BÁO CÁO KHCN: NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT LAI TẠI CHỖ GẮN HAI MÀU (Dual-ISH) BẰNG MÁY NHUỘM HÓA MÔ MIỄN DỊCH PHÁT HIỆN SỰ KHUẾCH ĐẠI GEN HER2 TRONG UNG THƯ BIỂU MÔ TUYẾN VÚ

UBND TỈNH THỪA THIÊN HUẾ
SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

ĐẠI HỌC HUẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC

BÁO CÁO KHOA HỌC
KẾT QUẢ ĐỀ TÀI KHCN CẤP TỈNH

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT LAI TẠI CHỖ
GẮN HAI MÀU (Dual-ISH) BẰNG MÁY NHUỘM HĨA
MƠ MIỄN DỊCH PHÁT HIỆN SỰ KHUẾCH ĐẠI GEN
HER2 TRONG UNG THƯ BIỂU MƠ TUYẾN VÚ
Mã số: TTH-2016-KC.12

Cơ quan chủ trì đề tài:
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC - ĐẠI HỌC HUẾ
Chủ nhiệm đề tài:
PGS.TS. ĐẶNG CÔNG THUẬN

Huế, tháng 8 năm 2019



1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư vú (UTV) là loại ung thư thường gặp nhất và là một trong
những nguyên nhân chính gây tử vong do ung thư ở phụ nữ trên toàn thế
giới cũng như tại Việt Nam.
Tỷ lệ mắc bệnh UTV có xu hướng tăng trên tồn thế giới nhưng tỷ lệ

tử vong vẫn từng bước giảm dần nhờ những thành tựu đạt được trong
phòng bệnh, phát hiện sớm, chẩn đoán và điều trị.
HER2 (thụ thể yếu tố phát triển biểu bì người, Human Epidermal
Receptor) là một trong bốn thành viên của họ các thụ thể yếu tố phát
triển biểu mô (Epithelial Growth Factor Receptor, EGFR). Chúng là các
thụ thể tyrosine kinase xuyên màng có liên quan chặt chẽ với nhau. Các
thụ thể tyrosine kinase giữ vai trò quan trọng trong điều hịa dẫn truyền
tín hiệu của yếu tố tăng trưởng. Sự rối loạn hoạt động của chúng sẽ ảnh
hưởng lên các quá trình tế bào như tăng sinh, tân sinh mạch máu, chu kỳ
tế bào, sự sống sót và quá trình tế bào chết theo chương trình làm cho tế
bào trở nên ác tính.
Nhiều nghiên cứu đã cho thấy có khoảng 25-30% số bệnh nhân UTV
có khuếch đại gen HER2, một tiền gen nằm trên nhánh q của nhiễm sắc
thể thứ 17, dẫn đến biểu hiện quá mức thụ thể HER2 và điều này có liên
quan mật thiết đến diễn tiến xâm lấn và tiên lượng xấu trên lâm sàng,
bao gồm nguy cơ cao của tái phát, di căn, phát triển nhanh của khối u và
thời gian sống thêm của bệnh nhân giảm đi.
Ứng dụng lâm sàng quan trọng nhất của xét nghiệm HER2 là lựa
chọn bệnh nhân cho việc điều trị đích bằng trastuzumab (Herceptin) một loại kháng thể đơn dòng. Herceptin đã được Uỷ ban thuốc và thực
phẩm Hoa Kỳ (FDA) chấp nhận dùng điều trị UTV giai đoạn muộn có
HER2 dương tính từ năm 1997.
Để xác định tình trạng HER2, kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang
(Fluorescent insitu hybridization - FISH) được xem như là tiêu chuẩn
vàng. Tuy nhiên, phương pháp này địi hỏi phải có kính hiển vi huỳnh
quang trong phịng xét nghiệm chun biệt, hơn nữa là các tiêu bản
huỳnh quang không thể lưu trữ được lâu dài để xem xét lại vì tín hiệu
huỳnh quang sẽ mất dần và giá thành xét nghiệm khá đắt.
Hiện nay, kỹ thuật lai tại chỗ gắn hai màu (Dual-ISH) bằng cách gắn
enzym có thể thay thế được kỹ thuật FISH để đánh giá cả sự khuếch đại
gen HER2 và của nhiễm sắc thể 17 trên cùng một tiêu bản. Phương pháp

