Nghiên cứu kỹ thuật phát sinh phôi sona và tạo hạt nhân tạo ở cây lan Hồ Điệp

1

1 Phần 1. Mở đầu

1.1 Đặt vấn đề
Từ lâu hoa Lan đã được tôn vinh là “Mỹ Nữ Sơn Lâm” của các loài hoa, đây
không chỉ là một loại hoa vương giả có vẻ đẹp lộng lẫy, mê hồn mà còn tượng trưng
cho bản tính hướng thiện của con người.
Trong dân gian, đã lưu truyền nhiều câu chuyện có liên quan đến loài hoa này.
Người đầu tiên ca ngợi hoa Lan là đức Khổng Phu Tử (Trung Quốc - 551 B.C), ví hoa
Lan là loài hoa quân tử...Và trước đó nữa, vua Thần Nông (Trung Quốc - 2800 B.C)
đã dùng hoa Lan trị bệnh như là một liều thuốc tiên, nên từ đó dân gian đã âm thầm
gọi hoa Lan là vua của các loài hoa... Tương truyền nước ta cũng có kể rằng: khi vua
Trần Nhân Tông rời kinh thành về Yên Tử, Quảng Ninh trong đêm ngủ mộng Ngài
thấy có người đến yết kiến và dâng tặng một giò hoa rất đẹp. Sáng ra, nghi nghi hoặc
hoặc hoặc nhà vua đi sâu vào trong núi thì bắt gặp tại một khe sâu có một loài
hoa lạ, đẹp và vô cùng thuần khiết. Đời sau người ta gọi loài hoa này là lan Trần mộng
(giấc mộng của vua Trần) để chỉ điển tích rũ sạch bụi trần bước vào cõi thiền thuần
khiết của Ngài.
Do đó, thú chơi Lan mang một ý nghĩa rất đặc biệt, bởi khi chăm Lan người ta
không chỉ chăm chút cái đẹp cho hoa mà còn đang dưỡng một cái Tâm trong sáng cho
mình.
Ngày nay, chúng ta có thể thấy hoa lan ở khắp mọi nơi và dễ bị choáng ngợp
trước vẻ đẹp quyến rũ, biến hóa muôn màu muôn vẻ của các loài lan như Cattleya, Hồ
Điệp , Dendrobium, Mokara, Vanda, Cymbidium, Oncidium.... Hoa lan được ưa
chuộng phải chăng bởi đó là biểu tượng của niềm khát khao cuộc sống phong lưu và
hạnh phúc bền bỉ.
Hoa lan là một món quà của tạo hóa, nó không chỉ là một loài hoa đẹp có giá trị
về mặt tinh thần mà còn có giá trị kinh tế cao và hiện đang có thị trường tiêu thụ mạnh
trong nước cũng như xuất khẩu.
Tại khu vực Đông Nam Á ngành hoa lan phát triển rất mạnh, Thái Lan là nước

xuất khẩu lan nhiều nhất thế giới (có đến 1.000 giống hoa lan), tại Malaysia thì chính
2

phủ đã qui hoạch hẳn 300 ha đất ở Johor và giao cho Hiệp hội hoa lan tổ chức thành
khu “Trung Tâm Sản Xuất Hoa Cảnh Xuất Khẩu”, ngành trồng hoa lan ở Đài Loan
cũng đang tăng nhanh tốc độ từ 15-20%, đạt doanh thu hằng năm hơn 9,3 tỷ đài tệ.
Ở Việt Nam, nghề trồng Lan phát triển chậm hơn các nước rất nhiều. Việc
trồng lan trên địa bàn TP.HCM lâu nay chủ yếu là do tự phát nên diện tích trồng còn
nhỏ và trình độ tay nghề nông dân chưa đồng đều, ngoài ra người trồng lan vẫn chưa
chủ động được nguồn giống, vì vậy việc trồng lan rất khó khăn, đặc biệt là trồng lan
Hồ Điệp. Loại lan này trồng rất khó và phải đầu tư lớn, từ việc cung cấp dưỡng chất và
giữ ẩm cho cây đến thiết bị nhà ươm, chăm sóc… đều phải nhập ngoại và chịu thuế
khá cao. Đặc biệt, sau 2 năm trở đi cây mới cho thu hoạch thì có thể lúc đó thị trường
đã bão hòa, lợi nhuận thu được không tương xứng với vốn và công sức bỏ ra.
Theo tình hình đó đã có nhiều công trình nghiên cứu nuôi cấy in vitro lan Hồ
Điệp nhằm tạo ra nguồn hoa mới ổn định. Từ nuôi cấy mô, nguồn gene từ các dòng lan
sưu tập sẽ được lưu giữ lại để nâng cao chất lượng giống, đồng thời tổ chức nhân
nhanh để cung cấp cho nhu cầu thị trường trong và ngoài nước. Tuy đã có một số
thành tựu đáng kể nhưng thực tế vẫn còn nhiều hạn chế như chất lượng giống không
đồng đều và không thể thực hiện trên quy mô lớn.
Dựa vào thực tế đã nêu trên, với đề tài “Nghiên cứu kỹ thuật phát sinh phôi
soma và tạo hạt nhân tạo ở cây lan Hồ Điệp (Phalaenopsis sp. )”, chúng tôi mong
muốn góp một phần vào nền công nghiệp sản xuất hoa lan Hồ Điệp. Trong đề tài này,
lan Hồ Điệp được sản xuất bằng phương pháp nhân giống in vitro tốc độ cao tạo cây
giống có đặc điểm về kiểu gen và kiểu hình đồng nhất với nguồn mẫu ban đầu. Từ đó,
có thể cho ra đời nhiều giống cây hoa lan Hồ Điệp mới có chất lượng tốt để ngày càng
đáp ứng được nhu cầu của những người yêu hoa Lan.
Hiện nay trên thế giới, các công trình nghiên cứu về phôi soma đã đạt được
những thành công nhất định trên thực vật hai lá mầm, trong khi ở những cây một lá
mầm vẫn còn gặp nhiều khó khăn. Vì những ứng dụng tốt đẹp mà phôi soma có thể

mang lại, trong đề tài này chúng tôi thử nghiệm một phương pháp tạo phôi soma trên
cây hoa lan Hồ Điệp sao cho việc tạo phôi soma trở nên thật đơn giản và hiệu quả.
Từ kết quả thu nhận được trong việc tạo phôi soma cây lan Hồ Điệp, chúng tôi
đi xa hơn nữa, bằng cách sử dụng các phôi soma ấy để tạo hạt nhân tạo. Công nghệ hạt
3

nhân tạo là phương pháp tạo một dạng hạt mô phỏng hạt tự nhiên, có một phôi sinh
dưỡng hoặc "chồi ngủ" được bọc trong một lớp dung dịch alginate (một chất có tác
dụng tạo lớp vỏ cứng bên ngoài cho mầm hạt) có chứa chất dinh dưỡng, phôi này sau
đó nảy mầm thành cây con hoàn chỉnh. Đây là một vấn đề đang được các nhà khoa học
trên thế giới quan tâm trong ứng dụng bảo quản phôi vô tính, chất mầm thực vật dài
hạn. Đồng thời mở ra một hướng mới cho việc sử dụng những hạt vô tính thay cho các
hạt hữu tính có khả năng nẩy mầm thấp và không đồng loạt.
Khi thực hiện đề tài này, chúng tôi hy vọng sẽ mang đến những hiểu biết mới
về quá trình hình thành phôi vô tính trên cây lan Hồ Điệp nói riêng và hoa lan nói
chung, đồng thời đem lại những ứng dụng thiết thực cho ngành nuôi cấy mô thực vật
tại Việt Nam.

