Khảo sát quá trình lên men thu nhận và tạo chế phẩm bacterial cellulose từ những nguồn nguyên liệu khác nhau

Đại Học Quốc Gia TP. Hồ Chí Minh
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
**********************

PHẠM VĂN PHIẾN

KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH LÊN MEN THU NHẬN VÀ TẠO
CHẾ PHẨM BACTERIAL CELLULOSE TỪ NHỮNG
NGUỒN NGUYÊN LIỆU KHÁC NHAU
Chuyên ngành : Công nghệ sinh học
Mã số : 60 42 80

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 08 năm 2012


Đại Học Quốc Gia TP. Hồ Chí Minh
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
**********************

PHẠM VĂN PHIẾN

KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH LÊN MEN THU NHẬN VÀ TẠO
CHẾ PHẨM BACTERIAL CELLULOSE TỪ NHỮNG
NGUỒN NGUYÊN LIỆU KHÁC NHAU
Chuyên ngành : Công nghệ sinh học
Mã số : 60 42 80

LUẬN VĂN THẠC SĨ

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS.TS.NGUYỄN THÚY HƯƠNG

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 08 năm 2012


CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Nguyễn Thúy Hương
Cán bộ chấm nhận xét 1: ...................................................................................

Cán bộ chấm nhận xét 2: ..................................................................................

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN
THẠC SĨ. Ngày .….tháng……năm……..
Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ
1………………………………………………..
2………………………………………………..
3………………………………………………..
4………………………………………………..
5………………………………………………..
Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV

Bộ môn quản lý chuyên ngành


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

---------------------------

---oOo--TP. HCM, ngày

tháng

năm 2012

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ và tên học viên: PHẠM VĂN PHIẾN

Giới tính: NAM

Ngày, tháng, năm sinh: 16/03/1967

Nơi sinh: TP. Hồ Chí Minh

Chuyên ngành: Cơng nghệ Sinh Học
Khố (Năm trúng tuyển): 2010
1- TÊN ĐỀ TÀI: Khảo sát quá trình lên thu nhận và tạo chế phẩm Bacterial

Cellulose từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau.
2- NHIỆM VỤ LUẬN VĂN :
- Khảo sát quá trình lên men tạo BC trên môi trường truyền thống (nước dừa già)

và các môi trường không truyền thống (rỉ đường, nước mía, phụ phẩm từ thơm, dịch
whey protein).
- Tối ưu hóa điều kiện ni cấy phịng thí nghiệm: pH, nhiệt độ và thời gian.
- Tối ưu hóa điều kiện dinh dưỡng căn bản: tỷ lệ Nitơ và Cacbon.
- Tối ưu hóa tốc độ lắc trong lên men chìm thu nhận A-BC.
- Xây dựng quy trình lên men sử dụng vi khuẩn A. xylinum BC16 thu nhận sản
phẩm BC đạt hiệu quả.
- Bước đầu khảo sát một số đặc tính của màng BC.
3- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: tháng 07 năm 2011
4- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: tháng 07 năm 2012
5- HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS.TS. Nguyễn Thúy Hương
Nội dung và đề cương Luận văn thạc sĩ đã được Hội đồng chuyên ngành thông qua.
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN
QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH

PGS.TS. Nguyễn Thúy Hương

KHOA QL CHUYÊN NGÀNH


i

LỜI CẢM ƠN

Xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong bộ môn Công nghệ Sinh học trường
Đại học Bách Khoa đã nhiệt tình, tâm huyết truyền đạt những kiến thức, những kinh
nghiệm tinh thông, sâu sắc quý báu, đã tạo mọi điều kiện thuận lợi trong q trình
tơi học tập và thực hiện luận văn tốt nghiệp.

Xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến Cơ PGS.TS.Nguyễn Thúy Hương, người
đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, động viên, đồng thời tạo mọi điều kiện tốt nhất để
tơi hồn thành luận văn tốt nghiệp.
Xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô thuộc bộ môn Công nghệ Sinh học
trường Cao đẳng Kinh tế Cơng nghệ thành phố Hồ Chí Minh cũng đã nhiệt tình, tạo
điều kiện thuận lợi trong quá trình tơi thực hiện luận văn tốt nghiệp tại trường.
Xin gửi lời cám ơn chân thành đến các bạn học viên cao học, các sinh viên
đại học, cùng thực hiện luận văn tốt nghiệp tại phịng thí nghiệm đã chia sẻ, trao đổi
kiến thức và đóng góp ý kiến quý báu, nhằm giúp đỡ, động viên tôi.
Tôi cũng xin cảm ơn cha mẹ, gia đình, vợ con và những người thân yêu nhất
là chỗ dựa tinh thần vững chắc, khuyến khích động viên tơi .
Cuối cùng, xin gửi đến tất cả bạn bè thân thuộc, những người đã luôn giúp
đỡ động viên tôi rất nhiều trong cuộc sống, trong quá trình học tập và thực hiên luận
văn tốt nghiệp.
TP. Hồ Chí Minh, ngày 01 tháng 08 năm 2012
Phạm Văn Phiến


ii

KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH LÊN MEN THU NHẬN VÀ
TẠO CHẾ PHẨM BACTERIAL CELLULOSE TỪ
NHỮNG NGUỒN NGUYÊN LIỆU KHÁC NHAU
TÓM TẮT
Bacterial Cellulose (BC) là sản phẩm tương hợp sinh học có nhiều đặc tính ứng dụng
trong nhiều lĩnh vực. Việc tận dụng các nguồn nguyên liệu phổ biến, rẻ tiền, có sẵn trong
tự nhiên như những phụ phẩm từ các quá trình sản xuất để lên men thu nhận BC sẽ đạt hiệu
quả kinh tế đồng thời giải quyết được tình trạng ô nhiễm môi trường. Nghiên cứu này ứng
dụng phương pháp tối ưu hóa để xác định các yếu tố ảnh hưởng : pH, nhiệt độ, thời gian và
tỷ lệ dinh dưỡng (Ni tơ và Cacbon) hợp lý cho quá trình lên men thu nhận BC.

