Chế tạo hạt nano vàng gắn kháng thể ứng dụng cho phát hiện nhanh viruts cúm a luận văn ths vật liệu và linh kiện nanô

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ

PHẠM VĂN ĐỒNG

CHẾ TẠO HẠT NANO VÀNG GẮN KHÁNG THỂ ỨNG
DỤNG CHO PHÁT HIỆN NHANH VIRUS CÚM A

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Hà Nội – 2010


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ

PHẠM VĂN ĐỒNG

CHẾ TẠO HẠT NANO VÀNG GẮN KHÁNG THỂ ỨNG
DỤNG CHO PHÁT HIỆN NHANH VIRUS CÚM A
Chuyên ngành: Vật liệu và Linh kiện Nanơ
(Chun ngành đào tạo thí điểm)

LUẬN VĂN THẠC SĨ

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS. TS. CHU HOÀNG HÀ

Hà Nội – 2010

MỤC LỤC

Trang
MỞ ĐẦU .........................................................................................................................1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU....................................................3
1.1. Tổng quan về hạt nano kim loại ...............................................................................3
1.2. Hiệu ứng cộng hưởng Plasmon bề mặt của hạt nano kim loại. ................................3
1.3. Các loại hạt nano ứng dụng trong y sinh học ...........................................................5

1.3.1. Các hạt nano kim loại.............................................................................. 5
1.3.2. Các hạt nano cấu trúc lõi/vỏ.................................................................... 6
1.3.3. Hạt nano từ tính....................................................................................... 6
1.3.4. Chấm lượng tử......................................................................................... 7
1.4. Hạt nano vàng...........................................................................................................7
1.5. Các phương pháp chế tạo hạt nano vàng..................................................................9

1.5.1. Phương pháp Turkevich ........................................................................ 10
1.5.2. Phương pháp Brust................................................................................ 11
1.5.3. Phương pháp Perrault............................................................................ 11
1.5.4. Phương pháp Martin.............................................................................. 11
1.5.5. Phương pháp rung siêu âm (sonolysis) ................................................. 12
1.6. Các ứng dụng trong y sinh học của AuNPs............................................................12

1.6.1. Đánh dấu sinh học................................................................................. 13
1.6.2. Phân phát thuốc và chuyển gen............................................................. 13
1.6.3. Sensor sinh học ...................................................................................... 14
1.7. Kit chẩn đoán bệnh bằng que thử nhanh ................................................................14

1.7.1. Giới thiệu............................................................................................... 14
1.7.2. Sơ đồ nguyên lý của que thử nhanh ...................................................... 15

1.8. Kháng thể................................................................................................................17

1.8.1. Giới thiệu chung.................................................................................... 17
1.8.2. Giới thiệu về vùng biến đổi của kháng thể (Single Chain Variable
Fragmet-scFv) ................................................................................................. 18
1.9. Bệnh cúm gia cầm A/H5N1 ...................................................................................19


Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP...............................................................22
2.1. Vật liệu ...................................................................................................................22
2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................22

2.2.1. Phương pháp chế tạo dung dịch nano vàng (AuNPs) ........................... 22
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu các nhân tố ảnh hướng đến chất lượng mẫu 25
2.2.2.1. Thời gian phản ứng ............................................................................ 25
2.2.2.2. Thay đổi lượng chất khử Na3C6H5Na3 ............................................... 25
2.2.3. Phương pháp nghiên cứu kích thước, hình thái và cấu trúc hóa học của
AuNPs. ............................................................................................................ 26
2.2.3.1. Phân tích bằng phổ hấp thụ UV ......................................................... 26
2.2.3.2. Phân tích bằng hiển vi điện tử quét (SEM)........................................ 27
2.2.3.3. Phân tích bằng phổ hấp thụ hồng ngoại FTIR ................................... 28
2.2.4. Phương pháp gắn kháng thể kháng virus cúm A/H5N1 lên bề mặt hạt
nano vàng ........................................................................................................ 30
2.2.4.1. Tìm pH tối ưu cho phản ứng gắn kháng thể và nano vàng ................ 30
2.2.4.2. Tạo phức hợp kháng thể gắn trên bề mặt hạt nano vàng (kháng
thể/nano vàng) ................................................................................................. 31
2.2.5. Phương pháp phát hiện virus cúm A/H5N1 sử dụng phức hợp kháng
thể/nano vàng. ................................................................................................. 32
2.2.5.1. Thiết kế que thử nhanh đơn giản........................................................ 32
2.2.5.2. Kiểm tra sự hoạt động của phức hợp kháng thể/nano vàng............... 33

2.2.5.2.1. Kiểm tra bằng Dot blot.................................................................... 33
2.2.5.2.2. Phương pháp que thử nhanh............................................................ 34
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.....................................................................36
3.1. Kết quả chế tạo hạt nano vàng................................................................................36

3.1.1. Kích thước, hình thái............................................................................. 36
3.1.2 Phân tích thành phần EDX..................................................................... 38
3.1.3. Đặc trưng quang học của AuNPs.......................................................... 38
3.1.4. Cấu trúc hóa học của AuNPs. ............................................................... 39
3.1.5. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng AuNPs ................... 40


3.1.5.1. Thời gian phản ứng ............................................................................ 40
3.1.5.2. Thay đổi lượng chất khử natri citrate................................................. 41
3.1.5.3. Thời gian và điều kiện bảo quản hạt AuNPs ..................................... 42
3. 2. Tạo phức hợp AuNPs gắn kháng thể cúm A .........................................................43

3. 2.1. pH tối ưu cho phản ứng gắn kháng thể/nano vàng .............................. 43
3. 2.2. Tìm lượng kháng thể thích hợp cho phản ứng gắn .............................. 44
3.3. Kiểm tra phát hiện virus cúm A/H5N1 bằng phức hợp kháng thể/nano vàng .......48

3.3.1. Kết quả phát hiện kháng nguyên virus cúm A bằng Dot blot............... 48
3.3.2. Kết quả kiểm tra thử nghiệm bằng que thử đơn giản............................ 49
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.......................................................................................51
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................52
PHỤ LỤC ......................................................................................................................57


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
SEM

quét

Scanning Electron Microscopy

Kính hiển vi điện tử

FTIR

Fourier Tranform Infrared spectroscopy

Phổ hồng ngoại

UV

Ultraviolet photospectroscopy

Phổ UV

AuNPs

Gold nanoparticles

Hạt nano vàng

SPR

Surface Plasmon Resonance

BSA

Bovine serum albumin

Cộng hưởng Plasmon bề mặt.
Huyết thanh bò


DANH MỤC HÌNH ẢNH

Trang
Hình 1.1.

Những chiếc cốc Lycurgus (Roman ~ 400 AD, Myth of King Lycurgus) được
làm bằng thủy tinh có pha thêm các hạt nano vàng và bạc. Cốc xuất hiện màu
xanh khi phản xạ, màu đỏ khi ánh sáng truyền qua

3

Hình 1.2.

Hiện tượng Plasmon bề mặt ở mặt phân cách giữa kim loại và điện mơi.

4

Hình 1.3.
Hình 1.4.
Hình 1.5.
Hình 1.6.

Đỉnh hấp thụh Plasmon bị dịch chuyển dưới sự thay đổi của tác nhân bọc xung
quanh hạt.