1.2 Mục đích và yêu cầu
1.2.1 Mục đích
- Tìm hiểu vai trò tác động của chất điều hòa sinh trưởng lên sự hình thành
mô sẹo cũng như phát sinh phôi soma của cây lan Hồ Điệp.
- Tạo hạt nhân tạo có ý nghĩa trong công tác duy trì nguồn mẫu, nguồn gen
thực vật quí hiếm trong một thời gian dài phục vụ cho những mục đích sử dụng khác
trong tương lai.
- Làm cơ sở cho việc kiểm chứng sự khác nhau giữa cây hoa lan Hồ Điệp in
vitro có nguồn gốc từ phôi soma với cây hoa lan Hồ Điệp từ các nguồn mô khác.
- Làm cơ sở để nghiên cứu tiếp khả năng tạo mô sẹo và phát sinh phôi soma
của các loại cây thân thảo một lá mầm khác.

1.2.2 Yêu cầu
- Tạo được cây hoa lan Hồ Điệp có đặc điểm về kiểu gen và kiểu hình đồng
nhất với nguồn mẫu ban đầu. Từ đó, có thể tạo ra số lượng lớn cây con có chất lượng
tốt, đồng thời làm giảm giá thành cây con.
- Hình thành quy trình nhân giống vô tính in vitro và tạo hạt nhân tạo cây hoa
lan Hồ Điệp, để góp phần nghiên cứu giải quyết nhu cầu giống phục vụ cho việc tiêu
thụ hoa trong nước và xuất khẩu.
4

Phần 2 Tổng quan tài liệu

2.1 Giới thiệu về cây lan Hồ Điệp
Cây lan Hồ Điệp (Phalaenopsis sp.) là loại cây đơn trục sống biểu sinh, thuộc :
Ngành : Hạt kín (Angiospermae).
Lớp : Một lá mầm (Monocotyledoneae).
Bộ : Lan (Orchidales).
Họ : Phong lan (Orchidaceae).
Cây phong lan Hồ Điệp (Phalaenopsis sp.) sinh trưởng và phát triển tốt trong
điều kiện khí hậu Việt Nam. Hồ Điệp có hoa đẹp, đa dạng, màu sắc phong phú lại lâu
tàn, trung bình trên mỗi phát hoa có từ 7 – 15 hoa, thời gian hoa tươi trên cây kéo dài
từ 3 – 4 tháng. Đó là tính chất hơn hẳn của phong lan Hồ Điệp so với các loại phong
lan khác, giúp cho lan Hồ Điệp có giá trị kinh tế cao ở trong nước cũng như ở nước
ngoài.
Khả năng tự sinh cây lan con trong thiên nhiên rất thấp. Thông thường để tạo số
lượng lớn cây con của giống lan này, người ta dùng phương pháp gieo hạt trong nuôi
cấy in vitro. Tuy nhiên những cây con mọc từ hạt thường tăng trưởng không đồng đều,
lâu trổ hoa, các đặc điểm của hoa không thuần nhất. Nhân giống bằng con đường tạo
mô sẹo và phát sinh phôi soma có thể khắc phục các nhược điểm trên.

2.1.1 Nguồn gốc và sự phân bố

Cây phong lan Hồ Điệp có nguồn gốc ở Tây Nam Châu Á, trải rộng trên
những vùng núi cao ở Trung Quốc và Tây Tạng đến Châu Úc, trên vùng kinh tuyến
bao gồm giữa Ấn Độ Dương và Thái Bình Dương. Người ta còn gặp giống này ở
Sumatra, Bornéo, Célèbes, Nouvelle Calédonie (Marry Noble, 1971).
Đây là những cây sống biểu sinh, trên những cây cao trong rừng dầy có ẩm độ
cao hoặc rất gần đất, trên những cây nhỡ (arbuter), hay sống bám trên những hốc đá,
hay trên những đám rêu dày, một vài loài sống ở vùng ven biển. Lan Hồ Điệp ít thích
hợp với nắng hơn so với những loại phong lan có giả hành. Nhiệt độ thích hợp cho sự
5

tăng trưởng và phát triển là 15
o
C – 38
o
C và giống này thường sống ở cao độ 200m-
400m (William và Kramer, 1983).
Tên Phalaenopsis có nguồn gốc từ Phalaina (phalène) và d’Opsis (apparence),
được Blume (nhà thực vật học người Hà Lan) đặt vào năm 1852 khi ông khám phá một loài
lan đặc biệt có hoa giống cánh bướm, đó là Phalaenopsis amabilis.
Đa số các tác giả đều đồng ý xếp chi Hồ Điệp có một nhụy, kiểu phát hoa bên và
có cấu tạo đơn trục. Trong chi này có khoảng 70 loài, được phân bố trong những vùng và
khu vực khác nhau. Các loài này thường xuyên lai chéo với nhau, do đó phả hệ của những
cây nhận được cũng rất phức tạp. Thế hệ con cháu của chúng cũng không thuần nhất. Tuy
nhiên sự lai tạo đưa đến một lợi ích lớn để cung cấp những cá thể luôn đổi mới và những
đặc tính quyến rũ của hoa (Perlz, 1974).

2.1.2 Vị trí lan Hồ Điệp trên thị trường
So với đa số các loại lan trên thị trường hiện nay, thì lan Hồ Điệp nổi bật hơn,
bởi các đặc tính của hoa đa dạng, màu sắc phong phú, hoa lâu tàn, trung bình hoa tươi
trên cành có thể kéo dài từ 3-4 tháng (Broly, 1982). Trục phát hoa dài, đường kính to,

mang nhiều hoa to, trung bình 7-15 hoa, do đó rất thuận lợi cho việc trang trí, và có thể
cắt cành xuất khẩu, chuyên chở xa mà không ảnh hưởng đến chất lượng hoa. Hồ Điệp
có giá trị kinh tế cao hơn một số giống lan khác. Nếu biết dùng biện pháp kỹ thuật để
thúc đẩy việc ra hoa sớm thì sẽ có lợi nhiều trong việc kinh doanh.

6



Hình 2.1 Một số loại lan Hồ Điệp phổ biến.
7

2.2 Nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.2.1 Khái niệm
Nuôi cấy mô tế bào thực vật hay còn gọi là nuôi cấy in vitro là công cụ cần thiết
trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của ngành công nghệ sinh học.
Nhờ áp dụng kĩ thuật nuôi cấy mô, con người đã thúc đẩy thực vật sinh sản nhanh hơn
gấp nhiều lần so với tự nhiên. Do đó tạo ra hàng loạt cá thể mới giữ nguyên tính trạng
di truyền của cơ thể mẹ, làm rút ngắn thời gian đưa giống mới vào sản xuất. Hơn nữa
dựa vào kĩ thuật nuôi cấy mô có thể duy trì và bảo quản nhiều giống cây trồng quí
hiếm để phục tráng giống cây trồng.
Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật bắt đầu từ một mảnh nhỏ thực vật vô
trùng được đặt trong môi trường dinh dưỡng thích hợp. Chồi mới hay mô sẹo mà mẫu
cấy này sinh ra bằng sự tăng sinh được phân chia và cấy chuyền để nhân giống.

