Nghiên cứu quy trình sản xuất chitosan khối lượng phân tử thấp, chitosan hòa tan trong nước và thử nghiệm ứng dụng trong bảo quản hỗn hợp caroten protein chiết rút từ phế liệu tôm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

NGUYỄN CƠNG MINH

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT
CHITOSAN KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ THẤP, CHITOSAN HOÀ
TAN TRONG NƯỚC VÀ THỬ NGHIỆM ỨNG DỤNG TRONG BẢO
QUẢN HỖN HỢP CAROTEN-PROTEIN CHIẾT RÚT TỪ PHẾ
LIỆU TƠM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ

KHÁNH HỒ - 2020


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

NGUYỄN CƠNG MINH

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT
CHITOSAN KHỐI LƢỢNG PHÂN TỬ THẤP, CHITOSAN
HOÀ TAN TRONG NƢỚC VÀ THỬ NGHIỆM ỨNG DỤNG
TRONG BẢO QUẢN HỖN HỢP CAROTEN-PROTEIN CHIẾT
RÚT TỪ PHẾ LIỆU TÔM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ

NGÀNH ĐÀO TẠO

: CÔNG NGHỆ CHẾ BIẾN THỦY SẢN

MÃ SỐ

: 9540105

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS.TS. TRANG SĨ TRUNG
TS. SIMONA SCHWARZ

KHÁNH HOÀ - 2020


Cơng trình được hồn thành tại Trường Đại học Nha Trang

Giáo viên hƣớng dẫn:
1. PGS.TS. Trang Sĩ Trung
Trường Đại Học Nha Trang
2. TS. Simona Schwarz
Viện Polymer Leibniz, Dresden, CHLB Đức

Phản biện 1: GS.TS. Nguyễn Thị Hiền
Phản biện 2: PGS.TS. Huỳnh Nguyễn Duy Bảo
Phản biện 3: PGS.TS. Nguyễn Duy Thịnh

Luận án được bảo vệ tại Hội đồng đánh giá luận án Trường Đại
học Nha Trang vào lúc 8h00, ngày 25 tháng 7 năm 2020.

Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Quốc gia

- Thư viện Trường Đại học Nha Trang


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình do tôi thực hiện. Các số liệu, kết quả trong
luận án là trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ cơng trình nào khác.
Tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm về những lời cam đoan của mình.
Tác giả luận án

Nguyễn Công Minh

i


LỜI CẢM ƠN
Để hồn thành luận án này tơi xin gửi lời tri ân đến Ban giám hiệu Trường Đại
học Nha Trang, Ban lãnh đạo Khoa Công nghệ thực phẩm, Viện CNSH&MT, Phòng
đào tạo sau đại học đã tạo điều kiện cho tơi trong q trình thực hiện luận án.
Tơi xin gửi lời cảm ơn đến Bộ KH&CN đã tài trợ kinh phí cho nghiên cứu
thơng qua đề tài Nghị định thư ―04/2014/HĐ-NĐT‖; Viện Polymer Lebniz – Dresden;
Viện Plant Biology and Biotechnology - Đại học Münster đã giúp đỡ tôi trong việc
thực hiện các phân tích cấp cao cho luận án. Tôi xin cảm ơn dự án Vlir Network đã tạo
điều kiện cho tôi tham gia các lớp tập huấn và một phần kinh phí hố chất cho việc
thực hiện thí nghiệm.
Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS.TS. Trang Sĩ Trung và TS. Simona
Schwarz đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm cho tơi
trong suốt q trình học tập và nghiên cứu
Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS. Nguyễn Văn Hịa, GS. Willem F.
Stevens đã ln tận tình giúp đỡ, hướng dẫn, động viên khích lệ và dành nhiều thời
gian trao đổi về chuyên môn với tôi trong quá trình thực hiện luận án.

Tơi xin gửi lời cảm ơn đến TS. Hoàng Ngọc Cương, ThS. Phạm Thị Đan
Phượng, ThS. Phạm Viết Nam, PGS.TS. Ngô Đăng Nghĩa, TS. Khổng Trung Thắng,
GS. Bruno Moerschbacher, TS. Jasper Wattjes, TS. Anna Niehues, các cán bộ kỹ thuật
của Trung tâm Thí nghiệm Thực hành, các em học viên cao học khóa 2015 – 2017,
2016 – 2018, các em sinh viên khóa K54, K55, K56, K57 Khoa Công nghệ thực phẩm,
Viện CNSH&MT đã đồng hành giúp đỡ, động viên, khích lệ và chia sẽ cho tơi nhiều
kinh nghiệm trong q trình học tập, nghiên cứu.
Tơi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã luôn động viên,
giúp đỡ, chia sẻ mọi khó khăn để luận án được hồn thành.
Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn!
Khánh Hoà, ngày …… tháng 8 năm 2020
Tác giả luận án

Nguyễn Công Minh
ii


MỤC LỤC
DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................ V
DANH MỤC HÌNH ...................................................................................................................VI
DANH MỤC BẢNG ..................................................................................................................IX
TẮT NHỮNG ĐĨNG GĨP MỚI CỦA LUẬN ÁN ............................................................. X
PHẦN MỞ ĐẦU ........................................................................................................................... 1
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................... 3
1.1. Chitosan khối lƣợng phân tử thấp (LMWC) ....................................................... 3
1.1.1. Khái niệm về LMWC ..................................................................................................... 3
1.1.2. Sản xuất LMWC ............................................................................................................. 3
1.1.3. Tính chất của LMWC ................................................................................................... 16
1.1.4. Ứng dụng của LMWC .................................................................................................. 22
1.2. Chitosan hòa tan trong nƣớc (WSC) .................................................................. 23

1.2.1. Khái niệm về WSC ....................................................................................................... 23
1.2.2. Sản xuất WSC ............................................................................................................... 23
1.2.3. Tính chất của chitosan hòa tan trong nước.................................................................. 27
1.2.4. Ứng dụng của chitosan hòa tan trong nước................................................................. 28
1.3. Hỗn hợp caroten-protein ..................................................................................... 29
1.3.1. Khái niệm về caroten-protein ....................................................................................... 29
1.3.2. Sản xuất caroten-protein ............................................................................................... 30
1.3.3. Ứng dụng của caroten-protein...................................................................................... 32
1.3.4. Biến đổi của caroten-protein trong quá trình bảo quản .............................................. 33
CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 38
2.1. Nguyên vật liệu nghiên cứu ................................................................................. 38
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ..................................................................................... 39
2.2.1. Phương pháp tiếp cận ................................................................................................... 39
2.2.2. Nghiên cứu sản xuất LMWC bằng phương pháp cắt mạch ở trạng thái rắn với tác
nhân H2O2 ................................................................................................................................ 40
2.2.3. Nghiên cứu quy trình sản xuất WSC ở trạng thái rắn với tác nhân khí HCl ............. 49
2.2.4. Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn, hoạt tính chống oxy hố của LMWC, WSC ... 56
2.2.5. Nghiên cứu ứng dụng LMWC, WSC trong bảo quản hỗn hợp carotene-protein..... 59
2.3. Phƣơng pháp phân tích ........................................................................................ 61
2.4. Phƣơng pháp tính tốn và xử lý số liệu .............................................................. 63
iii


CHƢƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................................... 64
3.1. Nghiên cứu sản xuất LMWC bằng phƣơng pháp cắt mạch ở trạng thái rắn
với tác nhân H2O2 ........................................................................................................ 64
3.1.1. Đánh giá tính chất của nguyên liệu chitosan ............................................................... 64
3.1.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của quá trình trương nở đến Mw chitosan sau cắt mạch bằng
H2O2 ...................................................................................................................................... 67
3.1.3. Nghiên cứu quá trình cắt mạch chitosan ở trạng thái rắn với tác nhân H2O2 .......... 77

3.1.4. Phân tích tương quan, hồi quy giữa khối lượng phân tử, độ deacetyl chitosan đầu
vào với khối lượng phân tử, độ tan của sản phẩm cắt mạch................................................. 81
3.1.5. Đề xuất quy trình thu nhận LMWC bằng phương pháp cắt mạch ở trạng thái rắn với
tác nhân H2O2 .......................................................................................................................... 85
3.1.6. Đánh giá hiệu suất và chất lượng LMWC................................................................... 87
3.2. Nghiên cứu sản xuất chitosan hòa tan trong nƣớc ở trạng thái rắn với tác
nhân khí HCl ................................................................................................................ 98
3.2.1. Thành phần hóa học của chitosan ban đầu. ................................................................. 98
3.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của chitosan và nhiệt độ phản ứng đến độ tan, Mw WSC. .. 99
3.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến độ tan, Mw WSC. ..................100
3.2.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ chitosan đến độ tan và Mw WSC.....................101
3.2.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của kích thước chitosan đến độ tan, Mw WSC. .................102
3.2.6. Đề xuất quy trình sản xuất WSC ...............................................................................104
3.2.7. Đánh giá tính chất của WSC ......................................................................................105
3.2.8. Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và chống oxy hoá của LMWC, WSC .................109
3.3. Nghiên cứu ứng dụng LMWC, WSC trong quản caroten-protein (C-P)......116
3.3.1. Thành phần hóa học của LMWC, WSC và C-P .......................................................116
3.3.2. Biến đổi hàm lượng carotenoid, protein hoà tan của C-P trong 24 tuần bảo quản
bằng LMWC và WSC...........................................................................................................120
3.3.3. Biến đổi TVB – N của C-P trong 24 tuần bảo quản với LMWC, WSC .................122
3.3.4. Biến đổi hàm lượng lipid; phospholipid; peroxide; vi sinh vật hiếu khí C-P trong 24
tuần bảo quản bằng LMWC và WSC ..................................................................................123
3.3.5. Đánh giá chất lượng của C-P trước và sau bảo quản................................................126
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................................ 131
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................................... 132

iv


DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt
AAS

Tiếng Anh

Tiếng Việt
Phổ hấp thu nguyên tử

Atomic absorption
Spectrophotometric

AOAC

Hiệp hội các nhà hoá phân tích

Association of Official
Analytical Chemists

χcr

Degree of crystallinity

Độ kết tinh

C–P

Caroten-protein

Hỗn hợp caroten-protein

CrI

Crystalline Index

Chỉ số kết tinh

DD

Degree of deacetyl

Độ deacetyl

FTIR

Fourier Transform Infrared

Quang phổ hấp thụ hồng ngoại

LMWC

Low molecular weight chitosan

Chitosan khối lượng phân tử thấp

WSC

Water soluble chitosan

Chitosan hoà tan trong nước

GlcN

D-glucosamine

D-glucosamine

GlcNAc

N-acetyl glucosamine

N-acetyl glucosamine

HMWC

High molecular weight chitosan

Chitosan khối lượng phân tử cao

MIC

Minimum Inhibitory
Concentration

Nồng độ ức chế tối thiểu

Mw

The Molecular Weight

Khối lượng phân tử trung bình

NMR

Nuclear Magnetic Resonance

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

PV

Peroxide Value

Chỉ số peroxide

SEM

Scanning Electron Microscope

Kính hiển vi điện tử quét

SEC-MALLS Size-exclusion chromatographyMulti-angle static light scattering

Sắc ký loại trừ kết hợp với phân tán
ánh sáng tĩnh đa góc

CTS/DM

Chitosan/dung mơi

TVB-N

Total Volatile Basic Nitrogen

Nitơ bazơ bay hơi

XRD

X-ray powder diffraction

Phổ nhiễu xạ tia X

Mw - Input

Khối lượng phân tử đầu vào

Mw - Output

Khối lượng phân tử đầu ra

ΔMw

Biến thiên khối lượng phân tử

ΔT

Biến thiên thời gian phản ứng
v


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cơng thức cấu tạo của (a) chitin/chitosan, (b) cellulose. ................................ 3

Hình 1.2. Các phương pháp sản xuất LMWC. ................................................................ 4
Hình 1.3. Phản ứng hình thành WSC ở dạng muối chitosan. ........................................ 24
Hình 1.4. Quy trình thu nhận caroten-protein từ phế liệu tơm. ..................................... 31
Hình 2.1. Sơ đồ phương pháp tiếp cận các vấn đề nghiên cứu của Luận án. ................ 39
Hình 2.2. Nghiên cứu cắt mạch chitosan ở trạng thái rắn với tác nhân H2O2. .............. 41
Hình 2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của dung mơi trương nở đến Mw chitosan. .............. 42
Hình 2.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NaOH trương nở đến Mw chitosan. ..... 43
Hình 2.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ trương nở đến Mw chitosan. ................ 44
Hình 2.6. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian trương nở đến Mw chitosan. ............... 45
Hình 2.7. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ H2O2 đến Mw chitosan......................... 46
Hình 2.8. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian xử lý H2O2 đến Mw chitosan. ............. 47
Hình 2.9. Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ H2O2/CTS đến Mw chitosan. ..................... 48
Hình 2.10. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu quy trình sản xuất WSC...................... 49
Hình 2.11. Mơ hình thiết bị phản ứng sản xuất WSC. .................................................. 51
Hình 2.12. Thiết bị phản ứng sản xuất WSC. ................................................................ 51
Hình 2.13. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ tan, Mw WSC. ........................ 52
Hình 2.14. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đến độ tan và Mw WSC. ................... 53
Hình 2.15. Nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ chitosan đến độ tan, Mw WSC. ........... 54
Hình 2.16. Nghiên cứu ảnh hưởng của kích thước chitosan đến độ tan, Mw WSC. ..... 55
Hình 2.17. Nghiên cứu ứng dụng LMWC, WSC trong bảo quản hỗn hợp C-P............ 60
Hình 3.1. Chitosan nguyên liệu (HMWC) dạng vảy (a) và dạng bột (b). ..................... 65
Hình 3.2. Mw và độ nhớt của chitosan cắt mạch bằng H2O2 sau khi được trương nở
trong các dung mơi khác nhau. ...................................................................................... 69
Hình 3.3. Phân bố kích thước của chitosan thu nhận trong trường hợp mẫu cắt mạch
trương nở trong NaOH 0,1% (a); NaOH 10% (b); H2O (c), NaCl 0,9% (d). ................ 70
Hình 3.4. Mw của chitosan cắt mạch bằng H2O2 sau khi trương nở trong NaOH có
nồng độ khác nhau. ........................................................................................................ 71
Hình 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ NaOH trương nở đến tỷ lệ trương nở chitosan
nguyên liệu (đường a) và Mw của sản phẩm cắt mạch (đường b). ................................ 72