Kết quả nghiên cứu xác định được điều kiện lên men tối ưu trên các môi trường
nguyên liệu: nước dừa già (pH: 5,2; Nhiệt độ: 30,3oC; Thời gian: 92 giờ; Peptone: 1,5%;
Glucose: 3,325%), rỉ đường (pH: 4,9; Nhiệt độ: 30oC; Thời gian: 107 giờ; Peptone: 1,0%;
Glucose: 2,78%), nước mía (pH: 5,2; Nhiệt độ: 30,5oC; Thời gian: 102 giờ; Peptone:
0,93%; Glucose: 3,65%), phụ phẩm từ thơm (pH: 5,3; Nhiệt độ: 30,6oC; Thời gian: 105
giờ; Peptone: 0,77%; Glucose: 3,48%), whey protein (pH: 5,2; Nhiệt độ: 30oC; Thời gian:
110 giờ; Peptone: 1,02%; Glucose: 3,64%). Kết quả khảo sát cho thấy có thể sử dụng các
mơi trường khơng truyền thống làm môi trường nguyên liệu thay thế cho môi trường
truyền thống nước dừa.
Việc ứng dụng nguồn vi sinh vật trong tự nhiên vào sản xuất sản phẩm BC sẽ mang
lại hiệu quả kinh tế cao, tiết kiệm về thời gian do vi khuẩn thích nghi và tăng trưởng nhanh,
tiết kiệm diện tích mặt bằng sản xuất, tiết kiệm chi phí đầu tư trang thiết bị, mặt khác quy
trình sản xuất khơng lệ thuộc vào điều kiện thời tiết khí hậu có thể chủ động trong quy
trình sản xuất
Một phần các kết quả nghiên cứu được thể hiện qua các bài báo dưới đây:
- Phạm Văn Phiến, Nguyễn Thúy Hương (2012). Tối ưu hóa q trình lên men
thu nhận Bacterial Cellulose từ môi trường rỉ đường và môi trường nước mía.
- Phạm Văn Phiến, Nguyễn Thúy Hương (2012). Tối ưu hóa q trình lên men
thu nhận Bacterial Cellulose từ mơi trường whey và môi trường phụ phẩm thơm.


iii

INVESTIGATION OF BACTERIAL CELLULOSE
FERMENTATION PROCESS IN DIFFERENT
MATERIALS
ABSTRACT
Bacterial Cellulose (BC) is a compatible biological product which has many
applications in various fields. Using cheap popular materials available in nature as well as
by-products from a production process for the BC fermentation will result in economic

effects and solve the environmental pollution. In this research, an optimized method was
used to determine suitable values of affecting factors: pH, temperature, time and nutrition
ratio (carbon to nitrogen ratio) for BC fermentation.
The research determined optimal conditions for various fermentation media: ‘old’
coconut milk (pH: 5.2; temperature: 30.30C; time: 92 hours; peptone: 1.5%; glucose:
3.325%), molasses (pH: 4.9; temperature: 300C; time: 107 hours; peptone: 1.0%; glucose:
2.78%), sugarcane juice (pH: 5.2; temperature: 30.5oC; time: 102 hours; peptone: 0.93%;
glucose: 3.65%), pineapple by-product (pH: 5.3; temperature: 30.6oC; time: 105 hours;
peptone: 0.77%; glucose: 3.48%), whey protein (pH: 5.2; temperature: 30oC; time: 110
hours; peptone: 1.02%; glucose: 3.64%). The results showed that these non-traditional
media can replace coconut milk which is usually used as the traditional medium.
Application of natural micro-organism source in BC fermentation will bring about
high economic profit, time saving due to the good ability in adaptation and growth of the
bacteria, minimum use of production area and low investment cost in equipment. In
addition, fermentation process does not depend on weather and climate conditions.
Therefore, all the production stages are under controll.
A part of these research results is shown in the articles below:
- Pham Van Phien, Nguyen Thuy Huong (2012). Optimization of fermentation
process to achieve bacterial cellulose on molasses medium and sugarcane juice medium.
- Pham Van Phien, Nguyen Thuy Huong (2012). Optimization of fermentation
process to achieve bacterial cellulose on pineapple medium and whey protein medium.


iv

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. i
TÓM TẮT LUẬN VĂN ............................................................................................ ii
MỤC LỤC................................................................................................................. iv
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT................................................................................ vii

DANH MỤC BẢNG............................................................................................... viii
DANH MỤC HÌNH ................................................................................................... x
CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU ............................................................................................. 1
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.................................................................... 5
2.1.KHÁI QUÁT VỀ VI SINH VẬT SINH TỔNG HỢP CELLULOSE (Bacterial
Cellulose- BC) ........................................................................................................ 5
2.1.1. Các vi sinh vật tổng hợp BC…………………………………………….5
2.1.2. Sơ lược Vi khuẩn Acetobacter xylinum…………………………………5
2.2. TỔNG QUAN VỀ BACTERIAL CELLULOSE…………………………….8
2.2.1. Cấu trúc của BC…………………………………………………………8
2.2.2. Tính chất của BC………………………………………………………10
2.2.3. Phân loại BC…………………………………………………………...11
2.2.4. Q trình sinh tổng hợp BC……………………………………………11
2.2.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp BC………………..15
2.2.6. Các nguồn nguyên liệu dùng để nuôi cấy thu nhận BC……………….17
2.3. MỘT SỐ ỨNG DỤNG QUAN TRỌNG ...................................................... 21
2.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGỒI NƯỚC CĨ LIÊN QUAN
ĐẾN ĐỀ TÀI ....................................................................................................... 23
CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP........................................................ 31
3.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU........................................................................... 31
3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ......................................................................... 36
3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................................................. 37
3.3.1. Khảo sát các đặc điểm sinh học của vi khuẩn Acetobacter xylinum..... 37
3.3.1.1. Kiểm tra đặc điểm, hình thái giống..................................................... 37
3.3.1.2. Khảo sát các đặc điểm sinh hóa đặc trưng .......................................... 37
3.3.2. Tối ưu điều kiện ni cấy phịng thí nghiệm:pH, nhiệt độ, thời gian.... 38
3.3.3. Tối ưu thành phần peptone và Glucose trong lên men tĩnh tạo S-BC ... 39
3.3.4. Kiểm định sự có ý nghĩa các hệ số hồi quy theo tiêu chuẩn student ..... 40
3.3.5. Kiểm tra tính tương thích của phương trình hồi quy ............................ 42
3.3.6. Tối ưu hóa thực nghiệm theo đường dốc nhất ...................................... 42

