu
với DNA chuẩn để biết trọng lượng phân tử hoặc trích ly được DNA khác nhau.
b) Cách tiến hành: hệ thống điện di bao gồm nguồn điện, buồng điện di, khuôn đổ gel
và hệ thống soi chụp ảnh. Các bước được tiến hành như sau:Cân khoảng 1g agarose
cho vào 100 ml đệm TBE (tris-borate-EDTA) hoặc TAE (tris-acetate-EDTA) ở nhiệt
độ phòng, khuấy đều và để yên 1 phút, cho vào lị viba (làm nóng chảy gel và khơng
tạo bọt).
Làm nguội gel xuống 50-550 C, thêm 1 µl ethidi bromua đổ gel vào khuôn gel và lắp
lược.Khi gel nguội, đặt khuôn gel vào buồng điện di, tháo lược và đổ đệm chạy vào
khay gel sao cho đệm cao hơn mặt gel khoảng 2-5 mm.Nạp DNA mẫu và DNA chuẩn
vào các giếng, đậy nắp và cắm điện cực.Điện di trong khoảng 30 phút với điện thế
100 -120 V. Chụp hình ảnh gel dưới ánh sáng UV để xem kết quả.
Lưu ý: tuỳ thuộc vào kích thước của DNA mẫu mà người ta chọn loại gel
(agarose,polyacrylamid), nồng độ gel, loại đệm (TBE hoặc TAE). Đệm TAE cho độ
phân giải cao các phân đoạn lớn hơn 4 kb, trong khi đệm TBE có phân giải cao từ 0,1
đến 3 kb. Ngồi ra độ phân giải các phân đoạn DNA còn phụ thuộc vào phương pháp
điện di, tối ưu điện thế, tối ưu lượng DNA nạp và đệm nạp.
12


Thuốc nhuộm ethidi bromua (EtBr) là một thuốc nhuộm huỳnh quang mà có thể nhận
biết cả hai loại DNA sợi đơn và sợi kép. Mặc dù vậy, ái lực liên kết với DNA sợi đơn
tương đối thấp hơn so với DNA sợi kép. DNA nhuộm EtBr được nhận biết bằng tia
cực tím. Tại bước sóng 254 nm, ánh sáng UV được hấp thụ bởi DNA và chuyển sang

thuốc nhuộm. Tại bước sóng 302 nm và 366 nm ánh sáng UV được hấp thụ bởi chính
thuốc nhuộm. Trong cả hai trường hợp, năng lương được phát xạ ứng với tia tại bước
sóng 590 nm trong vùng vàng đỏ của quang phổ thấy được. EtBr là chất gây đột biến
mạnh, cần phải mang găng tay khi thao tác với dung dịch thuốc nhuộm này và các gel
nhuộm. Để tạo độ phân giải cao rõ nét, các vạch và nền nhạt nên nhuộm gel với EtBr
ngay sau khi điện di.
3.3 Điện di DNA trên gel
Sản phẩm cắt của DNA được điện di trên gel agarose (hoặc polyacrylamic) sẽ tạo
thành các giải băng khác nhau.
a) Điện di trên gel agarose:Agarose là một loại polymer tách từ rong biển, cấu tạo bởi
2 monomer là D-galactose và 3,6 anhydro-L-galactose. DNA mang điện tích âm, di
chuyển từ (-)đến (+). Tốc độ di chuyển phụ thuộc:.
Kích thước phân tử.
Dạng cấu trúc DNA.Nồng độ agarose trong gel.
Điện thế.
Nhiệt độ.
Thành phần chất đệm điện di…
Đây là loại gel thông dụng nhất, thao tác đơn giản, Gel agarose được dùng để phân
tích những đoạn có kích thước 0,5-20 kb, được để trên một giá thể nằm ngang, sau khi
đun tan để nguội gía có lắp lược. Rút lược ra sau khi gel đã đông lại, đặt gel nằm
ngang trên buồng điện di, chứa dung dịch đệm. Điện di được thực hiện theo phương
nằm ngang. Các axit nucleic trong gel agarose được hiện hình dưới tia tử ngoại (UV)
nhờ ethidium bromide, chất này có khả năng gắn xen giữa các bazơ của axit nucleic
và phát huỳnh quang dưới tác dụng của UV. Ethidium bromide được cho vào gel
13


trước khi đổ. Sau điện di, gel được chiếu sáng bằng UV (λ=300 nm), axit nucleic hiện
vạch đỏ da cam, để ước lượng kích thước các trình tự axit nucleic trong gel agarose,
người ta dùng yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử là một tập hợp nhiều trình tự