A) Các dung dịch nano vàng (AuNPs) và nano bạc (AgNPs) được chế tạo theo
phương pháp Turkevich. B) Phổ hấp thụ UV tương ứng của các dung dịch.
Các hạt nano chấm lượng tử với kích thước khác nhau dưới tía cực tím (trên)
và dưới điều kiện ánh sáng thường (dưới).
(A). Vàng khối nguyên chất dạng khối từ quặng. (B) Hạt nano vàng kích thước
15nm và (C) dung dịch nano vàng do Faraday chế tạo năm 1850

4
5
8
8

Hình 1.7.

Dung dịch chứa các hạt nano vàng kích thước tăng dần (từ trái qua) [62]

8

Hình 1.8.

Phản ứng tạo hạt nano vàng theo Turkevich

9

Hình 1.9.

AuNPs có rất nhiều ứng dụng trong sinh học, bao gồm phép nhuộm đặc hiệu,
phân phát thuốc và DNA vào tế bào

12

Hình 1.10.

Mơ hình que thử nhanh cơ bản [63]

15

Hình 1.11. Một mẫu que thử nhanh thương mại sử dụng hạt nano vàng

16

Hình 1.12.

17

Cấu Trúc của kháng thể

Hình 1.13. Sơ đồ tạo scFv

19

Hình 2.1.

Sơ đồ phản ứng hóa học tạo hạt nano vàng theo phương pháp khử của
Turkevich

23

Hình 2.2.

Kích thước và hình dạng của hạt nano vàng theo thời gian phản ứng trong
khoảng thời gian t=10giây đến t=120giây

23

Hình 2.3.

Sơ đồ máy đo phổ hấp thụ UV/vis hai chùm tia

27

Hình 2.4.

Sơ đồ minh họa cấu tạo của kính hiển vi điện tử qt

27

Hình 2.5.

Mơ hình một máy quang phổ FTIR cơ bản

29

Hình 2.6.

Quy trình gắn kháng thể với hạt nano vàng

31

Hình 2.7.

Mơ hình que thử nhanh với hai vạch kháng thể (test line và control line)

33


Hình 2.8.

Mơ hình tiến hành thí nghiệm Dot Blot để kiểm tra sự hoạt động của phức hợp
kháng thể/nano vàng.

34

Hình 2.9.

Mơ hình thí nghiệm que thử nhanh: Que thử gắn vạch kháng thể được nhúng
vào dung dịch chứa phức hợp kháng thể/nano vàng.

35

Hình 3.1.

Ảnh SEM của AuNPs (A, B) và phân bố kích thước của hạt (C).

37

Hình 3.2.

Phổ phân tích thành phần vật liệu EDX của mẫu nano vàng

38

Hình 3.3.

Phổ hấp thụ của dung dịch AuNPs

39

Hình 3.4.

Phổ hồng ngoại (FTIR) của AuNPs

39

Hình 3.5.

Phổ hấp thụ UV của các mẫu vàng trong các khoảng thời gian phản ứng khác
nhau.

40

Hình 3.6.

Phổ hấp thụ của các mẫu dung dịch AuNPs theo bảng với hàm lượng citrate
khác nhau.

42

Hình 3.7.

Phổ hấp thụ của mẫu AuNPs ban đầu và sau thời gian 60 ngày

43

Hình 3.8.

Sự thay đổi màu dung dịch với lượng kháng thể gắn như nhau ở các pH khác
nhau từ trái sang lần lượt từ pH 5 - pH 11.

43

Hình 3.9.

Phổ hấp thụ của dung dịch nano vàng trước (đường a ) và sau khi gắn kháng
thể (đường b)

44

Hình 3.10.

Phổ hấp thụ FTIR của mẫu nano vàng không gắn kháng thể (A) và mẫu sau khi
gắn kháng thể lên bề mặt (B).

46

Hình 3.11.

Các hạt AuNPs trước (A) và sau khi gắn kháng thể (B)

46

Hình 3.12.

(A) Từ trái sang với các mẫu gắn lượng protein thay đổi từ (1 -100 µl kháng
thể nồng độ 100µg/ml trên 1ml dung dịch AuNPs). (B) Phổ hấp thụ của các
mẫu sau khi bổ sung dung dịch NaCl để kích thích kết tủa của dung dịch.

48

Hình 3.13.

Kết quả kiểm tra bằng Dot Blot với các nồng độ kháng nguyên khác nhau cố
định trên màng

48

Hình 3.14.

Vạch kháng thể kháng virus cúm A được cố định trên màng nitrocellulose bắt
các hạt kháng thể/nano vàng và tập hợp thành vạch. Vạch có thể quan sát dễ
dàng bằng mắt thường sau thời gian kiểm tra từ 5-10 phút.

49


MỞ ĐẦU
Cúm gia cầm (Avian influenza) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính của mọi lồi
chim, trong đó có gia cầm và thủy cầm, do các phân týp (subtype) của nhóm virus cúm
A (Influenza virus A) thuộc họ Orthomyxoviridae gây nên. Chủng virus cúm A/H5N1
được phát hiện lần đầu tiên gây bệnh dịch trên gà tại Scotland vào năm 1959. Cúm

A/H5N1 là một virus có độc lực cao, và gây bệnh trên người trong các vụ dịch cúm
gà những năm 1996 - 2008, đặc biệt ác liệt là do virus cúm A/H5N1 thể độc lực cao
(HPAI, highly pathogenic avian influenza) gây ra kể từ năm 2003 cho đến nay và
phát sinh nhiều dưới dịng (sublineage) và nhóm/phân nhóm (clade) có độc lực rất
cao. Theo thống kê của tổ chức Y tế thế giới (WHO), tính đến tháng 10 năm 2010,
tổng số ca mắc cúm A/H5N1trên thế giới lên tới 507, trong đó, 302 trường hợp đã
tử vong. Trong đó, Việt Nam và Indonesia là các 2 quốc gia có số người nhiễm và
tử vong cao nhất do virus cúm A/H5N1 gây nên. Để ngăn chặn sự lây lan của bệnh
và có các biện pháp điều trị kịp thời thì việc chẩn đốn nhanh và chính xác cúm
A/H5N1 là rất cần thiết.
Chẩn đoán và phát hiện nhanh virus cúm tại hiện trường đồng thời tiến hành các
công tác dập dịch là cơng việc rất quan trọng. Hiện nay có một thiết bị chẩn đoán
nhanh các loại bệnh dịch với thời gian kiểm tra nhanh và cho kết quả rất đáng tin
cậy đó là que thử nhanh. Đây là một thiết bị chẩn đoán được thiết kế dựa trên
nguyên tắc sắc ký miễn dịch đặc hiệu (immunochromatographic assays), và được
sử dụng phổ biến cho các xét nghiệm nhanh từ cuối những năm 1980. Que thử
nhanh được phát triển bằng việc sử dụng các hạt nano vàng hoặc các loại hạt khác
kích thước nano ở dạng huyền phù gắn kháng thể đơn dòng. Trong thiết bị này, các
hạt kích thước nano được sử dụng cho việc đánh dấu quang học, đóng vai trị như
một sensor màu dùng để phát hiện sự tồn tại của các chất có trong mẫu thử. Que
thử nhanh cho phép phát hiện rất nhiều đối tượng bao gồm kháng nguyên, kháng
thể, thậm chí trong kiểm tra sự tồn tại của các loại hợp chất khác. Que thử nhanh
rất tiện dụng, thân thiện với người dùng, giá thành sản xuất thấp và cũng như tính
linh hoạt cao trong sử dụng, có thể được sử dụng ở phạm vi rộng, khơng chỉ trong bệnh
viện hoặc các trung tâm y tế hiện đại.
Công nghệ nano hiện nay đã và đang trở thành một lĩnh vực hứa hẹn cho rất
nhiều ứng dụng trong khoa học và đời sống. Công nghệ nano sinh học tạo ra các sản
phẩm khả năng ứng dụng to lớn trong các lĩnh vực dược phẩm, y sinh. Trong các
loại vật liệu nano hiện nay, hạt nano vàng (AuNPs) là một trong những loại vật liệu
nano được nghiên cứu rộng rãi nhất. Với kích thước trong khoảng 10- 100 nm, các

hạt nano vàng tạo ra hiệu ứng cộng hưởng plasmon đặc trưng dưới tác động của các
photon. Các hạt nano vàng có thể được gắn với các phân tử sinh học, đã và đang trở
thành một sản phẩm với rất nhiều ứng dụng trong lĩnh vực y sinh học, trong chẩn
đoán và điều trị các tế bào ung thư [7, 48] và đặc biệt trong công nghệ chế tạo các
loại kit chẩn đoán nhanh các loại bệnh truyền nhiễm [14].
1


