CHƯƠNG 3 LÊN MEN CÁC SẢN PHẨM TỪ SINH KHỐI TẾ BÀO VI SINH VẬT

CHƯƠNG 3
LÊN MEN CÁC SẢN PHẨM TỪ SINH KHỐI TẾ BÀO VI
SINH VẬT
1. Lên men sản xuất axit glutamic, lysin, metionin từ vi khuẩn
corynebacterium glutamicum:
1.1. Lên men sản xuất axit glutamic:
Quá trình sản xuất axit glutamic bằng phương pháp lên men theo sơ đồ sau:
Nguyên liệu tinh bột
H2O

Phối chế

HCl

Thủy phân
Phối chế dịch lên men
Men giống
Chuẩn bị men giống

Nguyên liệu phụ

Thanh trùng dịch lên men
Lên men
Trao đổi ion
Tách axit glutamic

Hình 16. quy trình lên men sản xuất acid glutamic
1.1.1. Nguyên liệu, phối chế và thủy phân
Có thể sử dụng nguyên liệu là tinh bột (sắn, ngô, gạo...) hoặc rỉ đường. Đối
với tinh bột phải được thủy phân bằng axit. Để thủy phân có thể phối chế nguyên
liệu theo tỉ lệ: tinh bột /nước/HCl 100% = 100/350/0,77. Tiến hành thủy phân ở

nhiệt độ 148÷150oC, áp suất = 2,5 kg/cm2, thời gian 30÷34 phút. Sau khi thủy phân
xong làm nguội dung dịch xuống 60 ÷ 70 oC và tiến hành trung hịa: để trung hòa
lần 1 người ta dùng Na2CO3 trung hòa đến pH = 4,8 ÷ 5, tốc độ cánh khuấy 65
vịng/phút. Tiếp theo cho than hoạt tính để tẩy màu sơ bộ rồi lọc tách bã than và
cặn. Tiếp tục dùng Na2CO3 trung hịa lần 2 đến pH = 6,7 ÷ 7, tốc độ cánh khuấy 60
vòng/phút. Dùng Na2CO3 vừa rẻ tiền vừa làm cho dịch đường khơng có vị đắng
như NaOH.
57


1.1.2. Chuẩn bị mơi trường lên men
Ngồi dịch đường thủy phân, trong môi trường lên men phải bổ sung thêm 1
số chất khác. Ví dụ: mơi trường lên men sau:
Dịch đường hóa 13%
Cao ngơ
K2HPO4

0,7%
0,15%

MgSO4 0,075%
Urê cho ban đầu 2%, bổ sung giữa chừng 1,2% và MnSO4 2%
Trong thực tế sản xuất người ta dùng rỉ đường mía thay cho cao ngô và đây
cũng là nguồn cung cấp các loại đường cho vi khuẩn sinh tổng hợp axit glutamic.
Sau khi phối chế, môi trường được thanh trùng và làm nguội. Yêu cầu dịch
đường lên men phải vô trùng tuyệt đối, bảo đảm độ khơ 5 ÷ 6 Be.
1.1.3. Lên men dịch đường
*Chủng nấm men: người ta có thể sử dụng chủng vi khuẩn sau để lên men
tổng hợp axit glutamic: Corynebacterium glutamicum (ngồi ra có thể sử
dụng Brevibacterium flavum...)

Vi khuẩn sử dụng trực tiếp đường và NH 3 của môi trường lên men để sinh
tổng hợp L-axit glutamic có thể diễn ra theo 2 con đường:
Glucoza
Hexemonophotphat
Axit pyruvic
Axit α – xetoglutavic
Con đường amin hóa – khử

Con đường chuyển amin

L – axit glutamic
Hình 17. Quy trình lên men sản xuất acid glutamic từ dịch đường
Con đường amin hóa-khử:
HOOC-CO-CH2–CH2-COOH + NADPH2

HOOC-CH-CH2–CH2-COOH +
NH2

H2O + NADP
58


Con đường chuyển amin:
HOOC-CO-CH2-CH2-COOH + R-CH-COOH

HOOC-CH-CH2-CH2- COOH

NH2
+

NH2

RCO-COOH
*Phương trình tổng quát của quá trình lên men:
C6H12O6 + NH3 + 3/2O2

C5H9NO4 + CO2 + 3H2O

* Những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men:
+ Độ pH của mơi trường
Các chủng vi khuẩn sinh tổng hợp L-glutamic đều thích hợp ở mơi trường
trung tính hay kiềm yếu ở pH = 6,7 ÷ 8. Trong quá trình lên men độ pH giảm vì tạo
ra axit glutamic và 1 số axit hữu cơ khác. Do đó phải điều chỉnh độ pH thường
xuyên bằng NH4+, Nguồn NH4+ sử dụng phổ biến là: urê, nước NH 3, khí NH3,
NH4Cl...
+ Sự cung cấp O2
Lên men tổng hợp axit glutamic là q trình hiếu khí bắt buộc. Do đó sự cung
cấp oxi trong khi lên men là hết sức quan trọng. Nếu thiếu O 2 thì sản phẩm chủ
yếu là axit lactic, nếu thừa oxi thì sản phẩm chủ yếu là axit α-xetoglutavic. Oxy
được cung cấp cho dịch lên men bằng cách sục khơng khí vơ trùng kết hợp với
khuấy trộn liên tục, vận tốc cánh khuấy 150 vịng/phút.
+ Nhiệt độ
Nhiệt độ thích hợp nhất cho q trình lên men là 26÷37 oC, trong thực tế lên
men giai đoạn đầu ở 30÷32oC và giai đoạn cuối 36÷37oC.
+ Chất kích thích sinh trưởng
Q trình tổng hợp axit glutamic rất cần biotin. Biotin khơng chỉ là chất sinh
trưởng mà cịn là chất xác định thành phần và số lượng các sản phẩm lên men.
Sinh khối của vi khuẩn tăng tỉ lệ với hàm lượng biotin nhưng với axit glutamic thì
khơng hoàn toàn như vậy: lượng axit glutamic được tạo thành nhiều nhất khi trong
môi trường hàm lượng biotin thấp hơn nhiều so với lượng biotin cần thiết cho sự

phát triển tối đa của sinh khối. Biotin không làm thay đổi hoạt lực của các enzim
59


