Sản xuất butanol và ethanol từ nguyên liệu lignocellulosic: tiền xử lý sinh khối và chuyển đổi sinh học

Học viên: Huỳnh Thị Trúc Quân – CH2020
Địa chỉ liên lạc: 0855351231 –
Môn: Sinh khối
BÁO CÁO TỔNG HỢP
Sản xuất butanol và ethanol từ nguyên liệu lignocellulosic: tiền xử lý sinh khối và chuyển
đổi sinh học
1.

Nội dung nghiên cứu

Nghiên cứu quá trình sản xuất sinh học của ethanol và butanol từ gỗ (gỗ thông) và nguyên
liệu thức ăn là lignocellulosic từ thân thảo (cỏ timothy, rơm lúa mì).
Đánh giá quá trình xử lý sơ bộ bằng axit sulfuric lỗng sau đó là q trình thủy phân bằng
enzym của các gốc lignocellulosic này đã được phát triển để tạo ra sản lượng đường cao
hơn. Đánh giá các sản phẩm thủy phân sinh khối với các thành phần xenlulo và
hemicellulosic được lên men để sản xuất etanol và butanol.
2.

Phương pháp nghiên cứu

2.1.

Sinh khối lignocellulosic

Mẫu sinh khối gồm: gỗ thông, PW (Pinus bankiana), cỏ timothy, TG (Phleum pratense),
rơm, WS (Triticum aestivum). Các mẫu sinh khối được làm khơ và nghiền thành bột.
2.2.

Phân tích thành phần

Phân tích thành phần (cellulose-hemicellulose-lignin) của các mẫu nguyên liệu được thực

hiện bằng phương pháp NREL hai bước. (1) sử dụng nước, etanol và hexan để chiết xuất
các vật liệu vô cơ và đường phi cấu trúc từ các mẫu như diệp lục, sáp, sterol và lipid. (2)
sinh khối được làm khô và thủy phân bằng H2SO4 72% ở 30°C trong 1 giờ, H2SO4 4% ở
121°C trong 1 giờ. Các loại đường thủy phân (như arabinose, cellobiose, glucose và xylose)
được định lượng thông qua máy HPLC Agilent 1100 Series có các chỉ số khúc xạ. Phân tích
được thực hiện bằng cách sử dụng cột loại trừ ion Aminex HPX 87H. Pha động sử dụng là 5
mmol/L H2SO4 với tốc độ dòng chảy là 0,6 mL/phút và nhiệt độ cột là 55°C.
2.3.

Thủy phân bằng axit và enzyme

Tiền xử lý bằng axit lỗng: 10g sinh khối (khơ) trộn với 100 mL H2SO4 0–2,5% v/v thành
nước cất trong bình nón 250 mL. Tỷ lệ 1:10 w/v sinh khối/nước. Các bình được chắn bông


và đậy bằng lá nhôm trước khi hấp tiệt trùng ở 121°C trong 1 giờ để tiệt trùng. Các bình
được cân trước và sau khi hấp tiệt trùng để tính xem có bị mất nước và lượng nước mất được
bổ sung bằng cách thêm nước cất đã khử trùng vào các bình. Sau khi hấp tiệt trùng, dịch
thủy phân được làm lạnh đến nhiệt độ phòng và trung hòa đến pH 5,0 bằng NaOH 10 mol/L.
Khoảng 6 mL/L các chất cellulase, b-glucosidase và xylanase được thêm vào dịch thủy phân
sinh khối và ủ ở 45°C trong 72 giờ với sự lắc ở tốc độ 80 rpm. Sau 72 giờ thủy phân bằng
enzym, hỗn hợp được ly tâm ở 3300g để loại bỏ các cặn sinh khối. Chất lỏng nổi có chứa
đường thủy phân được thu hồi và lọc tiệt trùng bằng đĩa lọc 0,2 µm. Các sản phẩm thủy phân
sinh khối được khử trùng và bảo quản trong các chai Pyrex có nắp vặn đã được khử trùng ở
4°C trước khi tiến hành các thí nghiệm lên men. Mức đường (như glucose và xylose) trong
dịch thủy phân được định lượng thông qua HPLC bằng cách sử dụng cột Aminex HPX 87H
với các điều kiện hoạt động tương tự được đề cập trong phần Phân tích thành phần. Dịch
thủy phân với sản lượng đường lớn hơn được sử dụng để lên men etanol và butanol.
Phần trăm đường hóa được tính bằng công thức sau.
Saccharification ( ̣̀ %) = 100

2.4.