vi


Hình 3.6. Chitosan ban đầu, trương nở với H2O, NaOH 0,2% (a) và chitosan chưa
trương nở (b) trương nở với NaOH 0,2% (c) quan sát dưới kính hiển vi (x40). ........... 72
Hình 3.7. Phân bố kích thước của chitosan thu nhận trong trường hợp mẫu cắt mạch
không trương nở (a); trương trong nước (b), trương trong NaOH 0,2% (c). ................ 73
Hình 3.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tỷ lệ trương nở chitosan nguyên liệu và Mw của
sản phẩm cắt mạch bằng H2O2. ..................................................................................... 75
Hình 3.9. Ảnh hưởng của thời gian trương nở đến tỷ lệ trương nở chitosan nguyên liệu
(a) và Mw của sản phẩm cắt mạch (b). ........................................................................... 76
Hình 3.10. Ảnh hưởng nồng độ H2O2 đến tốc độ phản ứng (a) và Mw, độ tan (b) của
sản phẩm cắt mạch. ........................................................................................................ 77
Hình 3.11. Ảnh hưởng của thời gian đến tốc độ phản ứng (a) và Mw (b) của sản phẩm
cắt mạch. ........................................................................................................................ 79
Hình 3.12. Ảnh hưởng của tỷ lệ H2O2/CTS đến tốc độ phản ứng (a) và Mw (b) của sản
phẩm cắt mạch. .............................................................................................................. 80
Hình 3.13. Tương quan, hồi quy giữa Mw chitosan đầu vào (Mw-Input) với khối lượng
phân tử chitossan đầu ra (Mw-Output) ........................................................................... 82
Hình 3.14. Tương quan, hồi quy giữa Mw chitosan đầu vào (Mw-Input) với số lần cắt
mạch (a) và độ phân tán Mw -Output (b). ...................................................................... 83
Hình 3.15. Tương quan, hồi quy giữa độ deacetyl với số lần cắt mạch(a) và độ tan (b)
của sản phẩm cắt mạch. ................................................................................................. 85
Hình 3.16. Quy trình sản xuất LMWC ở trạng thái rắn với tác nhân H2O2. ................. 86
Hình 3.17. Phổ XRD (a); FTIR (b) của HMWC và LMWC. ........................................ 90
Hình 3.18. Phổ 1H NMR của LMWC............................................................................ 92
Hình 3.19. Phổ 1H NMR của chitosan chuẩn theo Lavertu và cộng sự (2003) [106]. .. 93
Hình 3.20. Phân bố Mw của LMWC xác định bằng HP-GPC-RID/MALS. ................. 95
Hình 3. 21. Độ nhớt của dung dịch LMWC, HMWC khi được bảo quản ở trạng thái
rắn và trạng thái dung dịch. ........................................................................................... 97

Hình 3.22. Ảnh hưởng của chitosan và nhiệt độ phản ứng đến độ tan, Mw WSC. ....... 99
Hình 3.23. Ảnh hưởng thời gian phản ứng đến độ tan, Mw WSC. ..............................101
Hình 3.24. Ảnh hưởng của mật độ chitosan đến độ tan, Mw WSC. ............................102
Hình 3.25. Ảnh hưởng kích thước chitosan đến độ tan, Mw WSC..............................103
Hình 3.26. Sơ đồ đề xuất quy trình sản xuất WSC......................................................104
vii


Hình 3.27. Phổ FTIR (a); XRD (b) của LMWC và WSC. ..........................................106
Hình 3.28. Hình SEM của LMWC và WSC. ..............................................................107
Hình 3.29. Phổ 1H NMR của WSC. ............................................................................108
Hình 3.30. Phổ SEC-MALL của LMWC và WSC. ....................................................109
Hình 3.31. Điện thế Zeta của LMWC, WSC trong nước, acid acetic. ........................109
Hình 3.32. Mật độ vi khuẩn (a) B. cereus; (b) V. parahaemolyticus trong các mẫu bổ
sung LMWC sau 96h ni cấy. ...................................................................................110
Hình 3.33. Mật độ vi khuẩn (a) B. cereus; (b) V. parahaemolyticus trong các mẫu bổ
sung WSC sau 96h ni cấy. .......................................................................................111
Hình 3.34. Khả năng ức chế vi sinh vật của WSC đến Bacillus cereus và Vibrio
parahaemolyticus sau 72 h ni cấy. ..........................................................................111
Hình 3.35. Hoạt tính khử gốc tự do DPPH của LMWC, WSC, HMWC. ...................112
Hình 3.36. Tổng năng lực khử của LMWC, WSC, HMWC. ......................................115
Hình 3.37. Hàm lượng carotenoid của C-P khi được bổ sung LMWC (a), WSC (b)
trong 24 tuần bảo quản. ...............................................................................................120
Hình 3.38. Hàm lượng protein hồ tan của C-P khi được bổ sung LMWC (a), WSC (b)
trong 24 tuần bảo quản. ...............................................................................................121
Hình 3.39. Hàm lượng TVB-N của C-P khi được bổ sung LMWC (a), WSC (b) trong
24 tuần bảo quản. .........................................................................................................122
Hình 3.40. Biến đổi lipid, phospholipid của C-P trong 24 tuần bảo quản. .................123
Hình 3.41. Biến đổi hàm lượng peroxide của C-P trong 24 tuần bảo quản. ...............124
Hình 3.42. Biến đổi mật độ vi sinh vật hiếu khí của C-P trong 24 tuần bảo quản. .....125

viii


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Ưu, nhược điểm của các phương pháp cắt mạch chitosan .............................. 5
Bảng 1.2. Một số công bố sử dụng enzyme cắt mạch chitosan ....................................... 6
Bảng 1.3. Các dung mơi thường sử dụng để hịa tan chitosan ...................................... 17
Bảng 1.4. Một số ứng dụng của LMWC ....................................................................... 22
Bảng 1.5. Các loại chitosan tan trong nước ................................................................... 25
Bảng 1.6. Một số ứng dụng của caroten-protein ........................................................... 33
Bảng 3.1. Chất lượng chitosan sản xuất theo quy trình Trung và cộng sự (2012)................. 64
Bảng 3.2. Thành phần khống cịn lại trong các loại chitosan........................................ 65
Bảng 3.3. Thành phần acid amin của chitosan .......................................................... 66
Bảng 3.4. Hệ số trương nở của chitosan trong các dung môi........................................ 68
Bảng 3.5. Mw chitosan đầu vào (Mw-Input (MwI)), Mw chitosan đầu ra (Mw Output
(MwO)) và số lần cắt mạch chitosan (MwI/MwO) .......................................................... 81
Bảng 3.6. Độ deacetyl, Mw chitosan đầu vào (Mw-Input), Mw chitosan đầu ra (Mw
Output, số lần cắt mạch và độ tan của sản phẩm cắt mạch. .......................................... 84
Bảng 3.7. Thông số chất lượng của sản phẩm LMWC ................................................. 87
Bảng 3.8. Hiệu suất cắt mạch, hiệu suất thu hồi sản phẩm ........................................... 88
Bảng 3.9. Thành phần khoáng và kim loại nặng trong chitosan .............................. 89
Bảng 3.10. Thành phần acid amin còn lại trong HMWC và LMWC ........................... 90
Bảng 3.11: Số sóng hấp phụ cực đại của các nhóm chức chitosan [137] ................ 92
Bảng 3.12. Độ dịch chuyển hóa học của proton LMWC và chitosan ........................... 94
Bảng 3.13. Độ acetyl, độ deacetyl LMWC xác định bằng 1H NMR, FTIR và UV-Vis94
Bảng 3.14. Khối lượng phân tử (Mw), độ polymer hóa (DP), Độ đa phân tán (PDI) của
LMWC xác định bằng phổ SEC-MALLS ..................................................................... 95
Bảng 3.15. Thành phần hóa học của chitosan ............................................................... 98
Bảng 3.16. Tính chất của LMWC và WSC .................................................................105