DNA, có kích thước đã biết.
b) Điện di trên gel polyacrylamide: điện di trên gel polyacrylamide được dùng trong
nhiều năm để tách RNA và Protein dựa vào trọng lượng phân tử của chúng.
Vào năm 1970, Daniel Nathans dùng điện di trên gel polyacrylamide như cơng cụ
đơn giản và nhanh chóng để tách các đoạn DNA bị cắt.
Dùng để tách các đoạn có kích thước <1000 bp (cặp bazơ) (bảng 7.1), tuy nhiên thao
tác với gel polyacrylamide phức tạp hơn gel agaroza. Do đó gel này chỉ thao tác với
mục đích đặc hiệu như:
- Tinh sạch các oligonucleotid tổng hợp.-Xác định trình tự đoạn DNA nhỏ.
- Tách các đoạn DNA nhỏ có chiều dài <500 bp.
- Gel được đổ giữa hai tấm thuỷ tinh và phương điện di thực hiện theo chiều thẳng
đứng.
Điện di trên gel có ưu điểm vì:
DNA giống như một axit hữu cơ, nó tích điện âm,DNA nhờ tính axit của nhóm
phosphat liên kết với deoxyriboza tạo nên trục của thang xoắn kép.
Trong dung dịch, ở PH trung tính, các oxy tích điện âm phát ra từ phosphat ở phía
bên ngồi của phân tử DNA. Khi đặt vào điện trường, DNA sẽ bị thu hút về cực
dương và chạy khỏi cực âm.
Trong lúc điện di, các đoạn DNA được phân loại theo kích thước trong gel
polyacrylamide. Những lỗ gel làm việc như các lỗ rây phân tử mà những phân tử nhỏ
dễ dàng qua hơn các phân tử lớn. Do đó, khoảng cách mà đoạn DNA đi qua sẽ tỉ lệ
nghịch với trọng lượng phân tử của nó. Trong một khoảng thời gian cho trước thì các
đoạn cắt càng nhỏ càng đi xa nơi xuất phát hơn là các đoạn lớn. Do kích thước lỗ nhỏ
nên gel polyacrylamide chỉ tách một cách có hiệu quả những đoạn DNA nhỏ hơn
1000 cặp nucleotide. Bởi vậy, khả năng này không thoả mãn được yêu cầu tách các
14


đoạn gen vài ngàn nucleotide, ít tốn thời gian hơn li tâm.
Phương pháp điện di trên gel polyacrylamide vẫn được dùng phổ biến, sử dụng kết

hợp với việc đánh dấu phóng xạ các đoạn DNA. Tiếp theo, người ta cắt gel
polyacrylamide thành nhiều khúc rồi đo hoạt tính phóng xạ trong mỗi khúc đó bằng
máy đếm xang. Hình ảnh hoạt tính phóng xạ được dùng để vẽ nên hình ảnh các giải
DNA trên gel.
c) Điện di trường xung điện:
Phương pháp điện di trường xung điện sử dụng để phân tách các phân tử DNA rất
lớn >50 kb, không thể phân tách được bằng gel agaroza dù ở nồng độ tối thiểu là
0,4%.Nguyên tắc của loại điện di này dựa vào sự thay đổi hướng điện trường trong
quá trình điện di. Mỗi lần hướng điện trường thay đổi thì phân tử DNA phải tự định
hướng lại. Thời gian cần cho sự định hướng tuỳ thuộc vào kích thước của phân tử,
phân tử càng dài thì thời gian tự định hướng càng lớn khiến cho nó di chuyển chậm
hơn một phân tử kích thước nhỏ.
d) Tinh sạch axit nucleic bằng điện di trên gel agroza:
Sau khi điện di các vạch tương ứng với DNA cần tinh sạch được phát hiện và thu
nhận lại theo một trong các phương pháp sau:
- Phần agaroza chứa các vạch đó được cắt ra và DNA được thu nhận sau khi đã
khuyếch tán từ gel agaroza vào một dung dịch đệm thích hợp.
- Một “giếng nhỏ “được khoét trong agaroza ngay trước vạch DNA. “Giếng “ này
được bơm đầy dung dịch đệm và điện trường được tái lập. DNA di chuyển vào
“giếng” chứa đầy dung dịch đệm và được thu nhận lại.
- Điện di được thực hiện trong một gel agaroza đặc biệt như ( nusieve hay seaplaque)
có điểm nóng chảy thấp (650C ). Khi agarose đã hoàn toàn tan chảy DNA được thu
nhận lại sau nhiều cơng đoạn tách chiết và tủa.
- Nhóm nghiên cứu tại phịng thí nhiệm Cold Spring Harbor do Joseph Samborook
lãnh đạo đã có hai cải tiến quan trọng nhất cho việc dùng điện di DNA làm cho việc
phân tách các đoạn DNA nhanh hơn.
15


