BÀI TẬP NHÓM MÔN CÔNG NGHỆ ENZYME

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
------

BÀI BÁO CÁO NHĨM 17
MƠN CƠNG NGHỆ ENZYME
GVHD:Ts.Nguyễn Minh Xn Hồng
Thành viên nhóm:
1. Nguyễn Thị Chúc An
2. Phạm Thị Thúy Dung
3. Cao Thị Diễm Mi
4. Lê Thị Thu Sương
5. Nguyễn Thị Thanh
6. Trần Phương Thảo
7. Ngô Diễm Thoa
8. Trương Trần Tiến

MỤC LỤC

16125090
16125004
16125309
16125426
16125444
16125456
16125462
16125502


Bài 1: KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA YẾU TỐ NGOẠI CẢNH ĐẾN HOẠT
TÍNH CỦA ENZYME.............................................................................................1

1. Tính đặc hiệu của Enzyme..................................................................................1
2. Ảnh hưởng của hiệt độ đến hoạt tính của enzyme..............................................2
3. Ảnh hưởng của PH đến hoạt tính của enzyme....................................................4
4. Khảo sát ảnh hưởng của chất hoạt hóa và ức chế đến hoạt tính enzyme:.............6
BÀI 2: ENZYME AMYLASE................................................................................9
1. Xác định hoạt lực Enzyme Amylase bằng phương pháp Heinkel.......................9
BÀI 3: ENZYME PROTEASE.............................................................................10
Xác định hoạt tính pepsin thơ bằng phương pháp Anson cải tiến...........................10
BÀI 4: ENZYME PECTINASE...........................................................................13
1.Phương pháp so màu............................................................................................13
2. Ứng dụng pectinase làm trong nước ép trái cây.................................................14


Thực tập mơn Cơng nghệ Enzyme Nhóm 17

Bài 1: KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA YẾU TỐ
NGOẠI CẢNH ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA ENZYME
1. Tính đặc hiệu của Enzyme
 Nguyên tắc:
Tính đặc hiệu của enzyme thể hiện ở điểm mỗi enzyme chỉ tác
dụng lên một cơ chất nhất định. Chẳng hạn amylase chỉ thủy phân
polysaccharide mà không tác dụng lên disaccharide.
Saccharose không cho phản ứng với Fehling vì trong phân tử có
nhóm cetose hoặc aldehid tự do. Phản ứng này chỉ dương tính khi saccharose đã
được thủy phân thành glucose và fructose.
 Cách tiến hành
- Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 0.5ml dung dịch amylase. Thêm
1ml dung dịch tinh bột 1% vào ống thứ nhất và 1ml dung dịch
saccharose 1% vào ống thứ hai. Đặt hai ống trong bình ổn nhiệt
10-20 phút.

- Trộn 1ml dung dịch Fehling A và 1ml dung dịch Fehling B với
nhau, rồi cho vào mỗi ống nghiệm 1ml dung dịch Fehling vừa
trộn đem đi đun 5 phút rồi nhận xét kết quả.

3


Thực tập mơn Cơng nghệ Enzyme Nhóm 17

Hình 1.1

2.

 Kết quả:
Ống nghiệm có tinh bột chuyển thành màu đỏ gạch, ống nghiệm cịn
lại khơng có hiện tượng gì.
 Nhận xét và giải thích:
Kết quả thí nghiệm cho thấy tính đặc hiệu của enzyme amylase chỉ
thủy phân tinh bột thành glucose và phản ứng với Fehling tạo màu
đỏ gạch mà không tủy phân disaccharide saccharose.
Ảnh hưởng của hiệt độ đến hoạt tính của enzyme.
 Nguyên tắc: Vận tốc của phản ứng enzyme thường tăng khoảng hai
lần khi nhiệt độ tăng khoảng 10°C. Ở nhiệt độ thấp, ví dụ khoảng
0°C, vận tốc xúc tác của men rất thấp, coi như không đáng kể, nhưng
ở nhiệt độ này, enzyme được bảo quản tốt. Ở 40-50°C, các enzyme
hoạt động mạnh nhất, cao hơn 50°, enzyme bắt đầu biến tính, vận
tốc xúc tác giảm dần. Đến 60-80°C, enzyme mất khả năng hoạt
động. Ở 100°C, enzyme bắt đầu mất tác dụng.
 Cách tiến hành:

Lấy 2 ống nghiệm cho vào:
 Ống 1: 1ml dung dịch hồ tinh bột 1%.
4


Thực tập mơn Cơng nghệ Enzyme Nhóm 17

 Ống 2: 0,5 ml dung dịch amylase đã pha loãng và 0,5 ml dung dịch đệm pH
7.
Đặt cả 2 ống vào bình ổn nhiệt ở 30°C trong vòng 5 phút. Tương tự làm với 60°C
và 90°C. Sau đó trộn 2 ống vào nhau và tiến hành khảo sát hoạt tính của enzyme
dưới ảnh hưởng của nhiệt độ bằng cách xác định thời gian thủy giải của amylase.
Phương pháp xác định thời gian thủy giải của amylase: Cứ sau mỗi 1 phút, nhỏ 1
giọt dung dịch lugol ( hoặc iod) lên mặt kiếng, sau đó nhỏ vị đó 1 giọt hổn hợp
dung dịch. Khi nào không thấy màu xanh xuất hiện nữa là lúc tinh bột đã bị thủy
phân hoàn toàn bởi amylase
 Kết quả:
 Ống 30°C: Thời gian không xuất hiện màu xanh là 4 phút.
 Ống 60°C: Thời gian không xuất hiện màu xanh là 6 phút.
 Ống 90°C: không mất màu xanh.
 Đồ thị:

10

9

9
8
7

6

6
5
4

4

3
2
1
0

30

60

90

 Nhận xét và giải thích:
 Nhận xét: Với ống 30°C thời gian thủy phân tinh bột bởi
amylase là nhanh nhất, ống 60°C là chậm hơn, còn ống 90°C
amylase không thể thủy phân tinh bột.
5


Thực tập mơn Cơng nghệ Enzyme Nhóm 17

 Giải thích: Vì nhiệt độ ảnh hưởng đến vận tốc và khả năng
xúc tác của enzyme. Ở 30°C nhiệt độ này enzyme có vận tốc

xúc tác tương đối cao vì vậy nên có thể nhanh chóng thủy
phân hết tinh bột trong 4 phút, Ở nhiệt độ 60°C enzyme bắt
đầu biến tính và biến tính vì vậy vận tốc xúc tác chậm lại, và
ở 90°C thì với nhiệt độ này enzyme bị biến tính hồn tồn và
khơng thể thủy phân tinh bột được vì vậy màu xanh sẽ khơng
thể khơng biến mất.

3. Ảnh hưởng của PH đến hoạt tính của enzyme
 Nguyên tắc :
-Hoạt tính của enzyme thể hiện trong vùng PH tương đối hẹp là PH tối ưu.
PH tối ưu của một số enzyme như pepsin là 1.2-2.5; catalase 7.0 ; trysin 8.09.0; ….
-Mức độ ion hóa của các enzyme phụ thuộc vào mơi trường . Enzyme có thể
có hoạt tính cao khi ở dạng tích điện dương hay tích điện âm hoặc ở trạng
thái đẳng điện.
 Cách tiến hành:
 Lấy 3 ống nghiệm , cho vào :
- Ống 1 : 1 ml dung dịch hồ tinh bột 1% và 1 ml dung dịch đệm PH
4
- Ống 2 : 1 ml dung dịch hồ tinh bột 1% và 1 ml dung dịch đệm PH
6
- Ống 3: 1 ml dung dịch hồ tinh bột 1% và 1 ml dung dịch đệm PH
8
 Pha loãng enzyme amylase 10 lần : hút 1 ml enzyme amylase sau đó
cho vào 9 ml nước
 Cho enzyme amylase vào : hút 1ml dung dịch enzyme đã pha loãng ở
trên cho vào 3 ống nghiệm trên( làm với từng ống 1 vì thời gian mất
màu khá nhanh)
 Tiến hành khảo sát hoạt tính của enzyme dưới ảnh hưởng của PH
bằng cách xác định thời gian thủy giải của amylase:
- Cứ sau vài giây nhỏ 1 giọt lugol (hoặc iod) lên mặt kiếng ,sau đó

nhỏ vào đó 1 giọt hỗn hợp dung dịch.( có màu xanh đậm)

