Đề tài: Nghiên cứu phương pháp chuyển gen bằng Agrobacterium tumefaciens vào cây lily

Lơng Văn Mạnh
Lớp CNSH 02-02

Phần 1: mở đầu
1.1. Đặt vấn đề
Sản xuất và kinh doanh hoa là một ngành đem lại lợi
nhuận kinh tế rất cao. Tổng giá trị sản lợng hoa hàng năm
của thế giới ớc tính khoảng 37 tỷ đô la tập trung ở các nớc
phát triển nh Nhật Bản, Hà Lan, Mỹ, Ngành sản xuất hoa
cũng đang trở nên rất phát triển ở các nớc châu á, điển
hình là Trung Quốc, ấn Độ, Thái Lan, Malaysia, Singgapo,
Philipin ở Việt Nam sản xuất và kinh doanh hoa đang trở
thành vấn đề cần đợc quan tâm đầu t và là lĩnh vực
đầy triển vọng.
Lilium thuộc họ liliaceae, có khoảng 85 loài phân bố
chủ yếu ở các vùng ôn đới và cận nhiệt đới thuộc phía bắc
bán cầu lily là một trong các loài hoa đẹp đang rất đợc a
chuộng trên thị trờng hoa hiện nay. Với kiểu dáng đẹp sang
trọng, một số chủng loại có hơng thơm quyến rũ và độ
bền hoa rất cao (9-15 ngày), dễ thu hoạch, bảo quản, trên
thế giới lilium cùng với tulip, freesia là ba loại hoa dang thân
củ chủ yếu, quan trọng trong ngành hoa thơng mại, chiếm
24% giá trị sản phẩm hoa thơng mại (Robinson và
Pizarobady, 1993) ở Việt Nam hiện nay, hoa lily đà đợc
trồng thành công ở nhiều tỉnh ở nớc ta nh Lâm Đồng
(Sapa), Hà Nội, Mộc Châu, Thái Bình, Quảng Ninh có hiệu
quả kinh tế rất cao nhng phải nhập nội củ giống. Tuy nhiên
điều kiện khí hậu nóng ẩm, ma nhiều của nớc ta đà tạo
điều kiện rất thuận lợi cho các loài cỏ dại phát triển đây là

1

Lơng Văn Mạnh
Lớp CNSH 02-02

một trong những yếu tố hạn chế chủ yếu đến sản xuất
hoa lily. Do đó tạo giống lily kháng đợc cỏ dại và sâu bệnh
là niềm mơ ớc của cả các nhà chọn tạo giống và ngời sản
xuất hoa thơng mại.
Việc tiến hành nghiên cứu phơng pháp chuyển gen
vào cây hoa lily nhờ vi khuẩn Agrobecterium tumefaciens
để tạo ra cây lily có khả năng kháng sâu hiên đang là
mong mỏi của ngành nông nghiệp. Mặt khác, đề tài tiến
hành trên đối tợng hoa chứ không phải là một đối tợng thực
phẩm nên đợc Nhà nớc khuyến khích và cho phép.
Đến nay trên thế giới việc tạo giống cây trồng chuyển
gen ngày càng phát triển và thu đợc nhiều thành tựu. Năm
2004 diện tích cây trồng chuyển gen đạt 81 triệu ha...
Các loại cây trồng chuyển gen chủ yếu đợc chuyển nạp
đặc tính kháng thuốc trừ cỏ và kháng sâu. Các nỗ lực
chính trong nghiên cứu chuyển gen vào cây lily đà đợc
thực hiện bởi các phơng pháp chuyển gen trực tiếp nh bắn
gen (Nishihara và cộng sù, 1993; Sanford vµ céng sù, 1993;
Wilmink vµ céng sù, 1995; Tsuchiya và cộng sự, 1996), sử
dụng xung điện (Miyoshi và cộng sự, 1995). Trong một số
năm gần đây, sự thành công trong nghiên cứu chuyển gen
nhờ vi khuẩn Agrobacterium đà đợc công bố trên một số
loài thuộc họ liliace bao gåm: Asparagus officinalis (Kiasaka
vµ Kameya, 1998), Allium sativum (Kondo và cộng sự,
2000), và Muscari armeniacum (Suzuki và Nakano, 2002).

Gần đây nhất, Y. Hoshi và cộng sự đà nghiên cứu thành
công quy trình tạo cây chuyển gen cho cây Oriental
2


Lơng Văn Mạnh
Lớp CNSH 02-02

hybrid lily, lilium ev. Acapulco bằng vi khuẩn Agrobacterium
. Tuy nhiên cho đến nay việc nghiên cứu chuyển gen cho
cây lily còn hoàn toàn cha đợc đề cập ở Việt Nam.
Trong bối cảnh nêu trên chúng tôi tiến hành đề tài
Nghiên

cứu

Agrobacterium

phơng

pháp

chuyển

gen

bằng

tumefaciens vào cây lily nhằm tạo

tiền ®Ị cho viƯc t¹o gièng lily chun gen ë níc ta.
1.2. Mục đích, yêu cầu của đề tài
Mục tiêu của đề tài là xây dựng đợc những khâu cơ
bản trong hƯ thèng kü tht chun gen kh¸ng thc trõ cá
cho cây hoa lily nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
Để đạt đợc mục tiêu đề ra ở trên chúng tôi cần hoàn
thành các yêu cầu sau:
1. Xây dựng hệ thống tái sinh cho cây lily
2. Xác định đợc các thông số cần thiết trong quy trình
chuyển

gen

môi

trờng

diệt

khuẩn

(kháng

sinh

cefotaxime),môi trờng đồng nuôi cấy, môi trờng chọn lọc
PPT.
3. Bớc đầu thử nghiệm chuyển gen gus, gen bar (gen
kháng thuốc trừ cỏ PPT) và gen cryIA(c) vào cây hoa lily
thông qua vi khuẩn Agrobecterium tumefaciens.