Bảng 3.17. Độ acetyl, độ deacetyl của LMWC và WSC xác định bằng 1H NMR ......107
Bảng 3.18. Khối lượng phân tử (Mw), độ polymer hóa (DP), Độ đa phân tán (PDI) của
LMWC và WSC xác định bằng SEC-MALLS ...........................................................108
Bảng 3.19. Thành phần hóa học và tính chất của LMWC, WSC và C-P....................116
Bảng 3.20. Thành phần acid amin của C-P .................................................................118
Bảng 3.21. Thành phần acid béo của C-P ...................................................................119
Bảng 3.22. Thành phần hóa học của C-P sau 10 tuần bảo quản .................................127
Bảng 3.23. Thành phần acid amin C-P sau 10 tuần bảo quản .....................................128
Bảng 3.24. Thành phần acid béo của C-P sau 10 tuần bảo quản.................................129
ix


TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
Tên luận án: Nghiên cứu quy trình sản xuất chitosan khối lượng phân tử thấp,
chitosan hoà tan trong nước và thử nghiệm ứng dụng trong bảo quản hổn hợp carotenprotein chiết rút từ phế liệu tôm
Ngành: Công nghệ chế biến thủy sản.
Nghiên cứu sinh:

Mã số: 9540105.

Khóa: 2014 - 2018

Nguyễn Cơng Minh

Ngƣời hƣớng dẫn: 1. PGS.TS. Trang Sĩ Trung
2. TS. Simona Schwarz
Cơ sở đào tạo:

Trường Đại học Nha Trang

Những đóng góp mới của luận án:
1. Luận án đã xây dựng được quy trình cắt mạch chitosan ở trạng thái rắn sử dụng
tác nhân H2O2 với 3 bước thực hiện là (i) trương nở, (ii) cắt mạch và (iii) thu hồi
sản phẩm. Sản phẩm cắt mạch có đồng đều về khối lượng phân tử (PDI = 2,2), độ
deacetyl cao (93,5%), khối lượng phân tử thấp (137 kDa), độ tan > 98%. Bên cạnh
đó, LMWC vẫn giữ được khả năng kháng Vibrio parahaemolyticus, Bacillus
cereus, khả năng khử gốc DPPH và tổng năng lực trong điều kiện in vitro
2. Luận án đã xây dựng được quy trình sản xuất chitosan hoà tan trong nước ở trạng
thái rắn với tác nhân khí HCl từ LMWC. Sản phẩm tạo ra có độ tan đạt > 98%,
khối lượng thấp phân tử thấp (97kDa, giảm khoảng 20% so với LMWC), độ đa
phân tán của khối lượng phân tử đạt 2,1. Bên cạnh đó, WSC vẫn giữ được khả
năng kháng Vibrio parahaemolyticus, Bacillus cereus, khả năng khử gốc DPPH và
tổng năng lực trong điều kiện in vitro
3. Kết quả thử nghiệm cho thấy, hỗn hợp caroten – protein được bổ sung 100ppm
chitosan khối lượng phân tử thấp hoặc 100ppm chitosan hoà tan trong nước có thể
hạn chế được sự thất thốt các thành phần dinh dưỡng như carotenoid, protein hoà
tan, lipid, phospholipid và sự gia tăng TVB-N, peroxide, vi sinh vật hiếu khí trong
thời gian 10 tuần đầu của q trình bảo quản.
TM Giáo viên hướng dẫn

Nghiên cứu sinh

PGS.TS. Trang Sĩ Trung

Nguyễn Công Minh
x


PHẦN MỞ ĐẦU
Chitosan là polymer sinh học có nhiều ứng dụng trong nông nghiệp, thực phẩm,

mỹ phẩm, môi trường … Các tính chất ứng dụng của chitosan phụ thuộc chủ yếu vào
độ deacetyl (DD), khối lượng phân tử (Mw) và dung mơi hịa tan chitosan. Chitosan
khối lượng phân tử cao thường được ứng dụng để tạo màng, tạo sợi, chất kết tủa, tạo
bông trong xử lý môi trường. Chitosan khối lượng phân tử thấp (LMWC) có tính
kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy hoá mạnh nên được sử dụng rộng rãi trong nông
nghiệp, thực phẩm, công nghệ sinh học… [98]. Tuy nhiên, chitosan chỉ hòa tan trong
một số dung dịch acid loãng như acid acetic, acid lactic, acid hydrochloride do vậy đã
hạn chế khả năng ứng dụng khi triển khai trong thực tế. Nhằm tăng cường hoạt tính
kháng nấm, kháng khuẩn, chống oxy hố và cải thiện tính tan, các nhà khoa học đã tập
trung nghiên cứu sản xuất LMWC và chitosan hoà tan trong nước (WSC) để mở rộng
phạm vi ứng dụng của chitosan.
Caroten-protein (C – P) là sản phẩm thu nhận từ quá trình sản xuất chitin. C-P
chứa nhiều acid amin, acid béo và carotenoid (đặc biệt là astaxanthin) nên có nhiều
ứng dụng trong thức ăn thuỷ sản và thực phẩm. Tuy nhiên, C-P dễ bị hư hỏng trong
quá trình bảo quản do các tác nhân vật lý, sinh học và hố học. Do đó, trong thực tế,
người ta thường sử dụng các hoá chất bảo quản nhằm hạn chế q trình biến đổi chất
lượng C-P. Hiện nay, có nhiều nghiên cứu về ứng dụng LMWC, WSC trong bảo quản
thực phẩm giàu protein, lipid trong cá Trích [88], cá Hồi [96], cá Tuyết [155], Hàu
[38], chả cá [100], súp cá [113] … do đó việc nghiên cứu ứng dụng hai loại chitosan
trên để bảo quản hỗn hợp caroten-protein là hướng đi cần được quan tâm nghiên cứu.
Từ những lý do trên đề tài “Nghiên cứu quy trình sản xuất chitosan khối
lượng phân tử thấp, chitosan hòa tan trong nước và thử nghiệm ứng dụng trong
bảo quản hỗn hợp caroten-protein chiết rút từ phế liệu tôm” được đề xuất thực hiện.
Mục tiêu nghiên cứu:
1. Xây dựng quy trình sản xuất LMWC (Mw < 150 kDa) ở trạng thái rắn.
2. Xây dựng quy trình sản xuất WSC có độ tan đạt trên 98% ở trạng thái rắn.
3. Xác định nồng độ LMWC, WSC thích hợp để bảo quản hỗn hợp caroten-protein
chiết rút từ phế liệu tôm.

