Khảo sát khả năng đối kháng nấm phytophthora của vi khuẩn bacillus phân lập từ đất vườn

ỦY BAN NHÂN DÂN TỈNH BÌNH DƯƠNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT

KHOA TÀI NGUYÊN MỘI TRƯỜNG

BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN
NĂM HỌC 2015-2016

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG NẤM
PHYTOPHTHORA CỦA VI KHUẨN BACILLUS
PHÂN LẬP TỪ ĐẤT VƯỜN

TÊN SINH VIÊN: NGUYỄN THỊ HÒNG

NGƯỜI HƯỚNG DẪN: THS NGUYỄN ANH DŨNG


Bình Dương, tháng 3 năm 2016


UBND TỈNH BÌNH DƯƠNG
CỘNG HỊA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA
VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI
1. Thông tin chung
- Tên đề tài: : Khảo sát khả năng đối kháng nấm Phytophthora của vi khuẩn

Bacillus phân lập từ đất vườn
- Sinh viên thực hiện:
Nguyễn Thị Hồng
Đỗ Thị Cẩm Tuyên
- Lớp: C14SH02
- Khoa: Tài nguyên Môi trường
- Chuyên ngành đào tạo: Sư phạm Sinh học
- Năm thứ: 2
- Số năm đào tạo: 3
- Người hướng dẫn: ThS. Nguyễn Anh Dũng.
2. Mục tiêu đề tài
Tìm ra những chủng vi khuẩn Bacillus có khả năng đối kháng mạnh với
nấm Phytophthora.
3. Tính mới và sáng tạo
Sử dụng chất kháng sinh từ vi khuẩn Bacillus không gây ảnh hưởng tiêu cực
đến sức khỏe con người, vật nuôi, cây trồng như thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc
hóa học, có khả năng kháng lại nấm Phytophthora trên cây trồng.
4. Kết quả nghiên cứu
Qua quá trình phân lập từ đất vườn, làm thuần đã thu được 11 chủng Bacillus và
chọn được 1 chủng nấm.
Với thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng nấm Phytophthora của vi khuẩn
Bacillus. Chúng tôi đã tiến hành khảo sát 8 chủng Bacillus với 1 chủng nấm đã chọn,


trong đó có 3 chủng đối kháng mạnh nhất là
- B1 AD = 9,75mm
- B3 AD = 10,75mm
- B5 AD = 11,75mm
5. Đóng góp về mặt kinh tế - xã hội, giáo dục và đào tạo, an ninh, quốc phòng
và khả năng áp dụng của đề tài.

Tìm ra những chủng vi khuẩn có khả năng kháng nấm phytophthora , cũng như
làm nguồn nguyên liệu sản xuất chế phẩm sinh học kháng lại nấm bệnh, góp phần hạn
chế ơ nhiễm mơi trường.
6. Công bố khoa học của sinh viên từ kết quả nghiên cứu của đề tài (ghi rõ họ
tên tác giả, nhan đề và các yếu tố về xuất bản nếu có) hoặc nhận xét, đánh giá của cơ
sở đã áp dụng các kết quả nghiên cứu (nếu có).
Ngày....tháng.....năm 2016
Sinh viên chịu trách nhiệm chính
thực hiện đề tài
(ký, họ và tên)

Nguyễn Thị
Hồng
Nhận xét của người hướng dẫn về những đóng góp khoa học của sinh viên thực
1_ •

Ạ
_ -> Ạ J Ạ •

hiện đề tài
Nhóm nghiên cứu đã thực hiên đề tài trên tinh thần trách nhiệm cao, có sự nổ lực, nhiệt
tình tìm tịi học hỏi, chủ động và thường xuyên liên lạc trao đổi với


GVHD để thực hiện đề tài đúng tiến độ.
Kết quả đề tài chủ yếu dựa vào vùng đất lấy nên chưa đưa ra được những chủng vi khuẩn có
tinh kháng nấm cao hơn. Tuy nhiên, đây là cách để sinh viên tiếp cận với thực tế và phù hợp
với trình độ sinh viên hiện tại.
Ngày tháng năm 2015
Xác nhận của lãnh đạo khoa Người hướng dẫn

(Ký,họ và tên)

(Ký,họ và tên)


UBND TỈNH BÌNH DƯƠNG

CỘNG HỊA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc
Địa chỉ liên hệ: phường Phú Hòa, Thành phố Thủ Dầu Một, Tỉnh Bình Dương.

TIN0962746576
VỀ SINH VIÊN
- THƠNG
Điện thoại:
CHỊU
TRÁCH
NHIỆM CHÍNH
Email:

2. Q
TRÌNH
HỌCĐỀ
TẬP
THỰC
HIỆN
TÀI
• Năm thứ nhất

Ngày.....tháng.....năm 2016
Sinh viên chịu trách nhiệm chính

- Ngành học: Sư phạm Sinh học
thực hiện đề tài
1. SƠ
SINH
- LƯỢC
Khoa: VỀ
Khoa
học VIÊN
Tự nhiên
- Họ
tên:quả
Nguyễn
Thịhọc
Hồng
- vàKết
xếp loại
tập: Trung bình khá
(ký, họ và tên)
- Ngày, tháng, năm sinh: 18/05/1995
Ngày...tháng.......năm 2016
- nhận
Nơicủa
sinh:lãnh
Bình
Thuận
Xác

đạo
Khoa
- (ký,
Lớp:họC14SH02
và tên)
- Chuyên ngành đào tạo: Sư phạm Sinh học
- Khóa học: 2014 - 2017
- Khoa: Tài nguyên Môi trường
Nguyễn Thị Hồng