tổng hợp nên axit glutamic mà ảnh hưởng đến tính thẩm thấu của màng tế bào,
làm cho axit glutamic từ bên trong tế bào vi sinh vật khuyếch tán ra ngồi mơi
trường lên men. Nồng độ biotin thích hợp nhất cho sinh tổng hợp axit glutamic
2÷5g/l.
Nguồn cung cấp biotin là cao ngơ, rỉ đường mía. Trong q trình lên men
nếu dùng rỉ đường mía làm nguồn cung cấp đường và biotin thì thường xảy ra
hiện tượng thừa biotin sẽ khơng có lợi, sinh tổng hợp axit glutamic ít, nếu sục khí
kém sẽ tạo ra alanin và axit lactic. Vì vậy, người ta phải bổ sung thêm penicilin để
kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn trong môi trường giàu biotin đồng thời tăng
trưởng quá trình tổng hợp axit glutamic.
1.1.4.Các phương pháp lên men
Có thể lên men gián đoạn, bán liên tục và liên tục.
Ở nước ta các nhà máy sản xuất bột ngọt đều dùng phương pháp gián đoạn.
Men giống phải được nuôi cấy sẵn từ ống thạch nghiêng và cho đến khi đạt tỉ
lệ giống theo yêu cầu.
Môi trường sau khi chuẩn bị và thanh trùng xong được làm nguội đến nhiệt
độ lên men và cấy men giống vào với tỉ lệ 1% để lên men. Thời gian lên men
32÷38h, nhiệt độ lên men 32÷38oC. Trong q trình lên men phải cung cấp khơng
khí vơ trùng liên tục, bổ sung thêm urê để chỉnh pH của môi trường lên men và
phải khuấy trộn. Do môi trường lên men tạo nên axit glutamic cùng với thành
phần của mơi trường có xu hướng làm tăng sức căng bề mặt. Vì vậy, trong quá
trình lên men tạo thành nhiều bọt ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp nên phải
sử dụng chất phá bọt (dầu lạc, dầu đậu tuơng, axit oleic...).
Sau khi lên men xong ta chuyển dung dịch sang thiết bị trao đổi ion để tách
axit glutamic.

1.1.5. Tách và tinh chế axit glutamic
Người ta sử dụng phương pháp trao đổi ion.
Nhựa trao đổi ion (hay còn gọi là rezin) là hợp chất cao phân tử, không tan
60


trong nước, axit, bazơ và các dung môi hữu cơ. Trong phân tử của nó có chứa
nhóm hoạt động hóa học có khả năng phân li thành ion. Có 2 loại rezin: rezin trao
đổi ion dương (gọi là rezin dương tính) và rezin trao đổi ion âm (rezin âm tính).
Bao gồm rezin dương tính mạnh và rezin dương tính yếu, rezin âm tính mạnh và
rezin âm tính yếu. Để tách axit glutamic người ta sử dụng rezin dương tính mạnh,
chịu được nhiệt độ 100oC, mức độ trao đổi ion: Fe3+ > Ca+3 > Mg2+ > K+ > NH4+ >
Axit glutamic> H+
Do vậy, có thể dùng NaOH nhả hấp phụ axit glutamic trên rezin.
*Tách axit glutamic bao gồm các công đoạn:
- Phối liệu để dịch trao đổi đảm bảo lượng axit glutamic: 0,45÷0,5kg/m 3, pH
≤ 5, nhưng khơng dưới 3,2 để tránh sự tự kết tinh của axit glutamic do tạo điểm
đẳng điện.
- Tiến hành trao đổi: dịch lên men đi từ dưới lên trong cột chứa đầy rezin:
v = 8÷10 m/h; Q = 150÷180 l/phút; t = 150÷180 phút.
Dùng nước nóng 70oC cho chảy qua cột trao đổi để rửa và chống kết tinh axit
glutamic trên bề mặt nhựa.
- Nhả hấp phụ: dùng NaOH 4÷5%; nhiệt độ = 65oC; v = 6m/h;
Q = 100 l/phút; t = 30phút.
* Phương trình nhả hấp phụ:
RSO3NH - CH - CH2 - CH2 – COOH + Na+

RSO3Na + C5H9NO4

COOH

1.1.6. Tinh chế axit glutamic
Axit glutamic sau khi tách còn lẫn tạp chất như HCl, chất màu, tạp chất sắt,...
Vì vậy, cần phải qua tinh chế. Quá trình gồm các khâu sau:
1. Tẩy rửa: Sau khi thu được axit glutamic ngậm HCl, dùng HCl 31% để rửa
nhằm hòa tan hết các axit amin khác ra khỏi axit glutamic ngậm HCl. Không nên
rửa quá nhiều để đỡ tốn hóa chất.
2. Trung hịa: Để tách HCl ra khỏi axit glutamic ngậm HCl, người ta dùng
Na2CO3 hoặc NaOH để trung hịa.
3. Khử sắt và canxi: Do trong q trình sản xuất chúng ta dùng axit mạnh,
61


nồng độ cao nên sắt từ thiết bị hoà tan vào, canxi trong nước sử dụng để sản xuất
cũng rơi vào sản phẩm. Do đó người ta phải khử sắt, canxi bằng hỗn hợp Na 2S và
axit oxalic:
FeCl2

+

Na2S

FeS + 2 NaCl

C2H2O4 +

Ca2+

C2O4Ca + 2H+

FeS và C2O4Ca kết tủa được tách ra khỏi dung dịch bằng lọc hoặc li tâm.

4. Tẩy màu: Để bảo đảm tốc độ kết tinh natriglutamat và chất lượng sản phẩm,
trước khi kết tinh cần tẩy màu dung dịch bằng than hoạt tính ở nhiệt độ thích hợp
(60oC), sau đó lọc ép tách bã than.

