Phương pháp khối phổ

2/13/12
1
KHỐI PHỔ
MASS SPECTROMETRY
KHÁI NIỆM
Thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định MW
của các hợp chất bằng việc phân tách các ion
phân tử theo tỷ số giữa khối lượng và điện tích
(m/z) của chúng. Từ đó có thể cho thông tin về
cấu trúc phân tử
Độ chính xác 99.99% (hợp chất sinh học)
VAI TRÒ
Xác định chính xác MW
-  Kiểm tra độ tinh sạch của mẫu, xác định những
biến đổi sau dịch mã, số lượng cầu nối S-S
Kiểm soát phản ứng
-  Phản ứng enzyme, phản ứng thủy phân protein
Giải trình tự amino acid, oligonucleotide
…
ỨNG DỤNG
CNSH: phân tích protein, peptide, oligonucleotide
Y dược: nghiên cứu thuốc: dược tính, cơ chế;
Môi trường: chất lượng nước, an toàn thực phẩm
…
2/13/12
2
NGUYÊN TẮC
Các phân tử đã được ion hóa sẽ phân mảnh thành
các mảnh có cấu trúc khác nhau có thể tách bằng
tỷ số giữa khối lượng (m) và điện tích (z) của
chúng trên cơ sở từ trường và điện trường

CẤU TẠO KHỐI PHỔ
Nguồn ion hóa ! Thiết bị phân tích ! Detector
(ionisaton source) (analyser)
Nguồn ion hóa
Một số kỹ thuật ion hóa thông dụng:
•  Ion hóa trên cơ sở va đập điện tử (EI)
•  Ion hóa hóa học (CI)
•  Bắn phá ion/nguyên tử nhanh (FAB)
•  Ion hóa theo cơ chế giải hấp sử dụng nguồn
laser với sự trợ giúp nền (MALDI)
•  Ion hóa phun điện tích (ESI)
ION HÓA TRÊN CƠ SỞ VA ĐẬP ĐIỆN
TỬ (Electron Impact – EI)
M + e
-
! M
+
+ 2 e
–
- Tạo e: sợi dây nhiệt
gia tăng bằng 1 trường
điện từ (70V)
- 

Các e (70 eV) chuyển
1 phần năng lượng
động học của chúng
cho M ! ion hóa (tách
e từ M)

TÁCH e TỪ PHÂN TỬ
TRUNG HÒA
2/13/12
3
Quá trình phân mảnh:
M
+
-> ion phân tử + các mảnh ion + các mảnh
không tích điện


Ưu nhược điểm của EI
ƯU ĐIỂM NHƯỢC ĐIỂM
- Độ nhạy cỡ pico mol
- Các dữ liệu phổ đã có
sẵn (> 100.000 hợp
chất)
- Thông tin về cấu trúc
nhận được từ kiểu phân
mảnh
-  Khoảng khối lượng
phân tích hạn chế (<
400 Da)
-  Chỉ áp dụng với mẫu
bay hơi
-  Phân mảnh quá
nhiều, không quan sát
được ion phân tử
Ion hóa hóa học
(Chemical Ionization)

•  Sử dụng chùm electron làm nguồn ion hóa
•  Nguyên tắc: tương tác ion – phân tử giữa các
ion khí và phân tử mẫu trung hòa ở áp suất
cao
•  Chùm e ion hóa các phân tử khí (ít ion hóa
mẫu)
•  Tương tác ion - phân tử ! ion hóa mẫu
•  Ion phân tử được tạo thành bền, ít phân
mảnh

Cơ chế
CH4 + e- ! [CH4]+ + 2e-
[CH4]+ + CH4 ! [CH5]+ + [CH3]+
[CH3]+ + CH4 ! [C2H5]+ + H2
…
[CH5]+ và [C2H5]+ đóng vai trò như các acid
và cho phân tử mẫu proton
[CH5]+ + M ! [MH]+ + CH4
[C2H5]+ + M ! [MH]+ + C2H4



2/13/12
4
Một số tác nhân khí thường được sử dụng:
Metan, propan, isobutan, H
2
, NH
3
, He,…

Bắn phá ion/nguyên tử nhanh
(Fast Atom/Ion Bombardment – FAB)
Mẫu được bắn phá bằng 1 nguồn năng lượng
cao (chùm nguyên tử Xenon, ion Cs+, nền tẩm
Glyceryl-NH4+)
Dung môi: không bay hơi, hòa tan được mẫu
(rượu m-nitrobenzyl, glyceryl)
Mẫu tích điện bằng cách phản
ứng với các phân tử và ion khác
Ưu điểm Nhược điểm
Khối lượng phân tích
~7KDa
Phân tích nhanh
Tạo ion phân tử ít phân
mảnh

Chỉ nhạy với các phân tử
có MW lớn
Pico mol – nanomol
Thông tin về cấu trúc thu
được rất hạn chế
Mẫu phải tan trong dung
môi
Không hiệu quả với chất
không phân cực, không
tích điện
2/13/12
5
Ion hóa theo cơ chế giải hấp sử dụng
nguồn laser với sự trợ giúp nền