2.2.2 Lịch sử phát triển
Năm 1838, hai nhà sinh vật học Đức là Schleiden và Schwann đề xướng học
thuyết tế bào và nêu rõ: Mọi sinh vật phức tạp đều gồm nhiều sinh vật nhỏ, các tế bào
hợp thành, các tế bào phân chia mang thông tin di truyền chứa trong tế bào đầu tiên,
đó là trứng sau khi thụ tinh và là những đơn vị độc lập từ đó có thể xây dựng lại toàn

bộ cơ thể.
Năm 1902, Haberlandt đề xướng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để
chứng minh tính toàn năng của tế bào, nghĩa là mỗi tế bào đều mang đầy đủ thông tin
di truyền của cá thể. Ông tiến hành trên cây họ hòa thỏa (cây một lá mầm) một lọai
cây khó thực hiện và ông bị thất bại.
Năm 1922, Kote (học trò Haberlandt) và Robbins (nhà khoa học người Mỹ) đã
lặp lại thí nghiệm của Haberlandt và nuôi cấy được đỉnh sinh trưởng tách ra từ đầu rễ
của một loại cây thuộc họ hòa thảo tạo ra hệ rễ nhỏ và có cả rễ phụ. Tuy nhiên sự sinh
trưởng như vậy chỉ tồn tại trong một thời gian sau đó chậm lại và ngừng hẳn mặc dù
tác giả đã chuyển sang môi trường mới.
Năm 1934, White đã nuôi cấy thành công đầu rễ cây cà chua (Lycopersicum
esculentum).
8

Năm 1937, Gautheret và Nobecout đã tạo ra và duy trì được sự sinh trưởng mô
sẹo cây cà rốt trong một thời gian dài trong môi trường thạch cứng.
Năm 1941, Overbeck đã chứng minh được vai trò của chất kích thích sinh
trưởng trong nuôi cấy phôi họ cà. Trong thời gian này chất hích thích sinh trưởng nhân
tạo thuộc nhóm auxin đã được nghiên cứu và tổng hợp hóa học thành công. Và năm
1948 Steward đã xác định được tác dụng của nước dừa trong nuôi cấy mô sẹo cây cà
rốt
Năm 1955, người ta tìm ra tác dụng kích thích phân bào của kinetin.Sau đó các
chất cytokinine khác như BAP, 2 IP, Zeatin cũng được phát hiện.
Năm 1957, SKoog và Miller công bố kết quả nghiên cứu về ty lệ giữa
kinetin/auxin đối với sự hình thành các cơ quan từ mô sẹo trên cây thuốc lá.
Từ năm 1954, đến năm1959 kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bào đơnđã được phát
triển, các tác giả đã gieo tế bào đơn và nuôi cấy tạo được cây hoàn chỉnh.
Năm 1966, Guha và Mahheswari nuôi cấy thành công tế bào đơn bội từ nuôi
cấy túi phấn cây cà độc dược.
Năm1967, Bougin và Nistsh tạo thành công cây đơn bội từ túi phấn cây thuốc

lá.
2.2.3 Ứng dụng
Năm 1986, một số lượng lớn cây trồng sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy mô
đã được tiêu thụ tên thị trường thương mại với hàng chục triệu dollar. Kỹ thuật này
thể hiện một số ưu điểm đã được ứng dụng:
- Nhân giống vô tính với tốc độ nhanh.
- Tạo cây sạch bệnh và kháng bệnh.
- Cảm ứng và tuyển lựa dòng đột biến.
- Sản xuất cây đơn bội qua nuôi cấy túi phấn.
- Lai xa.
- Lai tế bào soma và tạo dòng protoplast.
- Gây biến tính thực vật qua hấp thụ DNA và ngoại lai.
- Cố định nitrogen.
- Cải thiện hiệu quả của quang tổng hợp.
- Bảo quản nguồn gen quý.
9

2.2.4 Các phương pháp nuôi cấy in vitro
 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng
Mẫu cấy bao gồm: đỉnh sinh dưỡng, chồi đỉnh, chồi bên, có kích thước khoảng
0.58 - 1 cm. Đây là phương pháp dễ dàng nhất, mẫu sau khi vô trùng và được nuôi cấy
trong môi trường thích hợp cho loại cây đó thì sau một thời gian nuôi cấy tạo thành
một hay nhiều chồi. Sau đó, nuôi cấy trong môi trường có bổ sung chất kích thích sinh
trưởng thì sẽ tạo thành nhiều chồi, rễ, tạo thành cây hoàn chỉnh.

 Nuôi cấy mô sẹo
Mẫu cấy là những tế bào đỉnh sinh trưởng hay nhu mô được tách ra trong môi
trường giàu auxin thì mô sẹo được hình thành. Mô sẹo là những tế bào vô tổ chức có
màu trắng. Khối mô sẹo này có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong môi
trường không có chất kích thích sinh trưởng tạo mô sẹo. Nuôi cấy mô sẹo được thực

hiện đối với những cây không có khả năng nuôi cấy từ đỉnh sinh trưởng. cây tái sinh từ
mô sẹo có nhiều chồi hơn so với cây tái sinh từ đỉnh sinh trưởng, tuy nhiên mức độ
biến dị tế bào soma của phương pháp này rất cao.

 Phương pháp nuôi cấy tế bào đơn
Những khối sẹo được nuôi cấy trong môi trường lỏng, đặt trong máy lắc thì
khối sẹo dứơi tác dụng cơ học và hóa học sẽ tách ra nhiều tế bào đơn lẻ gọi là tế bào
đơn. Những tế bào đơn này nuôi cấy trong môi trường đặc biệt thì sẽ tăng sinh khối.
Sau một thời gian nuôi cấy trong môi trường lỏng tế bào đơn tách ra và đặt trải trong
môi trường thạch thì sẽ phát sinh thành những tế bào mô sẹo. Những tế bào mô sẹo
này được nuôi cấy trong môi trường cytokinin/auxin thích hợp thì sẽ tái sinh thành cây
hoàn chỉnh. Trong chọn giống cây trồng người ta dựa vào phương pháp này để tạo ra
giống mới bằng cách đột biến tế bào đơn bằng hóa chất hay phóng xạ.

 Nuôi cấy protoplast- chuyển gen
Protoplast (tế bào trần ), thực chất là tế bào đơn được tách vỏ cellulose, có sức
sống và duy trì chức năng sẵn có. Protoplast có thể tái sinh trực tiếp từ thân, lá, rễ bằng
cơ học, hoặc từ những tế bào đơn sẵn có. Trong môi trường thích hợp các protoplast
10

có khả năng tái sinh màng tế bào, tiếp tục phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh.
Trong chọn giống cây trồng người ta sử dụng phương pháp này để cải tiến giống cây
trồng bằng cách cho dung hợp protoplast ở 2 protoplast cùng loài hoặc khác loài.
Protoplast có khả năng hấp thu tế bào ngoại lai để cải thiện đặc tính của một số
loại cây trồng mà không thông qua các phương pháp chuyển gen khác.

 Nuôi cấy tế bào đơn bội
Hạt phấn của cây trồng được nuôi cấy trong môi trường thích hợp tạo thành mô
sẹo, những mô sẹo này có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh có bộ nhiễm sắc thể
n gọi là cây đơn bội. Trong nuôi cấy mô thực vật người ta sử dụng những mô sẹo này

xử lý colchicin để tạo thành cây đa bội.