THUYẾT MINH ĐỀ TÀI
NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN
Năm học 2015 - 2016
1. Tên đề tài: Khảo sát khả năng đối kháng nấm Phytophthora của vi khuẩn
Bacillus phân lập từ đất vườn
2. Mã số: (do cán bộ quản lý ghi)
3. Loại hình nghiên cứu: • Cơ bản 0 Ứng dụng • Triển khai
4. Lĩnh vực nghiên cứu:
• Khoa học Xã hội và Nhân văn

• Khoa học Kỹ thuật và Cơng nghệ

• Kinh tế

0 Khoa học Tự nhiên

• Khoa học Giáo dục

5. Thời gian thực hiện: 6 tháng

Từ tháng 9 năm 2015 đến tháng 3 năm 2016
6. Đơn vị quản lý về chuyên môn:
Khoa:
Tài Nguyên Môi Trường
Bộ môn: Sinh học Ứng Dụng
7. Giáo viên hướng dẫn:
Họ và tên:
Nguyễn Anh Dũng
Học vị:
Thạc sĩ
Đơn vị cơng tác (Khoa, Phịng): Khoa Tài Ngun Mơi Trường
Địa chỉ nhà riêng:
Điện thoại nhà riêng:
Di động:

090 786 03 88

8. Nhóm sinh viên thực hiện đề tài:
Sinh viên chịu trách nhiệm chính: Nguyễn Thị Hồng
kennyhong1801@,gmail.com
SĐT: 0962 746 576

E-mail:
Email:


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................................3
1.1.

Vi khuẩn Bacillus...........................................................................................3
1.1.1.
Đặc điểm sinh học của vi khuẩn Bacillus.....................................................3
1.1.2.
Khả năng đối kháng của vi khuẩn Bacillus...................................................5
1.2.
Nấm Phytophthora..........................................................................................6
1.2.1.
Vị trí phân loại..............................................................................................6
1.3.
Tình hình bệnh hại trên cây trồng................................................................8
1.4.
Tình hình nghiên cứu và sử dụng vi khuẩn Bacillus trong công tác bảo vệ
cây trồng......................................................................................................................12
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP...........................................................15
2.1. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu................................................................15
2.1.1.
Vật liệu nghiên cứu........................................................................................15
2.1.2.
Hóa chất và thiết bị........................................................................................15
2.1.3.
Thiết bị và dụng cụ........................................................................................15
2.1.4.
Môi trường nghiên cứu..................................................................................15
2.2. Phương pháp nghiên cứu:.................................................................................17
2.2.1.
Lấy mẫu ........................................................................................................17
2.2.2.
Phương pháp phân lập....................................................................................18
2.2.3.

Phương pháp khảo sát khả năng đối kháng của vi khuẩn Bacillus với nấm
Phytophthora ................................................................................................................19
2.2.4.
Phương pháp xử lý số liêu.............................................................................19
2.2.5.
Phương pháp nhuộm Gram............................................................................19
2.2.6.
Thử nghiệm Catalase.....................................................................................21
2.2.7.
Phương pháp giữ giống cấy chuyền...............................................................21
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................................22
3.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus...................................................................................22
3.2. Phân lập nấm.....................................................................................................24
3.3. Khảo sát khả năng đối kháng nấm của vi khuẩn Bacillus..............................25
CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.................................................................28
4.1. Kết luận............................................................................................................... 28
4.2. Kiến nghị............................................................................................................. 28
TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................29
PHỤ LỤC.................................................................................................................. 32


MỞ ĐẦU
Lí do chọn đề tài.
Nấm phytophthora được xem là một trong những tác nhân nguy hiểm hàng đầu cho
nền nông nghiệp nước ta gây ra các bệnh làm giảm năng suất cây trồng thậm chí có thể
gây chết cây như các bệnh: bệnh tiêu sầu (bệnh chết nhanh) trên cây tiêu; bệnh thối rễ,
thối thân, thối quả, xì mủ trên cây sầu riêng; loét sọc miệng cạo trên cây cao su
[17].v.v... Để phòng trừ tác hại do nấm Phytophthora gây ra thì nhiều loại thuốc trừ
nấm có nguồn gốc hóa học đã được sử dụng[19][20].
Tuy nhiên viêc sử dụng mơt cách bừa bãi các loại thuốc hóa học đã dẫn đến tình

trạng đề kháng thuốc của nấm bênh mà cịn gây ơ nhiễm mơi trường cũng như sức khỏe
con người.
Vi khuẩn Bacillus với khả năng cạnh tranh dinh dưỡng mạnh, tiết các loại enzyme,
và đăc biêt là khả năng sinh kháng sinh mạnh được xem là môt trong những nhân tố
sinh học hữu liiêu có thể dùng để khống chế nấm Phytophthora [8][15][16].
Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi thực hiên đề tài “Khảo sát khả năng đối kháng
nấm Phytophthora của vi khuẩn Bacillus phân lâp từ đất vườn.” với mục đích tuyển
chọn mơt số chủng vi khuẩn Bacillus với khả năng đối kháng mạnh, có thể dùng làm
chế phẩm khống chế nấm Phytophthora, từ đó đóng góp môt phần trong viêc giảm
thiểu ô nhiễm môi trường và xây dựng nền nơng nghiêp sạch và an tồn hơn.
Mục tiêu nghiên cứu
Tìm ra những chủng vi khuẩn Bacillus có khả năng đối kháng mạnh với nấm
Phytophthora.
Đối tượng nghiên cứu.
- Nấm Phytophthora phân lập từ các mẫu bệnh phẩm ở thực vật thu nhân ở Bình
Dương.
- Vi khuẩn Bacillus phân lập từ đất vườn.
Phạm vi nghiên cứu.
- Khảo sát khả năng đối kháng của vi khuẩn Bacillus với nấm Phytophthora trên
thạch đĩa trong phịng thí nghiệm.
1


1.1.