6


Thực tập mơn Cơng nghệ Enzyme Nhóm 17

- Làm đến khi nào không thấy màu xanh xuất hiện nữa là lúc tinh
bột đã bị thủy phân hoàn toàn bởi amylase .
- Ghi nhận lại thời gian thủy giải( tính từ lúc cho enzyme vào )

Hình
1.3
 Kết quả khảo
sát:
- Với ống có PH=4 thời gian thủy giải là 2 phút 45s
- Với ống có PH=6 thời gian thủy giải là 36s
- Với ống có PH=8 thời gian thủy giải là 2 phút 10s
 Biểu đồ:

7


Thực tập mơn Cơng nghệ Enzyme Nhóm 17

 Nhận xét và gải thích :
-Nhận xét: với ống có PH =6 có thời gian thủy giải nhanh nhất , cịn với
PH=4 và PH=8 có thời gian thủy giải chậm hơn
-Giải thích: Tùy thuộc vào nguồn gốc thì enzyme amylase sẽ có các PH
tối ưu khác nhau, nhưng dựa vào kết quả thí nghiệm thì ta có PH tối ưu của

enzyme amylase dùng làm thí nghiệm là 6( vì thời gian enzyme thủy giải
tinh bột nhanh nhất), với độ PH này rất thích hợp cho enzyme hoạt động
thủy giải tinh bột,chỉ mất khoảng có 36s để thủy giải cùng một lượng tinh
bột trong ống nghiệm . Còn đối với PH=4 và PH=8 không phải là độ PH tối
ưu của amylase và ở độ PH này có thể ức chế hoạt tính của enzyme nên là
khả năng thủy giải tinh bột của enzyme giảm nên thời gian mất màu
xanh( màu xanh do tinh bột phản ứng với iod) lâu hơn(với ống có PH=4 thời
gian thủy giải là 2 phút 45s ;với ống có PH=8 thời gian thủy giải là 2 phút
10s ).

4. Khảo sát ảnh hưởng của chất hoạt hóa và ức chế đến hoạt tính
enzyme:
 Nguyên tắc:
Amylase của nước bọt (α – amylase) sẽ tăng hoạt động của mơi trường có NaCl
ngược lại CuSO4 sẽ ức chế tác dụng của enzyme này.
Trong 3 ống nghiệm có chứa α – amylase và tinh bột.
Cho NaCl vào ống 1, CuSO4 vào ống 2, nước vào ống 3. Sau cùn một thời gian tác
dụng ta thấy:
ống 1: tinh bột được thủy giải hoàn toàn.
ống 2: khơng có sự thủy phân tinh bột.
ống 3: tinh bột chỉ được thủy giải đến dextrin.
 Các tiến hành:
Chuẩn bị 3 ống nghiệm:

8


Thực tập mơn Cơng nghệ Enzyme Nhóm 17

- ống 1: 0,5 ml dd amylase đá pha loãng và 0,5 ml NaCl 1%

- ống 2: 0,5 ml dd amylase pha loãng và 0,5 ml CuSO4 1%
- ống 3: 0,5 ml dd amylase pha lỗng và 0,5 ml nước cất.
Sau đó, cho vào mỗi ống 1ml đ hồ tinh bột 1%. Để 3 ống vào nhiệt độ phòng
( khoảng 25oC) tronbg từ 3-5 phút.
Tiếp theo nhỏ 1 giọt Iod lần lượt vào 3 ống nghiệm 1, 2, 3. Rồi lắc nhẹ cho phản
ứng xảy xa.