1

Nội dung nghiên cứu:
Để đạt được 3 mục tiêu nghiên cứu, luận án tập trung nghiên cứu 3 nội dung:
1. Nghiên cứu quy trình sản xuất LMWC bằng phương pháp cắt mạch ở trạng thái rắn
với tác nhân H2O2.
2. Nghiên cứu quy trình sản xuất WSC ở trạng thái rắn với tác nhân khí HCl.
3. Nghiên cứu ứng dụng LMWC, WSC để bảo quản hỗn hợp caroten-protein chiết rút
từ phế liệu tôm.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của Luận án:
1. Luận án đã xác định được điều kiện cắt mạch chitosan ở trạng thái rắn với tác
nhân H2O2 để thu nhận LMWC. Sản phẩm chitosan sau cắt mạch có khối lượng
phân tử < 150 kDa và tính ổn định cao trong quá trình bảo quản. Kết quả luận
án sẽ là cơ sở khoa học để triển khai các nghiên cứu tiếp theo nhằm đưa ra quy
trình sản xuất LMWC vào ứng dụng trong thực tế.
2. Luận án đã xây dựng được quy trình sản xuất WSC ở trạng thái rắn sử dụng tác
nhân khí HCl với độ hồ tan trong nước trên 98%. Kết quả luận án sẽ là tiền đề
cho các nghiên cứu về đa dạng hoá sản phẩm từ chitosan.
3. Luận án đã đánh giá khả năng kháng khuẩn Bacillus cereus, Vibrio
parahaemolyticus, khả năng khử gốc DPPH, tổng năng lực khử của LMWC,
WSC trong điều kiện in vitro. Kết quả luận án sẽ tạo tiền đề cho các nghiên cứu
chuyên sâu về hoạt tính kháng khuẩn, chống oxy hoá của LMWC, WSC.
4. Luận án đã bước đầu đánh giá khả năng bảo quản hỗn hợp caroten-protein của
LMWC, WSC. Kết quả luận án sẽ là cơ sở bước đầu để triển khai các nghiên
cứu chuyên sâu về ứng dụng chitosan trong bảo quản các loại thực phẩm giàu
protein, carotenoid, lipid.

2

CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Chitosan khối lƣợng phân tử thấp (LMWC)
1.1.1. Khái niệm về LMWC
LMWC là dẫn xuất của chitin thường có khối lượng phân tử thấp hơn 150 kDa
và độ nhớt biểu kiến 20 – 200 cP [117]. LMWC mang đầy đủ tính chất của chitosan và
có cấu tạo gồm nhiều đơn phân N-Acetyl-Glucosamine (GlcNAc - tiểu phần A), DGlucosamine (GlcN - tiểu phần D) liên kết với nhau bằng liên kết  - 1,4 glycoside.
Công thức cấu tạo của LMWC, chitin và cellulose tương tự nhau và chỉ khác nhau ở
nhóm chức ở vị trí cacbon thứ 2 (Hình 1.1).

Hình 1.1. Cơng thức cấu tạo của (a) chitin/chitosan, (b) cellulose.
LMWC tan tốt trong các acid loãng như acid acetic, acid propionic, acid citric,
acid lactic, acid hydrochloric tạo thành dung dịch keo tích điện dương. Khả năng tích
điện dương của LMWC có mối liên hệ đến độ deacetyl, dung mơi hịa tan và thường
thể hiện qua thơng số điện thế zeta [42]. LMWC có khả năng hút nước, khả năng hấp
phụ chất màu, kim loại, kháng khuẩn, kháng nấm và chống oxy hóa….
1.1.2. Sản xuất LMWC
Chitosan có ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như xử lý nước, nông nghiệp, nuôi
trồng thuỷ sản, sản xuất giấy, thực phẩm…[55, 146, 192] nhờ khả năng tạo màng, tạo
sợi, khả năng kháng khuẩn và chống oxy hố [192] nhưng các tính chất vật lý, hoá học
và sinh học của chitosan phụ thuộc chủ yếu vào độ deacetyl và khối lượng phân tử
trung bình của chitosan [55]. Chitosan thương mại thường có DD trong khoảng 70 –
3


90% và Mw trong khoảng 50-2000 kDa [117]. Dựa trên khối lượng phân tử trung bình
có thể chia chitosan thành 3 nhóm như sau: (i) Chitosan khối lượng phân tử cao
(HMWC) Mw > 700 kDa, độ nhớt > 800 cP; (ii) Chitosan khối lượng phân tử trung
bình (MMWC) Mw: 150-700 kDa, độ nhớt: 200-800 cP và (iii) Chitosan khối lượng
phân tử thấp (LMWC) Mw < 150 kDa, độ nhớt: 20-200 cP [117].
HMWC và MMWC có nhiều ứng dụng trong keo tụ, tạo bông, tạo màng và tạo

sợi sinh học [146]. Nhiều báo cáo khẳng định HMWC có thể được sử dụng trong việc
chế tạo cột phân tách pha [147, 153]. Tuy nhiên, độ tan kém ở pH trung tính và độ nhớt
cao của HMWC đã làm hạn chế khả năng ứng dụng của chúng. Trong khi đó, LMWC
có độ nhớt thấp thường có hoạt tính sinh học cao và được sử dụng như chất kháng
khuẩn, chống oxy hóa [49, 135, 175], kháng nấm [125]. Nguyên nhân có thể do LMWC
dễ dàng xâm nhập vào bên trong màng tế bào vi sinh vật nên làm tăng khả năng tiêu diệt
vi sinh vật [49, 111].
LMWC có khả năng hịa tan tốt hơn chitosan thương mại (có cùng độ deacetyl),
có tính kháng khuẩn, kháng nấm [102], có khả năng kích thích sinh học và chống oxy
hoá [49, 111, 125, 135, 175] nên được sử dụng rộng rãi trong thực phẩm, mỹ phẩm,
công nghệ sinh học và nơng nghiệp [98]. Vì vậy, sản xuất LMWC đã và đang được
nghiên cứu rộng rãi. LMWC có thể tạo thành từ quá trình deacetyl chitin khối lượng
phân tử thấp [19] hoặc cắt mạch từ chitosan có khối lượng phân tử cao. Thơng thường,
LMWC có thể được tạo thành từ quá trình cắt mạch HMWC với các phương pháp như
vật lý, hóa học, sinh học hoặc kết hợp các phương pháp trên [109, 187], quá trình cắt
mạch HMWC để tạo LMWC có thể được tóm tắt trong Hình 1.2.

Hình 1.2. Các phƣơng pháp sản xuất LMWC.
4


Mỗi phương pháp cắt mạch đều có các ưu và nhược điểm riêng, Bảng 1.1 mô tả
các ưu và nhược điểm của mỗi phương pháp ví dụ q trình cắt mạch bằng các tác
nhân hóa học thường được ưu tiên sử dụng trong cơng nghiệp nhưng có thể tạo ra các
vấn đề ô nhiễm cho môi trường, ngược lại quá trình cắt mạch bằng tác nhân vật lý như
tia X, tia Gamma có khả năng áp dụng ở quy mơ lớn nhưng đòi hỏi thiết bị đặc biệt.
Bảng 1.1. Ƣu, nhƣợc điểm của các phƣơng pháp cắt mạch chitosan
Phƣơng

Ƣu điểm

Tác nhân

Nhƣợc điểm

pháp
Vật lý

Tia gamma (60Co), vi

Dễ áp dụng quy Chất lượng sản phẩm

sóng, Xray, sóng siêu

mơ lớn

thấp. u cầu cao về
thiết bị và điều kiện

âm.

cắt mạch
Hóa học

Acid mạnh (HCl,

Chi phí thấp, dễ

Khó điều khiển q

HNO2, HF, H3PO4,…)