2

này khắc phục được các nhược điểm của FISH. Tháng 6 năm 2011, FDA
đã cấp phép sử dụng kỹ thuật xét nghiệm Dual-ISH để xác định tình
trạng khuếch đại của gen HER2 trong UTV. Kỹ thuật này đã và đang
được sử dụng ngày càng rộng rãi trên thế giới.
Do kỹ thuật Dual-ISH là một kỹ thuật hiện đại và được phép sử dụng
trong thực hành lâm sàng từ năm 2011 nên chưa được đầu tư, triển khai
thực hiện rộng rãi ở Việt Nam.
Nhằm mục đích triển khai kỹ thuật chẩn đoán mới để phát hiện sự
khuếch đại gen HER2 trong UTV tại khu vực Miền Trung - Tây Nguyên
và góp phần nâng cao chất lượng điều trị đích phân tử và cải thiện tiên
lượng bệnh UTV trong khu vực; chúng tôi thực hiện đề tài này nhằm 2
mục tiêu sau:
1- Hồn thiện quy trình kỹ thuật lai tại chỗ gắn hai màu để phát hiện
sự khuếch đại gen HER2 trong ung thư biểu mô tuyến vú tại Bệnh viện
Trường Đại học Y Dược Huế
2- Xác định sự khuếch đại gen HER2 bằng kỹ thuật lai tại chỗ gắn
hai màu, mối liên quan với sự biểu lộ protein HER2, tình trạng thụ
thể nội tiết và các yếu tố tiên lượng kinh điển trong ung thư biểu mơ
tuyến vú.
Tính mới, tính độc đáo, tính sáng tạo của đề tài:
Đây là nghiên cứu đầu tiên ở miền Trung - Tây Nguyên áp dụng
kỹ thuật Dual-ISH để phát hiện sự khuếch đại gen HER2 trong UTV
với số lượng mẫu khá lớn.
Kỹ thuật này sẽ là minh chứng cho tính sáng tạo, năng động của
đội ngũ giảng viên, kỹ thuật viên của Trường ĐHYD Huế luôn đi đầu
trong ứng dụng công nghệ mới, kỹ thuật hiện đại trong đào tạo, chẩn

đoán và điều trị.
Nghiên cứu này cũng sẽ là minh chứng rằng việc ứng dụng kỹ
thuật Dual-ISH để phát hiện sự khuếch đại gen HER2 sẽ cho kết quả
khách quan hơn, thuận tiện hơn và giá thành thấp hơn so với kỹ thuật
FISH nên sẽ là lựa chọn hàng đầu cho các cơ sở y tế muốn áp dụng
kỹ thuật lai tại chỗ trong tương lai.
Kết quả nghiên cứu này có thể được chuyển giao, áp dụng cho các
bệnh viện tuyến Trung ương, tuyến Tỉnh nhằm nâng cao năng lực
chẩn đoán, phát hiện sự khuếch đại gen HER2 và lựa chọn bệnh nhân
cho việc điều trị đích phân tử, góp phần cải thiện chất lượng sống và
tiên lượng bệnh cho bệnh nhân UTV.


3

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. DỊCH TỄ HỌC VÀ YẾU TỐ NGUY CƠ BỆNH UTV
1.1.1. Dịch tễ học
Tại Việt Nam, theo ghi nhận ung thư giai đoạn 2001-2004, tỷ lệ mắc
UTV ở các tỉnh miền Bắc là 19,6/100.000 dân, đứng đầu trong các loại
ung thư ở nữ và ở các tỉnh phía Nam là 16,3/100.000 đứng hàng thứ 2
sau ung thư cổ tử cung. Cụ thể tỷ lệ mắc UTV chuẩn theo tuổi ở Hà Nội
là 29,7/100.000, tại Thừa Thiên Huế là 9,4/100.000, tại TP Hồ Chí Minh
năm 2003 là 19,4/100.000. Theo Nguyễn Bá Đức nhìn chung tỷ lệ mắc
UTV ở Việt Nam từ 2001-2007 có xu hướng tăng rõ.
1.1.2. Yếu tố nguy cơ:
Các yếu tố nguy cơ của UTV nhìn chung được chia thành 2 loại: những
yếu tố nguy cơ có thể kiểm sốt được và những yếu tố nguy cơ khơng
kiểm sốt được.
1.1.2.1. Một số yếu tố nguy cơ khơng kiểm sốt được:

- Giới nữ: Nữ giới có nguy cao mắc bệnh UTV gấp hơn 100 lần so
với nam giới.
- Tuổi cao: Hầu hết các trường hợp UTV được phát hiện ở phụ nữ
trên 55 tuổi.
- Gen: Khoảng 5-10% UTV liên quan tới gen.
- Chủng tộc: Phụ nữ da trắng có tỷ lệ mắc UTV cao hơn phụ nữ Mỹ
gốc Phi. Tỷ lệ mắc và chết vì UTV ở phụ nữ châu Á, Tây Ban Nha
thường thấp hơn.
- Tiền sử bản thân hay gia đình mắc UTV: Người có mẹ hoặc chị em
gái ruột mắc bệnh UTV có nguy cơ mắc bệnh UTV gấp hai lần phụ nữ
khơng có tiền sử gia đình.
- Mơ vú đặc: Phụ nữ có vú với tỷ lệ mơ tuyến và mơ sợi nhiều, ít mơ
mỡ có nguy cơ gấp 1,5-2 lần người có mật độ vú trung bình.
- Bệnh vú lành tính: Phụ nữ có u tăng sản biểu mơ khơng điển hình
có nguy cơ mắc bệnh UTV cao hơn 4 - 5 lần so với những người khơng
có sự thay đổi tăng sinh ở vú.
- Tuổi có kinh lần đầu sớm (đặc biệt trước 12 tuổi) và mãn kinh chậm
(sau 55 tuổi) làm tăng nguy cơ UTV hơn do thời gian tiếp xúc với
estrogen, progesterone dài hơn.
- Nhiễm xạ khi <40 tuổi (khi tuyến vú còn đang phát triển) làm tăng
tỷ lệ mắc UTV.
- Sử dụng thuốc Diethyl-stibestrol (DES): được dùng ngừa sẩy thai.
1.1.2.2. Một số yếu tố có thể kiểm soát:


4

- Rượu: Những người uống 2-3 ly rượu hàng ngày tăng nguy cơ mắc
UTV lên 20%.
- Thừa cân và béo phì trước mãn kinh làm tăng nguy cơ mắc UTV típ

bộ ba âm tính.
- Ít vận động: Có thể liên quan tới cân nặng, nhiễm trùng hoặc thay
đổi hc mơn...
- Khơng có con hoặc có con muộn (sau 30 tuổi).
- Không nuôi con bằng sữa mẹ: Cho con bú 1-2 năm sau sinh làm
giảm nguy cơ UTV.
- Thuốc tránh thai và liệu pháp thay thế hormone sau mãn kinh.
1.2. PHÂN LOẠI, PHÂN ĐỘ, GIAI ĐOẠN UNG THƯ VÚ
1.2.1. Phân loại ung thư biểu mô tuyến vú
Kể từ phân loại mô bệnh học đầu tiên của WHO năm 1968, đến nay
đã có nhiều bản sửa đổi và bổ sung. Mới đây năm 2012, ấn bản lần 4 của
WHO về hệ thống phân loại mơ bệnh học UTV có nhiều điểm thay đổi
và bổ sung quan trọng.
1.2.2. Phân độ mô học ung thư biểu mô tuyến vú
Từ những ngày đầu nghiên cứu về bệnh học vi thể, người ta đã nhận
ra rằng, những u ác tính có sự khác nhau về mức độ ác tính và điều này
được biểu hiện trên hình thái (Hanseman 1890 và Dennis 1891).
Bảng 1.2. Đánh giá độ mô học UTBM ống xâm nhập theo hệ thống
phân độ Scaff-Bloom-Richardson (SBR) cải biên [13]
Đặc điểm
Điểm
Sự tạo ống
Chiếm đa số của u (>75%)
1
Mức độ trung gian (10-75%)
2
Ít hoặc khơng (<10%)
3
Sự đa hình thái của nhân
Các tế bào đồng nhất, đều đặn, nhỏ

1
Gia tăng kích thước và biến đổi mức độ vừa
2
Biến đổi rõ rệt
3
Nhân chia (10 vi trường độ phóng đại lớn)
0-5
1
6-10
2
>11
3
Theo cách đánh giá của Elston, độ của u phụ thuộc vào tổng số điểm
được tính:
- Độ 1: 3-5 điểm, biệt hóa cao


5

- Độ 2: 6-7 điểm, biệt hóa vừa
- Độ 3: 8-9 điểm, biệt hóa kém
Hiện nay, hầu hết các cơ sở y tế trong nước đều phân độ mô học trong
chẩn đốn UTV.
1.2.3. Phân loại theo TNM và xếp nhóm giai đoạn
1.2.3.1. Phân loại theo TNM (TCYTTG 2003)
1.2.3.2. Xếp giai đoạn theo Tổ chức Y tế Thế giới 2003
1.3. HÓA MƠ MIỄN DỊCH VÀ HER2 TRONG UNG THƯ VÚ
1.3.1. Hóa mô miễn dịch trong ung thư vú
Trong thời gian gần đây, nhiều dấu chứng sinh học của tế bào u đã
được đề nghị sử dụng để bổ sung vào vào danh sách các yếu tố dự đoán

tiên lượng cũng như dự đoán đáp ứng hoá trị cho bệnh nhân UTV.
1.3.2. Gen Her-2/neu (c-erbB-2) trong ung thư vú
Sản phẩm của Her-2/neu là một loại glycoprotein thuộc màng tế bào
trong họ thụ thể của yếu tố phát triển thượng bì, được tổng hợp từ protooncogen Her-2/neu nằm tại vị trí 21 trên nhánh dài nhiễm sắc thể 17 (ký
hiệu 17q21).
Protein c-erbB-2 là sản phẩm của gen Her-2/neu, có trọng lượng
phân tử 185kd, được biểu hiện ở mức độ thấp ở các tế bào biểu mô và cơ
biểu mô của mô tuyến vú bình thường. Bên cạnh chức năng là một thụ
thể của yếu tố phát triển thượng bì, Her-2/neu cịn có vai trị quan trọng
trong các cơ chế biệt hố tế bào, sự kết dính và di chuyển của tế bào, vì
vậy có thể góp phần vào vào khả năng xâm lấn và di căn của tế bào ung
thư.
Hầu hết các nghiên cứu về vai trò của Her-2/neu trong UTV đều dựa
vào mức độ biểu hiện của sản phẩm gen Her-2/neu bằng phương pháp
HMMD. Một số nghiên cứu khác dựa vào sự khuếch đại gen và nhận
thấy rằng sự gia tăng số lượng bản sao của gen Her-2/neu có liên quan
với tăng mức độ biểu hiện của sản phẩm protein. Có khoảng 20-30% các
trường hợp ung thư biểu mô tuyến vú xâm lấn có sự biểu hiện quá mức
của Her-2/neu.
Trong 48 nghiên cứu về vai trò tiên lượng của Her-2/neu thực hiện ở
15.000 bệnh nhân UTV, đa số nghiên cứu đều kết luận rằng sự khuếch
đại gen hoặc sự biểu hiện quá mức của Her-2/neu có liên quan với tiên
lượng xấu, nhất là ở bệnh nhân UTV có di căn hạch.
Ở Châu Á, tháng 1 năm 2016, Tang MC và cộng sự của Đại học Y
Hồng Kông đã công bố một nghiên cứu trên 99 bệnh nhân UTBM vú
xâm nhập cho thấy tỷ lệ khuếch đại gen HER2 bằng kỹ thuật Dual-ISH


