Phuong phap do quang

<span class='text_page_counter'>(1)</span>Mét sè ph¬ng ph¸p ph©n tÝch hãa sinh 1. Ph¬ng ph¸p ®o Quang (Đo màu định lợng) Đo quang là một phơng pháp phân tích định lợng dựa trên cờng độ màu của bản thân chất cần định lợng hoặc đợc tạo ra bằng các phơng pháp thích hợp 1.1. C¬ së cña ph¬ng ph¸p: §Þnh luËt Lambert-Beer 1.1.1. C¬ së: Khi chiếu một tia sáng đơn sắc có cờng độ I0 qua một dung dịch màu có chiều dày l, thì một phÇn ¸nh s¸ng bÞ ph¶n x¹ (I P), mét phÇn bÞ hÊp thô bëi dung dÞch mµu (I H), phÇn cßn l¹i lã ra ngoµi (It). ----- l----I0. IP. It IH. Hình 1: Sự phân bố của tia sáng đơn sắc khi chiếu qua một dung dịch Nh vËy: I0 = IP + IH + It (1) Trong c¸c dung dÞch mµu níc thêng gÆp trong ph©n tÝch ®o mµu th× IP rÊt nhá, cã thÓ bá qua. Do đó : I0 = IH + It (2) Từ đó, thấy rằng : - It chÝnh lµ phÇn ¸nh s¸ng kh«ng bÞ hÊp thô, ®i qua dung dÞch, ®Ëp vµo m¾t ta, g©y ra c¶m gi¸c vÒ mµu cña dung dÞch. - Vì I0 không đổi, nên khi IH càng lớn thì It càng nhỏ. IH càng lớn nếu trên đờng đi ánh sáng gặp nhiều phân tử chất màu hay là khi nồng độ chất màu càng lớn và chiều dày dung dịch cµng lín. Vµ ngîc l¹i, khi IH cµng nhá th× It cµng lín. Thiết lập mối quan hệ giữa I0 , IH , It là nội dung cơ bản của định luật hấp thụ ánh sáng của dung dÞch mµu. 1.2 Các định luật về sự hấp thụ ánh sáng 1.2.1. §Þnh luËt Lambert / Bouger Cờng đọ của một chùm tia sáng đơn sắc khi đi qua một dung dịch chất hấp thụ tỷ lệ nghÞch víi chiÒu dµy cña líp dung dÞch mµ nã ®i qua.. It = I0. 10- kl Trong đó:. I0 là cờng độ chùm sáng tới It là cờng độ chùm sáng đã truyền qua môI trờng. K lµ hÖ sè hÊp thô L ChiÒu dµy m«I trêng hÊp thô 1.2.2 §Þnh luËt Beer: Sự giảm cờng độ ánh sáng khi đi qua một dung dịch chất hấp thụ phụ thuộc vào số lợng các tiểu phần chất hấp thụ mà ánh sáng gặp phải trên đờng đị của chùm sáng, nghĩa là phụ thuộc vào nồng độ C của dung dịch chất hấp thụ:. K = aC. a là hằng số hấp thu, C là nồng độ dung dịch.