v

3.3.7. Khảo sát tốc độ lắc trong lên men chìm thu nhận A-BC ...................... 43
3.3.8. Khảo sát các đặc tính màng BC ............................................................. 43
3.3.8.1. Lên men tĩnh tạo màng BC trên năm loại môi trường nghiên cứu ..... 43
3.3.8.2. Phương pháp xử lý tinh sạch màng BC .............................................. 44
3.3.8.3. Khảo sát các tính chất màng BC ........................................................ 45
3.4. Phương pháp phân tích .................................................................................. 45
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ & BÀN LUẬN ................................................................ 48
4.1. KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VI KHUẨN A. xylinum BC16 48
4.1.1. Đặc điểm tế bào và hình thái vi khuẩn................................................... 48
4.1.2. Đặc điểm sinh lý của vi khuẩn ............................................................... 50
4.1.3. Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn ............................................................ 51
4.2.TỐI ƯU HĨA ĐIỀU KIỆN NI CẤY PHỊNG THÍ NGHIỆM: pH, NHIỆT
ĐỘ, THỜI GIAN.................................................................................................. 52
4.2.1. Trên mơi trường nước dừa già ............................................................... 52
4.2.2. Trên môi trường dịch rỉ đường .............................................................. 56
4.2.3. Trên mơi trường nước mía .................................................................... 60
4.2.4. Trên môi trường phụ phẩm thơm ........................................................... 64
4.2.5. Trên môi trường Whey protein .............................................................. 68
4.3. TỐI ƯU HÓA THÀNH PHẦN PEPTON VÀ GLUCOSE TRONG QUÁ
TRÌNH LEN MEN TĨNH TAO S-BC ................................................................. 72
4.3.1. Trên môi trường nước dừa già ............................................................... 72
4.3.2. Trên môi trường rỉ đường ...................................................................... 76
4.3.3. Trên môi trường nước mía ..................................................................... 79
4.3.4. Trên mơi trường phụ phẩm thơm ........................................................... 82
4.3.5. Trên môi trường Whey protein .............................................................. 86
4.4. KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA TỐC ĐỘ LẮC TRONG QUÁ TRÌNH

LÊN MEN LẮC TAO A-BC................................................................................ 89
4.5. SO SÁNH, ĐÁNH GIÁ, ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH LÊN MEN THU NHẬN
BC TRÊN CÁC MƠI TRƯỜNG NGHIÊN CỨU ............................................... 91
4.5.1. Tổng hợp điều kiện tối ưu ni cấy phịng thí nghiệm .......................... 91
4.5.2. Tỷ lệ pepton và glucose tối ưu trong lên men bề mặt tạo S-BC. ........... 92
4.5.3. Đề xuất quy trình lên men tĩnh tạo màng S-BC..................................... 94
4.5.4. Đề xuất quy trình lên men chìm tạo A-BC ............................................ 95


vi

4.6. KHẢO SÁT CÁC ĐẶC TÍNH CỦA MÀNG BC......................................... 95
4.6.1. Khảo sát độ hút ẩm của màng BC.......................................................... 96
4.6.2. Khảo sát độ chịu lực, độ kéo đứt, độ tro của màng BC ........................ .98
4.6.3. Khảo sát độ cảm quan về màu sắc, mùi vị, độ trong của màng BC....... 99
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN & ĐỀ NGHỊ ................................................................ 101
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


vii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
BC: bacterial cellulose – cellulose của vi khuẩn
PC: Plant Cellulose – cellulose của thực vật

S-BC: static bacterial cellulose – cellulose của vi khuẩn được nuôi cấy tĩnh
A-BC: Agitated bacterial cellulose – cellulose của vi khuẩn được ni cấy lắc
CCD: Central Composite Design – Mơ hình cấu trúc có tâm
CS: cellulose synthase

FBP: fructose –1,6–biphosphate phosphatase

PTS: hệ thống phosphotransferases
UGP: pyrophosphorylase

GK: glucosekinase

UDPGlc: uridine diphosphoglucose

FK: fructosekinase

Fru-bi-P: fructose –1,6-bi-phosphate

G6PDH: glucose – 6 – phosphate dehydrogenase

Fru-6-P: fructose – 6 – phosphate

1PFK: fructose –1– phosphate kinase

Glc-6-P: glucose – 6 – phosphate

PGI:phosphoglucoisomerase

PGA: phosphogluconic acid

PGM:phosphoglucomutase

UDPGlc: uridine diphosphoglucose

WSC: Chitosan tan trong nước

PVP: Polyvinyl pyrolidione
DAP: Diamonium phosphate
SA: Sulfat amonium
SEM: scanning electron microscopy – kính hiển vi điện tử quét
PET: polyethylene terephthalate
ePTFE: expanded polytetrafluoroethylene
hepPVC: Heparin-coated PVC tubes
GAG: nhuộm glycosaminoglycan
Gpa: Giga pascal= 109 Pa – lực trên một đơn vị diện tích
Mpa: Mega pascal