6

là 19,2% và tỷ lệ tương hợp với kỹ thuật FISH là 96%, phù hợp với
khuyến cáo của ASCO/CAP 2013. Tác giả kết luận rằng: Dual-ISH là
một xét nghiệm HER2 đáng tin cậy và là lựa chọn hữu ích trong UTV.
Một số nghiên cứu cho rằng mức độ biểu hiện của Her-2/neu cịn có
thể giúp dự đốn sự đáp ứng với liệu pháp nội tiết. Trong những trường
hợp UTV giai đoạn muộn, tế bào có Her-2/neu biểu hiện càng nhiều thì
đáp ứng với tamoxifen càng kém và kém hơn những trường hợp biểu
hiện Her-2/neu mức độ thấp.
1.4. NGHIÊN CỨU PHÂN NHĨM PHÂN TỬ TRONG UNG THƯ
VÚ
1.4.1. Phân nhóm phân tử ung thư vú bằng hóa mơ miễn dịch
Năm 2004, Nielsen và cs đưa ra bảng phân nhóm phân tử UTV gồm
3 nhóm phân tử, dựa vào 5 dấu ấn HMMD là thụ thể nội tiết, HER2,
CK5/6 và EGFR với tiêu chuẩn chẩn đoán cho từng typ.
Năm 2006, theo Carey và cs chia UTV thành 4 nhóm phân tử dựa vào sự
bộc lộ của các dấu ấn HMMD.
Năm 2009, Tang P, Kristin A.S, David GH đã nghiên cứu và đưa ra
một bảng phân nhóm phân tử UTV theo các tiêu chuẩn HMMD.
Năm 2010, Hsiao Y.H và cs nghiên cứu dựa trên các kiểu hình miễn
dịch.
Hội nghị UTV Quốc tế lần thứ 12 năm 2011 tại St Gallen, Thụy Sĩ đã
đưa ra bảng tiêu chuẩn phân nhóm phân tử UTV.
Năm 2013, Engstrom và cs [22] sử dụng các dấu ấn HMMD: ER, PR,
HER2, Ki67, CK5/6 và EGFR để phân nhóm phân tử UTV.
1.4.2. Các typ phân tử ung thư biểu mô tuyến vú
1.4.2.1. Typ lòng ống A và B
1.4.2.2. Typ HER2
1.4.2.3. Ung thư biểu mơ ba âm tính và typ dạng đáy
1.4.2.4. Typ lòng ống A và B lai HER2
1.4.3. Vai trò của typ phân tử trong điều trị và tiên lượng ung thư biểu

mô tuyến vú
Trong nhiều năm, khoảng 30% các bệnh nhân điều trị thất bại, do đó
cần tránh điều trị quá mức hoặc điều trị chưa đủ. Một số nghiên cứu đã
chỉ ra rằng, khi UTV được phân typ mô bệnh học và đánh giá theo các
thông số kinh điển sẽ có một tỷ lệ nhất định các bệnh nhân được điều trị
chưa chính xác. Hội nghị UTV Quốc tế lần thứ 12 năm 2011 tại St
Gallen, Thụy Sĩ đã đề cập tới phân nhóm phân tử để đi đến các khuyến
nghị về điều trị UTV, như sau: LUMA chỉ cần điều trị nội tiết đơn thuần,
trong khi đó typ LUMB có thể kết hợp điều trị nội tiết và hóa chất; typ


7

dạng đáy chỉ điều trị bằng hóa chất và typ HER2 kết hợp giữa điều trị
hóa chất và nhắm trúng đích (trastuzumab), đối với typ LAHH và LBHH
được điều trị bằng sự kết hợp giữa nội tiết, hóa chất và nhắm trúng đích.
Trong một nghiên cứu lớn, đã chỉ ra rằng các khối u dạng đáy và HER2
nhạy cảm với hóa trị bổ trợ dựa vào anthracycline hơn các typ lịng ống.
Hơn 45% khối u dạng đáy đáp ứng hồn toàn sau 12 tuần điều trị
paclitaxel tiếp theo bằng 5-fluorouracil, doxorubicin và
cyclophosphamide. Theo nghiên cứu này, các typ dạng đáy và HER2 kết
hợp với tỷ lệ đáp ứng bệnh học hồn tồn cao nhất (cả 2 là 45%) và typ
lịng ống có tỷ lệ đáp ứng thấp hơn (6%). Ở typ giống vú bình thường,
khơng có sự đáp ứng hồn toàn.
1.5. CÁC YẾU TỐ TIÊN LƯỢNG KINH ĐIỂN TRONG UNG THƯ
VÚ
1.5.1. Kích thước u
Kích thước u là một trong những yếu tố tiên lượng độc lập quan
trọng nhất, kích thước u được sử dụng là một trong các yếu tố đánh giá
giai đoạn bệnh.