2.3 Các yếu tố ảnh hƣởng trong nuôi cấy in vitro
2.3.1 Chất điều hoà sinh trưởng
Chất sinh trưởng thực vật hay còn gọi là chất điều hòa sinh trưởng thực vật là
các hợp chất hữu cơ (bao gồm các sản phẩm thiên nhiên của thực vật và các hợp chất
tổng hợp nhân tạo) có tác dụng điều tiết các quá trình sinh trưởng và phát triển, làm
biến đổi một quá trình sinh lý thực vật nào đó, ở những nồng độ rất thấp. Chúng không
phải là các chất dinh dưỡng hay các sinh tố dùng trong thực vật.

Một số chất điều hoà sinh trưởng thường dùng:
(1) Auxin

Auxin là một nhóm các chất được tổng hợp chủ yếu ở đầu thân, đầu rễ, được
vận chuyển đến các bộ phận khác nhau của cơ thể để kích thích sự tăng trưởng của tế
bào.
11

Các phản ứng auxin và sự tăng trưởng có liên quan với vô số quá trình sinh lý
và trao đổi chất khác và mối quan hệ nhân quả giữa auxin, ARN và chuyển hóa protein
không phải hoàn toàn rõ ràng. Phản ứng chủ yếu và nhanh chóng nhất đối với việc xử
lý auxin là làm tăng độ kéo dài của tế bào, điều này xảy ra chỉ một vài phút sau khi xử
lý. Một đặc trưng quan trọng là vách tế bào, là một vị trí quan trọng chịu sự tác động
của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật (Torry và csv, 1981). Auxin làm giảm pH
do kích thích sự bài xuất proton H
+
, pH hoạt hóa các enzym tác động nới lỏng vách tế
bào và enzym tổng hợp vách tế bào, nhờ đó khởi động quá trình giản nở tế bào (Roger
Prat, 1993).
Auxin hoạt hóa sự sinh tổng hợp các hợp chất cao phân tử (protein, xenluloza,

pectin, …) và ngăn cản sự phân giải chúng (Grodzinxki, 1981).

(2) Cytokinin
Đây là chất hoạt hóa sự phân chia tế bào (Mitsuhashi và csv, 1969; Mai Trần
Ngọc Tiếng, 1989), đồng thời làm tăng quá trình chuyển hóa acid nucleic và protein
(Vũ Văn Vụ và csv, 1993). Cytokinin được sử dụng khá nhiều trong kỹ thuật nuôi cấy
mô, những chất thường được dùng là Kinetin và BA (Benzyl Adenin).
Cytokinin phá vỡ trạng thái ngủ của hạt, kích thích hạt nẩy mầm, làm tăng sự
nở hoa. Cytokinin gây nên sự hình thành chồi mầm trong nhiều mô bao gồm mô sẹo
sinh trưởng (cals) trong mô nuôi cấy, hay việc tạo thành các mô bứu ở các cây gỗ lâu
năm (Nester và csv, 1985; Taiz L. và csv, 1991).
Cytokinin kích thích sự tổng hợp mới enzym Rubisco (Ribulozo-1,5-biphotphat
cacboxylaza/oxygenaza) hoặc ở mức sao chép (làm tăng hoạt tính ARN-polymeraza)
hoặc ở mức dịch mã (thành lập các polyriboxom) (Parthier, 1985). Ảnh hưởng của
Cytokinin thấy rõ khi phối hợp sử dụng với auxin (Meredith và csv, 1970). Skoog và
csv (1948) ghi nhận lượng benzyl amino purine cao có tác dụng kích thích sự tạo chồi,
đồng thời ức chế sự phân hóa tạo rễ.




12

 Thidiazuron [1-phenyl-3-(1,2,3-thidiazol-5-yl)urea] [TDZ]

Thidiazuron [1-phenyl-3-(1,2,3-thidiazol-5-yl)urea] là một hóa chất tổng hợp
dạng tinh thể thường tan trong ethanol và ít tan trong nước. Vào những năm 1970,
TDZ được sử dụng như một thương phẩm làm rụng lá phục vụ cho quá trình thu
hoạch bông vải. Đến gần đây, nó được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy mô do có hoạt
tính cytokinin và auxin mạnh hơn hẳn các cytokinin và auxin cơ bản thông dụng khác.

Về cấu trúc, phân tử TDZ khác hẳn các auxin và các cytokinin dạng adenin
với hai nhóm chức năng khác nhau: phenyl và thidiazol. TDZ sẽ bị giảm hoạt tính khi
bị thay thế bất kỳ một trong hai nhóm này bằng các vòng thơm khác (Murthy và csv,
1998).
Đối với cây in vitro, TDZ được thấy là có khả năng thay thế cả cytokinin và
auxin hoặc kết hợp các chất điều hòa sinh trưởng thực vật khác nhau để kích hoạt các
quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô.
- Tạo mô sẹo: thông thường auxin được dùng để cảm ứng sự phân chia tế bào
và tăng trưởng mô sẹo. TDZ cũng có khả năng cảm ứng tạo mô sẹo ở nhiều hệ thống
nuôi cấy khác nhau với tốc độ tăng sinh tế bào cao hơn nhiều các chất điều hòa sinh
trưởng thực vật khác, có khi lên đến 30 lần. Tuy nhiên mô sẹo thường hấp thu TDZ ít
hơn các chất điều hòa sinh trưởng thực vật khác, có lẽ do hoạt tính của TDZ khá cao.
Không có nhiều tài liệu nói về dạng mô sẹo tạo bởi TDZ, ngoài một số tài liệu cho
rằng TDZ có khuynh hướng tạo mô sẹo xanh với những tế bào kích thước nhỏ, xếp
chặt chẽ.
- Tạo chồi: có khá nhiều loại cây được tạo chồi bằng TDZ, đặc biệt hiệu quả
trên nhiều giống cây thân gỗ, ví dụ như Bạch đàn (Chen và csv, 1995). TDZ kích thích
tạo chồi trực tiếp khi nuôi cấy tế bào lớp mỏng, ví dụ trên cây đậu Phaseolus vulgaris
L. (Bui và csv, 2000). TDZ thúc đẩy sự biệt hóa các trung tâm tăng trưởng, làm giảm
13

sự ngủ của các đỉnh sinh trưởng ngọn, dẫn đến sự hình thành chồi bên và chồi bất định
trực tiếp từ mô cấy.
- TDZ được sử dụng trong quá trình tạo chồi (đặc biệt ở cây thân gỗ) với
nồng độ rất cao. Điển hình như báo cáo tạo phôi trên cây măng cụt bằng nồng độ TDZ
lên đến 2,25mM (Te-Chato và Lim, 1999)
- Sinh phôi: Người ta thấy rằng TDZ, có thể thay thế cho auxin hoặc tổ hợp
auxin và cytokinin trong sự hình thành phôi ở nhiều loài cây khác nhau như thuốc lá
(Gill và Saxena, 1993), đậu xanh (Murthy và csv, 1995), cây phong lữ (Visser và csv,
1992), neem (Murthy và Saxena, 1998), cacao (Li và csv, 1998), … thường là với tỷ lệ