áp dụng quy mơ

trình. Chất lượng sản

hoặc tác nhân oxy hóa

lớn

phẩm khó ổn định

(H2O2, K2S2O4,…).
Sinh học

ơ nhiễm mơi trường

Enzyme (cellulase,

An tồn và dễ

Giá thành sản xuất

chitinase,

điều chỉnh trong

cao, hiệu suất cắt

chitosanase,…)

sản xuất, sản

mạch thấp do tính

phẩm có độ tinh

đặc hiệu của enzyme

sạch cao
a, Cắt mạch chitosan bằng phương pháp sinh học
Cắt mạch chitosan bằng enzyme để sản xuất LMWC có nhiều ưu điểm hơn so
với phương pháp vật lý và hóa học do khả năng giảm thiểu các biến đổi cấu trúc khơng
có lợi của sản phẩm cắt mạch. Mặt khác, sản phẩm cắt mạch có độ tinh sạch cao, an
tồn và dễ điều chỉnh trong quá trình phản ứng [169]. Vì vậy, sử dụng các enzyme có
tính đặc hiệu cao (chitinase, chitosanase) hoặc khơng có tính đặc hiệu (cellulase,
pectinase) để sản xuất LMWC đã được các nhà khoa học quan tâm từ những năm
1980. Tuy nhiên, sự khan hiếm của các enzyme và giá enzyme khá cao đã hạn chế việc
ứng dụng phương pháp này ở quy mô sản xuất lớn. Hiện nay, nhiều enzyme đã được
nghiên cứu ứng dụng để thử nghiệm cắt mạch chitosan như chitinase, chitosanase,
5


cellulase….. Tuy nhiên, chitinase và chitosanase được nghiên cứu ứng dụng phổ biến
nhất. Nguồn chitosanase được sử dụng chủ yếu được chiết xuất từ vi khuẩn [69] hoặc
vi nấm [193]. Ngồi ra các đặc tính hóa sinh của một số chitosanase từ các vi sinh vật
cũng được tóm lược bởi Somashekar và cộng sự (1996) [161]. Các enzyme có tính đặc
hiệu cao thường có giá thành cao, khơng có sẵn trên thị trường tuy nhiên quá trình cắt
mạch khi sử dụng các enzyme này cho hiệu quả cao. Ngược lại, các enzyme khơng đặc
hiệu thường có giá thành thấp, có dạng thương mại nhưng hiệu suất cắt mạch thấp

[181, 183]. Bảng 1.2 cho thấy việc sử dụng enzyme để cắt mạch chitosan đã được
nhiều nhà khoa học nghiên cứu.
Bảng 1.2. Một số công bố sử dụng enzyme cắt mạch chitosan
Nguyên
liệu

Enzyme

Nhiệt

Thời

Hiệu suất

độ (oC)

gian (h)

(%)

TLTK

Chitosan

Cellulase

50

4

83,5

[109]

Chitosan

Chitosanase

60

0,5

90

[69]

Chitosan

Cellulase

55

5,5

82,6

[183]

Chitosan

Cellulase/Pectin/Amylase 53

2

90

[184]

Chitosan

Chitinase

25

3

85,2

[109]

Chitosan

Glucoamylase

55

24

94,2

[134]

Chitinases có khả năng cắt liên kết β – 1,4 glycoside giữa các đơn phân NAcetyl-D-Glucosamin và N-Acetyl-D-Glucosamin nhưng không cắt được các liên kết
giữa các đơn phân D-Glucosamin và D-Glucosamin [109, 158] trong khi đó,
chitosanase có thể cắt được các liên kết giữa các đơn phân N-Acetyl-D-Glucosamin và
D-Glucosamin; D-Glucosamin và D-Glucosamin [158, 161] bên cạnh đó, cellulase có
thể cắt ngẫu nhiên liên kết giữa các đơn phân N-Acetyl-D-Glucosamin và N-Acetyl-DGlucosamin trong chitosan [183]. Ở cùng điều kiện thủy phân, chitinase thể hiện hoạt
tính mạnh hơn so với cellulase và lysozyme [109]. Hơn nữa, mặc dù LMWC được sản
xuất bằng các enzyme này có Mw trung bình tương tự nhưng chúng có thể có sự khác
biệt đáng kể trong phân bố trọng lượng phân tử. Ngoài ra, các thuộc tính của sản phẩm
LMWC phụ thuộc vào DD của chitosan ban đầu. Để cải thiện hiệu quả cắt mạch

6


chitosan, hỗn hợp các enzyme như chitinase, chitonase và cellulase đã được nghiên
cứu sử dụng [109, 184].
Tại Việt Nam, nghiên cứu về ứng dụng enzyme trong cắt mạch chitosan cũng đã
được nhiều nhà khoa học triển khai [9, 10, 13]. Theo Bùi Văn Hồi và cộng sự (2017),
q trình cắt mạch chitosan bằng cellulase để thu nhận chitooligosaccharide có thể bị
tác động của các yếu tố như nhiệt độ, pH, nồng độ cơ chất (chitosan), nồng độ enzyme
và thời gian phản ứng. Tuy nhiên, điều kiện thích hợp nhất để thu nhận
chitooligoasaccharide là xử lý chitosan với cellulase ở 50oC, pH 5,5 với nồng độ cơ
chất 0,8%, hoạt tính enzyme 7 UI/g trong thời gian 150 phút. Chitooligosaccharide có
khối lượng phân tử giảm khoảng 5 lần so với chitosan ban đầu [10].
Hoài và cộng sự (2017) cho rằng, điều kiện tối ưu cho quá trình cắt mạch
chitosan bằng enzyme cellulase là: nhiệt độ 49oC; pH là 5,9; nồng độ cơ chất 0,76%;
hoạt tính enzyme 8,97 UI/g; thời gian thủy phân 180 phút. COS có trọng lượng phân
tử nhỏ hơn 10 kDa chiếm hơn 90%. Kết quả nghiên cứu là tiền đề cho tạo bột
chitooligosaccharide tan trong nước với các phân đoạn khác nhau, để hướng tới tạo bột

thực phẩm chức năng chitooligosaccharide hoặc các sản phẩm thực phẩm có chứa bột
chitooligosaccharide nhằm đem lại lợi ích sức khỏe cho con người [9].
Lê Thanh Long và cộng sự (2011) đã nghiên cứu cắt mạch chitosan bằng
cellulase ở trạng thái tự do và cố định trên gel polymer tự nhiên. Khi tiến hành cố định
cellulase để thủy phân chitosan cho thấy, hoạt độ của cellulase giảm 11,3% khi
cellulase cố định trên chất mang agar và 37,9% khi cố định trên chất mang chitosan so
với cellulase tự do. Điều này cho thấy khả năng cố định cellulase trên gel agar tốt hơn
so với gel chitosan trong điều kiện nghiên cứu. Mặt khác, phương pháp cố định
cellulase cho phép tái sử dụng cellulase nhiều lần và giảm chi phí enzyme trong q
trình thủy phân chitosan để sản xuất oligochitosan [13].
b, Cắt mạch chitosan bằng phương pháp vật lý
Cắt mạch bằng phương pháp vật lý được xem là phương pháp thân thiện với
môi trường do năng lượng phá vỡ liên kết β – 1,4 glycoside trong cấu trúc chitosan
được thu nhận từ các nguồn bức xạ tia Gamma [72], tia X, tia cực tím [180], bức xạ vi
sóng [151], sóng siêu âm [51, 91, 110]. Ngồi ra, cắt mạch bằng phương pháp vật lý
cũng có thể thực hiện ở nhiệt độ và áp suất cao [33, 73]. Ngồi ra, q trình cắt mạch
7


có thể được thúc đẩy bằng cách kết hợp các tác nhân vật lý với tác nhân hóa học như
H2O2 [4, 8, 119], HCl, CH3COOH [151]. Tuy nhiên, cắt mạch bằng phương pháp vật
lý cũng có một số hạn chế khi áp dụng cho sản xuất công nghiệp, như: (i) tốc độ phản
ứng nhanh; (ii) Sản phẩm cắt mạch có phân bố rộng về Mw và (iii) phương pháp này
thường đòi hỏi thiết bị đặc biệt.
Taşkin và cộng sự (2014) [168] đã nghiên cứu ảnh hưởng của độ deacetyl đến
khả năng cắt mạch chitosan có khối lượng phân tử 330 kDa bằng bức xạ γCo60 ở trạng
thái rắn với liều bức xạ từ 5 – 35 kGy. Kết quả cho thấy chitosan có độ deacetyl càng
cao thì càng dễ bị cắt mạch bằng bức xạ. Nguyên nhân được Taşkin và cộng sự cho là
do sự thay đổi trong cấu trúc tinh thể của chitosan. Theo đó, chitosan có độ deacetyl
càng cao thì độ kết tinh càng bé do đó càng dễ bị cắt mạch. Nghiên cứu của nhóm