1.2. Kỹ thuật sản xuất acid L – Lyzin và methionin
1.2.1. Chủng vi sinh vật

62


Chủng sản xuất là một thể đột biến cần homoxerin của Corinebacterium
glutamicum (hay còn gọi là Micrococus glutamicus). Dưới điều kiện lên men thích
hợp chủng này có thể sản xuất tới 50 g lyzin/ 1 lít mơi trường. Ngun liệu thường
dùng là glucoza hay mật rỉ với nồng độ 150g/lit.
1.2.2. Phương trình lên men tổng quát
100C6H12O6 + 219O2 + 86NH3

35C6H14N2O2 + 16C8H13O4 + 262CO2

1.2.3.Cơ chế
Glucoza
Pyruvat
Oxalaxetat
Aspactat
(1)

β– Aspactyl – photphat
Aspactat – β – Semialdehyt
(2)

Lyzin

(3)

Homoxerin

Treonin

methionin

Izoleuxin
Hình 18. Sơ đồ cơ chế tổng hợp L – Lyzin của Corinebacterium glutamicum
(1) – enzym Aspactokinaza; (2) – Enzym homoxerindehydrogenaza; (3) – Enzym
dihydropicolinat – syntetaza.
Lyzin là một axit amin thuộc họ aspactat và được tổng hợp qua con đường
phân nhánh mà qua đó homoxerin, methionin, treonin, izoleuxin cũng đựoc tạo
thành.
Những đường chấm biểu diễn sự ức chế bởi sản phẩm cuối cùng. Ở chủng
hoang dại lyzin và treonin cùng gây ra ức chế phối hợp đối với aspactokinaza (1).
Do khuyết homoxerindehydrogenaza (3) mà khơng có sự tạo thành treonin.
Dihydropicolinat – Syntetaza (2) không mẫn cảm dị lập thể nên sự ức chế bởi sản
phẩm cuối cùng bị triệt tiêu và có sự tổng hợp thừa lyzin (50g/lit).
63


1.2.4. Lên men
Nguồn hydrocacbon thích hợp cho tổng hợp lyzin là glucoza, fructoza,
maltoza và saccharoza. Các đường lactoza, rafinoza, pentoza các chủng sinh lyzin
khơng đồng hóa được. Cho nên người ta thường sử dụng các loại nguyên liệu như
rỉ đường, dịch thủy phân từ tinh bột (ngô, sắn) để làm môi trường sản xuất lyzin.

Nồng độ đường trong môi trường lên men khoảng 10-12%. Trong quá trình
lên men, nhằm để tăng hiệu suất thu hồi lyzin có thê bổ sung thêm đường để nâng
cao nồng độ đường lên 25% (nhưng cũng thận trọng vì có khi hiệu suất sinh lyzin
khơng tăng mà còn ảnh hưởng xấu đến vi sinh vật do làm tăng áp suất thẩm thấu
của môi trường).
Nguồn nitơ dùng là ure, NH3 hoặc các muối amon. Tỷ lệ giữa C:N đóng vai
trị quan trọng, nó ảnh hưởng đến hiệu suất tổng hợp lyzin. Thường bổ sung các
muối amon với hàm lượng 2%.
Ngồi ra cịn phải bổ sung vào môi trường các chất cung cấp nguồn photpho
như KH2PO4 và K2HPO4 (đảm bảo lượng photpho đạt 0,008 -0,02mg/lít, nếu nơng
độ này lên đến 1,6 – 2 mg/lit thì quá trình tổng hợp lyzin bị ngừng). Do đó khơng
nên dùng muối amon để làm nguồn cung cấp photpho và nitơ.
Phải bổ sung các muối có chứa các nguyên tố Mg, Fe, Cu, Mn (thường bổ
sung muối MgSO4 – 0,03%, còn Fe, Cu, Mn thì đã có trong cao ngơ, và rỉ đường).
Các chất kích thích sinh trưởng: + Biotin: cần khoảng 8-15 mg/lít, nếu q ít
(1 – 2 mg/lít) thì sản phẩm chủ yếu sẽ là axit glutamic. Biotin và B1 có trong cao
ngơ, đặc biệt trong rỉ đường mía có nhiều biotin.
+ Thiamin (B1): Nếu khơng có sẽ tạo thành alanin.
+ Treonin: Khơng có hoặc ít sẽ kìm hãm sự phát triển của vi sinh vật nhưng
dư sẽ dẫn tới sự ức chế sản phẩm cuối cùng. Hàm lượng thích hợp trong khoảng
200-800 mg/lít.
+ Methionin: nó có ảnh hưởng tới sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật.
Hàm lượng thích hợp là 150 – 250 mg/lít.
Có thể dùng homoxerin để thay thế cho treonin và methionin.

64


Bảo đảm mơi trường phải có pH = 7 – 7,6 và phải thanh trùng. Lượng giống
cho vào để lên men là 5 – 10%. Nhiệt độ lên men là 30 – 32 oC, cung cấp oxy 24g/lit.h. trong quá trình lên men dùng ure hoặc nước NH3 để điều chỉnh pH. Tổng

thời gian lên men 50-72h.
1.2.5. Thu hồi sản phẩm
Tùy vào dạng chế phẩm (dịch nuôi cấy, dịch cô đặc, bột hoặc tinh thể) mà quá
trình thu nhận sản phẩm có khác nhau.
- dịch ni cấy là chế phẩm thu được sau khi lên men và có thể dùng trực tiếp
pha vào thức ăn gia súc.
- Dịch cô đặc: Để tránh hư hỏng thì dịch sau khi lên men được axit hóa bằng
HCl đến pH = 5 và bổ sung dung dịch NaHSO3 25% (tỷ lệ 0,4% so với dịch lên
men) rồi đem đi cô chân không cho đến khi đạt nồng độ chất khô 35 – 40%. Chế
phẩm này dùng trong chăn nuôi.
- Bột: Từ dịch cô đặc có thể bổ sung thêm các chất độn (bột xương, cám…)
rồi sấy khô và nghiền nhỏ. Hoặc dịch cô đặc đem sấy phun để thu chế phẩm dạng
bột.
- Để thu nhận các tinh thể lyzin thì phải sử dụng nhiều phương pháp và tiến
hành theo nhiều bước.
Hỗn hợp lên men

Lọc (ly tâm)

Sinh khối

Dung dịch
Nhả hấp phụ

trao đổi ion

Dùng dung dịch NH4OH 2 -3,5% để nhả hấp phụ. Dùng HCl để axit hóa đến
pH = 5 rồi cơ đặc đến khi đạt nồng độ 30 -50% sau đó làm lạnh đến 10 – 12 oC để
trợ tinh. Để có chế phẩm tinh khiết thì đem chế phẩm kết tinh lần một kết tinh lại
nhiều lần (hòa tan trong cồn).