Ở Việt Nam hiện nay, việc ứng dụng các loại vật liệu nano là một lĩnh vực
nghiên cứu mới được quan tâm, đặc biệt là trong cơng tác chẩn đốn và chữa trị
các loại bệnh nguy hiểm. Bệnh cúm A hiện nay đang là một bệnh truyền nhiễm
nguy hiểm đã gây nên nhiều đợt dịch trên người và gia cầm thời gian vừa qua.
Chính vì thế, việc nâng cao hiệu quả, rút ngắn thời gian chẩn đốn, qua đó góp
phần cho cơng tác phịng chống bệnh kịp thời sẽ là đóng góp quan trọng trong việc
dập tắt các đợi đại dịch.
Để có cơ sở lý thuyết và thực nghiệm cho việc chủ động chế tạo được kit
chẩn đoán dựa trên các ưu điểm của vật liệu nano, góp phần đóng góp cho cơng
tác phịng chống và ngăn ngừa sự lây lan của virus cúm A/H5N1 ở Việt Nam,
chúng tôi thực hiện đề tài: “Chế tạo hạt nano vàng (AuNPs) gắn kháng thể ứng
dụng cho phát hiện nhanh virus cúm A”.
Mục tiêu nghiên cứu
Nghiên cứu ứng dụng thử nghiệm việc chế tạo vật liệu nano vàng có gắn
kháng thể kháng virus cúm A và bước đầu tiến hành việc phát hiện nhanh virus cúm
A/H5N1.
Nội dung nghiên cứu
+ Chế tạo các hạt nano vàng (AuNPs)
+ Nghiên cứu các đặc tính vật lý và hóa học của hạt nano vàng chế tạo được
+ Nghiên cứu chế tạo phức hợp hạt nano vàng gắn kháng thể.
+ Ứng dụng các hạt nano vàng đã được gắn kháng thể để phát hiện sự có mặt của
virus cúm A/H5N1.

2


CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU
1.1. Tổng quan về hạt nano kim loại
Các hạt nano kim loại có ít nhất kích thước một chiều dao động trong khoảng
1- 100 nm [45]. Ở kích thước nano mét, chúng có những tính chất đặc biệt và khác
biệt so với vật liệu khối cùng loại (tính chất điện, tính chất xúc tác, tính chất
quang, tính chất từ, cấu trúc và tính chất cơ). Việc tổng hợp các hạt nano không
chỉ được phát triển trong khoa học hiện đại ngày nay mà đã có từ rất lâu trong lịch
sử lồi người. Các nhà giả kim học đã chế tạo được những hạt nano vàng và họ tin
rằng đó là thứ thuốc giúp con người trường thọ [9]. Các loại hạt nano kim loại khác
đã được dùng để trang trí các cánh cửa nhà thờ, cung điện cho các màu sắc rực rỡ của
chúng.

Hình 1.1. Những chiếc cốc Lycurgus (Roman ~ 400 AD, Myth of King Lycurgus)
được làm bằng thủy tinh có pha thêm các hạt nano vàng và bạc. Cốc xuất hiện màu
xanh khi phản xạ, màu đỏ khi ánh sáng truyền qua [60].
Ngày nay việc nghiên cứu, chế tạo và ứng dụng của các hạt nano kim loại đã
góp phần tạo nên một bước tiến nhảy vọt trong khoa học cũng như đời sống do chúng
sở hữu những thuộc tính vật liệu khác biệt, nổi trội và quý giá so với các vật liệu khối
thông thường.
1.2. Hiệu ứng cộng hưởng Plasmon bề mặt của hạt nano kim loại.
Các hạt nano kim loại với kích thước nhỏ hơn bước sóng trong vùng khả kiến
bộc lộ đặc tính tự nhiên liên quan đến cộng hưởng plasmon bề mặt phụ thuộc vào
đặc tính hình học của hạt nano khi chúng bị kích thích bởi trường điện từ [25].
Trên bề mặt của hạt kim loại, plasmon là dạng sóng được truyền dọc theo bề mặt
của vật dẫn ở phần chuyển tiếp giữa kim loại và vật liệu điện môi chứa hạt.

3


Hình 1.2. Hiện tượng Plasmon bề mặt ở mặt phân cách giữa kim loại và điện mơi.
Plasmon bề mặt (sóng điện từ) bị kích thích khi các photon của bước sóng
tới đập vào khu vực chuyển tiếp kim loại/điện mơi và kích thích dao động cộng
hưởng ở bề mặt, tạo nên một dạng sóng truyền (plasmon bề mặt) [27, 50]. Đối với
các hạt nano kim loại, kích thước nhỏ tạo ra một sự hấp thụ cường độ mạnh trong
khu vực khả kiến/gần UV. Các điện tử dẫn tạo nên một dao động chọn lọc đặc
trưng, tạo nên dải Plasmon có thể quan sát trong khu vực gần 530 nm với các hạt
nano kích thước từ 5-20 nm. Đặc tính này được gọi là dao động cộng hưởng
Plasmon định xứ [31].
Tần số cộng hưởng Plasmon của các hạt nano phụ thuộc vào chỉ số khúc xạ
cục bộ. Một sự thay đổi nhỏ với chỉ số này sẽ dẫn đến việc dịch chuyển tần số dao
động và do đó sẽ tạo nên sự dao động tỉ số khúc xạ. Ví dụ, nếu bề mặt của hạt
nano được nhúng trong trong dung dịch đệm lỏng và sau đó được nhúng trong
dung dịch với tỉ số khúc xạ lớn hơn, điều này sẽ làm tăng tỉ số khúc xạ có thể được
phát hiện bởi sự dịch chuyển trong cộng hưởng plasmon (hay kích thích) của hạt
nano.
Increase
absorbance
Increaseinin
extinctionat
at
selected
selectedwavelength
wavelengthdue
duetoto
shift

shiftininplasmon
plasmonresonance
resonance
band
band

Extinction
Absorbance

Extinction at
Absorbance
at selected
wavelength
wavelength

Wavelength

Hình 1.3. Đỉnh hấp thụh Plasmon bị dịch chuyển dưới sự thay đổi của tác nhân bọc
xung quanh hạt [31].
4


Hiện tượng dịch chuyển đỉnh hấp thụ là do các tác nhân bọc xunh quanh hạt
nano, sự dịch chuyển này có thể phù hợp với các ứng dụng trong chế tạo các sensor
cảm biến sinh học bằng việc bọc chúng với kháng thể. Độ nhạy cảm của plasmon bề
mặt phụ thuộc vào đặc điểm hình thái (kích thước và hình dạng), môi trường điện môi
(tác nhân bọc, môi trường xung quanh, chất nền), tương tác giữa các hạt (trạng thái co
cụm).
Hình 1.4 minh họa thuộc tính quang học của các hạt nano vàng và nano bạc
được tổng hợp theo các quy trình khác nhau tạo ra các hình dạng và kích thước hạt

nano khác nhau. Do đó, màu sắc dung dịch chứa các hạt nano do cộng hưởng plasmon
cũng thay đổi, phổ hấp thụ UV thể hiện ở các đường hấp thụ với các đỉnh cực đại hấp
thụ ở các vị trí bước sóng khác nhau.