Taşkin đã cung cấp những thông tin khá quan trọng cho việc kiểm soát khối lượng của
chitosan bằng cắt mạch bức xạ khi biết độ deacetyl ban đầu của chitosan.
Gryczka và cộng sự (2009) [72] đã nghiên cứu cắt mạch chitosan bằng tia
gamma trong điều kiện chân khơng và điều kiện khí quyển cho thấy, với cường độ tia
gamma từ 300 kGy khối lượng phân từ chitosan giảm từ 690 kDa còn 20 kDa và đi
kèm là sự giảm về độ phân bố khối lượng phân tử. Nghiên cứu trên cũng chỉ ra rằng có
sự thay đổi một phần cấu trúc mạch vịng trong do đó cần có các khảo sát kỹ hơn để
xác định mức độ ảnh hưởng của tia bức xạ đến khả năng thay đổi cấu trúc chitosan
Theo Czechowska và cộng sự (2005) [51], hiệu suất của quá trình cắt mạch
chitosan bằng sóng siêu âm với cường độ 360 kHz đạt 76 – 82%, ngoài ra, thời gian
càng dài và năng lượng càng lớn sẽ tăng hiệu quả quá trình cắt mạch. Tuy nhiên,
nghiên cứu của Czechowska chỉ dừng lại ở mức thử nghiệm cắt mạch chitosan khi
được hoà tan ở trạng thái dung dịch do đó sản phẩm cắt mạch thu nhận ở trạng thái
dung dịch và cần có các nghiên cứu tiếp theo cho quá trình kết tủa, tinh sạch và phân
đoạn sản phẩm cắt mạch [51].
Wang và cộng sự (2005) đã sử dụng hiệu ứng đồng vận của tia tử ngoại + H2O2
để cắt mạch chitosan. Kết quả cho thấy độ nhớt nội của dung dịch chitosan 2% giảm
84,3% sau 30 phút chiếu tia UV (254 nm) + 2% H2O2; giảm 20,6% dưới tác dụng của
H2O2 2% (khơng có tia UV) và giảm 17,2% chiếu tia UV (khơng có mặt H2O2). Kết
quả trên cho thấy việc áp dụng hiệu ứng đồng vận của tử ngoại và H2O2 có hiệu quả
cao trong việc làm làm giảm độ nhớt của dung dịch chitosan [180].
8


Năm 2011, Duy và cộng sự đã kết hợp phương pháp vật lý và phương pháp hóa
học để thủy phân chitosan bằng tia gamma trong mơi trường có bổ sung H2O2 và thu
được olygochitosan có khối lượng phân tử thấp (5 – 10 kDa) [61]. Nghiên cứu trên chỉ
ra rằng, việc hồ tan chitosan trước q trình tác động của tia gamma là cần thiết tuy
nhiên nồng độ H2O2 sử dụng bổ sung trong quá trình cắt mạch là khá cao (1,5 – 5%)
do đó sản phẩm thu nhận thường bị biến màu và độ bền sản phẩm cắt mạch chưa được

tác giả đề cập đến.
Tại Việt Nam, nghiên cứu về cắt mạch chitin/chitosan bằng phương pháp vật lý
được bắt đầu từ những năm 1980 và chủ yếu được tiến hành ở Viện nghiên cứu hạt
nhân Đà Lạt trên cơ sở sử dụng lò phản ứng hạt nhân và nguồn chiếu xạ gamma 60Co
do đó đến nay đã có nhiều cơng bố về q trình cắt mạch chitin/chitosan bằng phương
pháp vật lý [3, 4, 7, 11, 15].
Theo Bùi Duy Du và cộng sự (2008), chitosan ở trạng thái dung dịch có thể
được cắt mạch bằng năng lượng phát ra từ nguồn

60

Co với liều chiếu xạ Gd = 4,69

kGy/s, mức độ suy giảm Mw phụ thuộc vào liều chiếu xạ. Bên cạnh đó, khối lượng
phân tử của chitosan cắt mạch có mức độ đồng nhất cao hơn chitosan ban đầu [3].
Theo Nguyễn Quốc Hiến và cộng sự (2016), có thể thu nhận oligochitosan (Mw
<10 kDa) bằng phương pháp chiếu xạ tia gamma 60Co hỗn hợp dung dịch chitosan 5%
và H2O2 1% trong khoảng liều xạ 10 - 20 kGy/s. Oligochitosan thu nhận được có hoạt
tính chống oxi hóa tăng theo sự giảm Mw. Tại nồng độ 0,2% (w/v) hoạt tính chống oxi
hóa xác định được là 69,9; 84,5; 89,2 và 99,3% tương ứng với Mw chitosan và
oligochitosan là 44,4; 17,4; 10,2 và 4,1 kDa. Kết quả nhận được chứng tỏ rằng
oligochitosan Mw < 10 kDa rất có tiềm năng ứng dụng làm chất chống oxi hóa do đó
oligochitosan có hoạt tính chống oxi hóa hiệu quả và an tồn [7].
Theo Đặng xuân Dự (2015), oligochitosan có thể được chế tạo bằng kết hợp
đồng vận của tia γ60Co và H2O2 5% ở liều xạ thấp dưới 20 kGy/s. Tuy nhiên, hiệu ứng
đồng vận giảm khi tăng liều xạ. Liều xạ cần để chế tạo oligochitosan từ chitosan ban
đầu có độ deacetyl là 91, 80 và 72% tương ứng là 7, 9 và 17 kGy/s. Hiệu suất cắt mạch
bức xạ được gia tăng đáng kể khi có mặt H2O2. Chitosan có DD càng cao thì hiệu suất
cắt mạch bức xạ và hằng số tốc độ cắt mạch càng cao [4].
Nghiên cứu của Vũ Thị Hoan (2018) cho thấy, có thể sản xuất chế phẩm

oligochitosan bằng cách sử dụng bức xạ gamma coban 60 để phân cắt chitosan dạng
9