1.3.Kỹ thuật sản xuất acid L – Triptophan
Nhờ vào sự tổng hợp của vi sinh vật, L – triptophan có thể thu nhận bằng hai
con đường: chuyển tiền chất của triptophan thành triptophan nhờ sự giúp đỡ của
65


các hệ enzym vi sinh vật; hoặc thu nhận triptophan nhờ sự đột biến do thiếu tirozin
và fenylalanin của các chủng vi sinh vật.
1.3.1.Phương pháp chuyển tiền chất
1.3.1.1. Tiền chất
Nhờ vi sinh vật có thể thu nhận được triptophan từ các tiền chất khác nhau.
Hiệu suất thu hồi sản phẩm từ các tiền chất khác nhau là không giống nhau. Một số
tiền chất hay sử dụng:
Axit antranilic

Hiệu suất thu hồi là 98,8%

Indol

87,2%

Indol + Cerin (1:2)

92,5%

Indol + Cestein (1:2)

89,5%

Indol + Alanin (1:4)

87,0%

1.3.1.2.Chủng vi sinh vật
Để chuyển các tiền chất người ta có thể sử dụng nhiều chủng vi sinh vật khác
nhau. Riêng đối với axit antranilic người ta hay dùng nhất là nấm men candica
utilis hoặc hansunella.
1.3.1.3. Cơ chế
Khi sử dụng axit antranilic làm tiền chất thì cơ chế của quá trình như sau:

Hình 19. Cơ chế chuyển tiền chất antranilic thành triptophan
1.3.1.4. Kỹ thuật lên men

66


Quá trình sản xuất chia làm hai giai đoạn: Thu nhận sinh khối và chuyển hóa
tiền chất nhờ sự giúp đỡ của sinh khối đã thu được.
Giai đoạn đầu không khác mấy so với quá trinh nuôi cấy các vi sinh vật giống
khác. Tức là quá trình cũng đi từ ống giống gốc, ống nghiệm, bình tam
giác….Lượng sinh khối thu nhận được phụ thuộc vào phương pháp nuôi cấy giống.
Họ thấy rằng nếu lượng giống đưa vào lên men càng lờn thì mức độ chuyển hóa
của axit antranilic càng lớn.
Nguồn cung cấp cacbon cho giống phát triển là saccharoza hoặc rỉ đường (với
hàm lượng từ 6,3 – 20%), nguồn cung cấp nitơ là ure với lượng 0,5 – 1%, ngoài ra
còn bổ sung thêm %: K2HPO4 – 0,01; MgSO4 – 0,005; CaCl2 – 0,01. Bảo đảm mơi
trường có pH = 7,5 – 8,0 và vô trùng. Tiền hành nuôi giống ở nhiệt độ 28 – 32 oC,
thời gian nuôi cấy của mỗi cấp không quá 24h. Yêu cầu giống đạt 3-5g sinh khối
khơ/1 lít mơi trường.

Giai đoạn hai được thực hiên trong thiết bị lên men. Đầu tiên chuẩn bị môi
trường trong thiết bị lên men và chuyển men giống đã nuôi ở giai đoạn một vào.
Tiếp tục nuôi giống trong 24h ở nhiệt độ 28 – 30 oC và khơng khí khơng ít hơn 7g
O2/ l.h. Nếu trong q trình ni giống có xuất hiện bọt thì phải dùng dầu phá bọt.
Sau 24h nuôi giống cho vào thiết bị lên men dung dịch axit antranilic 5%
trong rượu và trong amoniac 50% để lên men. Lúc này khơng khí bảo đảm 3-4 g
O2/l.h.
Sau khi cho dung dịch axit vào được 3 - 4h thì bổ sung thêm dung dịch rỉ
đường 25%. Tiếp theo cứ sau 12h thì bổ sung dung dịch rỉ đường, sau 6h thì bổ
sung dung dịch amoniac và axit antranilic một lần. Tổng thời gian của giai đoạn
hai là 120 – 140 giờ. Quá trình lên men giai đoạn hai thực hiện trong điều kiện pH
~ 8 và nhiệt độ khoảng 30oC.
1.3.1.5. Thu hồi sản phẩm
Dung dịch sau lên men có chứa khoảng 7,8 – 12,5 chất khơ, trong đó có 0,3 0,5% triptophan. Phần lớn (85% - 88%) triptophan nằm ở pha lỏng. Do đó để thu
nhận chế phẩm tinh khiết thì phải tinh chế dịch lọc. cịn nêu dùng cho chăn ni thì
sử dụng dạng cơ đặc có cả sinh khối nấm men.
67


Để làm thức ăn gia súc thì dịch lên men sau cơ đặc cịn lại 1/3 thể tích, sau đó
đem sấy trong thiết bị sấy phun ( t o = 110 – 120oC) để thu nhận bột dùng cho thức
ăn gia súc. Trong thành phần của bột này gồm có:
- Chất khô 90%
- Protein 48 – 54%
- Triptophan 1 – 3%
- Vitamin (mg/kg)
+ B1: 15 – 18,5
+ B2: 24,5 – 32,5
+ PP: 620 – 680.
Axit amin khác 6%. Trong đó có chứa nhiều axit amin như lyzin, histidin,

treonin, xerin, glutamate, prolin, glyxin, valin, tirozin, phenilalanin, acparagin,
acginin…
Để thu nhận triptophan tinh khiết thì phải tiến hành các bước sau:
- tách sinh khối bằng li tâm
- Dùng axit HCl hạ pH đến 1 và lọc kết tủa
- Tiến hành trao đổi ion
- Nhả hấp phụ nhờ dung dịch amoniac 5%
- Cô đặc dung dịch ở nhiệt độ 60 – 70oC
- Làm lạnh đến 4 – 6oC để trợ tinh
- Tách tinh thể triptophan
- Rửa các tinh thể bằng rượu etylic
- Sấy các tinh thể ở nhiệt độ 60oC
Các phế liệu của quá trình tinh chế này có thể dung cho chăn ni.
1.3.2.Thu nhận từ các chủng đột biến
Sự thu nhận triptophan cũng như tirozin và phenylalanin có thể thực hiện trên
các chủng đột biến của E. coli hoặc Basillus Subtilis.
Quá trình tổng hợp Triptophan, phenylalanin, tirozin có thể thực hiện qua sơ
đồ sau:

68


Glucoza
Axit forfoenol pyruvic

Eritroza – 4 – P
Axit skimic

axit antranilic

Axit corismic

Triptophan

Axit prephenic
Axit phenylpyruvic

axit hydrophenylpyruvic

Phenylalanin

Tirozin

Hình 20. Cơ chế tổng hợp triptophan, tirozin và phenylalanin trong tế bào VSV.