sinh phôi cao hơn so với các tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng thực vật khác. Do tính
chất này của TDZ, nên ngoài hoạt tính của cytokinin đã được đề cập nhiều, người ta
cho rằng, TDZ có ảnh hưởng đến quá trình biến dưỡng auxin. Victor và csv (1999) đã
cũng cố cho giả thiết này bằng một khảo sát so sánh hoạt tính phát sinh hình thái của
BAP và TDZ trên cây đậu phộng, ghi nhận sự khác biệt trong hoạt tính là TDZ có khả
năng sinh phôi vô tính, trong BAP không có khả năng này.
- Nuôi cấy protoplast: TDZ kết hợp với auxin (NAA; 2,4-D; NOA) được sử
dụng trong giai đoạn hình thành vách tế bào xung quanh protoplast, khởi đầu cho sự
phân chia tế bào (Chupeau và csv, 1993; Reustle và csv, 1995) và trong giai đoạn tiếp
theo tái sinh từ mô sẹo có nguồn gốc protoplast (Lenzner và csv, 1995). Nhiều báo cáo
khác nhau cho thấy, TDZ ở nồng độ thấp có hiệu quả cao hơn hẳn so với các cytokinin
khác.
- Tạo chồi ngoài vườn ươm : Ngoài các tác dụng sinh chồi in vitro, TDZ còn
có tác dụng kích thích tạo chồi trên cây khi được phun hoặc xử lý vào đất trong vườn
ươm, chủ yếu là tạo chồi bất định từ rễ hoặc phần dưới thấp của cây.
Đi cùng với những ưu điểm trên, nhược điểm của TDZ cũng được ghi nhận,
bao gồm : thủy tinh hóa chồi tái sinh (Debergh và csv, 1992; Briggs và csv, 1988;
Causineu và Donnelly, 1991); biến dị hình dạng lá (van Niewkerk và csv, 1986;
Cambecedes và csv, 1991); chồi chặt và ngắn (Fasolo và csv, 1989; Meyer và van
Staden, 1988); sự khó khăn trong việc kéo dài và ra rễ chồi tái sinh.

14

2.3.2 Ảnh hưởng của nguồn carbon
Trong môi trường nuôi cấy, các mô không có khả năng tự dưỡng do không
quang hợp đầy đủ trong điều kiện thiếu sự trao đổi khí với bên ngoài, do vậy cần cung
cấp đường để giúp mô, tế bào thực vật tổng hợp các chất hữu cơ, giúp tế bào phân
chia, tăng sinh khối. Các loại đường thường được sử dụng là sucrose, d-glucose, d-
fructose (Doods và Roberts, 1987). Sucrose là nguồn carbon được sử rụng rộng rãi
nhất cho các loại cây, nồng độ sucrose thay đổi từ 2%-12% hoặc cao hơn tùy thuộc

vào giống và tuổi phôi cấy.
2.3.3 Ảnh hưởng của nước dừa
Nước dừa (CW-coconut water) thêm vào môi trường với lượng thích hợp sẽ
kích thích sự phát triển của chồi bên cũng như sự hình thành cây con (Urata và
Iwanaga, 1965; Scully, 1966; Tanaka và Sakanishi, 1978).
Từ việc sử dụng CW, nhiều mô thực vật được nghiền tách dịch chiết và bổ
sung vào môi trường nuôi cấy có tác dụng kích thích sự phát triển phôi như nội nhũ
bắp, chà là, chuối, mầm đậu, mầm lúa mì, nước chiết cà chua … nhưng thông thường
các dịch chiết chỉ có tác dụng trên các loài cây trồng không cùng nguồn gốc (Trần Văn
Minh, 2002).
Hoạt tính của CW khác BAP, tuy nhiên có thể thay thế được BAP. Van
Overbeek và csv (1941) cho thấy CW kích thích sự phân chia tế bào của mô cây cà
độc dược (Datura solanaceae) trong môi trường nuôi cấy.
Theo Vũ Văn Vụ và csv (1993), trong CW khá giàu các hợp chất nitơ dạng
khử như các acid amin, ngoài ra trong CW còn chứa các hormon sinh trưởng như
cytokinine.
Theo sự phân tích thành phần dinh dưỡng của Tổ chức Y tế Thế giới, thì trong
CW có chứa protein, cacbohydrat, canxi, sắt và một số vitamin như thiamin,
riboflavin, niacin, acid ascorbic và đường.

2.3.4 Ảnh hưởng của than hoạt tính
Phải có những thực nghiệm xác định nồng độ than hoạt tính thích hợp cho quá
trình nuôi cấy. Than hoạt tính thêm vào môi trường kích thích sự phát triển phôi của
cây bắp, jujube và đu đủ.
15

2.3.5 Ảnh hưởng của độ pH và Agar
pH của môi trường nuôi cấy thường ở khoảng 6, thấp hơn 4,5 hoặc cao hơn 7
đều ức chế sự phát triển của mô (Nguyễn Văn Uyển, 1993 và Bùi Bá Bổng, 1995).
Các mô thực vật đều được cấy trên môi trường agar. Agar thường được sử

dụng ở nồng độ 6-10 g/lít, nồng độ agar tốt nhất cho sự phát triển của mô cấy là 8g/lít
(Ribeiro và csv, 2000).

2.3.6 Ảnh hưởng của các điều kiện vật lý
Ánh sáng cần thiết cho sự phát sinh hình thái của mô cấy. Trong tạo chồi ban
đầu và nhân chồi tiếp theo, cường độ ánh sáng chỉ cần trong khoảng 1.000 lux. Nhưng
trong giai đoạn tạo rễ, cây cần chiếu sáng ở cường độ cao từ 3.000-10.000 lux để kích
thích cây chuyển từ giai đoạn dị dưỡng sang tự dưỡng có khả năng quang hợp. Dưới
cường độ ánh sáng cao, cây lùn và có màu xanh hơi giảm nhưng có tỷ lệ sống sót cao
khi chuyển sang môi trường đất. Chưa có nhiều nghiên cứu về chế độ sáng trong môi
trường cấy mô, nhưng thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày của bóng đèn néon huỳnh quang
là thích hợp cho sự phát triển mô cấy của nhiều loài. Cấy phôi thường không sử dụng
ánh sáng đèn. Theo Scozzoli và Pasini, 1992; Pinto và csv, 1994, cấy phôi đào nên để
trong tối 14 ngày. Tương tự, ở cây bơ nên để 21 ngày trong tối ở nhiệt độ 21
0
C (Lano và
csv, 1995).
Ngoài ra, để mô cấy phát triển tốt thì môi trường nuôi cấy phải thông thoáng
và có nhiệt độ thích hợp, nhiệt độ trong phòng nuôi cấy thường được giữ ở 25-28
o
C
(Nguyễn Văn Uyển, 1993).