3


Lơng Văn Mạnh
Lớp CNSH 02-02

Phần II
Tổng quan tài liệu
2.1 Giới thiƯu chung vỊ c©y hoa lily
2.1.1 Ngn gèc
C©y hoa lily có nguồn gốc từ Trung Quốc, Nhật Bản,
Nam Triều Tiên, California (Mỹ) và một số nơi khác.
2.1.2 Vị trí phân loại thực vật
Trong hệ thống phân loại thực vật cây hoa lily đợc
xếp vào nhóm cây một lá mầm (Monocotyledones), phân
lớp hành (Lilidae), bộ hành (Liliales), họ hành (liliaceae), chi
lilium (theo Dơng Đức Tiến, Võ Văn Chi, 1978).
Cây hoa lily là cây thân thảo, thân dạng hành có
vảy. Thân thờng mọc đơn có lá. Lá luôn có hình mũi mác
hay hình vạch ít khi rộng, hình tim và mọc xung quanh
thân. Hoa lỡng tính, kích thớc lớn mọc ở nách lá hay ở ngọn,
có rất nhiêu màu sắc khác nhau. Hoa có thể mọc riêng lẻ
hay thành cụm gồm nhiều hoa, bao hoa 6 mảnh dạng cánh,
nhị 6, bầu hình trụ, đầu nhụy hình đầu, chia 5 thùy. Quả
nang có 3 góc và 3 nang, quả nang có nhiều hạt.
2.1.3 Đặc tính sinh vật học hoa lily
Đặc trng hình thái.
Lily là cây thân thảo lâu năm, thân cao từ 50-200
cm. Phần dới đất là thân vẩy, màu trắng hoặc màu hồng

nhạt, phía ngoài không có màng bao bọc, nên gọi là thân
vẩy trần (không vỏ, thân vẩy là củ giống để trồng).
Bộ phận trên mặt đất là thân, lá, và hoa, quả, là
phần thơng phẩm của lily. Rễ lily có hai tầng, rễ mọc ở gốc
của thân vẩy gọi là rễ gốc, to, mềm, có ngay trên củ giống
hoặc mọc ra ngay sau khi trång. RƠ mäc ë n¬i tiÕp giáp
giữa củ và thân trên mặt đất gọi là rễ thân. Đa số giống

4


Lơng Văn Mạnh
Lớp CNSH 02-02

sản xuất những thân vẩy( củ) mọc ra từ rễ này làm thực
liệu để nhân giống.
Lá lily thờng mọc chéo nhau, hình dài, hình trứng
không có cuống hoặc cuống rất ngắn, một số ít giống ở
nách lá có mầm, có thể dùng nhân giống.
Hoa lily to mọc riêng rẽ mọc thành chùm hoặc thành
cụm trên đỉnh ngọn thân.Mỗi củ chỉ có một cành hoa,
mầm thân của lily bị rụng đi, hoặc sau khi ngắt ngọn
không thể mọc ra thân mới, cũng không thể hình thành
cành hoa khác. Nếu muốn cắt hoa thì không đợc bấm
ngọn, hoa có hình loa kèn, hình phễu, hình sao, hình cái
chén nông. Màu sắc hoa rất phong phú, đẹp có màu
trắng, màu vàng lục, màu phấn hồng, màu cam, màu đỏ,
màu tím và nhiều màu. Màu cánh thờng là đơn sắc, hoặc
có đốm màu nâu, màu tím một số ít có hơng thơm.
Cánh hoa sáu cái, hai vòng, mỗi vòng ba cái, nhị đực

sáu cái, vòi nhỏ dài, túi phấn to có màu tím,,màu vàng ở
giữa có trục hoa nhỏ đầu phình to.
2.1.4 Giá trị kinh tế và giá trị sử dụng.
Loa kèn có hoa to màu sắc phong phú, hơng thơm - là
loại hoa đợc thế giới a thích, lả loại hoa có lợng lu thông lớn
trên thị trờng thế giới, sản lợng đứng hàng thứ 4 thứ 5 của
hoa cắt.
Hoa tơi là một sản phẩm hàng hóa đặc biệt của
ngành Nông Nghiệp. Hiện nay trồng hoa đà trở thành một
ngành sản xuất phát triển khắp thế giới. Trong đó hoa loa
kèn đóng góp một phần không nhỏ. Với u thế rất phong phú
về hình dạng, màu sắc, hơng thơm. Hoa loa ken có giá trị
kinh tế cao trong sản xuất lẫn mặt tinh thần.
Bên cạnh giá trị phong phú về tinh thần thì hoa loa
kèn còn đợc sử dụng để tách chiết và tinh chế dầu thơm
phục vụ cho một số ngành công nghiệp, mỹ phẩm, bánh

5


Lơng Văn Mạnh
Lớp CNSH 02-02

kẹo. Đối với y học, loài này cũng có một giá trị nhất định.
Loài hoa bách hợp L.browni febrown có tác dụng chữa bệnh,
có thể sử dụng làm thuốc.
Với giá trị nh vậy hoa loa kèn hứa hẹn mang lại một
nguồn doanh thu lớn cho ngành sẩn xuất, kinh doanh mặt
hàng này. Hiện nay, trên thị trờng Việt Nam, các loại hoa
loa kèn đang đợc bán phổ biến từ 10.000 đến 15.000

đồng/cành (theo điều tra của thời báo kinh tế). Nh vậy
đầu t vốn vào phát triển kinh doanh mặt hàng này sẽ đem
lại cho sản xuất lợi nhuận rất cao.
2.1.5 Các loại sâu hại chủ yếu trên cây lily
- Rệp
Các loại rệp gây hải chủ yếu là rệp bông và rệp khoai
tây râu dài.
Triệu chứng: Rệp hại lá non và nụ non tạo nên đốm
màu xanh, lá cong lại biến dạng nhng vẫn xanh làm sâu nụ,
Rệp còn truyền virus
- Sâu đục rễ
Triệu chứng: Ký sinh mặt ngoài rễ, hút dịch rễ, ảnh
hởng tới sinh trởng của cây làm lá vàng, nghiêm trọng hơn
là làm cho cây chết khô, tác hại chủ yếu vào lúc cây đang
sinh trởng và thời kỳ cất trữ củ.
- Sâu hại bộ cánh vẩy
Chủ yếu là ngài đêm cánh trắng và ngài dơi(ngài
cánh dơi)