- Thứ nhất, họ thay thế gel polyacrylamide bằng gel agaroze - một dạng agar rất tinh

khiết. Cơ chất agaroze tách rất hiệu quả các đoạn DNA có kích thước từ 100-50000
nucleotide. Các đoạn DNA kích thước khác nhau có thể được tách ra bằng cách thêm
nồng độ agaroze. Ở nồng độ thấp ( thấp hơn 0,3%) ta có gel thưa để tách các đoạn
lớn, còn ở nồng độ cao ( 2% ) ta có gel mau – dùng tách các đoạn nhỏ.
- Thứ hai, họ dùng thuốc màu huỳnh quang ethidium bromit để nhuộm các giải DNA
trên gel. Sau khi nhuộm các đoạn được phát hiện trực tiếp bằng tia tử ngoại (UV). Kĩ
thuật này rất nhạy, có thể phát hiện đến 5ng(0,005g) DNA. Bởi vậy, chúng ta dễ hiểu
vì sao ethidium bromit nhanh chóng thay thế cho việc đánh dấu pháng xạ trong phân
tích các đoạn DNA bị cắt.
Hiện nay, phương pháp thường dùng giống như nhóm nghiên cứu ở Cold Spring
Harber đã mơ tả năm 1973.
Dịng điện trên gel, DNA tích điện âm chuyển từ hốc chứa vào gel, di chuyển qua các
lỗ gel để tới cực dương. Phân tử thuốc màu tích điện âm khơng tác động gì với DNA,
nhưng di chuyển một cách độc lập tới cực dương.
Ví dụ: Loại phẩm màu làm dấu thơng thường là bromophenol blue có tốc độ di
chuyển tương đương với đoạn DNA 300 nucleotide. Sự di chuyển trông thấy được
của thuốc màu cho phép ta phỏng đoán sự di chuyển tương ứng của dải DNA không
thấy.
Sau khi điện di, gel được ngâm lắc trong dung dịch loãng ethidium bromit. thuốc
nhuộm khuyếch tán qua gel và tập trung tại nơi có DNA xen vào giữa hai sợi DNA
xoắn kép. Gel đã nhuộm này được xem dưới tia tử ngoại. phức DNA/ethidium
bromit hấp thụ tia tử ngoại ở 300nm, còn lại một ít năng lượng và phát ra dưới dạng
tia sáng thấy được 590nm.dưới tia tử ngoại, các đoạn DNA hiện ra có huỳnh quang
màu cam trên gel. điều này quan trọng nhất để hiểu rằng dải DNA thấy trên gel
không phải là phân tử DNA sợi đơn. Hơn nữa, đây là nơi tập trung của hàng triệu
phân tử DNA có cùng độ dài nucleotide như nhau.
Mặt khác, để ước lượng kích thước các trình tự nucleic acid trong gel, người ta sử
16

dụng một “yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử”. đó là một tập hợp nhiều trình tự
DNA có kích thước đã biết (thang DNA – DNA ladder), thông thường người ta sử
dụng thang DNA là thực khuẩn thể λ được thuỷ giải bởi enzym giới hạn HindIII.
3.4

Ứng dụng kĩ thuật điên di:
a. Điện di thuốc trị liệu
Tác dụng: chữa bệnh vào cơ thể hoặc lấy các ion thuốc có hại ra khỏi cơ thể.
Ví dụ: Muốn lấy một ion có hại (Ca++) ra khỏi cơ thể thì ta đặt điện cực trái dấu vào
vùng da nhiễm ion, điện cực đó sẽ hút các ion này ra khỏi cơ thể về phía nó.
b. Tác dụng của dịng điện một chiều:
-

Tác dụng giãn mạch: Làm tăng cường tuần hoàn và dinh dưỡng, tăng chuyển hoá,
chống viêm.