2.Sản xuất protein đơn bào
2.1. Ưu và nhược điểm của sản xuất protein đơn bào bằng vi sinh vật
*Ưu điểm
- Ít tốn diện tích
- tốc độ sinh trưởng cao: gấp 100 – 1000 lần so với đại gia súc
Ví dụ để sản xuất 1 tấn protein cần:
+ trồng 4 ha đậu trong 3 tháng
+ Nuôi 4 con bị trong vịng 15 – 18 tháng
+ Ni 300 m3 vi sinh vật trong vịng 24h.
- Khơng phụ thuộc vào khí hậu

69


- Thành phần và giá trị dinh dưỡng của sinh khối có thể điều chỉnh được bằng

cách thay đổi thành phần môi trường, điều kiện nuôi cấy hoặc tạo giống mới.
- Sử dụng nguyên liệu sẵn có và rẻ tiền.
*Nhược điểm:
- Trong sinh khối của vi sinh vật chứa nhiều axit nucleic (10 -20%) khơng có
lợi cho sức khỏe của con người.
- Protein vi sinh vật có hương vị chưa cao.
2.2. Các yêu cầu cơ bản của việc sản xuất protein đơn bào
Để đạt được hiệu quả kinh tế cao trong sản xuất sinh khối vi sinh vật cần phải
bảo đảm các yêu cầu sau đây:
1. Sử dụng nguyên liệu rẻ tiền và thu hoạch cao
Để đạt được năng suất cao thì cần chú ý đến hiệu suất chuyển hóa nguyên
liệu của vi sinh vật. Các dạng nguyên liệu được quan tâm nhiều:
- Cacbuahydro: Vi sinh vật có thể chuyển hóa 100% thành sinh khối.
- Hydrocacbon: (rỉ đường, dịch kiềm sunfit, xelluloza, tinh bột, cặn sữa….).
Vi sinh vật có thể chuyển 50% chất khô này sang sinh khối.
2. Tốc độ sinh trưởng cao
Nói chung tốc độ sinh trưởng của vi sinh vật là rất lớn, thời gian nhân đôi
ngắn:
- Vi khuẩn 0,3 – 2 h
- Nấm men và tảo 2 – 6 h
- Nấm sợi khoảng 10 h
- Gà mái khoảng 500 h
- Lợn khoảng 1000 h
- Trâu bò khoảng 2000 h
Như vậy trong cùng một đơn vị thời gian nếu nuôi cấy vi sinh vật để nhân
sinh khối sẽ thu được một khối lượng cao hơn rất nhiều so với các sinh vật khác.
3. Hàm lượng protein cao
Hàm lượng protein phụ thuộc vào chủng và chịu ảnh hưởng nhiều ở điều kiện
ni cấy. Nói chung hàm lượng protein ở vi sinh vật đạt 50 – 60%.
70

4. Chất lượng protein cao
Đánh giá chất lượng protein người ta hay quan tâm đến hàm lượng axit amin
không thay thế. Tiêu chuẩn này cũng mang tính chất lồi. Thành phần axit amin
của protein vi sinh vật giống như trong sữa và thịt. Protein trong vi sinh vật giàu
lyzin nhưng các axit amin chứa lưu huỳnh lại thấp.
5. Khả năng tiêu hóa của protein
Khả năng tiêu hóa của protein vi sinh vật bị hạn chế bởi các thành phần nitơ
phi protein ( như axit nucleic, peptit của thành tế bào). Tuy nhiên nếu protein được
tách khỏi tế bào thì vấn đề này khơng cần phải quan tâm. Do đó bản chất thành tế
bào là tiêu chuẩn để lựa chọn vi sinh vât trong sản xuất.
6. Sự an toàn về độc tố
Các vi sinh vật gây bệnh hoặc chứa các thành phần nghi ngờ thì khơng được
sử dụng để sản xuất protein đơn bào. Yêu cầu hàm lượng axit nucleic phải thấp.
Hàm lượng của nó càng cao thì càng làm giảm giá trị của protein. Khi tiêu hóa các
axit nucleic sẽ phân hủy thành các nucleotit, sau đó được phân hủy thành adenin và
guanin và cuối cùng thành axit uric. Trong cơ thể người khơng có enzym urinaza
do đó uric khơng chuyển hóa tiếp. Sự tích tụ axit uric sẽ gây nên bệnh thấp khớp,
tạo ra sỏi thân, sỏi bàng quang do độ hòa tan thấp của axit này. Lượng axit nucleic
hấp thụ qua dinh dưỡng không được vượt quá 2g/ngày.
Ở động vật vấn đề này khơng quan trọng vì chúng có khả năng đồng hóa axit
uric. Ta có thể làm giảm lượng axit nucleic bằng các biện pháp sau:
- Giảm mạnh tốc độ sinh trưởng.
- Chiết rút ARN bằng NaOH 10% nóng.
- Thủy phân ARN bằng kiềm và tách protein hịa tan trong đó bằng kết tủa
- Phân hủy ARN bởi enzym nucleaza đưa vào hoặc của bản thân tế bào. Dùng
phương pháp choáng nhiệt theo ba bước: Đầu tiên tế bào được đun nóng đến 68 oC
trong 5 giây, sau đó ure ở 52,5 oC trong hai giờ và cuối cùng ở 55 – 56 oC trong 1 h.
Việc xử lý này làm biến tính riboxom và hoạt hóa ribonucleaza. Các sản phẩm thủy

phân được tách ra khỏi tế bào, hàm lượng protein không bị ảnh hưởng, hàm lượng
axit nucleic giảm từ 1-2% lượng vật chất khô của tế bào.
71