6


Lơng Văn Mạnh
Lớp CNSH 02-02

Triệu chứng: ấu trùng ngài dơi cắn phá gốc cây, có
khi đục vào thân, ngài cánh trắng chủ yếu hại lá và nụ.
2.2. CHUYểN GEN ở THùC VËT
2.2.1. Kh¸i niƯm vỊ kü tht chun gen
Kü tht chuyển gen là kỹ thuật đa một hay nhiều

gen lạ đà đợc thiết kế ở dạng ADN tái tổ hợp vào tế bào chủ
của cây trồng nói riêng và của các sinh vật nói chung (vi
sinh vật, động vật) làm cho gen lạ có thể tồn tại ở dạng
plasmid tái tổ hợp hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ. Trong
tế bào chủ, các gen này hoạt động tổng hợp nên các
protein đặc trng dẫn tới việc xuất hiện các đặc tính mới ở
cơ thể chuyển gen.
2.2.2. Các phơng pháp chuyển gen vào thực vật
Có nhiều phơng pháp chuyển gen vào thực vật nhng
có thể phân loại thành hai nhóm phơng pháp chính: phơng pháp chuyển gen gián tiếp và phơng pháp chuyển gen
trực tiếp.
2.2.2.1. Phơng pháp chuyển gen gián tiếp
a) Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium
Dựa

vào

cơ

chế

chuyển

gen

của

vi

khuẩn

A.tumefaciens, ngời ta đà dùng vi khuẩn đất để chuyển các
gen mong muốn cho mình trên cơ sở thiết kế lại hệ thống Tiplasmid của vi khuẩn sao cho vẫn đảm bảo đợc chức năng
chuyển gen nhng không mang các gen gây độc cho cây. Ngời ta đà tạo ra các dạng vectơ mới để chuyển gen là những
vectơ liên hợp và vectơ nhị thể. Các hệ thống vectơ mới đợc
tạo thành này đều đợc dựa trên cơ sở cải tiến Ti-plasmid.
Phần T-DNA của Ti-plasmid sẽ bị cắt bỏ những gen gây u và

7


Lơng Văn Mạnh
Lớp CNSH 02-02

gen tổng hợp opine, thay thế vào đấy là các gen mong muốn
kèm theo gen chỉ thị và gen khởi động.
b) Chuyển gen nhờ virus
Ngoài vi khuẩn ra ngời ta còn dùng virus làm vectơ
chuyển gen cho cây trồng do virus rất dễ thâm nhập và lây
lan trong cơ thể thực vật. Mặt khác trong cấu tạo của virus
cũng có mặt axit nucleic làm cơ sở cho việc gắn các gen cần
chuyển vào. Hiện nay có hai loại virus đợc sử dụng làm vectơ
chuyển gen vào thực vật đó là: caulimovirus và geminivirus.
Tuy nhiên, việc chuyển gen nhờ virus rất ít đợc sử dụng.
Do virus về nguyên tắc không truyền qua hạt do vậy việc
nhân giống các cây chuyển gen nhờ virus phải tiến hành
bằng phơng pháp vô tính. Điều này không phải thực hiện đợc
với tất cả các loại cây. Đây chính là một nhợc điểm lớn của phơng pháp chuyển gen nhờ virus.
2.2.2.2. Chuyển gen trực tiếp
a) Chuyển gen nhờ kỹ thuật siêu âm (Mild sonication)

Kỹ thuật siêu âm dùng để chuyển gen vào các
protoplast (tế bào trần). Sau khi tách protoplast, tạo huyền phù
protoplast với các plasmid tái tổ hợp mang gen mong muốn và
gen chọn lọc. Cắm đầu siêu âm của máy phát siêu âm ngập
trong huyền phù protoplast 3mm. Cho máy phát siêu âm với
tần số 20kHz theo từng nhịp ngắn 110 millisecond. Tổng
thời gian tác động khoảng 500 900 millisecond. Sau đó
đem protoplast nuôi trong các môi trờng thích hợp hoặc môi

8


Lơng Văn Mạnh
Lớp CNSH 02-02

trờng chọn lọc để tách các protoplast đà nhận đợc ADN. Nuôi
cấy tái sinh cây.
b) Chuyển gen nhờ kỹ thuật điện xung (electroporation).
Kỹ thuật này cũng đợc sử dụng cho việc chuyển gen vào
protoplast. ở một điện thế cao trong thời gian ngắn thì có
thể tạo nên các lỗ trên màng tế bào trần làm cho ADN bên
ngoài có thể xâm nhập vào bộ gen của tế bào. Ngời ta chuẩn
bị một huyền phù protoplast với các plasmid tái tổ hợp mang
gen mong muốn và gen chọn lọc. Dùng thiết bị điện xung tạo
điện thế cao 200-600V/cm trong khoảng thời gian là 4 5
phần nghìn giây. Kết quả sẽ làm cho màng tế bào trần xuất
hiện các lỗ thủng tạm thời giúp cho ADN ngoại lai có thể xâm
nhập. Quá trình thờng đợc thực hiện trong các cuvet chuyên
dụng hoặc là các buồng xung điện có các tấm cực bằng
kim loại đặt cách nhau khoảng 1-4mm. Sau quá trình điện

xung đem protoplast nuôi trong các môi trờng thích hợp hoặc
môi trờng chọn lọc để tách các protoplast đà nhận đợc ADN.
Nuôi cấy tái sinh cây vµ tiÕp tơc chän läc.
c) Kü tht chun gen nhê silicon carbide
Silicon carbide là những vật liệu dạng sợi có đờng
kính rất nhỏ khoảng 0,6àm và dài khoảng 10 - 80àm. Khi
lắc một hỗn hợp huyền phù tế bào đơn và plasmid tái tổ
hợp mang gen mong muốn, gen chọn lọc với silicon carbide
trên máy lắc vortex khoảng 5 giây, các tế bào sẽ bị thủng
và các ADN ngoại lai có thể xâm nhập. Nuôi cấy tế bào tái

9


Lơng Văn Mạnh
Lớp CNSH 02-02

sinh thành mô sẹo và cây, chọn lọc để tách ra những cây
đà chuyển gen.
Thờng huyền phù tế bào đơn đợc thu hoạch vào ngày
thứ 5 hoặc thứ 6 sau khi cấy truyền là giai đoạn tốt nhất
để thực hiện quy trình chuyển gen.
d) Chuyển gen bằng phơng pháp súng bắn gen
Chuyển gen bằng phơng pháp bắn gen do Sanford ở
đại học Cornell (Mỹ) đề xuất vào năm 1987. Nguyên tắc
chung của phơng pháp là sử dụng các viên đạn có kích thớc
nhỏ nhng có tỷ trọng cao để đạt đợc gia tốc cao dới tác
dụng của một lực nén chúng có thể xuyên qua các vỏ và
màng tế bào đa lớp ADN bọc ngoài vào tế bào và tiếp cận
với bộ gen của tế bào.