Đánh giá mối liên quan giữa kích thước u với tỷ lệ sống thêm của
bệnh nhân cũng được Rosen và cộng sự (1993) nghiên cứu trên 767 bệnh
nhân UTV giai đoạn T1N0M0/T2N0M0 và cho thấy bệnh nhân UTBM
thể ống xâm nhập hoặc tiểu thuỳ xâm nhập, hạch nách âm tính, kích
thước u ≤ 1 cm thì tỷ lệ sống thêm không tái phát sau 10 năm và 20 năm
là 91% và 87%, trong khi đó với các u > 1 cm tỷ lệ này giảm xuống còn
73% và 68%. Nghiên cứu của Carter và cộng sự (1989) cho thấy kích
thước u tương quan với số lượng hạch nách.
1.5.2. Di căn hạch
Tình trạng hạch là yếu tố tiên lượng độc lập có giá trị bậc nhất trong
UTV, có nhiều bằng chứng chứng minh thời gian sống giảm khi số
lượng hạch tăng. Trong nghiên cứu lớn trên dữ liệu 24.740 trường hợp
UTV (chương trình SEER của Viện ung thư Quốc gia) đưa ra kết quả
với u kích thước < 2cm và hạch âm tính hoặc từ 1-3 hạch hoặc trên 4
hạch thì tỷ lệ sống 5 năm tương ứng là 96,3%, 87,4% và 66,0%
1.5.2.1. Hạch nách
Tình trạng hạch nách được coi là yếu tố tiên lượng quan trọng nhất
liên quan đến tỷ lệ tái phát và thời gian sống thêm. Tỷ lệ sống thêm, tái
phát, thời gian tái phát, thất bại trong điều trị đều liên quan với số lượng
hạch di căn. Tỷ lệ di căn hạch nách là khoảng 40,1% trong UTV giai
đoạn I, II; di căn hạch nách tương quan với kích thước u, độ mơ học, loại
mô học, giai đoạn bệnh [6].


8

1.5.2.2. Hạch vú trong
Các ung thư ở vị trí trung tâm và trên trong thường di căn hạch vú
trong hơn các hạch vị trí khác. Hạch vú trong ít được đánh giá nhưng di
căn vào hạch này đứng thứ hai sau di căn hạch nách và ý nghĩa tiên

lượng của nó cũng giống hạch nách. Hầu hết bệnh nhân có di căn hạch
vú trong cũng di căn hạch nách [33].
1.5.2.3. Hạch thượng địn
Di căn hạch thượng địn có tiên lượng xấu, tỷ lệ sống 5 năm sau khi
di căn hạch thượng đòn chỉ 33,6% [26].
1.5.3. Giai đoạn bệnh
Giai đoạn UTV là yếu tố tiên lượng quan trọng liên quan đến tỷ lệ
sống thêm và phương pháp điều trị. Tỷ lệ sống sau 5 năm chẩn đoán
UTV dựa trên thống kê của Hiệp hội ung thư Hoa Kỳ năm 2002 giảm
dần từ giai đoạn 0 (93%), giai đoạn I (88%), giai đoạn IIA (81%), giai
đoạn IIIA (67%) đến giai đoạn IV chỉ còn 5%; thống kê từ cơ sở dữ liệu
dựa vào số bệnh nhân chẩn đoán từ năm 2004 đến 2010, giai đoạn 0 và I
thì tỷ lệ sống sót sau 5 năm gần như 100%, giai đoạn II là 93%, giai
đoạn III là 72%, giai đoạn IV là 22% [18].
1.5.4. Độ mô học
Độ mô học là một trong những yếu tố tiên lượng quan trọng mặc dù
nó khơng được sử dụng như một thông số để đánh giá giai đoạn ung thư.
Có nhiều hệ thống phân độ mơ học nhưng hiện nay phân độ của Scarff –
Bloom – Richardson, sửa đổi bởi Elston và Ellis được đánh giá là có
hiệu quả nổi bật trong tiên lượng bệnh, được áp dụng rộng rãi. Đây có
thể coi là một yếu tố tiên lượng độc lập. Nghiên cứu trên 1244 trường
hợp UTV, Shetty đưa ra kết quả UTV có độ mơ học I thì tỷ lệ hạch
dương tính 3%, độ mơ học II và III là 11% và 19%[8].
1.5.5. Các yếu tố tiên lượng khác trong ung thư vú
1.5.5.1. Tuổi phát hiện
1.5.5.2. Loại mô học
1.6. CÁC XÉT NGHIỆM XÁC ĐỊNH PROTEIN HER2 VÀ GEN
HER2
1.6.1. Hóa mơ miễn dịch
Kỹ thuật này cho phép quan sát được sự hiện diện của kháng nguyên

(KN) trên tế bào và mơ, nhờ đó có thể đánh giá được cả về hình thái học
và kiểu hình miễn dịch của tế bào u. Ngồi ra, HMMD cịn giúp xác định
sự biểu lộ của các dấu ấn KN quan trọng trên tế bào u, giúp lựa chọn
phương pháp điều trị thích hợp, đặc biệt là liệu pháp điều trị nhắm trúng
đích (target therapy), đồng thời giúp tiên lượng bệnh nhân tốt hơn...