-

Kết quả:
ống 1 có màu vàng nâu.
ống 2 có màu xanh rêu đậm.
ống 3 có màu vàng nâu.

Hình 1.4
Giải thích kết quả:
- ống 1: Vì có Cl- là tác nhân hoạt hóa cho amylase nên tinh bột sẽ được thủy
phân hồn tồn. Khi chi iod vào thì khơng có tinh bột để bắt màu nên dd thu
được có màu của thuốc thử iod.
- ống 2: Vì có Cu2+ ức chế hoạt động của amylase nên tinh bột không bị thủy
phân. Do vậy khi cho thuốc thử iod vào thì có màu tím do kết hợp với màu
xanh lam của dd CuSO4 nên cho màu xanh rêu đậm.
9


Thực tập mơn Cơng nghệ Enzyme Nhóm 17

- ống 2: Do có nước cất nên nồng độ enzyme amylase bị lỗng đi. Do đó hiệu
suất thủy phân tinh bột chỉ đến các phân tử dextrin, không bắt màu với iod
nên khi cho iod vào dd thu được có màu của thuốc thử iod.

BÀI 2: ENZYME AMYLASE
1. Xác định hoạt lực Enzyme Amylase bằng phương pháp
Heinkel


Nguyên tắc:

Xác định lượng tinh bột bị phân hủy dựa trên cơ sở xác định mức độ giảm
cường độ màu hỗn hợp phản ứng với dung dịch iot.
Đơn vị hoạt động Enzyme là lượng Enzyme có khả năng phân giải 1 mg tinh
bột sau 30 phút ở 300C.
 Cách tiến hành:
- Lấy hai ống nghiệm ghi chú lên ống thứ nhất là ống enzyme; ống thứ hai là
ống đối chứng.
- Chuẩn bị dung dịch NaCl 0,1% : ta cân 0,1g muối NaCl cho vào 10ml nước
cất, khuấy đều ta được dung dịch NaCl 0,1%.
- Dùng pipette 1ml hút lần lượt 1ml dung dịch tinh bôt cho vào mỗi ống
nghiệm. sau đó lại cho vào mỗi ống nghiệm 1 ml dung dịch NaCl 0,1% và
2ml dung dịch đệm phosphate 0,05M, pH= 6, lắc đều. Sau đó để ở nhiệt độ
phịng trong 20 phút.
- Sau đó, cho vào ống Enzyme 1 ml dung dịch Enzyme ở nhiệt độ phòng; ống
đối chứng 1ml nước cất, lắc đều, tiếp tục để ở nhiệt độ phịng 30 phút.
- Sau đó cho vào mỗi ống 5ml dung dịch acid sulfosalisilic 20% để ngừng
phản ứng. Rồi cho vào mỗi ống 9ml dung dịch iod pha lỗng 150 lần.
- Sau đó đem đi đo màu ở bước sóng 560nm.
10


Thực tập mơn Cơng nghệ Enzyme Nhóm 17

 Số liệu lập đồ thị chuẩn:
Ống
Số mg tinh bột
OD560nm

1’
0
0,064

2’
0,2
0,275

3’
0,4
0,491

4’
0,6
0,751

5’
0,8
0,987

6’
1
1,262

OD560nm
1.4
1.2

f(x) = 1.2x + 0.04
R² = 1

OD560nm

1
0.8

OD560nm
Linear (OD560nm)

0.6
0.4
0.2
0

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

số mg tinh bột

 Số liệu thu được :
- Ống Enzyme: OD560nm= 0,098
- Ống đối chứng: OD560nm= 0,77
 Gọi A1 là kết quả của ống Enzyme:
A2 là kết quả của ống đối chứng:
 Tra lên biểu đồ ta được X= 0,556 mg tinh bột
Số tinh bột được phân giải là X = 0,556mg tinh bột*150=83,4 mg tinh bột
 Vậy số tinh bột bị phân giải trong thí nghiệm trên là 83,4 mg