viii

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Cấu trúc sản phẩm BC của một số loài vi khuẩn………………………...5
Bảng 3.1. Các mức và khoảng biến thiên của nhóm thí nghiệm 1……………….. 39
Bảng 3.2. Các mức và khoảng biến thiên của nhóm thí nghiệm 2………………...40
Bảng 3.3. Giá trị thực nghiệm hiện tại tâm phương án……………………………41
Bảng 4.1. Ảnh hưởng nhiệt độ đến A. xylinum BC16 trên môi trường dịch thể….50
Bảng 4.2. Ảnh hưởng pH đến A. xylinum BC 16 trên môi trường dịch thể………..51
Bảng 4.3. Kết quả kiểm tra đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn………………………51
Bảng 4.4. Kết quả (OD) thực nghiệm nuôi cấy trên môi trường nước dừa………..52
Bảng 4.5. Giá trị phương sai và phân bố theo tiêu chuẩn Student…………………53
Bảng 4.6. Thí nghiệm theo hướng gradient của mật độ quang của dịch nuôi cấy…55
Bảng 4.7. Kết quả (OD) thực nghiệm nuôi cấy trên môi trường rỉ đường……...…56
Bảng 4.8. Giá trị phương sai và phân bố theo tiêu chuẩn Student…………………57
Bảng 4.9. Thí nghiệm theo hướng gradient của mật độ quang của dịch nuôi cấy…59
Bảng 4.10. Kết quả (OD) thực nghiệm nuôi cấy trên môi trường nước mía………60
Bảng 4.11. Giá trị phương sai và phân bố theo tiêu chuẩn Student…………….….69

Bảng 4.12. Thí nghiệm theo hướng gradient của mật độ quang của dịch nuôi cấy..63
Bảng 4.13. Kết quả (OD) thực nghiệm nuôi cấy trên môi trường dịch thơm……...64
Bảng 4.14. Giá trị phương sai và phân bố theo tiêu chuẩn Student………………..65
Bảng 4.15. Thí nghiệm theo hướng gradient của mật độ quang của dịch nuôi cấy..67
Bảng 4.16. Kết quả (OD) thực nghiệm nuôi cấy trên môi trường whey protein…..68
Bảng 4.17. Giá trị phương sai và phân bố theo tiêu chuẩn Student………………..69
Bảng 4.18. Thí nghiệm theo hướng gradient của mật độ quang của dịch nuôi cấy..71
Bảng 4.19. Kết quả (g - BC) thực nghiệm trên môi trường nước dừa……………..72
Bảng 4.20. Giá trị phương sai và phân bố theo tiêu chuẩn Student………………..73
Bảng 4.21. Thí nghiệm theo hướng gradient của năng suất S-BC…………...…....74
Bảng 4.22. Kết quả (g - BC) thực nghiệm nuôi cấy trên môi trường rỉ đường……76
Bảng 4.23. Giá trị phương sai và phân bố theo tiêu chuẩn Student………………..76
Bảng 4.24. Thí nghiệm theo hướng gradient của năng suất S-BC…………...……78


ix

Bảng 4.25. Kết quả (g-BC) thực nghiệm nuôi cấy trên mơi trường nước mía…….79
Bảng 4.26. Giá trị phương sai và phân bố theo tiêu chuẩn Student………………..80
Bảng 4.27. Thí nghiệm theo hướng gradient của năng suất S-BC………...……....81
Bảng 4.28. Kết quả (g-BC) thực nghiệm nuôi cấy trên môi trường dịch thơm……83
Bảng 4.29. Giá trị phương sai và phân bố theo tiêu chuẩn Student………………..83
Bảng 4.30. Thí nghiệm theo hướng gradient của năng suất S-BC…………...…....85
Bảng 4.31. Kết quả (g-BC) thực nghiệm nuôi cấy trên môi trường whey…...……86
Bảng 4.32. Giá trị phương sai và phân bố theo tiêu chuẩn Student………………..87
Bảng 4.33. Thí nghiệm theo hướng gradient của năng suất S-BC…………...…....88
Bảng 4.34. Kết quả thực nghiệm xác định tốc độ lắc tối ưu…………………….…90
Bảng 4.35. Tóm tắt các điều kiện ni cấy tối ưu……..…………………………..91
Bảng 4.36. Tóm tắt tỷ lệ thành phần Pepton và Glucose tối ưu…………...............93
Bảng 4.37. Tóm tắt quy trình lên men lên men tĩnh trên các môi trường…………94

Bảng 4.38. Khảo sát độ hút ẩm của màng BC……………………………………..96
Bảng 4.39. Khảo sát tỷ lệ tro và độ bền của màng BC…………………………….98
Bảng 4.40. Khảo sát độ cảm quan của màng BC……………………………….....99


x

DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Cấu trúc BC……………………………………………………………....8
Hình 2.2. Cellulose vi khuẩn………………………………………………………..9
Hình 2.3. Cellulose thực vật………………………………………………………...9
Hình 2.4. BC tạo thành trong ni cấy tĩnh (A) và ni cấy lắc (B)………………10
Hình 2.5. Cấu trúc không gian của cellulose I (A) và cellulose II (B)…………….12
Hình 2.6. Sơ đồ các con đường tổng hợp cellulose ở A. xylinum……...……………13
Hình 2.7. Sơ đồ dự đốn q trình sinh tổng hợp và tiết ra cellulose……..……...14
Hình 2.8. Sản phẩm mật rỉ đường……………………….……...............................18
Hình 2.9. Cấu trúc của -lactoglobulin……………...…………………………….20
Hình 2.10. Cấu trúc của α-lactalbumin…………………………………………….20
Hình 3.1. Sơ đồ nội dung nghiên cứu của đề tài………...………………………...36
Hình 3.2. Sơ đồ quy trình chung lên men thu nhận BC…………………...………43
Hình 3.3. Quy trình xử lý màng BC……………...………………………………..44
Hình 3.4. Đo số lượng vi sinh vật bằng phương pháp đo độ đục……...…………..45
Hình 4.1. Hình dạng và cách sắp xếp của A. xylinum BC 16…………..………...48
Hình 4.2. Khuẩn lạc A. xylinum BC 16 trên đĩa Petri…………………………….49
Hình 4.3. Vi khuẩn A. xylinum BC 16 trên mơi trường thạch nghiêng…...……….49
Hình 4.4. Khả năng phát triển của A. xylinum BC16 trong môi trường dịch thể.....50
Hình 4.5. Đồ thị so sánh năng suất A-BC tươi trên các mơi trường ngun liệu....91
Hình 4.6. Đồ thị so sánh năng suất S-BC và A-BC trên cùng mơi trường…...…...94
Hình 4.7. Các sản phẩm S-BC chưa xử lý…..……………………………………96
Hình 4.8. Các sản phẩm S-BC đã xử lý………...…………………………………97