7. Những vấn đề kỹ thuật
Vi sinh vật phải dễ tách, dễ xử lý. Các tế bào lớn được tách ra bằng ly tâm tốt
hơn tế bào vi khuẩn. Chọn các chủng vi sinh vật có khả năng chịu nhiệt sẽ làm
giảm chi phí cho việc làm nguội. Tính khơng mẫn cảm với sự tạp nhiễm là tiền đề
cho việc làm nguội sản xuất protein khơng vơ trùng. Ngồi ra người ta cịn chú ý
đến khả năng đồng hóa đồng thời nhiều nguồn cacbon khác nhau.
2.3.Vi sinh vật dùng trong sản xuất protein đơn bào
2.3.1. Nấm men
Trong các đối tượng vi sinh vật được sử dụng trong sản xuất protein đơn bào
thì nấm men được nghiên cứu và sử dụng sớm nhất và đến nay đã và đang được sử
dụng rộng rãi ở nhiều nước trên thế giới. Nấm men giàu protein, vitamin (nhất là
vitamin nhóm B). Hàm lượng protein của nấm men dao động từ 40 – 60% khối
lượng chất khô. Protein của nấm men gần giống với protein nguồn gốc từ động vật,
chứa khoảng 20 loại axit amin, trong đó đầy đủ các loại axit amin khơng thay thế.
Thành phần các aminoaxit của nấm men cân đối hơn lúa mì, kém hơn một chút ít
so với sữa, bột cá, và sản phẩm động vật nói chung.
Được sử dụng rộng rãi nhất là Candida, Torulopsis, Saccharomyces vì các loại
này khả năng chuyển hóa các chất cao, đa dạng và quy trình cơng nghệ đơn giản.
2.3.2. Nấm sợi
Khi dùng ngun liệu là tinh bột và xellulo thì khơng thể sử dụng nấm men
được vì bản thân nấm men khơng có chứa amylaza, và celulaza do đó phải dùng
nấm sợi. Nấm sợi có nhược điểm là thời gian nhân đơi dài và hàm lượng protein
thấp (30%). Nhưng nấm sợi lại có ưu điểm là rất dễ tách sinh khối và tạo hương vị
đặc biệt.
Để dùng trong thực phẩm người ta sử dụng các loại Morchella. Lồi này có vị

ngon, phù hợp cho chế biến thực phẩm. Tuy nhiên khó khăn nhất là nuôi cấy
Morchella rất tốn kém và dễ bị nhiễm.
Hiện nay nhiều nơi sử dụng hỗn hợp giống Trichoderma virid và nấm men
Saccharomyces serevisiae để sản xuất protein. Ngoài ra người ta còn sử dụng hỗn

72


hợp Trichoderma virid với Candida utilis hoặc Endomycopsis fibiniger với
Candida utilis.
3.2.3..3 Vi khuẩn
Vi khuẩn dùng để sản xuất protein đơn bào thường được nuôi cấy trên
cacbuahydro. Người ta thường sử dụng các giống Pseudomonas, Flavobacterium,
Mycobacteriuum, Nocardia. Các giống vi khuẩn này có khả năng đồng hóa các
ankal, cacbuahydro béo và thơm.
Đối với nguyên liệu là metan người ta thường sử dụng Methylomonas
methania, Methylococens capsulatus.
2.3.4. Vi khuẩn lam và vi tảo
Tất cả mọi loại tảo có kích thước nhỏ bé và có thể thích hợp với việc sử dụng
các phương pháp nuôi cấy đối với vi sinh vật đều gọi là vi tảo. Cịn vi khuẩn lam
trước đây thì được gọi là tảo lam. Vể quy trình cơng nghệ sản xuất tạo sinh khối
của hai loại này về cơ bản là giống nhau.
Hàm lượng protein chiếm khoảng 40 - 60% lượng chất khơ, thậm chí đối với
Spirulina cịn lên đến 60 – 70%. Hàm lượng amino axit của hai loại này khá cân
đối, gần với protein tiêu chuẩn.
Ngoài ra trong sinh khối của hai loại tảo này còn chứa nhiều vitamin: A, B, K,
pantothenic và dạng tươi cịn có chứa vitamin C. Ở Spirulina có chứa nhiều
vitamin B12 nên được sử dụng để sản xuất thực phẩm và mỹ phẩm, TAGS (gà cho
trứng đỏ, da vàng). Trong sinh khối của vi khuẩn lam cịn có chứa kháng sinh nên
bảo quản tốt.

2.4.Quy trình sản xuất protein đơn bào từ vi sinh vật
2.4.1.Quy trình cơng nghệ
Ngun liệu

xử lý

chuẩn bị mơi trường dinh dưỡng

Vi sinh vật thuần khiết
Sản phẩm

Hồn thiện

Ni
xử lý

tách sinh khối

Cấy vi sinh vật
Lên men

Hình 21. quy trình sản xuất protein đơn bào
2.4.2. Nguyên liệu
73


Thường sử dụng các loại nguyên liêu như: rỉ đường, nước thải của các nhà
máy sữa, dịch kiềm sunfit, dịch thủy phân gỗ, tinh bột, dextrin, cacbuahydro….
2.4.3. Xử lý

Bao gồm nhiều công đoạn khác nhau tùy thuộc vào loại nguyên liệu và chủng
vi sinh vật sử dụng.
- Làm sạch: (tách tạp chất, loại bỏ các phần không cần thiết, làm sạch vi sinh
vật)
- Làm nhỏ nguyên liệu
- Thủy phân nguyên liệu (tinh bột, cellulose,….)
2.4.4. Chuẩn bị mơi trường dinh dưỡng
Ngồi cơ chất chình là cacbon thì trong mơi trường cần bổ sung thêm các chất
dinh dưỡng nguồn nitơ, photpho, kali, magie, các nguyên tố vi lượng và các chất
sinh trưởng như cao ngơ, cao nấm men… sử dụng các hóa chất để điều chỉnh pH
đến giá trị thích hợp.
2.4.5. Chuẩn bị giống
Nuôi cấy nhân giống đầu tiên được thực hiện trong phịng thí nghiêm, sau đó
được ni cấy tiếp ở phân xưởng sản xuất. Tỷ lệ tiếp giống chuyển tiếp là 1:10.
Thời gian nuôi cấy mỗi cấp khoảng 18 giờ. Trong q trình ni cấy dùng nước
amoniac để điều chỉnh pH và phải sục khí liên tục. Trong giai đoạn này cần chú ý
đến khử trung môi trường nuôi cấy.
2.4.6. Lên men
Thường sử dụng phương pháp lên men chìm và có thể lên men gián đoạn, bán
liên tục hoặc liên tục. Khi lên men chú ý điều khiển các yếu tố: nhiệt độ, độ pH,
môi trường dinh dưỡng, oxy, phá bọt…
2.4.7. Tách sinh khối
Tuy thuộc vào các điều kiện cụ thể mà có thể sử dụng các phương pháp khác
nhau để tách sinh khối như lọc, lắng, ly tâm….
2.4.8. Xử lý sinh khối
Tùy thuộc vào mục đích sử dụng mà q trình tách sinh khối bao gồm các
cơng đoạn sau đây:
74