9

Theo hướng dẫn của ASCO/CAP 2007 và 2013, để lựa chọn bệnh
nhân điều trị đích phân tử với trastuzumab (Herceptin), nhóm có kết quả
HER2 (2+) cần xác định lại những trường hợp có khuếch đại gen HER2
mới là nhóm đích, cịn lại những trường hợp khơng có khuếch đại gen
thì khơng phải là nhóm đích của điều trị đích phân tử trong UTV [60].
1.6.2. Lai tại chỗ huỳnh quang (FISH- Fluorescent In Situ
Hybridization)
FISH sẽ phát hiện số lượng các bản sao gen HER2 trong tế bào ung
thư. FISH là một phương pháp nhạy và đặc hiệu, xác định số bản sao
gen HER2 thường kết hợp và xác định số bản sao trung đoạn trên nhiễm
sắc thể 17 (CEP17). Kỹ thuật FISH cũng sử dụng mẫu mô vùi nến, được
cố định bằng formol và lát cắt chuẩn 4 đến 5μm. Kết quả phép lai này
thường được biểu diễn dưới hai dạng là dương tính và âm tính, tương
đương với việc có sự khuếch đại của gen HER2 hay không. Nếu lượng
gen HER2 càng nhiều thì nguy cơ các tế bào UTV phát triển càng mạnh.
Hiện nay, FISH có 3 hạn chế: phải có kính hiển vi huỳnh quang. Thứ
hai, tiêu bản FISH khơng thể lưu được lâu do sự thối hóa của các tín
hiệu huỳnh quang. Cuối cùng, kính hiển vi huỳnh quang giới hạn khả
năng quan sát cấu trúc của mô và đánh giá sự xâm nhập.
1.6.3. Kỹ thuật lai tại chỗ gắn màu (Chromogenic In Situ
Hybridization, CISH)

Kỹ thuật này tương đương với phép lai FISH, là kỹ thuật cải tiến của
phương pháp FISH, nó phát hiện việc có quá nhiều bản sao gen HER2
trong tế bào ung thư. Kỹ thuật mới sử dụng peroxidase enzyme để phát
hiện nhiễm sắc thể thay vì sử dụng huỳnh quang, cho phép đọc kết quả
bằng kính hiển quang học thơng thường. Như vậy, hình thái, đặc điểm
mơ bệnh học của tiêu bản có thể được đánh giá song song. Hơn nữa, tín
hiệu khơng phân hủy theo thời gian [38]. Kết quả của xét nghiệm thường
được ghi dưới dạng âm tính (khơng có sự khuếch đại gen HER2) và
dương tính (có sự khuếch đại gen HER2).
CISH để phát hiện khuếch đại gen HER2. Có 2 loại CISH:
+ CISH tiêu chuẩn: chỉ dùng một đầu dò HER2.
+ CISH hai màu (dual-color CISH: dc-CISH), sử dụng một đầu dò
HER2 và một đầu dò CEP17.
1.6.4. Xét nghiệm lai tại chỗ gắn hai màu DISH (Dual In Situ
Hybridization)
Tương tự như hai xét nghiệm ở trên, xét nghiệm này phát hiện sự
khuếch đại của gen HER2 và cũng được trả lời dưới dạng kết quả
khuếch đại và không khuếch đại.


10

Thực chất DISH chính là kỹ thuật CISH hai màu nhưng đầu dò
HER2 được gắn bạc nên sẽ nhuộm màu đen trong khi đầu dò CEP17
nhuộm màu đỏ. Kỹ thuật này thực hiện nhanh và dễ dàng hơn so với
FISH, cần một kính hiển vi quang học, làm cho nó đặc biệt phù hợp
với thói quen sử dụng trong các phịng thí nghiệm.
Kỹ thuật DISH có các ưu điểm sau so với kỹ thuật FISH:
- Ưu điểm lớn nhất của phương pháp DISH là có thể đánh giá
số lượng bản sao gen HER2, CEP17 và các đặc điểm mô bệnh học

cùng một lúc vì vậy việc xác định chính xác vùng tế bào ung
thư xâm lấn dễ dàng hơn
- Các tín hiệu khơng bị phân hủy theo thời gian, do đó tiêu bản
có thể được lưu trữ trong một thời gian dài ở nhiệt độ phịng, có
thể xem xét lại khi cần thiết và có thể nhiều người khảo sát cùng lúc
dưới kính hiển vi quang học
- DISH có giá thành rẻ hơn, thời gian thực hiện ngắn hơn.
1.7. NỘI DUNG CỦA HƯỚNG DẪN VÀ KHUYẾN CÁO DÀNH
CHO XÉT NGHIỆM HER2 CỦA ASCO/CAP 2013
1.7.1. Các khuyến cáo chính cho các chuyên gia ung thư
1.7.2. Các khuyến nghị chính cho BS Giải phẫu bệnh
1.7.3. Các lưu đồ sử dụng trong xét nghiệm HER2 dành cho ung thư
vú theo hướng dẫn của ASCO/CAP 2013