Hình 4.9. Đồ thị so sánh năng suất S-BC khô trên các môi trường nguyên liệu.....98
Hình 4.10. Đồ thị độ hút ẩm của màng BC trên các các môi trường……….....…..99


-1-

ĐẶT VẤN ĐỀ
Cellulose là hợp chất cao phân tử sinh học (biopolymer), là thành phần hữu cơ
chiếm số lượng lớn trên trái đất, có tầm quan trọng trong nền kinh tế toàn cầu, là thành
phần cấu tạo chủ yếu của tế bào thực vật. Ở vi sinh vật, cellulose là sản phẩm
polysaccharide ngoại bào, được gọi là Cellulose vi khuẩn hay Bacterial Cellulose.
Bacterial Cellulose (BC) là sản phẩm trao đổi chất cơ bản, đồng thời là lớp màng
bảo vệ của vi sinh vật, mặt khác đã có những cơng trình nghiên cứu cho thấy vai trò của
BC còn là nguồn dự trữ năng lượng cần thiết khi điều kiện môi trường sống trở nên
khắc nghiệt đối với vi sinh vật. Trong khi cellulose thực vật (PC: Plant Cellulose) đóng
vai trị quan trọng tạo cấu trúc lớp vỏ của thực vật. BC và PC có cấu trúc hóa học giống
nhau nhưng tính chất vật lý và hóa học thì khác nhau [14].
Sản phẩm BC được tổng hợp bởi một số loài vi khuẩn có khả năng tạo acid acetic
thuộc

các

chủng

như

Acetobacter,

Rhizobium,

Agrobacterium,

Achromobacter, Azotobacter, Rhizobium, Sarcina, và Salmonella

Aerobacter,
[14]

trong đó

Acetobacter xylinum là là vi sinh vật được xem là giống tạo BC hiệu quả nhất, gần đây
nó được xếp vào giống mới Glucoacetobacter bao gồm một số loài G. xylinus, G.
hansenii, G. europaeus, G. oboediens, và G. intermedius. Sản xuất BC từ Acetobacter
xylinum lần đầu tiên được báo vào năm 1886 bởi AJ Brown khi ông quan sát thấy rằng
các tế bào Acetobacter có khả năng sản xuất cellulose với sự hiện diện của oxy và
glucose [15].
BC là hợp chất tương hợp sinh học, không độc hại, có nhiều tính chất độc đáo với
cấu trúc siêu mịn, xốp nên có nhiều ứng dụng trong thực tế ở nhiều lĩnh vực như: làm
giấy cao cấp, tạo mặt bóng bề mặt các trang tạp chí, làm ván ép, tấm vách, tấm lót sàn,
làm vải chuyên dụng chất lượng cao như đồ thể thao. Hiện nay đã được công ty Sony sử
dụng BC làm màng lọc truyền âm thanh trong kỹ thuật chế tạo tai nghe cao cấp [16, 17].


-2-

Trong ngành thực phẩm, BC dùng làm thực phẩm ăn kiêng, món tráng miệng như
thạch dừa (Nata-de-Coco), chất làm đặc, chất ổn định dịch huyền phù, làm màng bảo
quản thực phẩm. Ngồi ra BC cịn được dùng làm chất mang trong kỹ thuật cố định tế
bào vi sinh vật [24, 51].
Trong lãnh vực y học màng BC được ứng dụng làm băng, gạc vô trùng vết thương,
làm da nhân tạo, màng điều trị phỏng, và đang được nghiên cứu cho các ứng dụng đặc

biệt khác như: mạch máu nhân tạo, tạo bộ khung trong cấy ghép mô sụn, làm màng vá
lỗ thoát vị, màng cứng trong hộp sọ, chất thay thế mô mềm, hệ thống khung treo cổ
bàng quang [16, 17, 57].
BC còn là vật liệu sinh học được ứng dụng trong ngành mỹ phẩm với vai trò chất
ổn định trong kem dưỡng da, mặt nạ đắp mặt, gel vuốt tóc, làm màng lọc trong cơng
nghệ xử lý nước thải bảo vệ môi trường.
Những ứng dụng rộng rãi của chế phẩm polymer sinh học này cho thấy nhiều ưu
điểm nhưng lại phụ thuộc nhiều vào quy mô sản xuất cũng như chi phí đầu tư sản xuất,
nên cần có những nghiên cứu cơ bản và nghiên cứu ứng dụng để cải thiện về giống, đa
dạng hóa mơi trường ni cấy, điều kiện ni cấy để phát triển quy trình cơng nghệ lên
men sản xuất chế phẩm BC hiệu quả hơn.
Ở nước ta việc ứng dụng sản phẩm BC còn rất hạn chế, thường chỉ được sản xuất
từ nguồn nguyên liệu là nước dừa già, sản phẩm chủ yếu làm thạch dừa (Nata-de Coco)
làm nguồn cung cấp thực phẩm, một số được ứng dụng thử nghiệm làm màng trị bỏng,
gạc băng bó vết thương. Nhưng quy mơ chỉ ở mức độ nhỏ và nguồn nguyên liệu này
chưa thích ứng cho sản xuất quy mô lớn.
Cấu trúc của BC phụ thuộc chặt chẽ vào điều kiện nuôi cấy, nguồn nguyên liệu
làm môi trường và phương thức ni cấy. Từ đó cho ta các sản phẩm BC với những
thuộc tính vật lý và cấu trúc đa phân tử khác nhau dẫn đến những khả năng ứng dụng
khác nhau, đáp ứng nhu cầu thực tiễn đặt ra.