BÀI 3: ENZYME PROTEASE
Xác định hoạt tính pepsin thơ bằng phương pháp Anson cải tiến.
 Ngun tắc:
Casein được pepsin phân giải trong môi trường acid tạo các đoạn
peptit ngắn không tủa bởi T.C.A (trichloro acetic acid) trong đó lượng
11


Thực tập mơn Cơng nghệ Enzyme Nhóm 17

tyrosin, trytophan được xác định bởi phản ứng màu với thuốc thử
folin. Đo mmật độ quang của dung dịch này suy ra nồng độ sản phẩm
và tính hoạt tính protein
 Q trình thực hiện:
 Chuẩn bị 3 ống nghiệm và cho vào mỗi ống 1ml dung dịch sau:

 Ống A1: Enzyme pepsin dạ dày heo
 Ống A2: Enzyme thương mại (protease đã pha loãng 100 lần)
 Ống B (đối chứng): H2O
 Cho vào mỗi ống 5ml dung dịch casein 2% rồi để ở nhiệt độ phịng trong
vịng 10 phút
 Sau đó cho 10ml TCA 5%. Để yên các ống 30 phút rồi đem lọc
 Lấy 1ml dịch lọc thêm 2ml NaOH 0,5N và 0,6ml thuốc thử Folin
 Sau 15 phút đo OD ở bước sóng 660nm (pha lỗng dung dịch 10 lần để đo).
Hình 3.1
 Xây dựng đường chuẩn tyrosin ngun chất:

Ống

1

2

3

4

5

6

µ mol tyrosin

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

OD660nm

0.021

0.312

0.497

0.687

0.83

1.019

12


Thực tập mơn Cơng nghệ Enzyme Nhóm 17

đường chuẩn t yros in
1.2

1

f(x) = 0 .96 x + 0 .0 8
R² = 0 .99

od 660nm

0.8
0.6
0.4
0.2
0

0

0 .2

0 .4

0 .6

0 .8

1

1.2

µmol tyrosin

 Kết quả:

 Ồng A1: 1,52
 Ống A2: 1,65*100=165
 Ống B: 0,178
 Tính kết quả:
 Hiệu số giá trị OD mẫu thí nghiệm và mẫu kiểm tra:
 OD1 = ODA1 - ODB = 1,52 – 0,178 = 1,342
 OD2 = ODA2 - ODB = 165 – 0,178 = 164,822
 OD = = 163,48
 Từ OD dựa theo đồ thị chuẩn tính lượng mol tyrosin tương ứng:
163,48 = 0,962*X + 0,08 => X cần tìm là 169,854
 Hoạt tính protease của pepsin biểu thị bằng số đơn vị
Protease/1g chế phẩm theo công thức:
 Hoạt độ protease/1ml enzyme = = = 271,77
13


Thực tập mơn Cơng nghệ Enzyme Nhóm 17

V: thể tích toàn bộ hỗn hợp (cơ chất + enzyme + TCA = 5+1+10=16 ml).
t: thời gian thủy giải 10 phút.

Hình 3

BÀI 4: ENZYME PECTINASE
1.Phương pháp so màu
 Nguyên tắc:
Là phương pháp dựa trên việc so sánh cường độ màu của dung dịch nghiên
cứu với cường độ màu của dung dịch tiêu chuẩn có nồng độ xác định. Dùng
phương pháp so màu chủ yếu để xác định lượng nhỏ các chất phân tích. Phương
pháp này mất ít thời gian so với các phương pháp hóa học khác. Nguyên tắc của

phương pháp này là xác định lượng acicd galacturonic được tạo ra bởi q trình
thủy phân bằng pectinase. Cơ chất pectin khơng kết tủa bởi ZnSO4.
14