Lên men etanol

Saccharomyces cerevisiae ATCC 96581 được sử dụng để lên men ethanol. Chất cấy để lên
men được duy trì trong mơi trường canh trường ATCC 1245 YPD đã khử trùng có chứa chiết
xuất nấm men (10 g/L), peptone (20 g/L) và dextrose (20 g/L) trong 24 giờ ở 30°C, pH 5,6
với 150 vịng/phút.
Đối với q trình lên men ethanol, 100 mL dịch thủy phân sinh khối được bổ sung với chiết
xuất nấm men (1,5 g/L), peptone (1 g/L), amoni sulfat (1 g/L), dipotassium phosphat (0,5
g/L), magie sulfat ( 0,5 g/L), và mangan (II) sulfat (0,5 g/L) ở pH 5,6 và được hấp tiệt trùng
ở 121°C trong 30 phút. Sau khi để đến nhiệt độ phịng, khoảng 6 mL S. cerevisiae thêm vào
mơi trường đã khử trùng và ủ trong 60 giờ ở 30°C và 150 rpm. Sản xuất etanol từ glucose
làm đối chứng.
1,5 mL mẫu được lấy sau mỗi 12 giờ để xác định etanol và đường dư trong HPLC.
2.5.

Lên men butanol

Clostridium beijerinckii B-592 được sử dụng để lên men butanol. Chuyển 6 mL dịch nuôi
cấy C.beijerinckii vào 100 mL môi trường ATCC 2107. Dung dịch clostridial tăng cường


được sửa đổi ATCC 2107 chứa peptone (10 g/L), chiết xuất thịt bò (10 g/L), chiết xuất nấm
men (3 g/L), dextrose (5 g/L), NaCl (5 g/L), tinh bột (1 g/L), L-cysteine HCl (0,5 g/L), natri
axetat (3 g/L) và 0,025% resazurin (4 mL/L).
Sản xuất butanol được nghiên cứu với glucose làm chất nền kiểm soát ở các mức thay đổi từ
50–150 g/L. Để 100 mL glucose có nồng độ quy định, 2,5 mL chiết xuất nấm men 40 g/L
được thêm vào và khử trùng ở 121°C trong 15 phút sau đó làm lạnh đến nhiệt độ phòng. Sau
khi làm lạnh, 6 mL C. beijerinckii (nuôi cấy trong ATCC 2107) được thêm vào mơi trường

và ủ trong buồng kỵ khí trong 72 giờ ở 35°C.
Tương tự, 100 mL dịch thủy phân sinh khối đã khử trùng bằng bộ lọc (pH 6,5) được chuyển
vào chai Pyrex có nắp vặn 250 mL đã được khử trùng trước. Đối với dịch thủy phân, 2,5 mL
dung dịch chiết xuất nấm men đã khử trùng 40 g/L được thêm vào, sau đó cấy 6 mL C.
beijerinckii đang phát triển tích cực (trong mơi trường ATCC 2107) như đã mơ tả ở trên.
Trong tất cả các q trình lên men, 1,5 mL mẫu lỏng được lấy cứ sau 12 giờ và được lọc
bằng các đĩa lọc 0,2 lm. Các mẫu lọc được định lượng axeton, butanol, etanol, axit axetic,
axit butyric và đường dư trong HPLC (cột Aminex HPX 87H) với các điều kiện đã đề cập
trước đó.
Tất cả các phân tích được đề cập ở trên như phân tích thành phần, thủy phân axit/enzym và
lên men etanol và butanol được thực hiện trong ba lần với độ lệch chuẩn nhỏ hơn 5%. Sản
phẩm thu được (g/g) được tính bằng gam lượng etanol hoặc butanol được tạo ra trên một
gam glucose hoặc đường được sử dụng. Năng suất (g/L/h) được tính bằng nồng độ ABE tối
đa (g/L) chia cho thời gian lên men cụ thể (h).
3.

Kết quả nghiên cứu

4.

Kết luận

5.

Bài học rút ra