Tách các mô tế bào đó nuôi cấy tái sinh thành cây. Gần
đây, ngời ta đà cải tiến súng bắn gen theo hớng không sử
dụng viên đạn lớn mà dùng bộ phận nén khí mạnh tạo áp lực
đẩy vi đạn. Thờng sư dơng lng khÝ heli ¸p lùc cao (sóng
Finer do Finer đại học Ohio (Mỹ) đề xuất 1992, súng Sautter
(1991)
e) Phơng pháp trực tiếp chuyển gen thông qua ống phấn
(pollen tube)
Phơng pháp chuyển gen này còn đợc xem là phơng pháp
chuyển gen không qua nuôi cấy mô. Phơng pháp này đợc
nhóm Ray Wu đại học Cornell (Mỹ) đề xuất năm 1988 trên đối
tợng cây lúa. Đề xuất này dựa trên sự kế thừa công trình của
các tác giả Trung Quốc Duan và Chen (1985). Theo phơng pháp
này thì ADN chuyển vào có thể theo đờng ống phấn chui vào
bầu nhuỵ cái và chuyển gen ngay sau khi hạt phấn mọc qua vòi
nhụy và bắt đầu đa tinh tử vào thụ tinh. Theo tác giả thì
10


Lơng Văn Mạnh
Lớp CNSH 02-02

chuyển gen qua bao phấn tốt nhất ngay sau khi quá trình thụ
tinh sảy ra ở noÃn nhng tế bào sinh dục cái cha phân chia. Nh
vậy, sự chuyển gen chỉ xảy ra đối với một tế bào sinh sản cái
(trứng) duy nhất và khi tái sinh cây sẽ không xuất hiện thể
khảm. ở Việt Nam, phơng pháp này đang đợc Viện nghiên cứu
cây bông và ViƯn C«ng nghƯ sinh häc thư nghiƯm ë quy m« lớn
trên cây bông.
2.3. Cơ sở khoa học của phơng pháp chuyển gen vào

thực vật nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
2.3.1. Cơ sở khoa học về khả năng tái sinh ở thực vật
a, Tính toàn năng của tế bào.
Haberlandt (1902), lần đầu tiên đà quan niệm rằng
mỗi tế bào bất kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đều có
khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn
chỉnh. Theo quan niệm của sinh học hiện đại thì mỗi tế
bào riêng rẽ đà phân hoá đều mang toàn bộ lợng thông tin
di truyền cần thiết và đủ của cả cơ thể sinh vật đó. Khi
gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát
triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Đó là tính toàn năng
của tế bào. Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu
ra chính là cơ sở lý luận của phơng pháp nuôi cấy mô và
tế bào thực vật. Cho đến nay con ngời đà hoàn toàn chứng
minh đợc khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn
chỉnh từ một tế bào riêng rẽ. [O.l.Gamborg, G.C.Phillips,
1997].
b, Sự phản phân hoá và phân hoá cđa tÕ bµo

11


Lơng Văn Mạnh
Lớp CNSH 02-02

Cơ thể thực vật trởng thành là một chính thể thống
nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, đợc hình
thành từ nhiều loại tế bào khác nhau. Tuy nhiên tất cả các loại
tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên (tế bào
hợp tử). ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử liên tục phân chia

hình thành nhiều tế bào phôi sinh cha mang chức năng riêng
biệt (chuyên hóa). Sau đó từ các tế bào phôi sinh này chúng
tiếp tục đợc biến đổi thành các tế bào chuyên hóa đặc
hiệu cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau.
Sự phân hoá tế bào là sự chuyển các tế bào
phôi sinh thành các tế bào mô chuyên hoá, đảm nhận
các chức năng khác nhau. Ví dụ: Mô dậu làm nhiệm vụ
quang hợp, mô bì làm nhiệm vụ bảo vệ, nhu mô làm
nhiệm vụ dự trữ, mô dẫn làm chức năng dẫn nớc và dẫn
dinh dỡng.
Quá trình phân hoá tế bào có thể biểu thị:

Tế bào
sinh

phôi

Tế bào dÃn

Tế bào phân hoá
có chức
năng riêng biệt

Tuy nhiên, khi tế bào đà phân hoá thành các tế bào có
chức năng chuyên, chúng không hoàn toàn mất khả năng
biến đổi của mình. Trong trờng hợp cần thiết, ở điều
kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi
sinh và phân chia mạnh mẽ. Quá trình đó gọi là phản
phân hoá tế bào, ngợc lại với sự phân hoá tế bào.

12


Lơng Văn Mạnh
Lớp CNSH 02-02

Về bản chất thì sự phân hoá và phản phân hoá là
một quá trình hoạt hoá, ức chế các gen. Tại một thời điểm
nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen đợc hoạt hoá (mà vốn trớc nay bị ức chế) để cho ta tính
trạng mới, còn một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động.
Điều này xảy ra theo một chơng trình đà đợc mà hoá trong
cấu trúc của phân tử ADN của mỗi tế bào khiến quá trình
sinh trởng phát triển của cơ thể thực vật luôn đợc hài hòa.
Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ
thể thờng bị ức chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách
riêng từng tế bào hoặc giảm kích thớc của khối mô sẽ tạo
điều kiện thuận lợi cho sự hoạt hóa các gen của tế bào.
Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô, tế
bào thực vật thực chất là kết quả của quá trình phân hoá
và phản phân hoá tế bào. Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào
xét cho đến cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh
hình thái của tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong
điều kiện nhân tạo và vô trùng) một cách định hớng dựa
vào sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào trên cơ sở
tính toàn của tế bào thực vật. Để điều khiển sự phát sinh
hình thái của mô nuôi cấy, ngời ta thờng bổ sung vào môi
trờng nuôi cấy hai nhóm chất điều tiÕt sinh trëng thùc vËt
lµ auxin vµ cytokinin.
T theo mơc đích nghiên cứu đặt ra nh tạo mô sẹo,
tạo chồi phụ, tạo rễ, tạo phôi vô tính hay cho mọc chồi trực

tiếp từ mô nuôi cấy, mà môi trờng thích hợp là rất cần thiết
(Bajaj và cộng sự, 1975).
13