- Rửa
- Triết rút protein (loại bớt ARN bằng các phương pháp khác nhau)
- Sấy (tốt nhất là dùng phương pháp sấy phun)

3 Sản xuất vitamin bằng phương pháp lên men vi sinh vật
3.1 Lên men sản xuất vitamin B12
Vitamin B12 là một vitamin nhóm B mà cơ thể cần với một khối lượng cực kỳ
ít, khoảng một vài microgam (1 microgam bằng 1 phần nghìn gam), tuy nhiên vai
trị của một lượng cực kỳ ít ấy lại là cực kỳ nhiều.
Vitamin B12 được biết đến như là chất tham gia vào việc tạo hồng cầu, tức tạo
máu. Ngày nay người ta còn thấy vai trò của vitamin B12 đối với các bệnh lý thần
kinh. Nhóm người có nồng độ vitamin B12 trong máu thấp sẽ có nguy cơ cao mắc
một số bệnh như bệnh suy giảm trí nhớ ở người già. Vitamin B12 cịn tham gia
chuyển hố để loại bỏ một amino acid có tên là homocystein – đây là chất gây bệnh
tim mạch cũng như bệnh não suy ở người cao tuổi (bệnh Alzheimer). Người cao
75


tuổi là đối tượng có nguy cơ cao thiếu vitamin B12 do khả năng hấp thụ của ruột ở
người già đối với vitamin này giảm rõ rệt, do đó cần tăng cường cung cấp thêm
vitamin B12 cho đối tượng nguy cơ này.
Do vai trò quan trọng của vitamin B12 nên người ta đang có xu hướng đánh
giá lại chính xác hơn về nhu cầu hàng ngày của loại vitamin này. Hiện tại nhu cầu
khuyến nghị hàng ngày của vitamin B12 là 1 microgam đối với hệ thống châu Âu
và 2,4 microgam đối với Mỹ và mức này đang bị coi là thấp hơn so với nhu cầu
thực sự của người lớn bình thường trong cộng đồng.
Khi xác định nhu cầu khuyến nghị hàng ngày cho một vitamin, người ta quan
tâm đến một mức độ tối thiểu của vitamin đó để tránh bị chứng thiếu vitamin. Một
nghiên cứu gần đây của các nhà nghiên cứu Đan Mạch được đăng trên tạp chí Dinh
dưỡng Lâm sàng của Mỹ (American Journal of Clinical Nutrition, Jan. 2006,

vol.83, pp.52-58) cho thấy nhu cầu hàng ngày của vitamin B12 tối thiểu phải là 6
microgam để có thể làm bình thường hố tất cả các thay đổi về sức khoẻ có liên
quan đến vitamin B12. Và mức này cho là thích hợp đối với cộng đồng người lớn
nói chung hơn là mức nhu cầu vitamin B12 hiện hành (chỉ có 1 microgam/ ngày).
Vitamin B12 có nhiều trong thực phẩm có nguồn gốc động vật như thịt trứng
sữa và hầu như khơng hiện diện trong thực phẩm có nguồn gốc thực vật. Do đó
người ăn chay thường có nguy cơ thiếu vitamin B12. Một chế độ ăn bình thường
cân đối sẽ giúp cung cấp đầy đủ 6 microgam vitamin B12 cho cơ thể hàng ngày.
Việc đề nghị tăng nhu cầu khuyến nghị hàng ngày của vitamin B12 sẽ làm thay đổi
công thức của các viên bổ sung vitamin và khống chất có chứa vitamin B12 cũng
như các thực phẩm được sản xuất có tăng cường vitamin B12.
Để đảm bảo cung cấp đủ 6 microgam vitamin B12 hàng ngày thì 1 viên bổ
sung vitamin cũng như 1 phần ăn của thực phẩm tăng cường B12 cần có ít nhất là
6 microgam vitamin B12 thay vì chỉ có 1 – 3 microgam như trước đây.
Cũng liên quan đến việc điều trị chứng thiếu hụt vitamin B12, gần đây các nhà
nghiên cứu thấy rằng việc dùng vitamin B12 liều cao bằng đường uống cũng hiệu
76


quả như dùng vitamin B12 bằng đưỡng chích như trước đây. Tuy nhiên liều
vitamin B12 dùng để uống có hiệu quả lại rất cao, 600microgam, tức gấp 200 lần
nhu cầu khuyến nghị hàng ngày. Các nhà chức trách châu Âu và Mỹ chưa có được
mức an tồn mới của vitamin B12, tuy nhiên các nhà nghiên cứu ở Anh Quốc cho
rằng mức này có thể cao đến 2000 microgam/ngày.
- Nhiệm vụ của Vitamin B12
Vitamin B12 hoạt động phối hợp với folic acid trong những phản ứnh sinh hóa
tối quan trọng diễn ra trong cơ thể liên hệ đến tiến trình phân cắt tế bào, và B12 rất
cần thiết cho sự tổng hợp DNA và RNA. Các mô trong cơ thể khơng thể phân cắt
và tăng trưởng bình thường nếu khơng có B12. Vai trị của B12 cịn quan trọng hơn
nữa với tủy xương là nơi chế tạo tế bào máu.