16

2.3 Nuôi cấy phát sinh mô sẹo
2.4.1 Sự hình thành mô sẹo

Hình 2.2 Mô sẹo lan Hồ Điệp
Mô sẹo là một khối tế bào phát sinh vô tổ chức, có hình dạng không nhất định,

do không có lớp nhu mô. Mô sẹo được hình thành từ mặt cắt của thân hay rễ, bao gồm
tế bào nhu mô và thành phần tế bào rây (Esau, 1977). Mô sẹo hình thành ở hầu hết các
bộ phận của cây (thân, lá, rễ), khi nơi đó có vết cắt (Street, 1969). Điều quan trọng
được nhận thấy ở đặc tính của mô sẹo là mô sẹo phát triển không theo quy luật nhưng
có khả năng biệt hóa thành rễ, chồi hoặc phôi để có thể hình thành cây hoàn chỉnh.
Đặc điểm sinh trưởng của mô sẹo có quan hệ với cơ quan hình thành mô sẹo,
thành phần môi trường nuôi cấy, và điều kiện nuôi cấy. Sự hình thành mô sẹo chia ra 3
giai đoạn : phát sinh mô sẹo, phân chia tế bào và biệt hóa.
- Trong pha phát sinh mô sẹo, sự trao đổi chất kích thích tế bào chuẩn bị
phân chia, giai đoạn này dài hay ngắn phụ thuộc vào tình trạng sinh lý của mô được
đưa vào nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy.
- Tế bào đi vào giai đoạn phân chia tăng sinh khối.
- Tế bào đi vào quá trình biệt hóa, xuất hiện sự biệt hóa tế bào và sự xuất hiện
các con đường trao đổi chất dẫn đến sự sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học
(Trần Văn Minh, 2003). Mô sẹo thường có màu vàng trắng, xanh hay màu sắc tố
17

anthocyanin. Sự biệt hóa của tế bào hình thành những chất liệu cấu tạo nhu mô các
loại, các tế bào rây… hơn nữa hình thành vùng mô phân sinh, trung tâm của sự tạo
nên chồi và rễ.
Nhiều nhà khoa học cho rằng, mô sẹo được tạo ra từ những mô hay cơ quan có
chứa diệp lục có khả năng quang tự dưỡng (Street, 1969). Hildebrandt và csv. (1963)
cho rằng, mô sẹo có chứa diệp lục phụ thuộc vào lượng đường bổ sung trong môi
trường và cường độ ánh sáng. Có nhiều yếu tố ảnh đến khả năng quang tự dưỡng của
những tế bào có chứa diệp lục (tế bào có màu xanh) như : cường độ ánh sáng mạnh,
ánh sáng màu xang cần thiết cho sự biệt hóa diệp lục và sự hình thành các enzym,
đường thấp, auxin thấp, CO
2
cao, và tăng hàm lượng phosphate (Barz và Husemann,
1982), và những tế bào quang tự dưỡng này có khả năng cố định

14
CO
2
bằng chu trình
Calvin mặc dù có sự xuất hiện của các acid hữu cơ 4 carbon (Yamada và csv, 1982).
Một vấn đề quan tâm trong nuôi cấy mô sẹo là sự biến tính tế bào. Sự biến tính này
xảy ra do : độ già của mẫu, sự thay đổi tế bào chất của nhân, tế bào đa bội thể có số
lượng DNA cao, thời gian duy trì nuôi cấy mô sẹo, điều kiện nuôi cấy, thành phần môi
trường nhất là hormon ( Trần Văn Minh, 2003).
Để tạo mô sẹo trong môi trường nuôi cấy có bổ sung chất sinh trưởng, đôi khi
có dịch chiết (Trần Văn Minh, 2003). Phụ thuộc vào từng loại mô nuôi cấy mà chất
sinh trưởng thêm vào có khác nhau (Trần Văn Minh, 2003). Chất hormon thường tổ
hợp thành 4 nhóm :
(1) Auxin.
(2) Cytokinin.
(3) Auxin + Cytokinin.
(4) Dịch Chiết.
Sau khi mô sẹo hình thành, mô sẹo được cấy chuyền. Môi trường cấy chuyền
cũng giống như môi trường tạo mô sẹo nhưng chất sinh trưởng được giảm nồng độ.
Kích thước tách mô sẹo nhỏ vừa phải để tế bào phát triển mạnh nhất, thường cụm mô
sẹo có trọng lượng là 20-100mg, thời gian giữa hai lần cấy chuyền là 20-30 ngày phụ
thuộc vào từng loại mô sẹo. Trong quá trình phát triển mô sẹo thường xuất hiện 2 loại
tế bào :
(1) Loại tế bào xốp, có không bào to, nhân nhỏ và tế bào chất loãng.
18

(2) Loại tế bào chặt, có không bào nhỏ, nhân to và tế bào chất đậm đặc.
Mô sẹo cấy chuyền càng nhiều lần thì khả năng tái sinh càng giảm. Ngoài ra,
nếu sau thời gian dài không cấy chuyền thì mô sẹo sẽ hoá nâu và chết.

Hình 2.3 Mô sẹo hoá nâu

2.4.2 Sự phát triển của tế bào mô sẹo
Giống thực vật cổ điển được sử dụng trong nghiên cứu phát sinh cơ quan là
thuốc lá (Skoog và Miller, 1957). Bước đầu tiên trong nghiên cứu tái sinh là tạo mô
sẹo. Mô nuôi cấy cho thấy tiêu biểu của sự phân chia tế bào, những chức năng đặc biệt
của tế bào, và sự hình thành cơ quan như cấu trúc của hệ thống mạch dẫn. Sự hình
thành mô sẹo từ mô nuôi cấy cho thấy có sự phân chia tế bào, những tế bào ít có tính
chuyên biệt và mất khả năng hình thành cấu trúc cơ quan (Trần Văn Minh, 2003).
Khi cấy chuyền mô sẹo trên môi trường agar, tế bào mô sẹo phát triển theo
hình chữ S. Có 5 pha trong sự phát triển mô sẹo :
(1) pha Lag : tế bào chuẩn bị phân chia.
(2) pha Exponential : tốc độ phân chia tế bào cao nhất.
(3) pha Linear : tế bào phân chia chậm lại và phát triển kích thước.
(4) pha Deceleration : tốc độ phân chia và kéo dài tế bào giảm.
(5) pha Stationary: số lượng và kích thước tế bào ổn định.
Sự phát triển của mô sẹo có thể đo được trọng lượng tươi. Đo trọng lượng khô
cho thấy chính xác hơn trọng lượng tươi, nhưng đòi hỏi mẫu phải đồng nhất. Đo đếm
sự phân bào nguyên nhiễm.
19

2.3.6.1 Sự tái sinh chồi từ mô sẹo
Theo Thomas và Davey (1975) (trích dẫn bởi Trần Văn Minh, 2003) sự
hình thành chồi từ mô sẹo được kích thích bởi :
- Các chất sinh trưởng đưa vào môi trường.
- Chất được sản sinh ra trong nuôi cấy mô sẹo.
- Các chất có chứa sẵn trong mẫu nuôi cấy.
Khả năng hình thành chồi từ mô sẹo phụ thuộc vào số lần cấy chuyền mà các
chất có trong mẫu không có khả năng tổng hợp trong thời gian dài (Gautheret,1959) và
sự hình thành tế bào xốp (Trần Văn Minh, 2003).

Hình 2.4 Chồi lan Hồ Điệp tái sinh từ mô sẹo

Sự hình thành chồi được điều khiển bằng hóa chất (Skoog, 1944). Theo Trần
Thanh Vân và Trinh (1978) sự hình thành chồi được điều khiển bằng :
- Tỷ lệ ctytokinin /auxin từ 10-100.
- Carbohydrate như sucrose và các chất hữu cơ như casein hydrolysate.
- Điều kiện nuôi cấy.
- Dịch chiết.
Tạo rễ cần auxin, đường, khoáng, nhiệt độ, ánh sáng… (Gautheret, 1959).
Adenine sulfate có tác dụng cản trở auxin. GA
3
cản trở sinh tổng hợp và tích lũy hạt
tinh bột, cần thiết trong hình thành chồi.
20

2.4 Phôi vô tính
2.5.1 Lịch sử nghiên cứu
Bắt đầu từ 1958, Street và Reinert đã mô tả sự hình thành phôi vô tính từ các tế
bào đơn của cà rốt. Sau đó, vào 1977, Murashige đưa ra ý kiến tạo phôi vô tính có thể
trở thành biện pháp vi nhân giống. và tiếp tục cho đến nay thì công nghệ phôi vô tính
được xem là rất có triển vọng cho nông nghiệp thế kỷ 21.