Sơ đồ 1.1. Lưu đồ thực hiện xét nghiệm HER2 bằng hố mơ miễn dịch


11

XÉT NGHIỆM HER2 BẰNG Dual-ISH
Mẫu chứng bắt tín hiệu đúng

Tỉ lệ HER2/CEP17 <2

Tỉ lệ HER2/CEP17 ≥ 2

Trung bình tín hiệu
HER2≥ 4/TB

Trung bình tín hiệu

HER2<4/TB

ISH(+)

ISH(+)

Trung bình tín hiệu
HER2 ≥ 6/TB

Trung bình tín hiệu
HER2 ≥4 và <6/TB

ISH(+)

ISH(-/+)

Trung bình tín hiệu
HER2 <4/TB

ISH(-)

Phải thực hiện IHC trên cùng mẫu, xét nghiệm ISH thay
thế hoặc mẫu mới (IHC hoặc ISH)

Sơ đồ 1.2. Lưu đồ xét nghiệm lai tại chỗ gắn hai màu (đoạn dò kép)
1.8. THUỐC ĐIỀU TRỊ ĐÍCH VÀ HĨA TRỊ BỔ TRỢ TRONG
UNG THƯ VÚ CĨ THỤ THỂ HER2 DƯƠNG TÍNH
1.8.1. Liệu pháp điều trị đích trong ung thư vú
1.8.1.1. Khái niệm về điều trị đích
1.8.1.2. Phân nhóm thuốc điều trị đích

1.8.1.3. Các thuốc điều trị đích trong ung thư vú
-Trastuzumab (Herceptin): Đây là một kháng thể đơn dịng. Nó
thường được phối hợp cùng với hóa chất, nhưng nó cũng có thể được sử
dụng đơn độc Trastuzumab có thể được sử dụng để điều trị cả UTV ở
giai đoạn sớm và giai đoạn muộn. Khi bắt đầu trước hoặc sau phẫu thuật
để điều trị UTV giai đoạn sớm, thuốc này thường được dùng trong một
năm. Đối với UTV tiến triển, điều trị thường được dùng cho tới khi bệnh
tiến triển. Thuốc này được đưa vào tĩnh mạch.
-Pertuzumab (Perjeta): kháng thể đơn dòng này có thể được sử
dụng cùng với trastuzumab và hóa trị, trước khi phẫu thuật để điều trị
UTV giai đoạn sớm, hoặc để điều trị UTV tiến triển. Thuốc này được
dùng bằng đường tĩnh mạch.
-Ado-trastuzumab emtansine (Kadcyla, còn gọi là TDM-1): Đây
là một kháng thể đơn dòng gắn liền với một loại thuốc hóa trị liệu. Nó


12

được sử dụng để điều trị UTV tiến triển ở những phụ nữ đã được điều trị
bằng trastuzumab và hóa trị. Thuốc này cũng được cho trong tĩnh mạch.
-Lapatinib (Tykerb): Đây là chất ức chế kinase. Dùng bằng đường
uống. Lapatinib được sử dụng để điều trị UTV tiến triển, và có thể được
sử dụng cùng với một số loại thuốc hóa trị liệu, trastuzumab hoặc thuốc
nội tiết.
-Neratinib (Nerlynx): Đây là một chất ức chế kinase. Dùng bằng
đường uống. Neratinib được sử dụng để điều trị UTV giai đoạn sớm sau
khi một người phụ nữ đã hoàn thành một năm trastuzumab và thường
được cho một năm. Một số thử nghiệm lâm sàng cho thấy nó cũng có thể
có hiệu quả trong UTV tiến triển.
Trong các thuốc điều trị nhắm trúng đích kể trên, Trastuzumab là

thuốc đầu tiên được FDA cho phép áp ụng trong UTV có thụ thể Her2
dương tính vào năm 1998. Những tác nhân khác như pertuzumab,
lapatibin không cho thấy tác dụng miễn dịch đối với cơ chế đề kháng và
tác dụng phụ đáng kể đối với bệnh nhân.
1.8.2. Hóa trị bổ trợ trong ung thư vú có thụ thể her2 +
1.8.2.1. Các thử nghiệm bổ trợ trong trong ung thư vú có thụ thể HER2+
- Thử nghiệm NSABP-B31 và NCCTG N9831
- Thử nghiệm BCIRG 006
- Nghiên cứu Hera
- Nghiên cứu FinHer
- Thử nghiệm PACS04
Chương 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu là 100 bệnh nhân đến khám và điều trị UTV tại
Bệnh viện Trường Đại học Y Dược Huế và Bệnh viện Trung ương Huế
từ tháng 03 năm 2017 đến tháng 06 năm 2018.
2.1.1. Tiêu chuẩn chọn bệnh
- Có khối u tuyến vú với các triệu chứng nghi ngờ UTV khi khám
lâm sàng
- Có các đặc điểm nghi ngờ UTV trên hình ảnh siêu âm, chụp hình vú
- Có kết quả tế bào học hoặc mô bệnh học mảnh sinh thiết trước mổ
là UTBM tuyến vú.
2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ
- Bệnh nhân được chẩn đoán MBH sau phẫu thuật là UTV tại chỗ
- Bệnh nhân UTV xâm nhập nhưng khơng có chỉ định phẫu thuật
(quá giai đoạn phẫu thuật)