Một dạng coenzym của B12, gọi là Methylcobalamin, với sự trợ giúp của folic
acid, có thể chuyển nhóm methyl để biến đổi homocystein (nồng độ cao của chất
này là một yếu tố nguy hại về bệnh tim mạch) thành methionine. Dạng coenzym
thứ nhì, Adenosylcobalamin, (có khi gọi là Coenzym B12, Cobamamide,
Dibencozide.) liên hệ đến sự chuyển biến vài acid béo có số carbon lẻ trong chuỗi
Carbon, cholesterol và đến sự tổng hợp leucin, một acid amin quan trọng trong cơ
thể.
B12 cũng tham dự vào sự tái tạo folic acid trong cơ thể: Nếu khơng có B12 cơ
thể khơng thể sử dụng thích đáng folic acid và sẽ phải cần đến một số lượng rất cao
vượt khỏi khả năng cung cấp của thực phẩm. Các phản ứng tái tạo này liên hệ đến
sự biến dưỡng homocystein.
Một nhiệm vụ quan trọng khác của B12 là đóng vai trị chính yếu trong sự
biến dưỡng các chất béo của cơ thể: Các chất béo với chuỗi Carbon chẵn (như 16,
18 C.) sẽ được phân cắt thành từng khúc nhỏ, mỗi khúc có 2 carbon để sau đó được
đưa vào các phản ứng tạo năng lượng. Các chất béo có chuổi Carbon lẻ (như 15, 17

77


C.) cũng được phân cắt tương tự và B12 sẽ giúp phân cắt khúc có chứa 3 carbon
sau cùng.
Vitamin B12, qua vai trò biến dưỡng methionine và homocystein, tham dự
vào sự chế tạo myelin, chất bao bọc và bảo vệ sợi thần kinh. Những nguời thiếu
B12, sẽ bị hư hại myelin, từ đó hư hại thần kinh ngoại vi và thần kinh tủy sống.
đây là sự kiện xẩy ra cho những bệnh nhân pernicious anemia.
- Nhu cầu và nguồn cung cấp:
Nhu cầu B12 hàng ngày cho người trường thành theo FAO/WHO là 2
microgram, (Handbook on Human Nutritional Requirements-WHO Geneva 1974).
Theo Food and Nutrition Board USA, nhu cầu này là 3 microgram. (dựa vào giả
thiết cho rằng khi ăn một chế độ có 3 microgram B12, ít nhất 50% lượng này sẽ

được cơ thể sử dụng) Nhu cầu trung bình theo USRDA lại là 6 microgram và với
phụ nữ có thai và cho con bú là 8 microgram.(RDA= Recommended Dietary
Allowances là lượng trung bình cần thiết nên đưa vào cơ thể hàng ngày do
National Research Council xác định để một người Mỹ mạnh khỏe không bị các
triệu chứng gây ra do ở suy thiếu chất này ; con số của USRDA dựa theo RDA và
dùng cho việc ghi trên nhãn thực phẩm, số lượng thường cao hơn RDA. Từ 1993
RDAs được đổi thành RDIs= Reference Daily Intakes và tử 1997 danh từ chính
thức được dùng tại Hoa Kỳ là RDIs)
Một đặc điểm khác của Vitamin B12 là tùy thuộc nhóm Vitamin tan trong
nước (nhóm này thường khơng được tồn trữ trong cơ thể) nhưng gan có một hệ
thống rất hữu hiệu để trữ B12 thường với số lượng đủ dùng được đến..1000 ngày!
Do đó cho dù chúng ta ngưng hồn tồn ăn uống những thực phẩm có chứa B12,
các triệu chứng thiếu B12 chỉ bắt đầu xuất hiện ít nhất là sau đó 3 năm. Ngồi ra
cịn có một hệ thống tái hấp thu nơi ruột khiến B12, đã sử dụng, sau khi từ mật qua
đường tiêu hóa, lại được hấp thu trở lại để dùng lại.
- Nguồn cung cấp B12:
78


Đa số các sách vở dinh dưỡng đều cho rằng B12 chỉ có trong động vật và
những sản phẩm từ động vật. Cobalamin thường có trong cá và sinh vật biển như
sò, ngao, thịt bò, sữa, gan, sò clam, cá Sardine là những nguồn chứa B12 cao nhất;
phó mát, các loại chứa nhiều vi sinh vật như Camembert, Gorgonzola cũng chứa
B12 khá nhiều.

79


3.2. Sản xuất vitamin C ( acid L-ascocbic )
Đa số động vật tổng hợp được toàn bộ lượng vitamin C cần thiết cho nhu cầu

của mình và do vậy vitamin này được tìm thấy trong các mơ của chúng (chủ yếu
trong gan và thận với nồng độ 10-40 mg/100g). Tuy nhiên, người và một số động
vật có xương sống cũng như cơn trùng lại phụ thuộc hồn tồn vàọ nguồn vitamin
C từ bên ngoài, chủ yếu là rau (bắp cải, bina, cà chua, 30-150 mg/100g) và quả
(cam, chanh, 40-50mg/100g), đã cung cấp cho con người lượng vitamin C cần thiết
(45-70 mg/ngày).
Một số vi sinh vật (nấm, nấm men, tảo) sản sinh một lượng rất nhỏ acid Lascocbic cần cho các quá trình trao đổi chất của chúng. Cho đến nay chưa tìm thấy
acid ascorbic ở vi khuẩn, hình như chúng khơng cần acid này.
Ở động vật có vú (trừ nhóm linh trưởng và một số khác) acid L- ascorbic
được tổng hợp từ D-glucose trong đó C1 của glucose trở thành C6 của acid
ascorbic và ngược lại. Sự tổng hợp diễn ra từ D-glucose tới acid D-glucuronic và
sau đó thành lacton của acid L-gulonic.
Sự oxy hố sau đó của gulonolacton ở vị trí C2, được xúc tác bằng L80


gulonolacton dehydrogenase, một enzyme khơng tìm thấy ở người, theo sau là sự
enol hóa sẽ cho acid L-ascorbic. Ở thực vật, acid L- ascorbic được tạo thành từ Dglucose hay D-galactose qua một số con đường chuyển hóa.
Một trong những con đường này giữ không làm cho trật tự của chuỗi cacbon bị
thay đổi, song các sản phẩm trung gian của con đường sinh tổng hợp thì cịn chưa
biết rõ. Có thể con đường này cũng giống con đường tổng hợp ở động vật.

Hình 23.Con đường sinh tổng hợp acid L-ascocbic
Từ trên 50 năm nay, cơng nghiệp đã có thể đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng về
vitamin C của con người nhờ phương pháp bán tổng hợp từ glucose. Nhiều q trình
hố học và sinh hóa kế tiếp nhau tham gia vào quá trình này và tất cả đều qua một
sản phẩm trung gian là acid 2-keto-L-gulonic, từ đó sẽ thu được acid L-ascorbic nhờ
con đtrờng hoá học bằng cách lacton hố và đồng phân hố (hình 3.9.)

Acid-keto-Lgulonic

Methyl-2keto-Lgulonate

Acid L-ascobic

Hình 24. Các quy trình bắt dầu bằng sự khử D-glucose
81