Hình 2.5 Phôi vô tính lan Hồ Điệp

2.5.2 Khái niệm về phôi vô tính
Phôi vô tính hay phôi soma là các thể nhân giống (propagule) có cực tính bắt
nguồn từ các tế bào dinh dưỡng, bao gồm cả phần mô phân sinh ngọn và mô phân sinh
gốc, do đó có thể hình thành chồi và rễ.

Không giống như các tế bào eukaryote, hầu hết tế bào thực vật đều có khả năng
phát triển thành phôi dưới những diều kiện nhất định. Williams và Maheswaran (1986)
đã cho rằng phôi vô tính có thể được hình thành từ một tế bào đơn hay từ cả một cụm
tế bào phôi. tiến trình này khác với những quá trình tự nhiên khác và được gọi là quá
trình hình thành phôi vô tính.
Phôi vô tính rất giống phôi hữu tính ở hình thái và sinh lí nhưng không có quá
trình tái tổ hợp di truyền do phôi vô tính không phải là sản phẩm của sự thụ tinh giữa
giao tử đực và giao tử cái. Do đó tất cả những cây con tái sinh bằng con đường này thì
có vật chất di truyền giống hệt các tế bào sinh dưỡng đã sinh ra chúng (Nguyễn Văn
Uyển, 1992). Đặc tính này của phôi sinh dưỡng không những cho phép thực hiện sự
21

nhân giống vô tính mà còn tạo ra những thay đổi chuyên biệt và trực tiếp để đưa các
tính chất mong muốn vào các cá thể bằng việc chèn thêm những trình tự gen cố định
vào tế bào sinh dưỡng. (Saiprasad, 2001).
Giống như các tế bào của mô phân sinh, các tế bào sinh phôi có các đặc tính cơ
bản như sau: tế bào nhỏ, có cùng một đường kính, có hoạt động biến dưỡng rất mạnh
mẽ, có cường độ tổng hợp ribonucleic acid rất cao, có tế bào chất đậm đặc, không bào
rất nhỏ, nhân to, dễ nhận thấy, hạch nhân rất to và sậm màu, đặc biệt là các tế bào này
có một lượng lớn các ribosom, ty thể, lưới nội chất nhỏ và có vách rất dày (Ammirato,
1987; Emons, 1994; Raghvan, 1983; Thorpe, 1988).

2.5.3 Sự phát sinh hình thái của phôi vô tính
Tất cả các phôi vô tính đều có cấu trúc lưỡng cực, gồm có mô phân sinh của cả
chồi và rễ, do đó có thể hình thành một cây hoàn chỉnh trong nuôi cấy in vitro. Sự phát
sinh hình thái ở phôi vô tính rất giống so với phôi hữu tính. những phôi phát triển bình
thường sẽ trải qua những giai đoạn phát triển riêng biệt như: hình cầu, hình tim, hình
thủy lôi và hình lá mầm.

 Cơ chế phát sinh phôi soma

Những quan sát chi tiết về quá trình phát sinh phôi phát hiện có 4 pha : 0, 1, 2
và 3, được nhận thấy trong giai đoạn đầu của tiến trình phát sinh phôi trong hệ thống
nuôi cấy nói trên (Fujimura và Komamine, 1979).
Ở pha 0, những tế bào đơn (giai đoạn 0) hình thành những cụm tế bào có khả
năng phát sinh phôi (giai đoạn 1) trên môi trường có auxin. Trong suốt giai đoạn này,
những cụm tế bào hình thành từ những tế bào đơn có khả năng tạo phôi khi môi trường
nuôi cấy không có auxin, để hình thành những cụm tế bào giai đoạn 1.
Sau đó, pha 1 xuất hiện khi cấy chuyển những cụm tế bào giai đoạn 1 qua môi
trường không có auxin. Trong suốt pha 1, những cụm tế bào tăng sinh chậm và dường
như không biệt hóa.
Sau pha 1 sự phân bào xuất hiện nhanh trên một phần của những cụm tế bào,
dẫn đến việc hình thành những tế bào phôi hình cầu. Pha này được gọi là pha 2.
22

Pha tiếp theo sau, pha 3, cây con in vitro phát triển từ những phôi hình cầu qua
phôi hình tim và phôi hình thủy lôi.

Hình 2.6 Các giai đoạn phát sinh phôi vô tính
 Các kiểu phát sinh phôi soma
Sự phát sinh phôi soma bất định
Các phôi vô tính có thể phát triển từ các tế bào hay các mô sẹo có liên quan của
một số loài thực vật nhiệt đới, các phôi bất định này có thể được tạo trực tiếp từ tế bào
đơn trên bề mặt của phôi non hoặc gián tiếp từ bề mặt của phôi non này. Phương pháp
này được sử dụng trong chương trình di truyền cải tạo giống, chẳng hạn như cứu các
phôi bị chết non do lai tạo.
Sự phát sinh đa phôi vô tính
Hiện tượng này xảy ra khi nuôi cấy các noãn non của thực vật hạt trần. Các
khối mô có khả năng tạo phôi cao khi được cấy chuyền sang môi trường mới sẽ phát
triển và tăng trưởng thành phôi. Mô có khả năng phát triển thành phôi có thể được
phân biệt với mô không có khả năng phát triển thành phôi do màu trắng của phôi và

hoá đỏ khi nhuộm bằng acetocarmine. Dưới ánh đèn tử ngoại các tế bào phôi có thể
phát huỳnh quang màu xanh lá cây.
Sự phát sinh phôi soma do cảm ứng
Hiện tượng này do sự nuôi cấy lỏng các tế bào và mô sẹo sau khi các mô này
chịu các xử lý đặc biệt đem lại sự cảm ứng khả năng tạo phôi. Người ta đã thực hiện
nhiều nghiên cứu trên nhiều loại thực vật ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau để quan
sát khả năng tạo thành mô sẹo.
23

2.5.4 Những nhân tố ảnh hưởng đến sự hình thành phôi vô tính
Việc cảm ứng tạo phôi vô tính là một trong những công việc khá mới mẻ và rất
khó khăn. Để đạt được hiệu quả cao và thành công, việc tìm hiểu các điều kiện sinh lý,
hóa học tác động đến sự hình thành phôi là một công việc rất quan trọng.

 Mẫu cấy
Mỗi loại mẫu cấy có những khả năng cảm ứng tạo phôi khác nhau. Sự lựa chọn
mẫu cấy rất khắc khe, ví dụ, nhiều loài một lá mầm đòi hỏi mẫu cấy phải ở một giai
đoạn cụ thể nào đó của hợp tử phôi non thì mới hình thành mô sẹo từ đó tạo phôi vô
tính. Những bộ phận thích hợp được sử dụng để nuôi cấy tạo phôi Asparagus
officinalis, Lilium như chồi đỉnh, cuống lá, lóng thân, mầm, phôi chưa trưởng thành,
còn những bộ phận khác thì hiệu quả tạo phôi rất thấp (Hisato Kunitake, 1998).