Vi khuẩn Bacillus CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.1. Đặc điểm sinh học của vi khuẩn Bacillus
Đặc điểm phân loại
Theo khóa phân loại của Bergey, chi Bacillus la một chi lớn và đa dạng, được phân

loại như sau:
- Giới Bacteria
- Ngành Firmicutes
- Lớp Bacilli
- Bộ Bacillales
- Họ Bacillaceae
- Chi Bacillus
Vi khuẩn Bacillus được Ehrenberg mô tả lần đầu tiên năm 1835 là Vibrio subtilis.
Năm 1872, Vibrio subtilis được Cohn dặt lại tên là Bacillus subtilis ( Gordon, 1981).
Họ Bacillaceae được chia làm 5 chi gồm: Bacillus, sporolactobacillus, Clostridium,
Sporosarcina, Desulfortomaculum, đặc trưng cho họ này là sinh nội bào tử [9],[12],[13].
Đặc điểm hình thái
Các vi khuẩn Bacillus là nhóm trực khuẩn sinh bào tử sống hiếu khí tùy tiện nhưng
trong điều kiện hiếu khí thì hoạt động mạch hơn.chúng rất phổ biến trong tự nhiên. Một số
lồi của giống này cịn thấy trong khoang miệng, trong đường ruột của người và động vật.
Tất cả các lồi Bacillus đều có khả năng phân giải hợp chất hữu cơ chứa nito, như protein
khá mạnh nhờ sinh ra proteaza ngoại bào. Ngoài ra, chúng cịn có khả năng sinh ra
amylaza làm lỗng tinh bột, biến chất này thành dễ hòa tan và thủy phân tiếp theo thành
các dextrin và các loại đường hợp thành [11].
Tế bào hình que, thẳng hoặc gần thẳng, kích thước 0,3 -2,2 ũ 1,2 - 7 lim. Các tế bào
thường xếp thành cặp hoặc chuỗi, đầu trịn hoặc hơi vng. Chúng là vi khuẩn Gram
dương, chúng thường di động nhờ roi. Một tế bào chỉ hình thành duy nhất một nội bào tử,
nội bào tử có hình oval hoặc hình trụ. Bào tử có khả năng chịu nhiệt, acid. Sự hình thành
nội bào tử khơng bị ngăn cản bởi sự tiếp xúc khơng khí. Các lồi thuộc chi Bacillus đặc
trưng cho trực khuẩn sinh bào tử mà vẫn giữ nguyên hình que khi mang bào tử, trong một


số trường hợp chỉ hơi phình to lên một chút. Tùy theo lồi, bào tử có thể nằm giữa, gần
cuối hoặc ở cuối [11].
Với các phương pháp nhuộm thông thường, bào tử không bị nhuộm màu hoặc chỉ

nhuộm được màu rất nhạt trông giống như các thể ẩn nhập. Để nhuộm màu, bào tử phải
được xử lí bằng các dung dịch thuốc nhuộm đậm đặc và vừa nhuộm vừa phải đun nóng
[11].
Đặc điểm phân bố
Nhờ khả năng sinh bào tử nên Bacillus có thể tồn tại trong thời gian rất dài dưới
các điều kiện khác nhau. Chúng rất phổ biến trong tự nhiên nên có thể phân lập từ nhiều
nguồn khác nhau như đất, nước, khơng khí, phân,...[9],[12],[13].
Dinh dưỡng và tăng trưởng
Hầu hết các loài thuộc chi Bacillus là những sinh vật hóa dị dưỡng, thu năng lượng
nhờ sự oxi hóa các hợp chất hữu cơ như đường, amino acid, acid hữu cơ,... Một số vi
khuẩn dị dưỡng không bắt buộc (B. schlegelli, B. megaterrium.) có khả năng phát triển
trong mơi trường chỉ có CO2. Một số lồi Bacillus có khả năng sử dụng các chất vô cơ,
trong khi một số loài khác như B. saphaericus, B . cereus cần các hợp chất hữu cơ
(vitamin, amino acid) cho sự sinh trưởng. Đặc biệt một số loài Bacillus gây bệnh cho côn
trùng như B. thuringiensis, B. popllae, B. lentimorbus, B. cereus, B. anthracis có nhu cầu
dinh dưỡng phức tạp, chúng khơng phát triển trong môi trường vi khuẩn thông thường như
NA, NB[9],[12],[13].
Phần lớn các loài thuộc chi Bacillus là vi khuẩn hiếu khí hoặc kị khí tùy nghi, nhiệt
độ sinh trưởng tối ưu từ 30-450C, một số vi khuẩn chịu nhiệt với nhiệt độ sinh trưởng tối
ưu lên tới 650C, hoặc ưa lạnh(5-250C). Các loài vi khuẩn thuộc chi Bacillus sinh trưởng
trong khoảng pH rộng từ 2-11. Trong phịng thí nghiệm, dưới điều kiện tối ưu, Bacillus có
thời gian thế hệ là 25 phút.
1.1.2. Khả năng đối kháng của vi khuẩn Bacillus
Các loại vi khuẩn thuộc chi Bacillus có khả năng đối kháng với vi sinh vật gây
bệnh thông qua khả năng sinh các chất có hoạt tính kháng vi sinh vật cao (enzym và chất
kháng sinh).