với cường độ 166kGy. Oligochitosan thu được sau khi chiếu xạ có 3 phân đoạn và có
khả năng kháng 5 loại vi khuẩn: E. coli O157:H7, Salmonella typhimurium, S. aureus,
B. subtilis và Listeria monocytogenes. Các thử nghiệm độc tính của oligochitosan trên
chuột thí nghiệm cho thấy tính an tồn của oligochitosan đối với hệ tiêu hố của chuột.
Ngồi ra, việc ứng dụng chế phẩm oligochitosan với nồng độ 1% trong thời gian 1
phút để bảo quản tôm bạc nguyên liệu cho thấy có thể bảo quản 6 ngày trong điều kiện
mát mà vẫn đạt tiêu chuẩn chất lượng dùng làm nguyên liệu chế biến [11].
c, Cắt mạch chitosan bằng phương pháp hóa học
Cắt mạch chitosan bằng tác nhân hóa học đang được sử dụng chủ yếu để sản xuất
LMWC và oligochitosan ở quy mơ lớn vì chi phí sản xuất thấp và dễ thực hiện, các tác
nhân thường sử dụng như HCl [63], HNO2 [172], H3PO4 [74], H2SO4 [191], acid acetic
[151], acid ascorbic [195], acid lactic [81] hoặc H2O2 [79, 170].
Cắt mạch chitosan bằng tác nhân acid.
Các tác nhân acid thường có ưu điểm là phản ứng diễn ra nhanh và dễ triển khai
ở quy mô lớn. Tuy nhiên, tác nhân acid có thể tác động đến cấu trúc của chitosan vì
acid đậm đặc khơng chỉ thủy phân liên kết β-1,4 glycoside mà còn cắt gốc acetyl và
phản ứng liên kết tạo muối với gốc -NH2 ở một mức độ nhất định phụ thuộc vào thời
gian, nhiệt độ phản ứng và nồng độ acid sử dụng. Bên cạnh đó dưới tác động của acid
có tính oxy hố mạnh, cấu trúc vịng piranose trong cơng thức phân tử chitosan dễ bị
phá vỡ, sản phẩm tạo ra thường chứa một lượng acid dư nên cần phải qua bước tinh
sạch. Ngoài ra, việc sử dụng acid vô cơ là một trong những nguyên nhân gây ô nhiễm
môi trường. Do vậy, cắt mạch bằng tác acid học địi hỏi phải kiểm sốt tốt các yếu môi
trường như nhiệt độ, độ ẩm, thời gian, lượng acid/chitosan.
Cơ chế cắt mạch chitosan bằng tác nhân acid [63, 81, 172, 178]
Cấu trúc mạch chitosan

Phản ứng cắt mạch chitosan bằng tác nhân acid
 Phản ứng tiếp nhận H+ của nguyên từ oxy trong liên kết β-1,4 glycoside
10


 Phản ứng cắt liên kết β-1,4 glycoside khi có mặt H2O

Liên kết β-1,4 glycoside là liên kết nhị dương do đó khi tiếp xúc với H+ phân tử
oxy được nhận điện tử và tích điện dương, tiếp theo sau là phân ly tại vị trí O5 và C1
để hình thành hợp chất trung gian mang điện tích + xung quanh có 6e; H3O+ có hình
dạng nữa chiếc ghế với C2, C1, O5 và C5 cùng nằm trên một mặt phẳng. Sau đó sản
phẩm trung gian phản ứng với H2O để tạo ra đường khử, quá trình này làm đứt liên kết
β-1,4 glycoside. Trong quá trình phân cắt, bước tạo phức trung gian diễn ra tốc độ
chậm và hầu hết quá trình cắt mạch polisaccharides bằng các tác nhân acid được giải
thích trên cơ chế này.
Cắt mạch chitosan bằng tác nhân hydrogen peroxide
Ngoài các tác nhân acid, hydrogen peroxide (H2O2) là một tác nhân oxy hóa
có khả năng cắt đứt liên kết β-1,4 glycoside trong cấu trúc chitosan được sự quan
tâm đáng kể của nhiều tác giả [79, 119, 170, 171]. H2O2 dễ bị phân hủy tạo oxy và
nước nên tác nhân này không ảnh hưởng đến môi trường. H2O2 vừa có khả năng cắt
liên kết β-1,4 glycoside trong cấu trúc chitosan vừa có khả năng loại bỏ gốc amin (NH2) của chitosan [141, 170]. Quá trình cắt liên kết β-1,4 glycoside bằng H2O2 diễn ra
nhanh trong thời gian đầu và sau đó chậm dần tùy thuộc vào điều kiện phản ứng như
nồng độ H2O2 và nhiệt độ. Trong trường hợp nồng độ H2O2 và nhiệt độ cao có thể làm
thay đổi cấu trúc chitosan (tạo nhóm carboxyl, mất gốc NH2) dẫn đến giảm độ hòa tan
của chitosan [141].
Cơ chế cắt mạch chitosan của H2O2
Chitosan là polysaccharide được cấu tạo từ các đơn phân D-Glucosamine
(GlcN) và N-Acetyl-Glucosamine (GlcNAc) thông qua liên kết β -1,4 glycoside và
11

trong cấu trúc phân tử có sự hiện diện của nhóm amin ở cacbon số 2. Trong q trình
cắt mạch chitosan bằng H2O2, các phản ứng được diễn ra lần lượt như sau:
Trước hết là sự phân ly của H2O2:
H2O2 = H+ + HO2-

(1)

Ion H+ của phương trình (1) sẽ liên kết với nhóm NH2 ở cacbon số 2 của
chitosan để tạo thành NH3+:
R – NH2 + H+ = R – NH3+

(2)

Từ (1), (2) ta có phương trình tổng qt:
H2O2 + R – NH2 = R – NH3+ + HO2-

(3)

Gốc HO2- được tạo ra khá linh động, nó dễ dàng bị thủy phân tạo ra gốc tự do
HO●, O● và nhóm -OH-. Như vậy, có thể hiểu là H2O2 liên tục bị thủy phân.
HOOH2O2 + HOO-

OH- + O●

(4)

HO● + O●2- + H2O

(5)

Gốc hydroxyl (HO●), là một gốc oxy hóa rất mạnh, hiệu suất hình thành gốc tự
do (HO●) và thời gian sống của nó phụ thuộc vào mơi trường [68]. Trong môi trường
kiềm (pH: 11 - 12), khả năng phân ly và thời gian sống của HO● là cao nhất và đây
cũng là lý do để ứng dụng H2O2 cho q trình tẩy trắng cellulose trong mơi trường
kiềm [162]. Trong phản ứng với liên kết β-1,4 glycoside trong mạch chitosan, HO● lấy
một hydro nguyên tử của mạch phân tử chitosan để tạo thành gốc tự do mới, phản ứng
cắt liên kết β-1,4 glycoside được trình bày trong phương trình 6, 6’, 7, 7’.
(GlcN)m − (GlcN)n + HO●→ (GlcN●)m − (GlcN)n + H2O
(GlcN)m − (GlcNAc)n + HO●→ (GlcN●)m − (GlcNAc)n + H2O
(GlcN●)m− (GlcN)n + H2O→ (GlcN)m + (GlcN)n
(GlcN●)m− (GlcNAc)n + H2O→ (GlcN)m + (GlcNAc)n

(6)
(6’)
(7)
(7’)

Sau quá trình cắt mạch, mạch chitosan ngắn lại do các liên kết β -1,4 glycoside
bị cắt đứt [170].
Kết quả nghiên cứu của Qin và cộng sự (2002) [141] về ảnh hưởng của H2O2
đến quá trình cắt mạch chitosan trong môi trường acid cho thấy rằng, nhiệt độ thường
(< 40°C) và pH = 5,5 thuận lợi cho quá trình cắt mạch. Ở pH cao khả năng hịa tan
chitosan kém trong khi pH < 5,5 lại kìm hãm quá trình cắt mạch do q trình proton
hóa nhóm amin. Ở nhiệt độ cao (> 40°C) q trình deproton hóa của nhóm -NH3+ tăng
12