<span class='text_page_counter'>(2)</span> 1.2.3 §Þnh luËt lamber - Beer: KÕt hîp hai ph¬ng tr×nh trªn ta cã - §é truyÒn quang T :. It = I0. 10- aCl T = It / I0 = 10- aCl. - Độ hấp thu quang A ( Mật độ quang OD). A = OD = lg1/T = lg1/10- aCl = aCl Với l chiều dày cuvet đo là 1 cm, a là hằng số thì OD tỷ lệ thuận với nồng độ dung dịch. Đây là hệ quả quan trọng của định luật Lambert-Beer để hiểu phơng pháp đo màu định lợng: khi nồng độ chất màu càng lớn thì mật độ quang học đo đợc càng lớn và ngợc lại. 1.3. Các yếu tố ảnh hởng đến màu của dung dịch và làm sai lệch định luật Lambert-Beer + Phơng pháp đo màu thờng đợc tiến hành nh sau : - Cho chất thử X cần định lợng có trong dung dịch kết hợp với thuốc thử R để tạo thành phøc hîp RX cã mµu : X + R XR (kh«ng mµu) (kh«ng mµu) (cã mµu) - Đo mật độ quang học (E) của dung dịch, xác định nồng độ XR và suy ra nồng độ của X. Do mật độ quang học E chỉ tỷ lệ thuận với nồng độ XR, nên phải chuyển đợc toàn bộ X thµnh XR vµ mµu cña XR ph¶i bÒn v÷ng, kh«ng bÞ pha t¹p bëi mµu cña c¸c chÊt kh¸c. + Nh÷ng ®iÓm c¬ b¶n cÇn chó ý: - Thuèc thö R: Đối với mỗi một chất cần định lợng X, phải chọn đợc thuốc thử R thích hợp để phức hợp XR t¹o thµnh cã mµu bÒn v÷ng, Ýt ph©n ly. Trong phần lớn trờng hợp, phức hợp XR chỉ đợc tạo thành sau một khoảng thời gian (quá trình sinh màu), đạt cực đại rồi giảm dần (quá trình phai màu). Sự đo màu chỉ chính xác và nhạy nhất khi đo trong khoảng thời gian cờng độ màu đạt cực đại và ổn định nhất. Do đo, cần xác định trớc khoảng thời gian này. - Pha lo·ng dung dÞch phøc hîp mµu: Do phản ứng tạo thành và phân ly của XR là một quá trình thuận nghịch và cờng độ màu của dung dịch phụ thuộc vào tỷ số nồng độ giữa các dạng có màu và không màu, nên khi pha loãng (hay làm giàu) dung dịch sẽ làm sai lệch định luật Lambert-Beer. Vì vậy, khi cờng độ mµu cña dung dÞch vît qu¸ giíi h¹n ®o th× ph¶i pha lo·ng mÉu thö vµ lµm l¹i xÐt nghiÖm. Cã thÓ h¹n chÕ ¶nh hëng nµy b»ng c¸ch dïng chÝnh thuèc thö R khi pha lo·ng dung dÞch màu (chứ không dùng nớc cất) để hạn chế sự tăng độ phân ly của XR. - pH cña dung dÞch Sự thay đổi pH (tăng hay giảm nồng độ H +) của dung dịch làm thay đổi màu của dung dÞch. Do : . pH ảnh hởng đến sự tạo thành phức hợp XR và do đó làm thay đổi màu. VÝ dô, ë pH=1,8–2,5, ion Fe3+ kÕt hîp víi sulfosalicylat t¹o thµnh ion phøc monosulfosalicylat [Fe(Sal)]2+ có màu đỏ; còn ở pH=8-11, ion Fe3+ kết hợp với sulfosalicylat t¹o thµnh ion phøc sulfosalixylat [Fe(Sal)3]2+ cã mµu vµng. . pH ảnh hởng đến sự phân ly và phân huỷ phức hợp màu. . H+ trực tiếp tham gia vào phản ứng dẫn đến làm đổi màu của dung dịch. Ví dụ, trong ph¶n øng: 2 CrO42 - + 2 H+ CrO2 - + H2O (vµng) (da cam) hîp.. Do đó, ngời ta phải nghiên cứu trớc các dung dịch màu chuẩn để tìm ra khoảng pH thích.

<span class='text_page_counter'>(3)</span> - ¶nh hëng cña ion l¹: Ion lạ có thể có màu riêng, có thể kết hợp với R thành một phức hợp có màu làm ảnh hởng đến màu của phức hợp XR, có thể tạo với R một phức hợp không màu làm hao hụt thuốc thö R g©y gi¶m sù t¹o thµnh phøc hîp XR. §Ó lo¹i bá ¶nh hëng nµy, cã thÓ : . Dùng một lợng R vừa đủ để tạo thành phức hợp XR nếu XR bền hơn phức hợp của R víi ion l¹ hoÆc cho thõa nhiÒu R nÕu XR kÐm bÒn h¬n phøc hîp cña R víi ion l¹. . Dùng một hợp chất khác để tạo với ion lạ một phức hợp bền vững, gọi là “khóa ion lạ”. . Thªm vµo dung dÞch chuÈn mét lîng ion l¹ b»ng lîng ion l¹ cã trong dung dÞch cÇn định lợng. . Tách riêng ion lạ bằng các phơng pháp thích hợp trớc khi định lợng X. . Đo màu ở bớc sóng đặc hiệu của XR. Do tÊt c¶ nh÷ng yÕu tè trªn, nªn trong ph©n tÝch so mµu ph¶i tu©n thñ chÆt chÏ thµnh phÇn vµ liÒu lîng thuèc thö, pH cña dung dÞch, thêi gian ®o mµu, bíc sãng cña ¸nh s¸ng tíi, dung dịch đối chiếu... 1.2. M¸y ®o quang Cã nhiÒu lo¹i m¸y ®o quang: quang kÕ (Photometer), quang phæ kÕ (Spectrophotometer)... với các bớc sóng cố định (dùng kính lọc) hoặc có thể thay đổi (dùng cách tử)... Nói chung, cấu tạo của các máy đo quang đều gồm các bộ phận chính sau: - Nguồn sáng: dùng đèn thờng, đèn thuỷ ngân, đèn halogen, đèn cực tím - Bộ phận tạo ánh sáng đơn sắc: kính lọc hoặc cách tử - Cóng đo (cuvette): có chiều dày (l) không đổi (0,5 cm, 1 cm); bằng thạch anh, thuỷ tinh, nhùa. -Tế bào quang điện: để biến đổi quang (ánh sáng ló) thành dòng điện. - Bộ phận khuếch đại. - Bé phËn ®o vµ hiÖn kÕt qu¶: thang ®o hoÆc mµn h×nh hiÖn sè. Sơ đồ cấu tạo đơn giản của các máy đo quang nh sau:. 1 2 Nguån s¸ng KÝnh läc (§Ìn) hoÆc c¸ch tö. 3 4 Cãng ®o. 5 TÕ bµo quang ®iÖn. 6 Khuếch đại. HiÖn kÕt qu¶. Hình 2: Sơ đồ cấu tạo đơn giản của máy đo quang Ngoµi c¸c bé phËn chÝnh trªn, c¸c m¸y cßn cã thÓ cã thªm c¸c phÇn kh¸c nh c¸c bé phËn ®iÒu chØnh, c¸c bé phËn g¸ l¾p thªm... 1.3. C¸c ph¬ng ph¸p §o mµu. 1.3.1. §o mµu b»ng m¾t : Dùng khi không có máy đo quang hoặc khi chỉ cần đánh giá tơng đối . 1.3.1.1. Ph¬ng ph¸p dïng thang mÉu ( hoÆc gam mµu) - Điều chế một dãy ống dung dịch chuẩn (ống chuẩn) có nồng độ tăng dần đã biết (C S) đựng trong các ống nghiệm đồng chất..