Lơng Văn Mạnh
Lớp CNSH 02-02

Trong kỹ thuật chuyển gen vào cơ thể thực vật, thì
nguồn vật liệu thờng đợc sử dụng để chuyển gen là: mô
lá, mô thân, mẩu callus, phôi, những tế bào tách rời
Những vật liệu này sau khi đà đợc biến nạp thành công,
các tế bào đà dung nạp những gen ngoại lai, ta phải tìm
cách làm cho những tế bào này tái sinh đợc thành một cơ
thể hoàn chỉnh bằng cách đặt nó vào một môi trờng tái
sinh thích hợp. Nếu nh, sự tái sinh thành cây hoàn chỉnh
không thành công thì tất cả những vật liệu đà đợc biến
nạp đó sẽ trở nên vô nghĩa. Chính vì vậy, sự thành công
của kỹ thuật chuyển gen phụ thuộc vào sự tái sinh của tế
bào. Do vậy, việc lựa chọn và điều chỉnh môi trờng nuôi
cấy mô và tế bào thực vật đóng vai trò hết sức quan
trọng, mang tính quyết định tới thành công hay thất bại
của thí nghiệm biến nạp, bên cạnh đó, vấn đề sử dụng mô
hay tế bào thích hợp để biến nạp cũng là mục tiêu nghiên
cứu không kém phần quan trọng (Potrykus, 1991).
James

F.

Hutchinson,

Daniel

Isenegger,

Savitri

Nadesan, Neil Smith and Peter Waterhouse, (2000) nhËn
thÊy: ®Ĩ có thể tạo đợc giống mới nhờ cải biến di truyền
một cách hiệu quả thì phải đảm bảo 04 yêu cầu sau:
Hệ thống tái sinh thích hợp để tái sinh đợc cây đÃ
chuyển gen;
Hệ thống vectơ thích hợp để có thể đa các gen lạ vào
bộ DNA;

14


Lơng Văn Mạnh
Lớp CNSH 02-02

Có các gen thích hợp đà đợc nhân dòng và đà xác định
đợc các đặc tính;
Các phơng pháp để đánh giá các cây chuyển gen trong
phòng thí nghiệm, nhà kính và đồng ruộng. (James F.
Hutchinson, Daniel Isenegger, Savitri Nadesan, Neil Smith
and Peter Waterhouse, 2000).
Srivastava, (1988) cũng đà nhận xét: môi trờng tái
sinh các mô biến nạp đóng vai trò quan trọng để nhận đợc
kết quả.

2.3.2. Khả năng chuyển nạp gen bằng vi khuẩn
Agrobacterium tumefacienns
Chuyển nạp gen thành công trên cây trồng đà đợc ghi
nhận bằng cách sử dụng vectơ Ti-plasmid, thông qua vi
khuẩn Agrobacterium tumefaciens để đa gen mong muốn
vào trong bộ gen cây trồng.
Chi Agrobacterium đợc chia làm một số loài dựa vào
triệu chứng gây bệnh và kí chủ. Một số loài thuộc chi
Agrobacterium

nh: A. radiobacter (loài này không gây

bệnh cho cây), A. tumefaciens và A. rhizogens gây bệnh
khối u (crown gall) và bệnh rễ tơ (hairy root disease), A.
rubi gây bệnh khối u trên cây mía, A. vitis gây bệnh khối
u trên cây nho và một số loài cây khác (Otten và ctv, 1984).

15


Lơng Văn Mạnh
Lớp CNSH 02-02

Hình 2.1. Một số khối u do vi khuÈn Agrobacterium
tumefaciens t¹o ra. A: mét khèi u rất lớn hình thành trên
thân cây hoa Hồng, B: một dÃy khối u nằm trên nhánh của
cây Nho
(Deacon và ctv., 2005).
Agrobacterium tumefaciens là loài vi khuẩn đợc sử dụng
phổ biến nhất trong chuyển nạp gen. Agrobacterium

tumefaciens thuộc vi khuẩn đất, gram âm, hình que, có khả
năng di động (có 5-11 lông roi), không sinh bào tử và cùng họ với
vi khuẩn cố định đạm Rhizobium (Deacon và ctv, 2005). Vi
khuẩn Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn hiếu khí, phát
triển tối u ở nhiệt độ 290C. Agrobacterium tumefaciens là tác
nhân gây bệnh cho cây do nó có khả năng chuyển T-DNA vào
tế bào cây chủ (Hansen và Chilton, 1999, Gelvin, 2000), sau
đó T-DNA này hợp nhất vào bộ gen của tế bào cây chủ dẫn
đến hình thành khối u. Khối u đợc hình thành trên rễ (phần
nằm trên mặt đất) và đỉnh của nhiều loài cây hai lá mầm,
một số loài cây ăn quả nh táo, lê, đào, nho và những cây cảnh
nh hoa hồng. Khi tế bào cây bị tổn thơng, tế bào vi khuẩn sẽ
di chuyển đến vị trí vết thơng và xâm nhập vào cây qua
vết thơng đó. Vi khuẩn độc mang một hoặc nhiều plasmid,
một trong số đó có mang gen tạo khối u và đợc biết với tên gọi
là Ti-plasmid. Ti-plasmid cũng mang các gen để xác định kí
chủ và triệu chứng khi nhiễm vào cây. Những vi khuẩn không
mang Ti-plasmid đợc xem nh là vi khuẩn không độc và không
có khả năng gây bệnh khối u cho cây. Khối u đầu tiên xuất
hiện nhỏ mầu trắng, sau lớn dần và xuất hiện các vết lốm đốm
16


Lơng Văn Mạnh
Lớp CNSH 02-02

nâu đen do các tế bào ngoại biên chết đi (hình II.1 và II.2).
Các khối u có thể mềm và xốp, có thể bị vỡ vụn khi chạm vào,
nhng cũng có thể cứng và xuất hiện các u nhỏ hoặc nhiều
mấu. Các khối u có đờng kính đến 30 cm nhng phổ biến là 510 cm. Cây bị nhiễm vi khuẩn sẽ trở nên còi cọc, lá úa vàng và

rất nhạy cảm với các điều kiện môi trờng. Khi xâm nhiễm vào
cây, một phần gen trên Ti-plasmid sẽ gắn vào nhiễm sắc thể
của cây làm cho các tế bào phát triển mạnh và sản xuất ra một
chất đặc biệt gọi là Opine. Vi khuẩn sẽ sử dụng chất này làm
nguồn cacbon cho các hoạt động biến dỡng (Zhu và ctv, 2000).