Các loại enzyme ngoại bào mà vi khuẩn Bacillus thường sản sinh ra trong quá trình
sống như: protease, amylase, cellulose, chitinase, glucanase, lipase, urease,... Các loại

enzyme này có tác dụng làm cho vi khuẩn thích ứng với nhiều hồn cảnh và điều kiện môi
trường sống. Chitinase do Bacillus tiết ra có khả năng phá vỡ thành tế bào của nấm bệnh
vì chitin là một trong những thành phần cấu tạo quan trọng của thành tế bào vi nấm gây
bệnh thực vật. Wen và cộng sự (2007) đã chứng minh rằng Bacillus Cereus QQ308 là một
chủng có khả năng sản xuất enzyme thủy phân chống lại nấm bệnh[17].
Ngoài ra, các chất kháng sinh tiết vào mơi trường cũng có tính sát khuẩn hoặc kìm
hãm sinh trưởng gây ảnh hưởng đến quần thể vi sinh vật khác. Mục đích gián tiếp là cạnh
tranh dinh dưỡng và năng lượng có sẵn trong mơi trường. Nghiên cứu của Stien (2005)
cho thấy tiềm năng sản sinh chất kháng sinh của B. Subbtilis có khả năng tiết ra hơn 20
loại chất kháng sinh với cấu trúc khác nhau như: subtilin, ericin, merasacidin, sublancin,
subtilosin, surfactin, iturin, bacillibactin, bacillomytin, diffcidin, oxydifficin, bacilysocin,
rhizocticin, amicoumacin, mysobaccillin,. Các chất kháng sinh này có thể có tác dụng đơn
lẻ hoặc kết hợp nhau[3].
1.2.

Nấm Phytophthora

1.2.1. Vị trí phân loại
- Giới Fungi
- Ngành Mycophyta
- Lớp Oomycates
- Bộ Pernoporales
- Họ Pythiaceae
- Chi Phytophthora
Đặc điểm sinh học
Nấm Phytophthora là chi khá phổ biến thuộc lớp Oomycetes, bộ Pernoporales, họ
Pythiaceae, sợi nấm không màu, không vách ngăn, đơn bào, kích thước khơng đồng đều.
Túi bào tử hình trứng hoặc hình quả chanh, khơng màu, trong suốt. Bào tử hình cầu hoặc
hình thận có 2 lơng roi di chuyển rất nhanh trong nước [4]
Khi Phytophthora được nuôi cấy trong mơi trường thích hợp, khuẩn ty (Mycelium)

của nó phát triển rất nhanh. Dưới điều kiện ẩm ướt chúng tạo ra những bào tử vơ tính được
gọi là túi bào tử (Sporangia) hoặc túi bào tử động (Zoosporangia). Túi bào tử này nảy mầm
trong môi trường nước hoặc khi nhiệt độ mơi trường giảm. Chúng phóng thích ra những
bào tử động (Zoospores) với hệ lông roi không đều nhau (Heterokont flagella). Những bào
tử động sau khi được phóng thích sẽ bơi lội hàng giờ liền và cuối cùng ngừng bơi lội để
cuộn tròn hay kết kén. Sau một thời gian chúng hình thành vách tế bào. Ở giai đoạn này,
bào tử được gọi là kén hay nang (Cyst). Bào tử vách dày (Chlamydospore) ở dạng hình
cầu hay oval, là một cấu trúc nghỉ vơ tính. Cấu trúc hữu tính bao gồm túi giao tử đực
(Antheridium - bộ phận sinh sản đực) và túi noãn ( Oogonium - bộ phận sinh sản cái). Quá
trình giảm phân hình thành nên túi giao tử đực và túi noãn. Đây chỉ là giai đoạn đơn bội
trong vòng đời của Phytophthora. Giai đoạn lương bội đóng vai trị quyết định trong suốt
chu kì sống của chúng. Các vịi thụ tinh từ túi giao tử đực sẽ thoát vị đưa nhân của giao tử
đực vào noãn. Hợp tử sau khi được thụ tinh sẽ nảy mầm ở điều kiện thích hợp tùy thuộc
vào sự kết hợp của trứng với một hay nhiều ống giao tử đực. Giống Phytophthora bao
gồm một số loài nấm dị tản (Heterothallic)(có hai kiểu lai A1và A2) chẳng hạn như
P.infestans. Số cịn lại là những lồi nấm đồng tản (Homothallic) bao gồm cả P. sojae
hoặc[7].
Giai đoạn lưỡng bội có vai trị chính trong chu kỳ sống. Các vịi thụ tinh giao tử
đực sẽ thoát vị đưa nhân giao tử đực vào nỗn. Sự kết hợp giữa trứng có thể với 1 hoặc
nhiều ống giao tử đực. Hợp tử sau thụ tinh sẽ nảy mầm khi gặp điều kiện thích hợp[7].
Chu kì sống của nấm Phytophthora[3]

Sporangium

Chlamydospore


Chu kì sống của Phytophthora

(SI-AMMOUR, 2002)
Khả năng gây bệnh
Phytophthora tấn công trên tất cả các bộ phận của cây. Do đó mầm bệnh có thể dễ
hiện diện ngay khi cây chưa có dấu hiệu bệnh rõ ràng [7]. Phytophthora có thể tồn tại
nhiều năm trong đất. Nó làm thối rễ, làm cho cây gặp khó khăn trong việc hút nước và
muối khoáng. Đối với những cây lâu năm như sầu riêng, tiêu, cao su, ... rễ cây khi bị
nhiễm Phytophthora dễ bị mục nát, có màu nâu hoặc đen ở bên trong, mềm hơn bình
thường. Đặc biệt nấm Phytophthora gây tác hại lớn đến đến cây cao su, làm giảm sản
lượng mủ và ảnh hưởng đến sự tái tạo của vỏ mới của cây [3].
Trong điều kiện có nước và nhiệt độ thấp, bào tử tạo thành nhiều bào tử động một
cách nhanh chóng di chuyển theo nước xâm nhiễm lây bệnh qua miệng cắt mặt cạo, qua
vết thương cơ giới và qua lỗ hở tự nhiên của cây. Sợi nấm xuyên sâu vào các mô tế bào
qua mạch libe, qua mô phân sinh tới mạch gỗ [24].
Những năm 60 của thế kỉ XX, đã có những nghiên cứu liên quan đến bệnh trên cây
cao su ở Việt Nam. Trong 19 bệnh ảnh hưởng đến cây cao su thì bệnh do phytophthora sp
gây ra với các biểu hiện như: rụng lá, sọc đen và loét thân[6]. Không những thế, nấm
Phytophthora cịn tấn cơng các cây nơng nghiệp ngắn ngày, gây ra các triệu chứng như
thối rễ, vàng và héo lá ở cà chua, làm thối rễ và hỏng trái ở cây ớt[3].
1.3.