-3-

Việc nghiên cứu ứng dụng nguồn vi sinh vật trong tự nhiên vào sản xuất sản phẩm
BC sẽ mang lại hiệu quả kinh tế cao, tiết kiệm về thời gian do vi khuẩn thích nghi và
tăng trưởng nhanh, tiết kiệm diện tích mặt bằng sản xuất, tiết kiệm chi phí đầu tư trang
thiết bị, mặt khác quy trình sản xuất khơng lệ thuộc vào điều kiện thời tiết khí hậu có
thể chủ động trong các khâu sản xuất [9].
Mặt khác việc nghiên cứu tận dụng tối đa các nguồn nguyên liệu sẵn có, phổ biến

trong nước, các nguồn phụ phế phẩm của các quá trình sản xuất khác vào việc sản xuất
BC sẽ tạo nên sự phong phú, đa dạng môi trường nguyên liệu nuôi cấy và đa dạng
nguồn sản phẩm ứng dụng thực tiễn, tiết kiệm chi phí sản xuất và hạ thấp giá thành sản
phẩm, tạo ra giá trị kinh tế ứng dụng hiệu quả đồng thời giải quyết được nguy cơ ô
nhiễm môi trường do các chất thải từ nguồn phụ phẩm, phế phẩm công nghiệp gây ra.
Hiện nay trong bối cảnh thế giới thường xuyên có xung đột, chiến tranh, cùng với
thiên tai, biến đổi khí hậu toàn cầu. Việc khai thác Cellulose từ nguồn thực vật cây
trồng khơng cịn thuận lợi do nạn phá rừng, do thiên tai, lũ lụt, nạn xói mịn bạc màu đất
đai. Việc khai thác và sử dụng Cellulose từ nguồn gỗ rừng tự nhiên một cách sâu rộng
sẽ dẫn đến những hậu quả của sự nóng lên tồn cầu do gia tăng khí thải CO2 dẫn đến
gây hủy hoại cho môi trường tự nhiên. Mặt khác để khai thác cây trồng làm nguồn cung
cấp Cellulose phải cần nhiều hơn ba mươi năm cho cây phát triển, trưởng thành, trong
khi sử dụng nguồn vi khuẩn sản xuất BC chỉ trong vài ngày. Vì vậy việc nghiên cứu
ứng dụng nguồn vi sinh vật trong quá trình lên men thu nhận BC, cùng với việc nghiên
cứu tối ưu hóa điều kiện lên men, tối ưu hóa thành phần mơi trường ni cấy và phương
thức lên men sẽ đem lại nhiều lợi ích kinh tế, có ý nghĩa thiết thực cho xã hội và góp
phần bảo vệ nguồn tài nguyên thiên nhiên.
Để góp phần giải quyết những vấn đề đặt ra, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu:
“Khảo sát quá trình lên men thu nhận và tạo chế phẩm Bacterial Cellulose từ
những nguồn nguyên liệu khác nhau”.


-4-

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Khảo sát quá trình lên men thu nhận BC từ nhiều nguồn nguyên liệu phổ biến khác
nhau, từ đó xây dựng quy trình lên men thu nhận BC hiệu quả.
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
-

Khảo sát một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn A. xylinum BC16.

-

Khảo sát q trình lên men thu nhận BC trên mơi trường truyền thống (nước dừa
già) và các môi trường không truyền thống (rỉ đường, nước mía, phụ phẩm từ
thơm, dịch whey protein).

-

Tối ưu hóa điều kiện ni cấy phịng thí nghiệm: pH, nhiệt độ và thời gian.

-

Tối ưu hóa điều kiện dinh dưỡng căn bản: tỷ lệ Nitơ (pepton hoặc whey) và
Cacbon (glucose).

-

Tối ưu hóa tốc độ lắc trong lên men chìm thu nhận A-BC.

-

So sánh, đánh giá hiệu quả quá trình lên men tạo sản phẩm BC trên năm loại mơi
trường nghiên cứu. Từ đó xây dựng quy trình lên men sử dụng vi khuẩn A.
xylinum BC16 thu nhận sản phẩm BC đạt hiệu quả.

-

Bước đầu khảo sát một số đặc tính của màng BC.

-5-

2.1. KHÁI QUÁT VỀ VI SINH VẬT TỔNG HỢP BACTERIAL CELLULOSE
2.1.1. Các vi sinh vật sinh tổng hợp BC
Cellulose vi khuẩn được tổng hợp bởi một số loài vi khuẩn có khả năng tạo acid
acetic trong điều kiện hiếu khí thuộc các chủng như: Acetobacter, Alcaligenes,
Pseudomonas, Achromobacter, Aerobacter, Azotobacter, Rhizobium, Agrobacterium,
Sarcina, Salmonella. Con đường tổng hợp và cơ chế điều hịa tổng hợp sản phẩm BC ở
các lồi vi khuẩn khác nhau là giống nhau, nhưng cấu trúc BC ở mỗi lồi thì khác nhau
[14]

. Sự khác biệt đáng kể thuộc về tính hóa lý của các sản phẩm BC chủ yếu ở chiều dài

của chuỗi polymer, tính kết tinh và trạng thái kết tinh của nó, từ đó xác định được các
tính chất vật lý của sản phẩm như: độ bền cơ học, độ hòa tan trong các dung môi, khả
năng chịu được các ảnh hưởng của các tác nhân gây biến tính [48].
Bảng 2.1. Cấu trúc sản phẩm BC của một số loài vi khuẩn [14, 22] .
STT
1
2
3
4
5
6
7
8
9
2.1.2.

Giống
Acetobacter
Achromobacter
Aerobacter
Agrobacterium
Alcaligen
Pseudomonas
Rhizobium
Sarcina
Zoogloea

Cấu trúc Cellulose
Lớp màng ngoại bào tạo thành các dải
Sợi
Sợi
Sợi ngắn
Sợi
Các sợi khơng tách biệt
Sợi ngắn
Cellulose dị hình
Chưa rõ cấu trúc

Sơ lược Vi khuẩn Acetobacter xylinum

A. xylinum hiện được xem là giống vi khuẩn sinh tổng hợp BC hiệu quả nhất và
được ứng dụng nhiều trong thực tế

[5, 14]

. Vi khuẩn là tác nhân chính của q trình lên

men acetic nên còn được gọi là vi khuẩn acetic, chúng sống phổ biến trong tự nhiên, có
thể phân lập từ dấm chua, rượu bia, nước hoa quả, khơng khí, đất, nước [3].