-

Tác dụng lên hệ thần kinh: Tại cực dương có tác dụng giảm đau, giảm co thắt,
giảm trương lực cơ. Tại cực âm: Có tác dụng kích thích, làm tăng trương lực cơ.
c. Tác dụng của ion thuốc:

-

Không gây tổn thương da, không gây đau, không gây lây truyền các bệnh đường
máu như khi tiêm.

-

Điện di protein

Tác dụng:
Giúp phát hiện nhanh những tính chất nổi bậc của lúa như mùi thơm, protein,
amylose…
Giúp các nhà chọn giống thực hiện công tác chọn lọc, tạo giống lúa thuần, giống
lúa mới một cách nhanh nhất, rẻ tiền và hiệu quả cao.
Chọn ra được dịng Nếp Bè 1-2 có chiều dài hạt dài hơn giống đối chứng, năng

suất cao hơn 15% và hàm lượng protein trên 10%.
Ngồi ra cịn ứng dụng nhiều trong kĩ thuật nhuộm, thuộc da, tạo màu, hoá dầu,
mĩ phẩm, sơn,…

17


CHƯƠNG IV: NGUYÊN LÝ VÀ ỨNG DỤNG CỦA CÁC PHƯƠNG PHÁP
GIẢI TRÌNH TỰ GENE

4.1 Giải trình tự là gì ?
DNA là cơ sở hóa học của gen. Phân tử DNA là một chuỗi xoắn kép của hai mạch
đơn được cấu tạo từ 4 loại nucleotide khác nhau nhờ các base của chúng, đó là: A
(adenine), C (cytosine), G (guanine) và T (thymine). Các nucleotide này nối kết liên tiếp
với nhau theo một thứ tự xác định. Giải trình tự của gen tức là phát hiện được thứ tự sắp
xếp của 4 loại nucleotide này trên phân tử DNA.
4.2 Các phương pháp giải trình tự gene
4.2.1

Phương pháp hóa học giải trình tự DNA

Vào năm 1977, Maxam và Gilbert đã phát minh được một phương pháp hóa
học để có thể giải trình tự một đoạn DNA.

Nguyên tắc của phương pháp này là: (1) Trước hết là phải đánh dấu một đầu
của đoạn DNA cần phải giải trình tự bằng một gốc phospho đồng vị phóng xạ
(32P); (2) Xử lý các đoạn DNA đã đánh dấu này với chất hóa học có thể làm biến
đổi đặc hiệu một hoặc hai loại base của nucleotide trên đoạn DNA. Ví dụ,
dimethylsulphate để biến đổi Guanine bằng các thêm một gốc methyl ở vị trí
nitrogen thứ 7 (N7), hydrazine làm biến đổi Thymine và Cytosine, hydrazine và
NaCl để làm biến đổi Cytosine, acid để làm biến đổi Guanine và Adenine, NaOH
để làm biến đổi Adenine và Cytosine với Adenine ưu tiên hơn Cytosine. Như vậy
trong giai đoạn này, phải dùng ít nhất 4 ống nghiệm và trong mỗi ống nghiệm,
DNA được xử lý với một lượng rất giới hạn của một trong các chất hóa học nêu
trên để mỗi ống nghiệm chỉ có chứa các đoạn DNA mà trên mỗi đoạn DNA này
chỉ có một vị trí nucleotide đặc hiệu với chất hóa học là bị biến đổi; (3) Các
18