Tình hình bệnh hại trên cây trồng[7]
Hằng năm trên thế giới, bệnh trên cây đã gây ra nhiều thiệt hại to lớn cho nông

nghiệp. Chúng phá hủy đến 537,3 triệu tấn các loại nông sản chủ yếu, chiếm 11,6% tổng
sản lượng nông nghiệp trên thế giới. Riêng lúa chiếm khoảng 9%, bắp 10%, cây rau 12%,
cây ăn quả 16,5%. Trong các loại bệnh cây, bệnh do vi nấm gây ra chiếm khoảng 83%[4].
Những thơng tin chính quan tâm đến sự hiện diện, sự phân bố của bệnh
Phytophthora ở việt Nam được điều tra và kiểm soát bởi Viện Bảo Vệ Thực Vật Quốc Gia
ở Hà Nội. Từ những kết quả điều tra và những nghiên cứu ngoài đồng, 13 lồi
Phytophthora đã được tìm thấy ở Việt Nam. Sau đây là những thông tin về bệnh

Phytophthora trên một số cây trồng chính tại Việt Nam theo ghi nhận của Thanh, Ngo,
Viên và Andre' Drenth năm 2004.

Cà chua và khoai tây
Bệnh tàn lụi lá là bệnh chính trên nhóm cây trồng này. Được nghiên cứu ở vùng
đồng bằng sông Hồng trong những năm 1960. Tác nhân gây bệnh là Phytophthora
infestans và bệnh xuất hiện hàng năm từ tháng 12 đến tháng 3 khi điều kiện khí hậu lạnh
và ẩm; gây mất mùa 30 - 70%, trong trường hợp xấu bệnh gây mất mùa toàn bộ (Vũ,
1973). Điều đáng lưu ý là phạm vi ảnh hưởng của bệnh cao hơn mức trung bình ở những
vùng đất sét. Bệnh dược khống chế bằng phun 1% Bordeaux. Ngoài ra thuốc diệt nấm
Maneb và Zineb 0,2 - 0,3% a.i. cũng được xem là có hiệu quả phịng chống P. infestans
cao.
Khoai sọ
Bệnh tàn lụi lá gây ra bởi P. colocasiae được xem là bệnh chính trên khoai sọ ở
Bắc Việt Nam. Bệnh được báo cáo đầu tiên bởi Roger (1951). Nhiệt độ ấm (24 - 30 0C) và
ẩm độ cao là yêu cầu cho bệnh lan rộng. Bệnh xuất hiện hằng năm, bắt đầu vào giữa tháng
4, tháng 5 và cao điểm ở tháng 7, tháng 8 khi nhiệt độ ổn định ở 27 - 29 0C, lượng mưa
trung bình trong tháng ở mức 201 - 308 mm.
Dứa
Bệnh thối nõn dứa là một trong những bệnh chính gây mất năng suất dứa. Bệnh
được tìm thấy ở tất cả các vùng trồng dứa trên khắp đất nước gồm Thừa Thiên Huế, Nghệ
An, Hà Tây, Bắc Giang, Thanh Hóa và Ninh Bình. Giống dứa cayenne mẫn cảm với bệnh
hơn các giống dứa khác. Một điều thú vị là ở những vùng có pH đất thấp (3,5 - 4,2) như
Tiền Giang và Tp. Hồ Chí Minh, bệnh thối nõn dứa khơng được tìm thấy.
Tuy nhiên, điều này không rõ là do pH thấp hoặc là do một yếu tố khác.
Tác nhân gây bệnh là P. cinnamomi và P. nicotianae, điều này được chứng minh bởi các
thí nghiệm trong nhà kính được kiểm sốt tại Viện BVTV quốc gia ở Hà Nội năm 2001
(Ngô và cộng sự, 2001).

Cây cam quýt


Phytophthora citrophthora được báo cáo đầu tiên trên cam ở đồng bằng sông Cửu
Long trong những năm 1950 và không được theo dõi mãi đến những năm 1970, khi bệnh
có mặt ở tất cả các vùng trồng cam quýt, như vùng Thanh Trà ở Thừa Thiên Huế, Ninh
Bình ở Tiền Giang. P. citrophthora tấn công thân và quả, với các biểu hiện triệu chứng,
làm chảy nhựa và thối quả. Sự phát triển nhanh trong mùa mưa, nguy hiểm nhất là vào
tháng 7 và tháng 8. Vào tháng 3 năm 2002, tỷ lệ mắc bệnh trên cam ở Cao Phong - Hịa
Bình là 10% nhưng sau đó đã tăng lên 20 - 30% vào tháng 8. Quýt bị ảnh hưởng nhiều
hơn, với nhiều vườn đã bị mất năng suất và chết cây. Những mẫu lấy từ mô cây cam quýt
bị loét thân ở tỉnh Tiền Giang được nhận biết là P. nicotianae (A. Drenth, thông tin chưa
công bố).
Sầu riêng
Sầu riêng (Durio zibethinus Murr) là một trong những cây ăn trái được ưa thích
nhất ở miền Nam Việt Nam và diện tích trồng sầu riêng ngày càng được mở rộng do trồng
chúng có hiệu quả kinh tế hơn các cây trồng khác. P. palmivora là tác nhân gây bệnh ở sầu
riêng, bao gồm thối rễ, loét thân, thối trái và rụng lá. Nó được tìm thấy trong tất cả các
vùng trồng sầu riêng ở những vùng cả miền Nam và miền Trung Việt Nam. Trong năm
2001, bệnh đã ảnh hưởng đến cả các vùng thấp trồng sầu riêng và đặc biệt nghiêm trọng ở
tỉnh Quảng Nam. Trong 3075 cây trồng ở xã Quế Trung, có 2138 cây bị chết do P.
palmivora, gây thiệt hại kinh tế 15 tỉ đồng VND (1,5 triệu USD). Những nơi khác, bệnh đã
được tìm thấy phổ biến nhất ở Cái Bè, Tiền Giang, với 24,6% cây bị nhiễm bệnh. Tỷ lệ
mắc bệnh có liên quan với tuổi cây, những cây hơn 10 tuổi là mẫn cảm với bệnh nhất.
Mận
Trong những năm gần đây bệnh đốm đen trên mận (Prunus salicilas) đã làm giảm
lượng thu hoạch một cách đáng kể ở tỉnh Bắc Hà và Mộc Châu. Phytophthora cactorum
được nhận biết là tác nhân gây bệnh. Ở Bắc Hà vào tháng 3 năm 1996, bệnh gây thiệt hại
nghiêm trọng trên 300ha mận làm mất mùa 20%. Suốt những năm 1997 và 1998, bệnh lan
rộng ít hơn nhưng mức độ tàn phá thì mãnh liệt hơn, với những vướn bị đốm đen thì mất