(Matrix-asisted Laser Desorption/
Ionization MS – MALDI/MS)
Phân tích các hợp chất có MW lớn, không bay
hơi (protein, peptide, glycoprotein,…)
Ion hóa và chuyển mẫu từ pha mẫu lỏng vào
pha khí
•  FAB: nguyên tử/chùm ion, nền mẫu: dung môi
lỏng
•  MALDI: nguồn laser, nền mẫu: chất rắn
Chiếu chùm laser vào mẫu đã được trộn hay hòa tan
chất nền
Vai trò chất nền: hấp thụ năng lượng laser và tạo ra
sản phẩm dễ bay hơi
Phân tử không tích điện phản ứng với nền hoặc các
phân tử khác ! hợp phần tích điện
Nền mẫu: gắn kết với các phân tử mẫu cần
quan tâm được tẩm trên 1 đế làm bằng vật liệu
rắn không bay hơi
Nhờ sự chiếu xạ, nền mẫu được bay hơi và kéo
theo sự bay hơi của các phân tử mẫu kèm theo
nền
Nền hấp thụ phần lớn năng lượng để bảo vệ
mẫu không bị phá hủy bởi laser
Ưu điểm Nhược điểm
MW ~300KDa
Femtomol – picomol
Ít hoặc không phân mảnh
Phân tích mẫu phức tạp
…
Độ phân giải thấp

Nền mẫu gây khó khăn khi
phân tích các hợp chất có
MW < 1KDa

2/13/12
6
Ion hóa phun điện tử
(Electrospray Ionization – ESI)
Tạo các phân tử ion hóa pha khí từ các dd lỏng
Dung dịch mẫu được phun trong vùng có
trường điện từ mạnh được duy trì ở 4000V
Phân tích các phân tử phân cực
Ion hóa phun điện tử
(Electrospray Ionization – ESI)
Tạo ra dòng phun mịn của các giọt nhỏ tích
điện cao dưới 1 trường điện từ
Các giọt nhỏ trước khi đi vào thiết bị phân tích
sẽ được kết hợp với dòng khí khô hoặc nhiệt
để làm bay hơi dung môi
Cơ chế ion hóa
Loại bỏ electron
Proton hóa
Cation hóa
Đề proton hóa
Chuyển các phân tử tích điện vào pha khí
Bắt giữ electron
Loại bỏ electron
Phân tích các hợp chất có MW thấp không
phân cực
EI, FAB, MALDI

2/13/12
7
Proton hóa
Thêm 1 proton vào phân tử
FAB, ESI, MALDI
Cation hóa
Thêm 1 ion tích điện dương (cation) vào 1 phân
tử trung hòa để tạo 1 phức tích điện
Hiệu quả với các phân tử không bền khi proton
hóa
ESI, MALDI, FAB
Đề proton hóa
Loại bỏ 1 proton
FAB, MALDI, ESI
Chuyển phân tử tích điện vào pha khí
Chuyển các phân tử tích điện trong dung dịch
vào pha khí
FAB, MALDI, ESI
2/13/12
8
Bắt giữ electron
Hấp thụ hoặc bắt giữ electron để tạo phân tử
tích điện âm
Sử dụng cho các phân tử có ái lực e cao
(halogen)
EI, FAB, MALDI
Thiết bị phân tích khối lượng
•  Thiết bị phân tích tứ cực (quadrupole)
•  Bẫy ion tứ cực (quadrupole ion traps)
•  Thiết bị phân tích khối lượng sử dụng từ

trường (magnetic sector)
•  Phân tích thời gian bay (time-of-flight - TOF)
•  Thiết bị phân tích thời gian bay phản xạ
electron (time-of-flight reflectron)
•  Cộng hưởng gia tốc ion chuyển hóa Fourier
(Fourier transform-ion cyclotron resonance –
FT-ICR)
phân tách các ion trên cơ sở tỷ số m/z.

Thiết bị phân tích khối lượng
•  Thiết bị phân tích tứ cực (quadrupole)
Các ion chuyển động trong trường điện từ sẽ dao
động phụ thuộc vào tỷ số giữa m/z và trường RF
phân tách các ion trên cơ sở tỷ số m/z.

2/13/12
9
Thiết bị phân tích khối lượng
•  Bẫy ion tứ cực (quadrupole ion traps)
phân tách các ion trên cơ sở tỷ số m/z.

Thiết bị phân tích khối lượng
•  Thiết bị phân tích khối lượng sử dụng từ
trường (magnetic sector)

phân tách các ion trên cơ sở tỷ số m/z.

Thiết bị phân tích khối lượng
•  Phân tích thời gian bay (time-of-flight – TOF)

phân tách các ion trên cơ sở tỷ số m/z.

Thiết bị phân
tích khối lượng
•  Thiết bị phân
tích thời gian
bay phản xạ
electron (time-
of-flight
reflectron)
phân tách các ion
trên cơ sở tỷ số
m/z.

2/13/12
10
Thiết bị phân tích khối lượng
•  Cộng hưởng gia tốc ion chuyển hóa Fourier
(Fourier transform-ion cyclotron resonance –
FT-ICR)
phân tách các ion trên cơ sở tỷ số m/z.

DETECTOR
Kiểm soát và khuếch đại tín hiệu dòng ion
Chuyển tín hiệu đến hệ thống dữ liệu
Các detector hay sử dụng
•  Cốc Faraday
•  Thiết bị nhân electron
•  Dinôt chuyển hóa nhân quang (thiết bị đếm tín
hiệu hay detector Daly)

•  Detector dinôt năng lượng cao (high energy
dynode detector: HED)
•  Detector chuỗi