Hình 2.2. Một khối u do vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens tạo ra (nguồn
/>Bộ nhiễm sắc thể vi khn Agrobacterium tumefaciens
cã kiÕn tróc vßng, kÝch thíc 2,6 Mb. Ngoài ra vi khuẩn còn mang
plasmid lớn có kích thớc 200-800 kbp (Gelvin, 2003), phần lớn
những gen có liên quan đến sự hình thành khối u ở thực vật đều
nằm trong plasmid này nên đợc gọi là Ti-plasmid.

2.3.2.1. Ti-plasmid
Ti-plasmid là một phân tử DNA sợi đôi mạch vòng nằm tách
biệt với nhiễm sắc thể và có khả năng nhân lên một cách độc lập

17


Lơng Văn Mạnh
Lớp CNSH 02-02

trong tế bào vi khuẩn. Việc xác định Ti-plasmid nh một nguyên lý
tạo TIP (tumor inducing principle) đà đánh dấu bớc khởi động của
một

giai

đoạn

mới

trong

nghiên

cứu

về

Agrobacterium

tumefaciens. Điều này đà mở ra khả năng nghiên cứu cấu trúc và
chức năng của plasmid bằng kỹ thuật di truyền phân tử (Bùi Chí
Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2000).
Cấu trúc chung của một Ti-plasmid gồm: vùng T-DNA - trình
tự mà hoá đợc chuyển vào trong cây, vùng mang các gen vir - vùng
trực tiếp tham gia tạo T-DNA sợi đơn và chuyển T-DNA này vào tế
bào cây, vùng rep - cần cho sự tái bản của Ti-plasmid, vị trí tra và
trb - tham gia vào quá trình chuyển tiếp hợp của Ti-plasmid, các
gen cần cho việc hấp thu và chuyển hoá các opine (Zhu vµ ctv,
2000). Hai yÕu tè quan träng trong cấu trúc của Ti-plasmid cần cho
sự chuyển gen vào cây là đoạn T- DNA bao gồm cả trình tự 25 bp
ở hai bờ của đoạn T- DNA và gen vir (Gelvin, 2003).

2.3.2.2. Chức năng của T-DNA
T-DNA là một đoạn DNA cã kÝch thíc 10-30 kbp (Gelvin,
2003), cã mang c¸c gen mà hoá cho việc tổng hợp auxins,

cytokinins, opines và các gen gây khối u. Trong Ti-plasmid, vị
trí của T-DNA đợc giới hạn bởi các trình tự lập lại có chiều dài
khoảng 25 bp nằm ở 2 đầu gọi là bờ phải và bờ trái. Tuy nhiên, bờ
trái của T-DNA bị mất không ảnh hởng đến tính độc nhiều, trong
khi đó bờ phải lại cần thiết và đợc đề nghị rằng tiến trình
chuyển nạp diễn ra với bờ phải trớc rồi tiến dần về phía trái. Việc
đảo ngợc bờ phải sẽ làm yếu đi khả năng tạo khối u (Miranda và
ctv, 1992; Gelvin, 2003).
T-DNA m· hãa mét vµi protein, protein nµy biểu hiện trong tế
bào cây đợc chuyển gen sẽ làm thay đổi hình thái của cây. Theo
Binns và Costantino (1998), T-DNA mà hóa cho 13 protein và những

18


Lơng Văn Mạnh
Lớp CNSH 02-02

vùng không sao mà của các gen đợc chuyển mang nhiều đặc
điểm của các gen trong nh©n cđa thùc vËt, thÝ dơ nh kiĨu hép
TATA (TATA box) và hộp CAAT (CAAT box). Một nhóm các gen của TDNA điều khiển tổng hợp các hormon sinh trởng của cây, những
hormon này làm các tế bào tăng sinh và làm thay đổi hình dạng
bên ngoài. Sản phẩm của gen iaaM và gen iaaH điều khiển sự
chuyển hoá tryptophan thông qua indolacetamin thành indolacetic
axit (auxin). Sản phẩm của gen ipt giúp gắn kết isopentenyl
pyrophosphat với AMP (Binns và Costantino, 1998) và các enzyme
trong cây đợc cho là chuyển hoá isopentenyl-AMP thành cytokinin
zeatin bằng cách loại bỏ nhóm phosphoribosyl và loại bỏ phân tử
hydro của một nhóm methyl của isopentenyl. Hai gen trên T-DNA
khác đợc cho là có chức năng trong tạo khối u là 5 và tml (cũng còn

gọi là 6b). Sản phẩm của gen 5 điều khiển sinh tổng hợp indole-3lactate, đó là một chất đồng đẳng với auxin (Korber và ctv,
1991). Trong khi đó gen tml (cũng còn gọi là 6b) làm tăng mức độ
nhạy cảm của các tế bào cây với phytohormon bằng một cơ chế
cha đợc giải thích (Tinland và ctv, 1992). Gen tml có thể kích
thích tạo các khối u ngay cả khi vắng mặt các gen gây khối u
khác.
Một nhóm gen đợc chuyển thứ hai điều khiển sản xuất
nguồn dinh dỡng cho vi khuẩn Agrobacterium

tumefaciens phát

triển, đó là các opines. Đây là một dạng kết hợp giữa một amino
axit với một ceto (keto) axit hoặc với một đờng (Dessaux và ctv,
1998). Các tế bào chuyển gen tổng hợp và tiết ra một số lợng lớn
các opines. Các opines này hấp dẫn vi khuẩn mang kiểu gen tiêu
biểu (bên ngoài vùng T-DNA và thờng trên plasmid độc) cần cho
việc phân giải các opines đợc tổng hợp từ khối u (Ziemienowicz,
2001, trích từ Petit và Tempé, 1985). Dựa trên các kiểu opines đợc

19


Lơng Văn Mạnh
Lớp CNSH 02-02

hình thành từ các khối u mà phân chia nhóm vi khuẩn
Agrobacterium

thành các chủng nh là: octopine, nopaline,

succinamopine vµ agropine. HiƯn cã Ýt nhÊt lµ 20 loại opine khác
nhau, mỗi chủng tạo ra và phân giải một nhóm opine chuyên biệt.
Chẳng hạn nh, các Ti-plasmid kiểu octopine điều khiển tổng hợp
ít nhất 8 opine. Gen ocs mà hóa cho octopine synthase, enzym này
gắn pyruvate với arginine, lysine, histidine hoặc ornithine để tạo
ra octopine, lysopine, histopine hoặc octopinic axit và tất cả
những opine này đều đợc tìm thấy trong các khối u (Dessaux và
ctv, 1998). Sản phẩm của gen mas2 đợc cho là làm kết nối
glutamine hoặc glutamic axit với glucoz (mặc dù điều này cha đợc
chứng minh bằng thực nghiệm), trong khi đó sản phẩm của mas1
lại làm giảm bớt các dạng trung gian mannopine và mannopinic axit.
Sản phẩm của gen ags sẽ làm lacto hóa mannopine thµnh agropine.
Mannopine vµ agropine cịng cã thĨ lactate hãa thành agropinic
axit (Dessaux và ctv, 1998). Bởi vậy, các khối u đợc tạo ra bởi Tiplasmid kiểu octopine có thể tạo 4 loại octopine và 4 kiểu thuộc
nhóm mannityl opine.