mùa trên 50%.
Triệu chứng bệnh trên mận là những điểm úng nước màu trắng xám trên trái non,


phát triển thành những đốm đen trũng với rìa mép màu nâu. Trong vài trường hợp bệnh
nặng, toàn bộ trái bị khô quắt lại và rụng khỏi cây. Những đốm trũng được bao phủ bởi
những sợi nấm trắng trong điều kiện ẩm ướt, P. cactorum được phân lập từ những đốm đen
trong điều kiện này.
Nhiệt độ mát (nhiệt độ ngày 14 - 18 0C), chênh lệch nhiệt độ ngày đêm cao, ẩm ướt và có
sương mù được xem là điều kiện lý tưởng cho P. catorum lây nhiễm. Do vật bệnh tăng
nhanh vào tháng 3 và đầu tháng 4, chậm dần khi nhiệt độ tăng dần lên gần cuối tháng. Và
cây mận chưa trưởng thành mẫn cảm với bệnh đốm đen hơn cây mận đã trưởng thành. Vào
tháng 3 năm 1998, ở tỷ lệ bệnh trên cây mận hai năm tuổi là
10% trong khi trên cây mận bốn năm tuổi là 2,1%.
Cao su
Trong những năm 1960, bắt đầu có những nghiên cứu quan tâm đến bệnh trên cao
su ở Việt Nam. 19 bệnh ảnh hưởng đến cao su ở Việt Nam, rụng lá, sọc đen và loét thân
gây ra bởi các loài Phytophthora. P. palmivora được phân lập từ khoảng 70% cây cao su bị
bệnh sọc đen, trong khi P. botryosa được tìm thấy trên 75 - 80% từ lá và trái của những
cây cao su bị rụng lá. Cả hai loài P. palmivora và P. botryosa được biết là tác nhân gây
bệnh trên cao su ở tất cả các vùng trồng trên đất nước.

1.4.

Tình hình nghiên cứu và sử dụng vi khuẩn Bacillus trong công tác bảo vệ cây
trồng[4]
Trong công tác bảo vệ thực vật, biện pháp đấu tranh sinh học bằng cách sử dụng

một hay nhiều loại vi sinh vật để kiềm chế bệnh thực vật từ đất đã được từ đất đã được tổ
chức FAO đề xuất từ rất sớm[3].

Trên cơ sở nghiên cứu và tìm kiếm ngày càng nhiều các loại vi sinh vật có khả
năng bảo vệ cây trồng, không gây ảnh hưởng đến sức khỏe của con người và thân thiện
với môi trường. Các loại vi khuẩn thuộc chi Bacillus được công nhận là một trong những


tác nhân kiểm soát sinh học hiệu quả nhất và khả năng ức chế sự phát triển của mầm bệnh.
Đã có nhiều cơng trình trong nước và quốc tế nghiên cứu về khả năng kháng vi nấm gây
bệnh cây trồng của Bacillus. Dưới đây xin đề cập đến một số cơng trình nghiên cứu về khả
năng ứng dụng của Bacillus vào cơng tác bảo vệ cây trồng trong và ngồi nước.
Wan Gyn Kim và cộng sự (2007) nghiên cứu 20 chủng Bacillus spp. Phân lập ở các
đống phân ủ hoai. Nhóm tác giả đã tiến hành khảo sát khả năng kháng các vi nấm gây
bệnh thực vật như Fusarium oxysporum, Phytophthora capsici, Rhizoctonia solani AG-4
và Sclerotinia sclerotonium của các chủng Bacillus phân lập được ở quy mô invitro. Kết
quả nghiên cứu cho thấy hầu hết các chủng Bacillus spp. Đều kháng các chủng nấm khác
nhau. Từ 20 chủng Bacillus phân lập được, nhóm tác giả đã lựa chọn được chủng M34 và
M47 có khả năng đối kháng với nấm Phytophthora capsici. Ngoài ra, hai chủng Bacillus
M27 và M75 được xác định là những chủng có khả năng kháng lại tất cả các vi nấm được
sử dụng để kiểm tra hoạt tính của các chủng Bacillus phân lập được. Tuy nhiên, một vài
nghiên cứu lại cho kết quả không giống nhau về khả năng thể hiện hoạt tính của các chủng
Bacillus trong điều kiên in vitro và ngoài đồng ruộng (Fravel, 2005). Vì thế việc tiếp tục
thực hiện các thí nghiệm kiểm tra hoạt tính của những chủng Bacillus có tiềm năng đối
kháng với vi nấm gây bệnh trên quy mô cánh đồng là một việc cần thiết[3],[15], [16].
Hai Kuan Wang và cộng sự (2012) đã tuyển chọn được chủng Bacillus cogulans
TQ33 có khả năng kháng mốc xám Botrytis cinerea làm hỏng trái cây và các loại rau củ.
Tác dụng kiểm soát sinh học của chủng Bacillus này đã được kiểm tra ở điều kiện nhà
kính. Ngồi ra, chủng Bacillus cogulans TQ33 cịn có đặc điểm là tổng hợp các chất ngoại
bào có khả năng kháng nhiều loại nấm gây hại cây trồng khác như Phytophthora
drechsleri Tucker,... Vì thế, chủng B. cogulans TQ33 có tiềm năng lớn trong việc kiểm sốt
các loại nấm gây bệnh thực vật[17].
Nguyễn Lý Nhơn và cộng sự (2008) đã tuyển chọn được chủng Bacillus subtilis