nucleotide bị biến đổi này sẽ bị lấy ra khỏi mạch khung đường-phosphate (sugarphosphate backbone) của đoạn DNA và nhờ đó tách ra được các đoạn mạch đơn
có một đầu đánh dấu 32P và một đầu bị mất phân tử base vì phân tử này đã bị lấy
ra khỏi mạch khung (hình 37). (4) Thực hiện điện di mẫu DNA đã xử lý trong 4
ống nghiệm này trên 4 hàng của một gel polyacrylamide biến tính để các mạch
đơn trong mẫu di chuyển trong gel không bị biến đổi trong q trình điện di. Nhờ
đó, sau khi hồn tất điện di, các mạch đơn sẽ bị dừng tại các vị trí khác nhau, tùy
thuộc vào mạch đơn này dài ngắn khác nhau, theo hàng dọc suốt chiều dài của
gel. Áp gel đã điện di này trên một phim nhạy tia X, các vị trí dừng lại của các
mạch đơn trên gel điện di sẽ tạo thành các vạch trên phim vì các vị trí này đều bị
đánh dấu phóng xạ do các mạch đơn đều có một đầu được đánh dấu bằng 32P. Từ
các vạch trên phim xạ ký tự ghi này (autoradiography), có thể đọc được trình tự
của các nucleotide của đoạn DNA.
Phương pháp hóa học xác định trình tự DNA của Maxam và Gilbert trên thực
tế không phải dễ thực hiện vì cần phải xác định khá nhiều thơng số tối ưu cho thí
nghiệm, trong đó khó nhất là phải xác định được nồng độ giới hạn nhất của các

chất hóa học sao cho khi xử lý mẫu DNA thì trên mỗi đoạn DNA chỉ có một base
bị biến đổi để ứng với mỗi vị trí của base bị biến đổi thì sẽ có một mạch đơn có
đầu đánh dấu 32P được tách ra. Chính vì sự phức tạp này, phương pháp Maxam
Gilbert hiện nay ít được sử dụng, mà thay vào đó các nhà khoa học dùng phương
pháp enzyme với nhiều ưu điểm vượt trội hơn.

19


Mạch đơn DNA

32P

A p G p C p T p T p T p G p A p G p G p A p C p G p A..

32P

Các mạch DNA đơn
có đầu bị đánh dấu
32P

32P
32P
32P
32P

Hình 4.1: Các mạch đơn có một đầu đánh dấu với

32

P và một đầu base

Guanine bị lấy khỏi mạch khung do bị biến đổi. Các mạch đơn này
có chiều dài ngắn khác nhau tùy thuộc vào vị trí của Guanidine trên
đoạn DNA.
3’
5’
G C C C AC T T C AG AA G AAAAA G G
C
T+G
G
A>C

Hình 4.2: Hình xạ ký tự ghi trên phim nhạy tia X một gel polyacrylamide sau khi
đã điện di. Các vạch là vị trí các mạch đơn bị dừng lại sau điện di Các vị trí này gần
hay xa khởi điểm là tuỳ kích thước của mạch đơn dài hay ngắn khác nhau. Từ các
vạch này, đọc trình tự của đoạn DNA trong mẫu.

20


4.2.2

Phương pháp enzyme giải trình tự DNA

Phương pháp enzyme được Sanger và các cộng sự phát minh cũng vào năm 1977,
và ngày hôm nay phương pháp này càng ngày càng được hồn thiện và thực hiện dễ
dàng tại các phịng thí nghiệm. Ngun tắc chung của phương pháp này có thể tóm tắt
như sau:

CATACGTGGCCTT
ACG

mồi GGAATGC
CATACGTG CCTTA
G
CG
thêm
d*NTP,
DNA
polymer
ase,
ddATP

GGAAT
GC

thêm
d*NTP,
DNA
polymer
ase,
ddCTP

thêm
d*NTP,
DNA
polymer
ase,
ddGTP

thêm
d*NTP,
DNA
polymer
ase,
ddTTP

CGTAAGG*C*CdA
CGTAAGG*C*C*A*CdG
CGTAAGG*C*C*A*C
CGTAAGG*C*C*A*C*G*
*G*TdA
T*A *TdG
CGTAAGGdC
CGTAAGG*C*C*A*C*
CGTAAGG*Cd
GdT
C
CGTAAGG*C*C*A*C*
CGTAAGG*C*
điện di trênG*T*AdT
C*AdC