2.3.2.3. Chức năng của gen Vir
Quá trình chuyển T-DNA từ vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens sang tế bào cây chủ đợc thực hiện bởi hoạt động của
các gen vir. Có ít nhất 25 gen đợc nhận biết trong 7 đơn vị phiên
mà là: virA, virB, virC, virD, virE, virG, virF vµ vïng nµy có kích thớc
khoảng 30- 40 kbp (de la Riva và ctv, 1998). Theo Stachel vµ ctv.
(1987) vïng nµy cã 20 gen nằm trên 6 operon, các gen đó là: virA,
virB, virC, virD, virE và virG. Những gen vir này có vai trò trong
việc tạo sợi đơn T-DNA trong vi khuẩn và chuyển nó vào tế bào
cây chủ rồi gắn vào nhiễm sắc thể cây chủ.

20

Lơng Văn Mạnh
Lớp CNSH 02-02

Các gen vir có vai trò trong việc nhận diện ra vết thơng của
cây thông qua tín hiệu hoá học (Acetosyringone) tiết từ vết thơng. Các tín hiệu hoá học từ vết thơng ở tế bào cây chủ tạo ra đợc nhận biết trớc tiên bởi protein virA, rồi đến protein virG để làm
kích hoạt các gen độc khác ở vùng vir, tạo ra các protein cần thiết.
Sự cảm ứng gen vir phụ thuộc vào nhiệt ®é thÊp vµ ®iỊu kiƯn pH
axit. HƯ thèng ®iỊu hoµ gen vir hoạt động thông qua hai gen
độc: virA và virG. Biểu hiện cơ bản của gen virA tổng hợp nên
protein nằm trong màng tế bào. Protein virA đáp ứng với sự trao
đổi chất của vết thơng của cây và có thể đáp ứng nhạy cảm với
sự thay đổi của môi trờng. Với một nồng độ AS thích hợp virA có
thể đợc kích thích bởi đờng, các opine khối u hoặc amino axit
(Ziemienowicz, 2001). Protein virA sẽ tự phosphoryl hoá, sự tự
phosphoryl hoá này sẽ làm protein nội bào virG đợc phosphoryl hoá
bởi aspartic axit còn lại sau khi virA tự phosphoryl hoá (Jin và ctv,
1990) và kích hoạt sao mà cho tất cả các gen vir. Các promoter của
gen vir có kích thớc khoảng 12 bp trong trình tự vir box (Winans
và ctv, 1987). Sự phosphoryl hoá làm cho protein virG gắn kết vào
vir boxes và kích hoạt sự sao m· cđa c¸c gen virBCDEFGH
(Ziemienowicz, 2001).
C¸c gen vir cã vai trò trong việc tạo sợi đơn T-DNA trong vi
khuẩn (hình II.3) và đa sợi đơn T-DNA vào trong tế bào cây. Các
protein đợc mà hoá bởi gen virD và virE thực hiện chức năng tạo ra
phức hợp T-DNA. Protein virD2 là một endonucleaz, protein này có
chức năng xúc tác cắt sợi T-DNA ở vị trí 5của bờ phải sau đó virD1
cắt rời sợi T-DNA tại vị trí đầu 3 của bờ trái tạo thành một sợi đơn.
Ngoài chức năng cắt sợi T-DNA virD2 còn có chức năng khác nh bám
dính vào đầu 5 để tránh sự tác động của enzim nucleaz và
chuyển sợi đơn T-DNA vào nhân tế bào thùc vËt v× trong virD2

21


Lơng Văn Mạnh
Lớp CNSH 02-02

còn chứa một tín hiệu gọi là tín hiệu định vị trong nhân
(nuclear locolization signal). Hai giả thuyết về chức năng của
protein VirD2 trong sự kết nạp T-DNA đà đợc đề nghị: virD2 vừa
làm nhiệm vụ cđa mét enzim integraz võa lµm nhiƯm vơ cđa mét
enzim ligaz (Ziemienowicz, 2001).
VirE2 là một protein nối kết vào sợi đơn T-DNA, nó sẽ bảo vệ
T-DNA khỏi sự phân giải của các enzim nucleaz trong tế bào cây
(Deng và ctv, 1998) gièng nh virD2, virE2 cịng cã chøa mét tÝn
hiƯu định vị trong nhân. VirB có chức năng hình thành một cái
kênh xuyên qua vách tế bào thực vật, giúp chuyển sợi đơn T-DNA
vợt xuyên qua tế bào vi khuẩn đến vách, màng tế bào thực vật và
sau đó vợt qua các lỗ nhân để vào nhân tế bào. Hai sản phẩm
của gen vir cũng đợc cho là có chức năng trong việc tạo T-DNA sợi
đơn là: virC1 và virC2. virC1 đà đợc thấy gắn kết vào vùng
overdrive, vùng này nằm gần bờ phải, và bởi vậy giúp tăng cờng
sự cắt T-DNA ở vị trí bờ vai của virD1/virD2 endonucleaz (Gelvin,
2003). Một số tác giả khác cho rằng virC1 và virC2 không cần cho
tạo T-DNA sợi đơn. Nhng khi vắng mặt hai protein này thì hiệu
quả chuyển nạp T-DNA vào cây khá thấp. Do đó đề nghị rằng
chúng có chức năng trong việc tăng cờng sản xuất sợi đơn T-DNA
(Zhu vµ ctv, 2000). Cïng víi protein virD4, mêi mét protein virB,
virE2 và virF tham gia đa T-DNA vào nhân. Hệ thống chuyển nạp
T-DNA đợc mà hóa bởi operon virB, operon này mang 11 gen. Sự

chuyển phức hợp T-DNA dựa trên chiên mao (pili) do operon virB mÃ
hoá và đột biến ở bất kì gen nào trong số 11 gen của operon này
đều làm mất khả năng tạo pili và tạo khối u (Lai và Kado, 1998).
Các protein virB điều khiển tạo chiên mao này (chiên mao này tơng tự nh chiên mao tiếp hợp) và virB2 là tiểu phần chính của
chiên mao này. Hai protein virB là virB4 và virB11 cã ho¹t tÝnh