Thực tập mơn Cơng nghệ Enzyme Nhóm 17

 Định nghĩa đơn vị hoạt tính:
Một đơn vị hoạt tính pectinase là lượng Enzyme trong điều kiện tiêu chuẩn
( ở nhiệt độ 30°C pH 3,9-4,1, thời gian phản ứng là 60 phút với nồng độ pectin
trong môi trường phản ứng là 0,66%, mức độ thủy phân pectin là 30%) có khả
năng xúc tác, làm biến đổi 1g pectin sau 60 phút thành acid galacturonic.
 .Hóa chất:
- Dung dịch petin 1%
- Dung dịch ZnSO4 15%
- Dung dịch Enzyme 1%
- Dung dịch Antrone 0,2% (C6H4COH4CH2) trong acid sulfuric đậm đặc
 Tiến hành:
Cho 20ml dung dịch pectin 10% vào ống nghiệm rồi tiếp theo cho 10ml dung
dịch Enzym 1%, lắc đều cho vào tủ ấm ở nhiệt độ 30°C (dung dịch pectin có PH =
3,9-4,1).
Sau 60 phút lấy ra thêm 2ml ZnSO 4 15%, đem lọc qua giấy lọc, dung dịch lọc
được đem pha loãng 5 lần dùng cho phản ứng với Anthrone.
Lấy 5ml Anthrone cho vào ống nghiệm, rồi cho 2,5ml dung dịch lọc đã pha
loãng, lắc mạnh trong thời gian 10 phút. Sau đó đặt trong nồi thủy ở nhiệt độ 70°C
trong thời gian 12 phút rồi lấy ra là nguội đến nhiệt độ phòng và tiến hành đo giá
trị OD ở bước sóng X = 584 nm.
 Tính hoạt độ
Giá trị OD ở bước sóng X=584 là 0,363 (đã pha lỗng dung dịch 100 lần)
Hoạt tính pectinase = 0,34OD  0,0104/m = 0,34.0,3630,0104/10 =0,011302

 OD = ODTN  ODĐC = 0,363 0,3= 0,063
ODTN: Giá trị OD của thí nghệm
OD ĐC: Giá trị OD của đối chứng
15


Thực tập mơn Cơng nghệ Enzyme Nhóm 17

2. Ứng dụng pectinase làm trong nước ép trái cây
 Hóa chất
- Nước ép táo
- Dung dịch pectinase 1%
 Các bước tiến hành
- Cân 30g táo, ép lấy dịch quả, pha loãng thành 100ml nước cất
- Hút 8ml dung dịch trên cho vào mỗi ống nghiệm của 5 ống nghiệm khác nhau.
- Thêm dung dịch pectinase 1% vào từng ống nghiệm với thể tích tuần tự trong các
ống là 0; 0,4; 0,8; 1,2; 1,6ml.
- Sau đó thêm nước cất vào sao cho mỗi ống có đủ 10ml.
- Để tất cả các ống nghiệm ở 45-50 độ C trong 30 phút.
- Sau đó lấy 5ml dung dịch bên trên mỗi ống đem độ truyền suốt ở bước sóng
584nm.
 Kết quả
Ống nghiệm
0 ml
31,5

Ống nghiệm
0,4ml
27,5

Ống nghiệm
0,8ml
28,8

16

Ống nghiệm
1,2 ml
34,6

Ống nghiệm
1,6ml
20,9


Thực tập mơn Cơng nghệ Enzyme Nhóm 17

Hình 4.2

- Đường biểu diễn độ truyền suốt của dung dịch nước ép táo

Biêu diên đô truyên suốt cua dung dich
40
35
30
25
20
Biêu diên đ ô truyên suôt cua
dung dịch

15
10
5
0

 Nhận xét và giải thích:

17


Thực tập mơn Cơng nghệ Enzyme Nhóm 17

 Nhận xét: Dịch quả trong ống nghiệm 1,2ml có độ trong cao nhất, dịch quả
trong ống nghiệm 1,6ml có độ trong thấp nhất.
 Giải thích: Enzyme pectinase sẽ thủy phân pectin, làm giảm độ nhớt, giúp
dịch quả thoát ra dễ dàng, nâng cao hiệu suất ép và làm trong dịch quả. Vì
vậy, dịch quả có độ truyền suốt càng lớn thì dịch quả càng trong, tức là có
nhiều enzyme pectinase làm trong dịch quả.

18