gel

CGTAAGG*C*C*A*C*G*
T*A *TdG
CGTAAGG*C*C*A*C*G*
T*AdT

CGTAAGG*C*C*A*C*G*
TdA
CGTAAGG*C*C*A*C*Gd
T
CGTAAGG*C*C*A*CdG
CGTAAGG*C*C*AdC
CGTAAGG*C*CdA
CGTAAGG*CdC
CGTAAGGdC

Chiều điện
di

21


Hình 4.3: Phương pháp Enzyme giải trình tự DNA. Đoạn DNA được chèn vào
một vector tại một vị trí biết rõ trình tự, nhờ đó có thể tổng hợp được các
mạch đơn có một đầu là mồi, một đầu là các nucleotide tận. Trong hình các
nucleotide đánh dấu * là các nucleotide được dánh dấu 35S, nhờ vậy các mạch
đơn được đánh dấu.
Trước hết chèn các đoạn DNA cần phải xác định trình tự vào một vector là phage
hay plasmid tại một vị trí mà trình tự chuỗi của vị trí này đã được xác định rõ.
Chuyển thể tức là đưa các vector mang đoạn chèn DNA này vào tế bào vi khuẩn để
nhân bản các vector này thành nhiều bản sao, sau đó tách chiết và tinh khiết các
vector từ vi khuẩn để thành các vector tự do.
Dùng các đoạn mồi bổ sung một cách đặc hiệu với trình tự của vector tại vị trí
chèn đoạn DNA. Thêm vào ống phản ứng men DNA polymerase và 4 loại nucleotide
tự do (gọi là dNTP: deoxynucleotide triphosphate) và một lượng rất giới hạn các
nucleotide tận (terminator, là ddNTP: dideoxynucleotide triphosphate, cũng như

dNTP, có 4 loại ddNTP tương ứng với 4 base A, T, C và G). Phản ứng được thực hiện
trong 4 ống, và mỗi ống cho một loại ddNTP khác nhau. Bắt đầu từ đoạn mồi, men
DNA polymerase sẽ kéo các dNTP vào để tổng hợp mạch đơn bổ sung với mạch
DNA chèn trên vector, và sự tổng hợp mạch đơn sẽ bị dừng lại tại vị trí mà ddNTP
được kéo vào thay vì dNTP.
Lý do sự tổng hợp bị dừng lại là vì
ddNTP có cấu trúc hóa học bị mất đi gốc
OH tại vị trí carbon thứ 3 của đường
deoxyribose, mà gốc OH tại vị trí này chính
là nơi để dNTP kế tiếp được gắn vào. Nhờ
vậy trong ống phản ứng có các mạch đơn
DNA có các chiều dài khác nhau tương ứng

22

ACGT

T 3’ C
GCAGTCCTAGCTTAGCG
G 5’


với các vị trí trình tự các nucleotide trên
đoạn DNA gốc (hình 4.3).

Hình 4.4: Hình xạ ký tự ghi một kết quả giải trình tự DNA trên gel
polyacrylamide. Từ kết quả này, đọc được trình tự DNA

Để giải trình tự, người ta dùng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide biến
tính. Với phương pháp đánh dấu mồi hay các dNTP bằng đồng vị phóng xạ 32P hay

35

S thì sau khi điện di, cũng giống như phương pháp của Maxam và Gilbert, người ta

phát hiện các vạch điện di bằng kỹ thuật xạ ký tự ghi, và từ các vạch này giải được
trình tự của đoạn DNA (hình 4.4).
4.2.3

Giải trình tự bằng máy tự động (automated sequencer)

Các phịng thí nghiệm hiện nay đều dùng phản ứng giải trình tự bằng phương
pháp enzyme, nhưng khi làm giải trình tự thì thường dùng các máy tự động chứ
không dùng kỹ thuật xạ ký tự ghi như trước đây. Để thực hiện được giải trình tự
bằng máy tự động thì các mạch DNA đơn sản sinh trong ống phản ứng giải trình
tự phải được đánh dấu huỳnh quang để các vạch điện di của các mạch đơn này
phát sáng khi đi qua một chùm tia sáng laser. Cấu tạo của một máy tự động giải
trình tự gồm hai phần chính yếu, đó là: phần điện di với gel polyacrylamide và
phần phát hiện các vạch điện di. Phần điện

23