22


Lơng Văn Mạnh
Lớp CNSH 02-02

ATPaz và đợc cho là cung cấp năng lợng cho việc xuất các tiểu
phần protein khác, cho vận chuyển T-DNA, hoặc cả hai. Hệ

thống virB đa T-DNA tới tế bào chất của tế bào cây, nơi
đây các bớc cần cho chuyển T-DNA vào nhân và kết nạp với
DNA của cây đợc thực hiện (Zhu và ctv, 2000). Cầu nối virB
có thể gắn kết với phức hợp T-DNA bëi protein virD4, protein
nµy n»m trong mµng vµ rÊt cần cho việc chuyển nạp. Hệ
thống virB/virD4 đa phức hợp T-DNA–virD2 vµ protein virE2
vµo tÕ bµo chÊt cđa tÕ bµo cây, phức hợp T-DNA cuối cùng đợc tạo ra bằng cách phủ T-DNA với protein virE2 (Ziemienowicz,
2001).
2.3.2.4. Cơ chế lây nhiễm
Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens đợc tìm thấy ở
trên và xung quanh bề mặt rễ. Nhng vi khuẩn chỉ xâm
nhiễm đợc vào cây khi cây bị tổn thơng do nhiều nguyên
nhân. Điều này có thể dễ dàng đợc chứng minh bằng các thí
nghiệm. Trong điều kiện tự nhiên, các tế bào vi khuẩn đợc
dẫn dụ đến vết thơng nhờ các tín hiệu hoá học. Tuy nhiên,

chủng vi khuẩn có mang Ti-plasmid sẽ đáp ứng mạnh hơn bởi
vì chúng nhận diện đợc các hợp chất phenolic tiết ra từ vết
thơng nh acetosyringone (AS).
Chất này có tác dụng rất mạnh dù ở nồng ®é thÊp (10 -7
M). Bëi vËy, mét trong nh÷ng chøc năng của Ti-plasmid là mÃ
hoá cho các thụ thể (receptor) nhận biết các hợp chất hoá học.
Những thụ thể này nằm trên màng tế bào vi khuẩn và có thể
giúp cho vi khuẩn nhận biết ra các vùng bị tổn thơng.
Acetosyringone đóng vai trò quan trọng trong tiến trình

23


Lơng Văn Mạnh
Lớp CNSH 02-02

xâm nhiễm. ở nồng độ cao (10-5 10-4 M) hơn nó sẽ kích
hoạt các gen vir trên Ti-plasmid (Deacon và ctv, 2005). Các
gen vir đợc kích hoạt tốt nhất ở nhiệt độ 25-27 0C. Tuy
nhiên, hầu hết các chủng Agrobacterium

hoạt động ổn

định ở nhiệt độ 18-200C (Gelvin, 2003).

Hình 2.3. Quá trình tạo phức hợp sợi đơn T-DNA
(nguồn Valentine, 2003).
Sau khi đợc kích hoạt, các gen vir sẽ điều khiển quá
trình tạo T-DNA sợi đơn trong tế bào vi khuẩn (hình II.3).
Quá trình tạo T-DNA sợi đơn đợc thực hiện trong tế bào vi

khuẩn và do các protein virD1 và virD2 thực hiện. Sau đó
protein virD2 gắn vào sợi đơn T-DNA để tạo thành phức hợp
T-DNA. Ngoài virD1, virD2 ngời ta còn cho rằng virC1 và
virC2 cũng tham gia vào quá trình tạo T-DNA sợi đơn. Phức
hợp T-DNA-virD2 cùng với protein virE2 đợc chuyển vào trong
tế bào cây thông qua hệ thống chuyển nạp đợc mà hoá bởi
các gen virB. Cùng với một số thành phần trong tế bào chất
của tế bào cây, các protein của vi khuẩn sẽ tiếp tục đa phức
hợp T-DNA vào trong nhân tế bào (Ziemienowicz, 2001).
Trong nhân tế bào cây, T-DNA đợc kết nạp vào bộ gen
của cây (hình II.4) không theo một quy luật tái tổ hợp nào
cả. Mô hình cơ sở cho sự kết nạp T-DNA vào bộ gen của cây
đà đợc đề nghị. Theo mô hình này, đầu tiên đầu 3 của TDNA nhận diện các đoạn tơng đồng với DNA của cây và
gắn vào. Cả việc tách sợi DNA của cây và overhang đầu 3
24


Lơng Văn Mạnh
Lớp CNSH 02-02

của T-DNA đều đợc enzyme nucleaz thực hiện. Cuối cùng
nucleotide gắn với virD2 tìm các đoạn vi tơng đồng
(microhomology) trên DNA của cây và gắn vào. Sự gắn kết
này mang cầu nối phosphotyrosine có ái lực ®iƯn tư cđa ®Çu
5’ ®Õn gÇn ®Çu 3’ nucleophilic cđa DNA cây mà bị tách ra.
Cuối cùng sự gắn kết trên sợi DNA của cây đợc hoàn thành
và cây chuẩn bị một cơ chế sinh tổng hợp đoạn T-DNA dẫn
đến sự kết nạp của T-DNA hoàn thành.

Hình 2.4. Quá trình kết nạp T-DNA vào bộ gen của

tế bào cây
(nguồn Valentine, 2003)
Cuối cùng, sau khi sự kết nạp hoàn thành các gen trên
T-DNA hoạt động tổng hợp nên các sản phẩm cần thiết cho
vi khuẩn (Ziemienowicz, 2001). Các opines đợc tạo ra từ các
khối u do vi khuẩn Agrobacterium nhiễm vào đợc vi khuẩn
biến dỡng nhờ vào các gen ở vùng phân giải opine trên Tiplasmid. Tùy theo kiểu opine mà đợc chuyển hóa bởi các
gen khác nhau (Ziemienowicz, 2001, trích tõ Petit vµ
TempÐ, 1985).

25