Hình 1.4. A) Các dung dịch nano vàng (AuNPs) và nano bạc (AgNPs) được chế tạo
theo phương pháp Turkevich. B) Phổ hấp thụ UV tương ứng của các dung dịch [31].
1.3. Các loại hạt nano ứng dụng trong y sinh học
1.3.1. Các hạt nano kim loại
Hạt nano kim loại là dạng phân tán của các pha rắn trong một môi trường chất
lỏng, hầu hết các hạt nano kim loại với kích thước từ vài nm đến µm (Au [5], Ag
[40], Pt [57], Pa [58], Cu, Fe, và Hg [22]). Các loại hạt nano kim loại quan trọng nhất
được nghiên cứu và ứng dụng là nano vàng (AuNPs) và nano bạc (AgNPs). Các hạt
nano vàng được hình thành từ một ngun tử khởi đầu, sau đó được bao bọc bởi số
lượng các nguyên tử vàng nhất định xung quanh, số lượng các hạt xung quanh được
tính bởi công thức [10n2+2] [41], với n là số các lớp nguyên tử trong hạt. Như vậy
hạt nano vàng nhỏ nhất sẽ bao gồm 13 nguyên tử vàng (Au). Các hạt khác tương tự
có cấu trúc gần với khối 20 mặt (icosahedrons) và khối 12 mặt (dodecahedrons) xấp
xỉ dạng hình cầu cùng với đường kính tăng dần.

5


1.3.2. Các hạt nano cấu trúc lõi/vỏ
Các hạt nano kim loại có cấu trúc lõi/vỏ (core/shell nanoparticles) có những
đặc tính quang học rất đặc trưng. Chúng có hai dao động cộng hưởng plasmon bề mặt
tương ứng với dải điện tử của các thành phần kim loại tinh khiết trong cấu tạo hạt kim
loại (của cả lõi và vỏ) [1]. Đặc tính quang học của các hạt nano kim loại được giải
thích bằng lý thuyết Mie cho các hạt bị bọc bởi một lớp khác [10, 41] . So với các thể
dị hướng, các hạt nano kim loại cấu trúc lõi vỏ được tổng hợp, ví dụ như dạng hợp
kim bởi quá trình phát xạ laser, chỉ thể hiện một đỉnh Plasmon, nằm giữa các vùng

hấp thụ của kim loại nguyên chất. Các hạt nano kim loại lõi- vỏ đóng vai trị rất quan
trọng việc chẩn đốn sinh học [8].
Hơn nữa, các hạt nano kim loại thuần nhất bộc lộ một số khuyết điểm liên quan
đến độ bền hóa học hoặc khi được sử dụng trong các dung môi khác nhau. Để ngăn
chặn hiện tượng kết đám, các hạt huyền phù có thể được bọc bởi một lớp vỏ cách
điện, ví dụ vỏ silica [34]. Sau khi bọc các hạt nano kim loại bằng lớp vỏ điện mơi,
chúng có thể được sử dụng trong các môi trường dung môi khác nhau. Độ dày của lớp
vỏ silica trong suốt có thể được kiểm sốt trong q trình tổng hợp. Việc thay đổi độ
dày của lớp silica và chỉ số khúc xạ của dung mơi cho phép kiểm sốt thuộc tính
quang học thơng qua độ phân tán. Với việc tăng độ dày của lớp vỏ silica lên tới một
kích thước nhất định, cường độ của dải plasmon tăng và đỉnh hấp thụ sẽ dịch chuyển
về phía bước sóng dài hơn (redshift) do chỉ số khúc xạ cục bộ tăng xunh quanh hạt.
Tuy nhiên, khi kích thước của cấu trúc vượt lên trên 80 nm, hiện tượng tán xạ trở nên
đáng kể, tạo nên một sự gia tăng mạnh trong phổ hấp thụ của các bước sóng ngắn hơn
(blue-shift) tương tự như đặc điểm của hạt nano vàng khơng có lớp vỏ silica. Kết quả
tương tự đối với các lớp phân tử sinh học, hoặc polymer được hấp thụ lên bề mặt của
các hạt nano kim loại. Lớp vỏ polymer cũng sẽ làm thay đổi các thơng số hình học,
điện mơi của hạt [23]. Một loại hạt nano composite khác có cấu trúc vỏ kim loại bọc
xung quanh một lõi điện môi . Thuộc tính quang học của những hạt nano silica đơn
phân tán (cịn gọi là các hạt Stưber [55]) có thể bị ảnh hưởng bởi việc bọc xunh quanh
một lớp vỏ kim loại mỏng và đồng đều. Khi giữ nguyên kích thước của lõi điện môi, sự
dịch chuyển của hấp thụ quang tương đối nhạy với độ dày của lớp vỏ.
1.3.3. Hạt nano từ tính
Các hạt nano từ hầu hết là các hợp chất của oxit sắt (Fe3O4 /magnetite Fe2O3
/maghemite) do đó không phải là những hạt kim loại nguyên chất. Tuy nhiên chúng là
một trong những công cụ mạnh mẽ và hiệu quả nhất trong sinh học và y học. Có hai
loại hạt nano từ tính: (1) các đầu magnetic chứa các hạt nano oxit sắt được bọc bởi
mạng lưới polymer-silica và (2) các hạt oxit kim loại nguyên chất trong một dải nm.
Các hạt oxit sắt ferromagnetic phân tán đơn domain được gọi là chất lỏng từ và có thể
được sử dụng trong các ứng dụng sinh học nếu nó có tính hợp sinh cao. Việc biến tính

các đầu magnetic hoặc hạt nano, cho phép chúng có thể gắn với protein hoặc DNA và
6


do đó, sử dụng trong các ứnh dụng phát hiện, chẩn đoán và là tiềm năng trong việc
ứng dụng chế tạo các cơng cụ chẩn đốn và chữa trị hiện đại, ví dụ như trong nhiệt trị
tế bào ung thư [58] mà chỉ có các hạt nano từ tính hợp sinh học mới có thể được sử
dụng. Hoặc việc sử dụng các hạt nano từ tính và các đầu từ (magnetic bead) làm tác
nhân làm mạnh ảnh chụp cộng hưởng từ (MRI) cũng như phát hiện các phân tử sinh
học bằng các sensor từ tính. Một ứng dụng khác có thể kể đến là việc tách chiết các
phân tử sinh học sử dụng hạt nano từ tính là một trong những kỹ thuật trong các
phịng thí nghiệm đang được chuẩn hóa trên tồn thế giới vì ưu điểm tiện lợi, nhanh
và rẻ tiền. Ho và các cộng sự (2010) sử dụng các hạt từ tính gắn kháng thể như một
đầu dị ái lực hiệu quả cho việc làm giàu có chọn lọc các vi khuẩn từ mẫu dung dịch
lỏng [16].
1.3.4. Chấm lượng tử
Chấm lượng tử là những cấu trúc nano tinh thể có thể phát xạ khi bị kích thích
trong một dải tần số ánh sáng nào đó. Các loại chấm lượng tử có cấu trúc nano như
CdSe, CdS, CdTe trong khoảng 200- 10,000 nguyên tử, đặc điểm nổi bật của chấm
lượng tử là thể hiện đặc tính quang học phụ thuộc mạnh vào kích thước và tính chất
điện tử [2].