Bac02 có nhiều tiềm năng trong kiểm soát bệnh hại do các chủng nấm Phytophthora
capsici,... gây ra. Khi sử dụng các vi sinh vật hữu hiệu khác, sự hiện diện của chủng
Bacillus subtilis Bac02 trước, đồng thời hoặc sau khi có sự hiện diện của nấm bệnh có ảnh
hưởng đáng kể đến hiệu quả kiểm soát nấm bệnh của chủng này. Dù ở trường hợp nuôi cấy


nào thì chủng Bacillus subtilis Bac02 đều có khả năng ức chế sự tăng trưởng của nấm
bệnh. Điều này cho thấy chủng Bacillus subtilis Bac02 có tiềm năng để phịng ngừa bệnh
hại cũng như giúp ngăn chặn sự bùng phát các bệnh hại do chung gây ra[8],[4].
Đoàn Lê Minh Hiền (2013) đã tuyển chọn được 2 chủng Bacillus B14 và B34 có
khoảng cách vơ khuẩn lần lượt là 10,6 (mm) và 11,7 (mm).
Trên cơ sở nghiên cứu và phát hiện được tiềm năng đối kháng với vi nấm gây bệnh
trên cây trồng của các loài vi khuẩn thuộc chi Bacillus, người ta đã sử dụng các chủng
Bacillus có hoạt tính kháng nấm mạnh để tạo các chế phẩm sinh học phòng trừ bệnh trên
cây. Một số chế phẩm sinh học chứa Bacillus đã và đang được sử dụng phổ biến như: BioFA, Bio-BL, Bio-F.... chứa 108 CFU/g Bacillus sp. Ngoài vi khuẩn Bacillus, các chế phẩm
này còn chứa các vi sinh vật có ích khác như: Pseudomonas, Azotobacter, Streptomyces,
Trichoderma[4].
Đặc điểm chung với nhiều ưu điểm nổi trội của các loại vi sinh vật thuộc các nhóm
kể trên là:
- Khơng gây ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe con người. vật ni. cây trồng như
thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc hóa học.
- Cân bằng hệ sinh thái trong mơi trường đất nói riêng và mơi trường nói chung.
- Cây trồng hấp thu chất dinh dưỡng dễ hơn. góp phần tăng năng suất và chất
lượng nông sản
- Giảm thiểu bệnh hại. tăng khả năng đề kháng bệnh của cây trồng mà không làm
ảnh hưởng đến môi trường.


CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

2.1.1. Vật liệu nghiên cứu
- Mẫu nấm bênh thực vật do Phytophthora gây ra tại Bình Dương.
- Mẫu đất vườn thu được tại Bình Dương.
2.1.2. Hóa chất và thiết bị
- Glucose, NaNO3, NaCL, Agar, KCL, MgSO4.7H2O, khoai tây, nước cất, cao thịt,
KH2PO4, pepton, cao nấm men.v.v...
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ
- Tủ sấy, máy đo PH, tủ cấy vô trùng, máy lắc, tủ lạnh (sanyo), máy hấp thanh trùng, lò
viba, bếp điện, cân điện tử, đĩa petri, bình tam giác, micropipet.v.v...


2.1.4. Môi trường nghiên cứu
MT1 : MT Czapek - Dox: Ni cấy, giữ giống nấm sợi, thử hoạt tính enzym ngoại
bào (amilaza, proteaza, xenluloza) [5]
Glucose

20g

KH2PO4

1,5g

NaNO3

3,5g

KCL

0,5g

MgSO4.7H2O

0,5g

FeSO4.7H2O

0,1g (vết)

Agar

20g

Nước cất

1000ml

pH =

6,5-7

MT2: Meat peptone agar (MPA): Dùng để nuôi cấy giữ giống vi sinh vât kiểm
định [5]
Pepton

5g

NaCL

5g

Cao thịt

5g


Agar

20g

Nước cất

1000ml

pH=
7,5
MT3: Malt Extract Agar ( MEA) : Dùng để phân loại nấm sợi [5].
Malt Extract
Pepton
Glucose
Agar
Nước cất
pH=