-6-



Phân loại

Theo khóa phân loại Bergey, vi khuẩn A. xylinum thuộc:
- Lớp Schizomycetes
- Bộ Pseudomonadales
- Bộ phụ Pseudomonadieae
- Họ Pseudomonadaceae
- Giống Acetobacter
- Lồi xylinum


Đặc điểm hình thái

Tế bào A. xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, dài khoảng 1-2 µm,
Gram (-), có thể di động hoặc khơng di động, không sinh bào tử. Tế bào đứng riêng lẻ,
xếp đôi, hoặc kết thành chuỗi dài [18, 31].
Khuẩn lạc của A. xylinum trên mơi trường thạch có dạng hình trịn, nhỏ (đường
kính: 2 – 5 mm), màu trắng đục, bề mặt nhầy và trơn bóng, phần giữa khuẩn lạc lồi,
dày và sẫm màu hơn các phần xung quanh, rìa mép nhẵn. Khuẩn lạc mọc riêng lẻ khi
còn non, về già khuẩn lạc dính nhau từng cụm theo đường cấy.



Đặc điểm sinh lý và sinh hóa

- Các đặc điểm sinh lý :
A. xylinum thuộc loại vi khuẩn hiếu khí bắt buộc nên tăng trưởng ở bề mặt tiếp
xúc giữa môi trường lỏng và mơi trường khơng khí. Vi khuẩn có khả năng tạo màng
cellulose khá dày và chắc trên môi trường ni cấy lỏng. Có giả thuyết cho rằng màng
mỏng cellulose được sản xuất bởi A. xylinum được sử dụng cho việc làm nổi các tế bào
để giúp chúng có thể nhận được oxy từ mơi trường khơng khí [34, 35, 36].
Vi khuẩn A. xylinum phát triển trong khoảng nhiệt độ (25 ÷ 32°C), pH khoảng từ
(4,0 ÷ 6,0), nồng độ ethanol có thể lên tới 10%, pH tối ưu của chúng là 5,5

[27]

. Vi


-7-

khuẩn không phát triển được ở nhiệt độ 37°C ngay khi trong mơi trường ni cấy có
nguồn dinh dưỡng tối ưu.
- Các đặc điểm sinh hóa đặc trưng [36]:



-

Có khả năng oxy hóa ethanol thành acid acetic.

-

Cho phản ứng Catalase dương tính.

-

Khơng phát triển trên mơi trường Hoyer.

-

Chuyển hóa Glucose thành acid.

-

Chuyển hóa Glycerol thành Dihydroxyacetone.

-

Khơng sinh sắc tố nâu trên khuẩn lạc.

-

Có khả năng sinh tổng hợp Cellulose.

Đặc điểm dinh dưỡng

A. xylinum cần các nguồn dinh dưỡng như carbon, nitơ và các chất sinh
trưởng đa dạng. Chúng có thể sử dụng các loại đường, rượu, các acid hữu cơ làm
nguồn cung cấp carbon và dùng muối amôn làm nguồn cung cấp nitơ. Vi khuẩn có
thể sử dụng được nhiều loại đạm như: pepton, cao nấm men, nấm men, dịch đậu nành

và sử dụng được các loại đường khác nhau như: glucose, galactose, sucrose, maltose,
lactose, maltose, dextrin

[5]

. Chúng có khả năng oxy hóa rượu etylic thành acid acetic,

propylic thành acid propionic, butylic thành acid butylic, khơng oxy hóa được metylic
và các rượu bậc cao khác. Vi khuẩn có thể chuyển hóa glucose thành acid gluconic là
ngun nhân làm pH mơi trường giảm từ 1 – 2 đơn vị và giảm một phần năng suất tổng
hợp cellulose [28, 32].


-8-

2.2. TỔNG QUAN VỀ BACTERIAL CELLULOSE
2.2.1. Cấu trúc của BC
BC là một chuỗi polymer do các gốc glucopyranose nối nhau bằng liên kết -1,4
glucan. Những chuỗi glucan này được vi khuẩn tổng hợp và kết nối lại tạo thành những
thớ sợi thứ cấp (sub-fibrils), có bề rộng 1,5 nm. Đây là những thớ sợi tự nhiên, mảnh
nhất khi so sánh với sợi cellulose sơ cấp trong tượng tầng ở một vài loại thực vật cũng
như lớp mucus của Cydonia oblonga. Các thớ sợi thứ cấp (subfibrils) kết lại thành
những vi sợi (microfibrils), những vi sợi tạo thành bó (bundles), cuối cùng những bó
kết lại tạo thành dải (ribbons). Mỗi dải có chiều dày (3÷4 nm) và chiều rộng (70÷80
nm). Các dải siêu mịn của BC có chiều dài từ (1÷9 m) tạo thành cấu trúc mắt lưới dày
đặc, được ổn định nhờ các liên kết hidro, đó là lớp film (pellicle).

Hình 2.1. Cấu trúc BC [34].
Cellulose vi khuẩn (BC-Bacterial Cellulose) và cellulose thực vật (PC-Plant
Cellulose) tương tự như nhau về mặt hóa học, chúng có cùng cơng thức phân tử

(C6H10O5)n và là một polymer không phân nhánh, nhưng cả hai khác nhau ở mức độ
polymer, PC có khoảng (13000 ÷ 14000) đơn vị và BC có khoảng (2000 ÷ 6000) đơn
vị, trong vài trường hợp có thể đạt đến (16000 ÷ 20000) đơn vị

[14, 15, 28]

. Ngoài ra BC


-9-

cịn có chỉ số kết tinh cao hơn PC (trên 60%). BC có đường kính khoảng bằng 1/100
đường kính của PC nên chúng có độ mịn, độ xốp cao hơn. BC có độ chịu lực cao, hệ số
Young (độ chịu lực) bằng 15 Gpa đối với sản phẩm sấy khô, hệ số này xấp xỉ với nhơm.