Hình 1.5. Các hạt nano chấm lượng tử với kích thước khác nhau dưới tía cực tím
(trên) và dưới điều kiện ánh sáng thường (dưới) [61].
Các chấm có thể phát xạ với phổ ánh sáng năng lượng thấp trong một dải rộng,
phổ kích thích liên tục, và hơn nữa, chúng rất bền dưới phản ứng quang hóa. Do đặc
tính quang học phụ thuộc kích thước, tín hiệu phát quang có thể bao gồm tồn bộ phổ
bức xạ vùng nhìn thấy. Đặc điểm này tạo điều kiện cho việc kích thích các chấm
lượng tử với kích thước khác nhau ở cùng một thời điểm và làm cho chúng phù hợp
với vai trò là các đầu dò phát quang cho việc đánh dấu trong hệ thống sinh học [43].

1.4. Hạt nano vàng
Vàng khối (Au) đứng ở vị trí thứ 79th trong bảng hệ thống tuần hồn, nó là một
trong những vật liệu đầu tiên được con người khám phá, khai thác và sử dụng. Vàng
sở hữu bốn tính chất nổi bật: kim loại sáng màu vàng, khả năng chống oxi hóa và ăn
7


mòn rất tốt, độ dẻo cao và khối lượng riêng lớn (19.32 g/cm3). Cấu hình điện tử của
vàng (1s2 2s2p6 3s2p6d10 4s2p6d10f14 5s2p6d10 6s1) quyết định thuộc tính quang học,
hoạt tính hóa học và cấu trúc tinh thể. Vàng khối có cấu trúc tinh thể lập phương tâm
diện (fcc). Mật độ nguyên tử lớn giúp vàng trở nên tương đối khó truyền qua khi bị
tác dụng bởi tia X và nó tương tác mạnh với các điện tử trong các kỹ thuật hiển vi
điện tử quét (SEM) và hiển vi điện tử truyền qua (TEM). Vàng được sử dụng làm vật
dụng và đồ trang sức quý giá cho con người từ rất xa xưa cho đến ngày nay.
Khi vàng khối thơng thường được chế tạo ở kích thước nhỏ mức nano mét,
chúng được gọi là các cấu trúc nano vàng. Hạt nano vàng (AuNPs) là các hạt nano tồn
tại ở dạng dung dịch huyền phù có độ bền cao của các cụm nguyên tử vàng với các
kích thước nằm trong khoảng 1- 100 nm.
A

C

B
Hình 1.6. (A). Vàng khối nguyên chất dạng khối từ quặng. (B) Hạt nano vàng kích
thước 15nm và (C) dung dịch nano vàng do Faraday chế tạo năm 1850[38].
Khi ở kích thước nano mét, AuNPs sở hữu nhiều tính chất lý hóa khác nhau so
với vật liệu vàng khối [2, 12]. Một ví dụ điển hình nhất đó là sự thay đổi màu sắc từ
màu vàng đến đỏ ruby khi vàng khối được chuyển thành các hạt vàng phân tán dạng
hạt có kích thước nano mét.

Hình 1.7. Dung dịch chứa các hạt nano vàng kích thước tăng dần (từ trái qua) [62]
8


Theo thuyết Plasmon, khi trường điện từ của ánh sáng tới đập vào cụm các
nguyên tử vàng, các electron tự do bề mặt (6 electron trong trường hợp AuNPs) tồn
tại trong vùng dẫn của AuNPs dao động qua lại, do đó tạo nên vùng cộng hưởng
plasmon, tại đó có đỉnh hấp thụ trong vùng khả kiến 530-540 nm [26]. Vùng plasmon
bề mặt được sử dụng như một chất chỉ thị cho việc hình thành nên các hạt nano vàng
từ muối của chúng. Độ nhạy của hấp thụ plasmon bề mặt được làm cơ sở cho cơ chế
phát hiện liên quan đến các thiết bị cảm biến sử dụng AuNPs [42].
Các tính chất vật lý của AuNPs phụ thuộc vào kích thước, hình dạng, khoảng
cách giữa các hạt (mật độ) và bản chất của chất hoạt động bề mặt được sử dụng để
ngăn cản việc kết đám giữa các hạt [2]. Theo lý thuyết Mie, hiện tượng cộng hưởng
Plasmon bề mặt bị biến mất khi kích thước hạt nhỏ hơn 2 nm và lớn hơn 500 nm [12].
Các thanh nano vàng (nanorod) có hai dải cộng hưởng plasmon, một dải là cộng
hưởng theo chiều dọc của thanh ở 550-600 nm và một dải cịn lại theo chiều vng
góc với thanh ở 520 nm [33]. Dải bước sóng theo chiều dọc của thanh rất nhạy cảm và
sự thay đổi hệ số tỉ lệ của thanh sẽ thay đổi vùng hấp thụ từ vùng nhìn thấy tới vùng
gần hồng ngoại đỏ (near-infra red-NIR) [32]. Thuộc tính này quang học duy nhất này
của các thanh nano vàng được sử dụng trong chữa trị bằng tia hồng ngoại gần và tán
xạ Raman được kích thích của các phân tử sinh học được hấp thụ . Do đó, bằng việc
thay đổi kích thước và hình dạng của AuNPs, cộng hưởng plasmon có thể phù hợp và
đáp ứng với các ứng dụng trong hiện ảnh tế bào, phân phát thuốc và chữa trị.
Sáu điện tử tồn tại trong vùng dẫn của hạt nano vàng là đặc điểm khiến chúng
trở nên dễ dàng liên kết được với các nhóm thiol và amine [29]. Do đó, AuNPs có thể
dễ dàng được gắn bằng các loại protein hoặc các phân tử sinh học giàu axit amine,
dẫn đến các ứng dụng sinh học quan trọng bao gồm phân phát thuốc hướng đích [44,
52], hiện ảnh tế bào [4], và biosensor [47]. Hơn nữa, các điện tử tự do khiến cho
AuNPs trở nên hữu ích như một tác nhân làm tăng cường độ tương phản [3] . Các

nghiên cứu về hiện ảnh được dựa trên các so sánh về độ tương phản bằng việc thay
đổi mật độ điện tử trong các mô khác nhau. Với mật độ điện tử cao, AuNPs đóng vai
trò như một tác nhân làm tăng độ tương phản một cách tuyệt vời trong việc phát hiện
các khối u, vùng đích trong cơ thể.
1.5. Các phương pháp chế tạo hạt nano vàng
Nhìn chung, các hạt nano vàng được tổng hợp trong pha lỏng (phương pháp
hóa ướt) bằng việc khử axit chloauric (HAuCl4) mặc dù có rất nhiều các phương
pháp tiên tiến và độ chính xác cao đã được phát triển. Sau khi hòa tan muối HAuCl4,
dung dịch được khuấy nhanh trong khi bổ sung thêm chất khử (natri citrate). Các ion
Au3+ được khử về các nguyên tử Au0. Khi ngày càng nhiều các nguyên tử được tạo
thành, dung dịch trở nên bão hòa, và các nguyên tử vàng bắt đầu kết hợp lại với nhau
để hình thành nên các hạt kích thước bán nano. Các ngun tử cịn lại sẽ tiếp tục bám