 Môi trường nuôi cấy
Gần 70% nghiên cứu thành công đều nhờ vào sử dụng môi trường MS với hàm
lượng muối khoáng cơ bản (Ammirato, 1983; Litz và Gray, 1992; Thorpe, 1988). Lý
do vì môi trường này có chứa hàm lượng muối nitrat và ammonia cao. Tỉ lệ giữa muối
nitrat và ammonia trong môi trường rất quan trọng trong việc cảm ứng tạo phôi
(Niedz, 1993, 1994). Polyamine trong môi trường dinh dưỡng có hiệu quả kích thích
đến việc hình thành phôi vô tính (Minocha và Minocha, 1995). Những chất hữu cơ
khác như nước dừa, casein thủy phân, tinh chất mạch nha (malt extract)… ở những

nồng độ khác nhau cũng được sử dụng và đã cho thấy có nhiều ảnh hưởng đến cảm
ứng tạo phôi ở một số loài thực vật. Bên cạnh đó cũng đã có những đề nghị về vai trò
của nitrogen, amino acid, amid, cũng như của kali, photphat đến sự hình thành phôi(
Tisserat và cộng sự, 1979; Ammirato, 1983).

 Nguồn cacbohydrate
Sucrose là một nguồn cacbon chính trong môi trường nuôi cấy. Tuy nhiên trong
một vài trường hợp, galactose (Cabasson và cộng sự, 1997), lactose (Jumin và Nato,
1995), maltose (Dhir và Yavada, 1995), glucose và fructose (Canhoto và Cruz, 1994)
24

và manitol (Kunitake và cộng sự, 1991) khi kết hợp với sucrose đã đẩy mạnh sự cảm
ứng tạo phôi cũng như sự phát sinh hình thái bình thường của phôi.

 Chất điều hòa tăng trưởng
Chất điều hòa tăng trưởng được chia làm 5 nhóm chính là auxin, cytokinin, acid
abscisic, gibberellin, ethylen. Các chất điều hòa tăng trưởng là tối cần thiết cho việc
cảm ứng tạo phôi và mỗi chất điều hòa tăng trưởng thì lại có những tác dụng lên việc
tạo phôi khác nhau trên những loài thực vật khác nhau và ở những nồng độ khác nhau.
Quá trình cảm ứng hình thành phôi vô tính ở những loài thực vật khác nhau cho thấy
có 3 kiểu ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng đối với phôi:
1) Sự hiện diện của chất điều hòa tăng trưởng là cần thiết trong tất cả các giai
đoạn phát triển cuả phôi
2) Chất điều hòa tăng trưởng cần thiết trong giai đoạn cảm ứng, tuy nhiên, sang
đến giai đoạn phát triển cao hơn thì các chất điều hòa này cẩn phải được loại
bỏ
3) Sự hình thành phôi vô tính chỉ xuất hiện khi có sự có mặt của chất điều hòa
tăng trưởng, nhưng khi phôi vô tính phát triển sau giai đoạn hình cầu thì sự
có mặt của chất điều hòa không còn tác dụng nữa.
Chất điều hòa tăng trưởng là auxin, thường là 2,4-D và NAA được sử dụng

trong hơn 50% và 25% trường hợp cảm ứng tạo phôi (Evans và cộng sự, 1983; Litz và
Gray, 1992). Có những sự khác biệt ở mức tế bào và mức độ phôi trong hoạt động
phân chia tế bào của các tế bào phôi vô tính và tế bào mô sẹo, cũng như là những sự
khác biệt trong sự phát triển hình thái của phôi vô tính được cảm ứng trên những chất
auxin khác nhau ( Rodrigeuz và Wetztein, 1998). Auxin được chứng tỏ cho thấy có
một tác dụng tích cực khi được sử dụng kết hợp với cytokinin và TDZ. Tuy nhiên ở
nồng độ auxin cao thường hạn chế sự phát triển của phôi vô tính trong những giai đoạn
đầu tiên của sự phát triển phôi.
Cytokinin cũng có những tác dụng tương đối lên sự hình thành phôi, nhưng nó
không có những tác dụng đáng kể. Mặc dù vậy, sự kết hợp của cả auxin và cytokinin
cho thấy nhiều thuận lợi để đạt được hiệu quả cảm ứng phôi tối đa trên một số loài
(Cruz và cộng sự, 1990; Nishi, 1997). Tuy nhiên hiện nay, đã có nhiều nghiên cứu sự
25

dụng TDZ, chất điều hòa tăng trưởng thuộc nhóm cytokinin, nhằm mục đích cảm ứng
tạo phôi vô tính ở một số thực vật hai lá mầm (Murthy và cộng sự, 1998). Vì vậy trong
những năm gần đây việc sử dụng TDZ đã trở nên phổ biến.
Môi trường không có hormone thường được sử dụng cho sự phát triển của phôi
vô tính từ dạng hình cầu cho tới khi phát triển thành cây con. Đôi khi, những nồng độ
thấp của hormone trong môi trường cần cho sự biểu hiện hoặc trong môi trường cần
cho sự phát triển thì có thể có lợi, thậm chí là bắt buộc phải có, tùy theo loài, để kích
thích sự phát triển bình thường của phôi.
Tóm lại, để cảm ứng tạo một cấu trúc lưỡng cực cần phải có tín hiệu của một
loại hormone. Ngược lại, để cảm ứng tạo cơ quan thì phải có hai tín hiệu hormone
khác nhau: đầu tiên là tạo chồi, sau đó tạo rễ, sử dụng hai môi trường khác nhau. Để
những tế bào phôi phát triển bình thường thành những cây con thì cần một môi trường
khác, có hoặc không có hormone.

 Thời gian xử lý
Khoảng thời gian mẫu cấy được xử lý với chất điều hòa tăng trưởng là một

nhân tố quan trọng trong việc cảm ứng cũng như hình thành phôi vô tính một cách
bình thường. Khi mẫu cấy được chuyển sang môi trường không có nhân tố tăng
trưởng, một khoảng thời gian tối thiểu là 8 ngày rất cần thiết cho việc cảm ứng hình
thành phôi với một hiệu quả rất cao mà không cần quan tâm đến dạng chất điều hòa
tăng trưởng đã sử dụng.

 Sự tương quan gữa độ tuổi của mẫu cấy và sucrose
Thường thì độ tuổi (Wetzstein và cộng sự, 1989) hay giai đoạn phát triển của
mẫu cấy (Karunaratne và cộng sự, 1991) là một nhân tố quan trọng trong cảm ứng tạo
phôi. Do đó, sự phát triển tối đa hay độ tuổi sinh lý của mẫu cấy là một nhân tố chủ
yếu trongcảm ứng tạo phôi có hiệu quả ở một số loài thực vật. Hơn nữa, nguồn dinh
dưỡng cơ bản cần thiết (sucrose/cacbonhydrate) cho các loại mô thì khác nhau đáng kể
tùy vào độ tuồi phát triển (Monnier, 1990). Bên cạnh đó, sự ảnh hưởng của các chất
kích thích tăng trưởng khác nhau đến các loại mô khác nhau thì phụ thuộc nhiều vào
nồgn độ sucrose có trong môi trường nuôi cấy (Thompson và Thorpe, 1987). Một