20g
1g
20g
20g
1000ml
5,6

MT4 : (PGA) [5].
Glucose

30g

Agar
Nước cất

20 g
1000
ml

Khoai tây

200g

MT5 : Thạch nước (WA)
[5]
Agar

25g

Nước cất

1000
ml

2.2. Phương pháp nghiên cứu:
2.2.1. Lấy mẫu [1]

+ Lấy mẫu nấm bệnh
Dùng kẹp và kéo vô trùng cắt mẫu bệnh vào túi nilong sạch buộc chặt, đánh số, ghi
địa điểm. Sau đó phân lập mẫu bệnh trên mơi trường PGA (MT4) và WA(MT5) trong 24h
kể từ khi lấy mẫu.
+ Lấy mẫu đất:
Dùng muỗng vơ trùng lấy một ít lớp đất mặt cho vào túi nilong sạch, buộc chặt ,
đánh số và ghi địa điểm. Tiếp tục như vậy lấy đất cách mặt 5cm. Mẫu được phân lập trên
môi trường MT2 trong vòng 24h sau khi lấy.
2.2.2. Phương pháp phân lập
+ Phân lập nấm [2][11][14]
Dùng kéo và kẹp vô trùng đã được khử trùng cắt mẫu bệnh thành miếng nhỏ có
diện tích 1mm đặt vào đĩa petri đã được đỗ mơi trường PGA và WA trong mơi trường nhiệt
độ phịng để từ 3 ngày đến 5 ngày rồi quan sát kết quả.
+ Phân lập vi khuẩn [5][11]
- Nguyên tắc: Tách rời các tế bào vi khuẩn, nuôi cấy các tế bào trong môi trường


dung dịch đặt trưng để cho vi khuẩn phát triển, sau đó cấy truyền sang một hay vài lần để
vi khuẩn có thể thuần khiết được chủng vi khuẩn.
- Tiến hành: Cân 1g đất từ mẫu đất thu được cho vào ống nghiệm thêm 9 ml nước
cất. Sau đó khuấy đều mẫu đất với nước thu được dịch lọc có độ pha loãng 10-1. Lắc đều
rồi hút 1ml dung dịch 10-1 cho vào ống nghiệm cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước cất ta
được dung dịch pha loãng nồng độ 10-2. Tiếp tục pha loãng như thế ta được dung dịch nồng
độ 10-3, 10-4, 10-5, 10-6. Nhỏ 0,1ml (2 giọt) dung dịch ở mỗi nồng độ lên đĩa petri có chứa
môi trường (MPA). Dùng que trang trải đều khắp trên mặt thạch, giữa nguyên que trang
tiếp tục sang đĩa 2 và 3. Sau đó ủ các đĩa ở nhiệt độ phịng từ 2-5 ngày. Sau đó lựa chọn
những khuẩn lạc vi khuẩn có đăc điểm mơ tả như khóa phân loại thì tiếp tục cấy chuyền
làm thuần cho đến khi thu được giống thuần khiết. Cuối cùng, cấy giống sang ống thạch
nghiêng để bảo quản và nghiên cứu các đặc điểm sinh học của vi khuẩn.
- Sau khi đã có chủng vi khuẩn thuần khiết tiến hành quan sát môt số đăc điểm sinh học để

phân loại đến chi của vi khuẩn Bacillus theo Lương Đức Phẩm (2011).
2.2.3. Phương pháp khảo sát khả năng đối kháng của vi khuẩn Bacillus với nấm
Phytophthora [1].
- Nguyên tắc: Khi vi khuẩn trên khối thạch có khả năng hình thành hoạt chất
đối kháng thì vi khuẩn sẽ ức chế sự phát triển của nấm và tạo vịng vơ khuẩn xung quanh
khối thạch.
- Tiến hành: Dùng khoan nút chai vô trùng khoan các khối thạch có vi
khuẩn cần thử hoạt tính đối kháng. Sau đó đặt khối thạch vào đĩa petri có mơi trường MT4
đã cấy nấm kiểm định. Sau đó ủ ở nhiệt độ phòng từ 3-5 ngày.
- Đánh giá khả năng đối kháng: Dùng thước đo đường kính vịng phân giải
(D) và đo đường kính vi khuẩn.
(D-d) < 10mm: Đối kháng yếu
20ó(D-d)ó 10mm: Đối kháng trung bình
25> (D-d)> 20mm: Đối kháng mạnh
(D-d)> 25mm: Đối kháng rất mạnh
2.2.4. Phương pháp xử lý số liêu
Xử lý số liệu bằng phần mềm Excel 2010 và Statgraphics Centurion XV


2.2.5. Phương pháp nhuộm Gram[22].
Đây là phương pháp làm tiêu bản nhuộm màu được sử dụng rất phổ biến để theo dõi
các đặc điểm hình thái
- Nguyên tắc :
Sự bắt màu thuốc nhuộm của tế bào vi sinh vật là một quá trình hấp thụ, khả
năng bắt màu của tế bào vi sinh vật có liên quan đến muối magiê của acid riboleic.
Khi nhuộm phức tạp, muối này có phản ứng với thuốc nhuộm loại tryphenylmetan
(gelatinviolet, oryatanviolet, metylviolet) chịu được dưới tác dụng của cồn (không
bị mất màu dưới tác dụng của cồn). Nhứng vi khuẩn không bị mất màu là những vi
khuẩn gram (+), ngược lại những vi khuẩn mất màu là những vi khuẩn gram(-).
- Cách tiến hành :

- Làm tiêu bản :
+ Dùng que cấy lấy nước vơ trùng để làm vết bơi trên phiến kính.
+ Dùng que cấy lấy một chút khuẩn lạc của chúng làm vết bôi theo thứ tự
sau:
+ Để khô vết bôi trong khơng khí hoặc cố định nhẹ trên ngọn đèn cồn.
- Nhuộm tiêu bản
+ Đặt 1 miếng giấy lọc lên 1 vết bơi.
+ Nhuộm tiêu bản bằng thuốc nhuộm tím kết tinh qua giấy lọc trong 1 phút
+ Nhuộm lugol trong 1 phút.
+ Rửa nước.
+ Tẩy bằng cồn trong 30 giây, để nghiêng tiêu bản nhỏ từ từ từng giọt cồn cho
đến khi tan hết màu.
+ Rửa nước.
+ Nhuộm bổ sung Fuchsin hay Safranin từ 10 - 30 giây
Làm khô và soi tiêu bản với vật kính dầu 100.
2.2.6. Thử nghiệm Catalase[21]
- Nguyên tắc:
Catalase là một enzyme có khả năng phân hủy hydrogen peroxide(H2O2) thành