9


vào hạt sẵn có, nếu dung dịch được khuấy ở tốc độ phù hợp, các hạt sẽ tồn tại ở dạng
đồng đều và bền trong môi trường lỏng và ở dạng huyền phù.
Để ngăn cản sự kết đám của các hạt nano vàng, các tác nhân làm bền cũng
được sử dụng để bọc lên bề mặt hạt. Các hạt cũng có thể được biến tính bằng với các
loại phân đoạn hữu cơ khác nhau để tạo nên dạng hạt lai hữu cơ -vô cơ với những
chức năng tiêu biểu [49]. Các hạt nano vàng cũng có thể được tổng hợp bằng phương
pháp bắn phá laser.
1.5.1. Phương pháp Turkevich
Phương pháp này được phát minh bởi J. Turkevich và các cộng sự vào vào
năm 1951 [18, 24] và sau đó được cải tiến bởi G. Frens vào những năm 1970 [13], và
là một phương pháp tổng hợp dung dịch nano vàng đơn giản nhất tính cho đến thời
điểm hiện tại. Nhìn chung, phương pháp này tạo ra các hạt nano vàng đơn phân tán
hình cầu tan trong nước với kích thước đặc trưng từ 10-20 nm. Các hạt lớn hơn cũng
có thể được tạo ra bằng phương pháp này nhưng sẽ mất nhiều quy trình cơng nghệ

hơn trong việc duy trì tính phân tán cũng như hình dạng hạt. Quy trình tạo hạt nano
vàng liên quan đến phản ứng giữa một lượng dung dịch nóng chloauric HAuCl4 với
dung dịch natri citrate. Hạt nano vàng sẽ hình thành bởi vì các ion citrate sẽ bao xung
quanh bề mặt lõi vàng, nó đóng cả hai vai trò làm tác nhân khử cũng như tác nhân
làm bền hạt nano.

Hình 1.8. Phản ứng tạo hạt nano vàng theo Turkevich
Để tạo ra các hạt nano vàng lớn hơn, u cầu một lượng citrate ít hơn (có thể
dưới 0.05% và tuy nhiên, một lượng citrate quá nhỏ sẽ khơng thể kích thích phản ứng
khử hết các ion Au3+). Việc khử bởi một lượng natri citrate sẽ giảm lượng ion citrate
sẵn có cho việc bọc xunh quanh hạt nano vàng, điều này sẽ làm cho các hạt nhỏ kết
đám với nhau và tạo nên những hạt lớn hơn (cho đến khi tổng diện tích bề mặt của
các hạt trở nên đủ nhỏ để được bọc bởi tất cả các ion citrate tồn tại trong dung dịch).
10


1.5.2. Phương pháp Brust
Phương pháp này được phát hiện bởi Brust và Schiffrin vào đầu những năm
1990 [37] và có thể được sử dụng để tổng hợp các hạt nano vàng trong dung môi hữu
cơ mà thông thường không thể trộn lẫn trong nước (như toluence). Phản ứng đặc của
phương pháp giữa axit chloauric và tetraoctylammonium bromide (TOAB) trong
toluence và natri borohydrate đóng vai trị lần lượt như chất chống kết tủa và chất
khử.
Các hạt nano vàng chế tạo theo phương pháp này có kích thước trung bình 5-6
nm. NaBH4 đóng vai trị tác nhân khử, trong khi TOAB đóng vai trò là chất xúc tác
chuyển pha và chất làm bền. Một điều quan trọng là TOAB không bọc xung quanh
hạt nano một cách vững chắc, nhưng dung dịch sẽ bị kết tủa sau khoảng thời gian 2
tuần. Để hạn chế hiện tượng này, một tác nhân làm bền mạnh có thể được sử dụng
như thiol (alkanethiol), có thể liên kết cộng hóa trị với hạt nano vàng, tạo ra một dung
dịch gần như vĩnh cửu. Alkanethiol bảo vệ hạt nano vàng có thể bị kết tủa nhưng sau

đó sẽ được hòa tan lại. Một số tác nhân chuyển pha có thể duy trì việc bọc với các hạt
nano sau khi đã làm sạch, việc này có thể gây ảnh hưởng đến thuộc tính vật lý của hạt
như tính tan.
1.5.3. Phương pháp Perrault
Phương pháp này được phát minh bởi Perrault và Chan trong năm 2009 [51], sử
dụng hydroquione để khử HAuCl4 trong dung dịch có chứa sẵn các hạt nano vàng.
Phương pháp này tương tự với phương pháp sử dụng trong việc phát triển film tạo
ảnh, trong đó các hạt bạc (Ag) bên trong film lớn dần lên trong khi có sự bổ sung của
các nguyên tử bạc được khử ngay trên bề mặt. Tương tự như thế, các hạt nano vàng
có thể đóng vai trị là chất cầu nối với hydroquinone để xúc tác việc khử các ion vàng
trên bề mặt. Sự tồn tai các chất ổn định như các ion citrate có thể tạo ra việc mọc các
hạt có kiểm sốt. Phương pháp này có thể tạo ra các hạt nano với kích thước rất lớn trong
khoảng 30-250 nm.
1.5.4. Phương pháp Martin
Phương pháp này được phát minh bởi nhóm Eah vào năm 2010 [39], phương
pháp này tạo ra các hạt nano vàng dạng “trần” trong nước bằng việc khử HAuCl4 với
NaBH4 Mặc dù không sử dụng các chất hoạt động bề mặt như citrate, các hạt nano
vàng phân tán rất bền. Phân bố kích thước gần như đơn phân tán với đường kính có
thể chính xác và tái tổng hợp trong khoảng 3.2 đến 5.2 nm. Chìa khóa cho việc làm
bền HAuCl4 và NaBH4 trong dung dịch stock với HCl và NaOH lần lượt trong hơn 3
tháng và hơn 3 giờ. Hơn nữa, tỷ số của các ion NaBH4-NaOH với HAuCl4-HCl phải
được kiểm sốt chính xác trong vùng gọi là “sweet zone”. Các hạt nano “trần” được
bọc với một đơn lớp 1-dodecanethiol và sau đó chuyển pha thành hexane bằng việc
lắc hỗn hợp của nước, acetone và hexane trong 30 giây. Do đó, tất các sản phẩm phản
11


ứng kết hợp tồn tại ở pha nước-acetone. Lượng 1-dodecanethiol chỉ chiếm 10%
nguyên tử vàng trong tổng số. Tất cả các quy trình phản ứng này chỉ mất dưới 10
phút.