Hình 2.2. Cellulose vi khuẩn (2 m) [42].

Hình 2.3. Cellulose thực vật (200 m) [42].

Cấu trúc của BC phụ thuộc chặt chẽ vào điều kiện và phương thức nuôi cấy. Trên
môi trường nuôi cấy tĩnh, vi khuẩn tổng hợp màng mỏng cellulose trên bề mặt của dịch
nuôi cấy, tại ranh giới giữa bề mặt dịch lỏng và lớp khơng khí giàu oxy. Các miếng này
gọi là màng BC trên môi trường tĩnh được ký hiệu là S-BC (Static-BC). Các sợi
cellulose sơ cấp liên tục được đẩy ra từ những lỗ xốp xếp dọc trên bề mặt của tế bào vi
khuẩn, kết tinh lại thành các vi sợi và bị đẩy xuống sâu hơn trong môi trường dinh
dưỡng. Các dải cellulose từ môi trường tĩnh tạo nên các mặt phẳng song song khơng có
tổ chức, có vai trị chống đỡ cho quần thể tế bào A. xylinum. Trong môi trường nuôi
cấy lắc, các sợi BC được tạo ra nối với nhau và bẻ nhánh nhiều hơn so với trong môi
trường nuôi cấy tĩnh, sản phẩm được kí hiệu là A-BC (Agitated-BC). Sản phẩm A-BC
được tạo ra dưới dạng các hạt nhỏ, các hạt hình sao và các sợi dài sợi ngắn, chúng phân

tán rất tốt trong môi trường [14].
Sự khác biệt về cấu trúc không gian ba chiều của S-BC và A-BC được quan sát rõ
hơn dưới kính hiển vi điện tử quét (SEM). Những sợi S-BC kéo dài và nằm chồng lên
các sợi khác theo chiều đan chéo nhau trong khi các sợi A-BC thì rối rắm và cong.


- 10 -

Ngoài ra, bề mặt cắt ngang của sợi A-BC (0,1ữ0,2 àm) ln hn si S-BC (0,05ữ0,1
àm). S khỏc biệt về hình thái giữa hai lọai BC này làm cho mức độ kết tinh và kích cỡ
kết tinh của chúng cũng khác nhau [14].

Hình 2.4. BC tạo thành trong môi truờng nuôi cấy tĩnh (A) và nuôi cấy lắc (B) [14].
2.2.2. Tính chất của BC
- BC rất trong suốt, có bản chất là polysaccharide trọng lượng phân tử lớn.
- Sợi cellulose được tổng hợp có trọng lượng nhẹ.
- Kích thước ổn định, có sức căng và độ bền sinh học cao.
- Khơng hồ tan trong nước, nhưng hồ tan trong dung dịch kiềm.
- Khả năng giữ nước tốt, trong điều kiện ngập nước có thể vận chuyển nước xen vào
các sợi cellulose. Có khả năng kết sợi, tạo tinh thể tốt, có tính bền cơ và chịu nhiệt cao.
- Độ tinh sạch cao hơn so với các loại cellulose khác, khơng chứa ligin và
hemicellulose.
- Có thể bị phân huỷ hoàn toàn bởi một số vi sinh vật và là nguồn năng lượng có thể
phục hồi.
- Có khả năng kết sợi, tạo tinh thể tốt, có tính bền cơ và tính chịu nhiệt cao. [32].


- 11 -

2.2.3. Phân loại BC

Trong tự nhiên tồn tại phổ biến hai dạng kết tinh của BC là cellulose I và cellulose
II, được phân biệt bởi các phương pháp phân tích bằng tia X, tia quang phổ hoặc tia
hồng ngọai. Tùy thuộc vào điều kiện, môi trường nuôi cấy, giống vi khuẩn, mà tồn tại
dạng cellulose nào chiếm ưu thế.
- Cellulose I: được tổng hợp bởi đa số thực vật và vi khuẩn A. xylinum ở môi
trường lên men tĩnh. Các chuỗi β-1,4 glucan sắp xếp song song với nhau theo một
trục. BC tạo ra từ môi trường nuôi cấy tĩnh có dạng màng dày trên bề mặt mơi trường,
có ưu thế trong việc tạo màng, có độ chịu lực cao.
- Cellulose II: các chuỗi β-1,4 glucan sắp xếp ngẫu nhiên, hầu như không song
song, liên kết với nhau bởi một lượng lớn liên kết hydrogen giúp cho nó có độ bền về
nhiệt, thường được tổng hợp trong mơi truờng nuôi cấy lắc. Cellulose II chỉ được tổng
hợp ở một vài sinh vật (một số loại tảo, một số vi khuẩn: Sarcina ventriculi, A.
xylinum...). Các sợi BC tạo ra thường phân bố trong khắp môi trường nuôi cấy hoặc tạo
ra các hạt nhỏ hoặc hạt hình sao. BC tạo ra từ mơi trường ni cấy lắc có độ chịu lực
khơng cao nhưng có ưu thế ở độ trương nở, độ ngậm nước cao [14, 15].
A. xylinum tổng hợp được cả hai loại cellulose I và cellulose II. Từ cellulose I có
thể chuyển thành cellulose II, nhưng cellulose II thì khơng có khả năng chuyển thành
cellulose I [14, 42].
2.2.4. Q trình sinh tổng hợp BC
A. xylinum là vi khuẩn khơng có khả năng quang hợp, chúng có thể sử dụng
nguồn carbon là các monosaccharide để tạo ra cellulose ngoại bào. Trong môi trường
nuôi cấy tĩnh, A. xylinum tạo ra màng cellulose ngay trên bề mặt tiếp xúc giữa môi
trường nuôi cấy và mặt thống khơng khí.