<span class='text_page_counter'>(4)</span> - Điều chế một ống dung dịch thử (ống thử) có nồng độ cha biết (CT) theo các điều kiện giống hệt nh khi điều chế các dung dịch chuẩn và đựng trong ống nghiệm đồng chất với các èng nghiÖm cña dung dÞch chuÈn. - So màu của ống thử với các ống chuẩn để tìm ống chuẩn có cờng độ màu bằng cờng độ mµu cña èng thö. Nồng độ của ống chuẩn chính là nồng độ của ống thử . Tuỳ theo từng dung dịch mà ngời ta có các cách quan sát cờng độ màu khác nhau. 1.3.2. So mµu b»ng m¸y 1.3.2.1. Ph¬ng ph¸p so s¸nh (hay ph¬ng ph¸p dïng èng chuÈn ) - Điều chế song song một dung dịch chuẩn chứa chất cần xác định có nồng độ đã biết (C S) và một dung dịch thử chứa chất cần xác định có nồng độ cha biết (CT) theo cùng một qui trình. - Đo mật độ quang học (E) của ống chuẩn và ống thử trong cùng điều kiện (máy, bớc sóng, cóng ...), đợc ES và ET tơng ứng. - TÝnh kÕt qu¶ theo c«ng thøc:. CT =. ET ES. x CS. 1.3.2.2. Phơng pháp biểu đồ mẫu : - Điều chế một dãy dung dịch chuẩn chứa chất cần định lợng có nồng độ đã biết (CS) tăng dần . - Đo mật độ quang học (E) của từng ống, đợc các ES tơng ứng . - Biểu diễn sự phụ thuộc của ES theo CS trên trục toạ độ, đợc một đờng thẳng ES ET CT. CS. Hình 3: Phơng pháp xác định nồng độ một dung dịch bằng biểu đồ mẫu - Điều chế một ống thử chứa chất cần định lợng có nồng độ cha biết CT theo cùng một qui trình nh đối với ống chuẩn. - Đo mật độ quang học của dung dịch thử, đợc ET . - Từ đồ thị tính đợc nồng độ CT Chó ý : . ET ph¶i n»m trong kho¶ng cña c¸c ES . Biểu đồ mẫu phải dựng hàng ngày . 1.3.2.3. Ph¬ng ph¸p hÖ sè - Điều chế một dãy ống chuẩn có nồng độ CS đã biết và tăng dần. - Đo mật độ quang của các ống chuẩn đợc các ES tơng ứng. - TÝnh hÖ sè a (hoÆc F) theo c«ng thøc å CS F= å ES - Điều chế một ống thử có nồng độ cha biết (CT). - Đo mật độ quang của ống thử, đợc ET. - Tính nồng độ ống thử (CT) theo công thức: CT = F. ET Chó thÝch : Trong dung dịch màu có các hợp chất khác (có trong thuốc thử để tạo hợp chất màu) khi đo màu cũng cho một mật độ quang học nhất định. Vì vậy, khi định lợng bằng đo màu, ngời ta.

<span class='text_page_counter'>(5)</span> thờng đối chiếu ống thử và ống chuẩn với một ống trắng để loại trừ ảnh hởng này, khi đó E đo đợc là do chất màu cần định lợng gây ra. 1.4 Các phơng pháp đo trên máy bán tự động 1.4.1 Ph¬ng ph¸p ®o ®iÓm cuèi 1.4.2 Ph¬ng ph¸p ®o hai ®iÓm 1.4.3 Phơng pháp đo động học C¸c lo¹i èng tr¾ng : Cã 3 lo¹i : Tr¾ng thuèc thö, Tr¾ng bÖnh phÈm, Tr¾ng níc cÊt ho¹c kh«ng khÝ.

<span class='text_page_counter'>(6)</span>