Những hạt nano vàng được bọc bởi lớp phân tử hữu cơ kỵ nước có tính chất
đặc biệt cho khả năng tự sắp xếp 2 chiều và tính điện trong dung mơi khơng phân cực.
Chúng nổi lên ra ngồi phía bề mặt của hạt toluene trong khơng khí và hình thành
một lớp màng mỏng, và hình thành nên đơn lớp và có thể phủ lên bất kỳ loại đế nào
khi toluence bay hơi mà không cần bất kỳ thiết bị phức tạp nào. Loại màng đơn lớp
chứa các hạt nano vàng gần như đồng đều ở tất cả các kích thước nm, µm và mm,
phương pháp này khơng hạn chế về kích thước chế tạo, do đó nó có thể bao phủ bề
mặt của cả miếng silicon tới 3 inch.
Việc kiểm sốt kích thước chính xác trong khoảng 3.2 – 5.2 nm rất quan trọng
cho cả việc chuyển pha của các hạt nano vàng từ nước sang toluence và sự sắp xếp
chiều của chúng trên giọt toluence.
1.5.5. Phương pháp rung siêu âm (sonolysis)
Một phương pháp khác được sử dụng để tạo ra các hạt nano vàng đó là phương
pháp rung siêu âm. Phương pháp này dựa trên việc sử dụng sóng siêu âm, nó kích
thích phản ứng giữa muối vàng chloauric và dung dịch glucose, các tác nhân khử là
các nhóm hydroxyl (hình thành giữa khư vực biên giới của giữa các lỗ trống hỗn loạn
và nước dạng khối). Dạng hình thái hạt nano vàng đạt được là các dây nano dạng
mảnh (nanoribbon) với chiều rộng khoảng 30-50 nm và chiều dài lên tới vài
micromets. Những dải dây nano này rất dẻo và linh hoạt và có thể uốn cong với góc
lớn hơn 900. Khi glucose được thay thế bởi cyclodextrin (một loại phân đoạn của
glucose) thì có các hạt nano hình cầu được hình thành, điều này chứng minh cho
viêcn glucose đóng vai trị rất quan trọng trong việc quyết định hình thái và kích
thước của cấu trúc nano vàng.
1.6. Các ứng dụng trong y sinh học của AuNPs
Hạt nano vàng là một vật liệu quý, ít nhất là ở kích thước nano mét, chúng thu
hút được chú ý rất lớn của các nhà khoa học cùng với vô số những ứng dụng đang gia
tăng hàng ngày.
Một trong những lĩnh vực đã được phát triển rất mạnh trong những thập kỷ qua
đó là việc sử dụng các hạt nano vàng trong lĩnh vực y sinh học hay khoa học sự sống.
Những ứng dụng y sinh này có thể chia thành bốn lĩnh vực: đánh dấu sinh học, phân

phát thuốc, đốt nhiệt và cảm ứng [54].

12


Hình 1.9. AuNPs có rất nhiều ứng dụng trong sinh học, bao gồm phép nhuộm đặc
hiệu, phân phát thuốc và DNA vào tế bào [54].
1.6.1. Đánh dấu sinh học
Thuộc tính nổi bật và tiêu biểu nhất của AuNPs được khai thác đó là tạo ra độ
tương phản và làm mạnh tín hiệu màu. Ví dụ trong kính hiển vi điện tử truyền qua,
đặc tính hấp thụ mạnh điện tử của hạt nano vàng khiến chúng trở nên vật liệu phổ
biến và thích hợp nhất cho việc nhuộm để tăng cường tính tương phản của các vật
liệu hấp thụ kém điện tử. Kích thước nhỏ của chúng và khả năng chức năng hóa của
hạt, có thể ứng dụng trong việc gắn với các kháng thể (immunostaining), nghĩa là
chúng có thể cung cấp độ phân giải rất cao và đặc biệt trong rất nhiều ứng dụng đánh
dấu sinh học khác. Tương tự như thế, đặc tính quang học- khả năng hấp thụ mạnh, tán
xạ và đặc biệt là cộng hưởng Plasmon bề mặt giúp chúng trở nên cơng cụ hữu ích
trong các kỹ thuật ứng dụng hiệu ứng quang học bao gồm các sơ đồ kết hợp gồm hiện
ảnh nhiệt-quang (photo-thermal), hay quang-thanh (photo-acoustic imaging). Hơn
nữa, các hạt nano vàng có thể được đánh dấu phóng xạ bởi các kích thích neutron,
cho phép việc phát hiện ở mức độ cực nhạy và được sử dụng như một tác nhân làm
tăng độ tương phản của tia X.
1.6.2. Phân phát thuốc và chuyển gen
Các hạt nano vàng có thể đóng vai trị như thụ thể mang cho các ứng dụng
phân phát thuốc và chuyển gen. Các phân tử hoạt hóa sinh học được hấp thụ lên bề
mặt của hạt nano vàng có thể được dẫn đường vào các tế bào và được giải phóng. Vận
chuyển DNA, là một nguyên tắc cơ bản của liệu pháp gen. Khả năng hấp thụ mạnh
ánh sáng của hạt nano vàng cho phép chúng trở nên phù hợp với các đối tượng mơi
trường kích thích nhiệt; năng lượng hấp thụ ánh sáng được tiêu tan vào các hạt xung
quanh, làm tăng nhiệt độ của môi trường xunh quanh. Hiệu ứng này có thể được sử

dụng để mở các viên nang polymer dạng bọc kích thước micro, ví dụ cho mục đích
phân phát thuốc. Những thuộc tính khác như các hạt được chức năng hóa như nhau, có
13


thể gắn đặc hiệu với các tế nào cụ thể nào đó, ứng dụng này rất quan trọng trong các
ứng dụng điều trị như bệnh ung thư hay nhiệt điều trị bằng cách nung nóng các mơ có
sẵn các hạt nano để phá hủy các tế bào ung thư ác tính. Tuy nhiên, đối với các ứng
dụng in vivo những yếu tố gây độc của các hạt nano lại đang trở thành vấn đề nổi
cộm cần quan tâm và cần được nghiên cứu kỹ lưỡng với sức khỏe. Mặt khác, người ta
chưa biết được khả năng ảnh hưởng của của các hạt nano này khi tồn tại trong môi
trường tới vi sinh vật và hệ thống sinh thái.
1.6.3. Sensor sinh học
Các thuộc tính quang học của chúng có thể thay đổi khi gắn với phân tử sinh
học cụ thể, cho phép phát hiện và định lượng phân tích. Phổ hấp thụ của hạt nano
vàng có thể thay đổi đột ngột khi các hạt trở nên co cụm với nhau. Sự co cụm của các
hạt ảnh hưởng đến chất lượng của các sản phẩm này đã thương mại hóa nhưng nó có
thể cực kỳ hữu dụng trong ứng dụng phát hiện DNA với độ nhạy cực cao, thậm chí
chỉ là vài cặp DNA liên kết bổ sung lỗi.
Một chiến lược khác cho việc sản xuất sensor là hiệu ứng dập tắt huỳnh quang.
Các phân tử huỳnh quang được kích thích và gần các hạt AuNPs có thể truyền năng
lượng của chúng vào kim loại tạo nên một sự hồi phục không phát xạ của các chất
huỳnh quang. Trong một số các sơ đồ phát hiện khác, chất phân tích thay thế các phân
tử huỳnh quang từ bề mặt của các hạt hoặc thay đổi sự hình thành của chúng, mục
đích để sự paths quang của những phân tử reporter bị thay đổi trong sự xuất hiện của
chất phân tích. Trong khi rất nhiều các thuộc tính quang học khác của hạt nano vàng
đã được khai thác trong những ứng dụng gần đây, vẫn cịn vơ số các ứng dụng tiềm
năng mà chúng ta chưa khai thác hết. Điều này sẽ cuối cùng dẫn đến các phép phân
tích được thiết lập kỹ lưỡng, quy trình hiện đại cho việc đa dạng các ứng dụng sinh
học trong tương lai gần.

1.7. Kit chẩn đoán bệnh bằng que thử nhanh
1.7.1. Giới thiệu
Một ứng dụng phổ biến sử dụng hạt nano vàng, đó là phép thử sắc ký đặc hiệu
(Immunochromatographic assays) hay còn được gọi là que thử nhanh (flow lateral
test trip) dựa trên phản ứng đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể và hiện tượng
mao dẫn trong các ống nhỏ của màng mỏng. Đây là công nghệ được mở rộng từ kỹ
thuật ngưng kết hạt latex lần đầu tiên được phát triển vào năm 1956 bởi Singer và
Plotz [56].
Que thử nhanh thực chất là một thiết bị dùng để kiểm tra thiết kế theo kiểu onestep và dễ dàng sử dụng. Ưu điểm nổi bật của thiết bị này là thời gian kiểm tra nhanh,
giá thành rẻ và đặc biệt người sử dụng không địi hỏi trình độ kỹ thuật cao do đó nó
phù hợp cho những ứng dụng cách xa phịng thí nghiệm. Thiết bị que thử nhanh cho
kết quả của phép thử có hoặc khơng. Hơn nữa, que thử có thể được bảo quản trong
14


thời gian dài mà không cần đến tủ lạnh, điều này mang lại hiệu quả đối với những khu
vực thiếu thốn thiết bị.
1.7.2. Sơ đồ nguyên lý của que thử nhanh
Que thử nhanh bao gồm có 6 bộ phận cơ bản (Hình 1.10):

Hình 1.10. Mơ hình que thử nhanh cơ bản [63]
Nguyên lý chung của que thử nhanh hiện nay dựa trên sự chuyển động của mẫu
chất lỏng qua khu vực dùng để phát hiện, tại đó các phân tử phản ứng đặc hiệu với
chất phân tích và cho ra tín hiệu màu. Một que thử nhanh điển hình bao gồm có:
màng, sample pad, conjugate pad và adsorbent pad như mơ tả trên hình 1.9. Màng có
thể được chế tạo từ nitrocellulose [35, 46], nylon [6], polyethersulfone [21], hoặc
polyethylene [22]. Dạng màng phổ biến nhất được sử dụng là nitrocellulose với kích
thước ống nhỏ trong màng là 0.05 đến 12 µm. Sample pad được gắn ở phần cuối của
màng và thường được làm từ cellulose hoặc cross-linked silica. Conjugate pad được
đặt ở vị trí tiếp xúc với sample pad và màng. Chất dùng để đánh dấu hoặc các thành

phần dùng cho việc nhận biết mẫu phân tích được làm khơ trên khu vực này, sẽ tương
tác đặc hiệu với vật liệu có trong mẫu phân tích lỏng. Các chất đánh dấu cho việc phát
hiện có thể là các hạt nano vàng (Au), các hạt latex khô [15], selenium, carbon, hoặc
liposome [59]. Việc sử dụng các hạt nano được công bố lần đầu tiên bởi Leuvering và
cộng sự [30] vào năm 1980 và ngày nay chúng được sử dụng phổ biến cho việc đánh
dấu. Đối với việc phân tích một đối tượng cụ thể, hai vạch được cố định lên màng:
một vạch kiểm tra (test line) cho ra kết quả kiểm tra và vạch kiểm soát (control line)
dùng để xác nhận chất phân tích đã chảy qua màng phân tích. Đối với phép kiểm tra
cho nhiều đối tượng khác nhau, có thể sử dụng nhiều vạch kiểm tra khác nhau. Chất
15


lỏng di chuyển ngược lên màng do lực mao dẫn của màng và dừng lại ở absorbent
pad ở đầu cuối của màng.

Hình 1.11. Một mẫu que thử nhanh thương mại sử dụng hạt nano vàng
Khi kháng thể được sử dụng cho việc phát hiện bệnh trong mẫu, phép thử được
gọi là “lateral flow immunoassays”. Chúng dùng để kiểm tra xem có hay khơng bệnh
trong mẫu. Những năm gần đây, que thử nhanh trở nên là một thiết bị phân tích hữu
hiệu có sẵn trên thị trường cho việc phát hiện các loại hormone, virus, hợp chất độc
hại, chất làm rối loạn trao đổi chất. Hai dạng thiết kế phổ biến được sử dụng. Kiểu
sandwich (possitive assay) được thiết kế cho các mẫu phân tích có nhiều hơn một
epitope được phát hiện bởi hệ thống miễn dịch, đặc biệt là kháng thể. Đối với kiểu
định dạng này, vạch kiểm tra sử dụng kháng thể đơn dòng và cường độ của chúng
tương ứng trực tiếp với lượng chất cần phân tích có trong mẫu. Thứ hai, kiểu cạnh
tranh (negative assay) được thiết kế với các chất cần phân tích có khối lượng phân tử
nhỏ hơn 1000 Da và có chỉ một epitope. Vạch kiểm tra trong phép phân tích này có
thể là kháng thể kháng lại chất cần phân tích (anti-analyte antibody) hoặc chất gắn kết
chất phân tích-protein (analyte-protein conjugates). Kết quả trên vạch kiểm tra sẽ đậm
màu nhất nếu như không có mặt có chất cần phân tích vì mối quan hệ nghịch đảo giữa

nồng độ của chất cần phân tích và sự hình thành chất mầu.
Chẩn đốn dùng que thử nhanh giúp giảm thiểu thời gian kiểm tra, mang lại sử
thuận tiện và hướng tới thị trường. Hơn nữa kiểu mơ hình kiểm tra này cho tín hiệu
mạnh hơn, thời gian kiểm tra ngắn so với các phép kiểm tra khác dựa trên nguyên lý
miễn dịch như miễn dịch phóng xạ (radioimmunoassay), miễn dịch liên kết enzyme
(enzyme linked immunoassay).

16


1.8. Kháng thể
1.8.1. Giới thiệu chung
Kháng thể là các phân tử immunoglobulin (Ig) có trong huyết thanh của động
vật có vú, có khả năng liên kết đặc hiệu với kháng ngun đã kích thích sinh ra nó.
Kháng thể có bản chất protein và bị biến tính bởi các tác nhân hóa học, hóa lý và sinh
học.

Hình 1.12. Cấu Trúc của kháng thể
Tất cả các dạng kháng thể đều có cấu tạo giống nhau do một hay nhiều đơn vị
monomer tạo thành, có dạng hình chữ Y. Đơn vị cơ bản của phân tử kháng thể gồm 4
chuỗi polyleptit hai chuỗi nặng có trọng lượng phân tử lớn (2H) và hai chuỗi nhẹ có
trọng lượng phân tử lượng thấp (2L) nối với nhau bằng liên kết cộng hóa trị (-S-S-)
và liên kết khơng cộng hóa trị.
Chuỗi nặng gồm vùng biến đổi VH, vùng đa dạng D, vùng liên kết JH và vùng
cố định CH trong khi đó chuỗi nhẹ có VL, JL và CL. Một cặp chuỗi nặng có vùng V-DJ và chuỗi nhẹ là V-J tạo nên vị trí bám của kháng thể nơi nhận diện ra vị trí gắn kết
kháng ngun.
Kháng thể có hai đặc tính hữu dụng: tính đặc hiệu và tính ghi nhớ. Tính đặc
hiệu thể hiện ở việc mỗi loại kháng thể chỉ liên kết và tấn công một loại kháng
nguyên nhất định. Loại kháng thể đó được gọi là kháng thế đơn dịng. Kháng thể đơn
dịng chủ yếu được ứng dụng trong việc chẩn đốn bệnh. Hai cơng trình tiêu biểu

trong số nhiều cơng trình mà sử dụng kháng thể đơn dịng trong chẩn đốn là:
Gần đây, Jianfeng Chen (năm 2007) [20] và các đồng sự đã thành công trong
việc phát hiện nhanh cúm gia cầm H5N1 từ dịch niệu gà, miếng gạc khí quản và các
mô. Ở đây họ đã sử dụng kháng thể đơn dòng đặc hiệu với glycoprotein HA của
H5N1 để gắn lên nhóm cacboxyl của hạt latex bằng các nhóm cacbondiimide tan
17