13

- Bệnh nhân UTV đã điều trị trước đó (phẫu thuật, xạ trị, hóa trị...)
2.1.3. Cỡ mẫu:
Trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn mẫu thuận tiện với số lượng là
100 bệnh nhân, lấy trong thời gian 16 tháng, từ tháng 3/2017 đến tháng
6/2018
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu
- Nghiên cứu mô tả cắt ngang
2.2.2. Các bước tiến hành nghiên cứu
- Chọn đối tượng nghiên cứu
- Ghi nhận các dữ kiện hành chính, bệnh sử và triệu chứng lâm sàng
- Siêu âm vú, chụp hình vú, xét nghiệm tế bào học, sinh thiết để xét
nghiệm mô bệnh học và ghi nhận kết quả
- Phẫu tích bệnh phẩm UTV sau phẫu thuật, đánh giá và ghi nhận
kích thước u, độ mơ học, phân loại mơ bệnh học, tình trạng di căn hạch
nách, phân loại TNM và phân giai đoạn bệnh
- Xét nghiệm các dấu ấn miễn dịch ER, PR, Ki67 và HER2 bằng kỹ
thuật HMMD
- Thực hiện thử nghiệm kỹ thuật lai tại chỗ gắn hai màu cho một số
trường hợp UTV có HER2 âm tính, dương tính (2+) và (3+)
- Điều chỉnh thời gian và chuẩn hóa các hóa chất, chất đệm, sinh
phẩm... thống nhất quy trình kỹ thuật chuẩn cho máy BenchMark GX
của hãng Ventana, Roche tại Bộ môn/Khoa Giải phẫu bệnh, Bệnh viện
Trường Đại học Y Dược Huế
- Tiến hành kỹ thuật lai tại chỗ gắn hai màu cho tất cả các trường hợp
UTV
- Khảo sát mối liên quan giữa sự khuếch đại gen HER2 bằng kỹ thuật
lai tại chỗ gắn hai màu với sự biểu lộ protein HER2, tình trạng thụ thể
nội tiết, phân nhóm phân tử bằng kỹ thuật HMMD và với các yếu tố tiên

lượng kinh điển
- Phân tích số liệu, viết báo cáo.
2.2.3. Các kỹ thuật sử dụng và cách đánh giá
2.2.3.1. Hồn thiện quy trình kỹ thuật lai tại chỗ gắn hai màu để phát
hiện sự khuếch đại gen HER2 trong UTBM tuyến vú
- Tham khảo quy trình chuẩn về lai tại chỗ của nhà sản xuất
- Đối chiếu các hóa chất, sinh phẩm, trang thiết bị thực tế của đơn vị
phục vụ cho kỹ thuật lai tại chỗ trên máy hiện có
- Tiến hành lai 1 tiêu bản Xenograff (Mẫu chứng của hãng, nhằm
kiểm tra sự hoạt động của máy móc và hóa chất)


14

- Tiến hành lai mẫu nghiên cứu có kết quả nhuộm HMMD với HER
âm tính, Her 2+, Her 3+ trên cùng một tiêu bản theo quy trình chuẩn,
đánh giá sau mỗi lần thực hiện, điều chỉnh thời gian của các bước dựa
trên thực tế kết quả sau mỗi lần lai, có tham khảo sự điều chỉnh của các
bệnh viện khác
- Sau khi đã điều chỉnh và hồn thiện quy trình, tiến hành lai tại chỗ
cho 20 trường hợp mẫu nghiên cứu có kết quả HMMD với HER âm tính,
Her 2+, Her 3+
- Thu thập đủ số mẫu nghiên cứu còn lại (80 trường hợp) và tiến hành
lai tại chỗ theo quy trình đã hiệu chỉnh, hồn thiện.
2.2.3.2. Kỹ thuật chọc hút tế bào bằng kim nhỏ (Fine Needle Aspiration,
FNA)
2.2.3.3. Kỹ thuật sinh thiết lõi mô vú dưới hướng dẫn siêu âm để xét
nghiệm mô bệnh học
2.2.3.4. Kỹ thuật xử lý bệnh phẩm để chẩn đốn mơ bệnh học sau phẫu
thuật

2.2.3.5. Kỹ thuật hóa mơ miễn dịch [3]:
Ngun tắc kỹ thuật của xét nghiệm HMMD:
Thời gian nhuộm trong máy là 6 giờ.
Đánh giá kết quả nhuộm HMMD theo tiêu chuẩn của nhà sản xuất
như sau:
Tiêu bản chứng:
- Mẫu chứng dương: Là các tiêu bản UTV đã được biết trước đó là
dương cho mỗi dấu ấn sinh học. Mỗi dấu ấn sinh học đều có mẫu chứng
dương riêng.
- Mẫu chứng âm: Cũng là mẫu UTV xâm lấn dùng cho chứng dương,
tuy nhiên không cho ủ với kháng thể thứ nhất.
* Cách đánh giá các dấu ấn sinh học trên tiêu bản HMMD:
- Đánh giá ER, PR:
+ Cách nhuộm màu: Nhuộm nhân tế bào.
+ Cách đánh giá: theo thang điểm Allred, bảng 2.1 [3
Phản ứng dương tính khi tổng điểm ≥2
Âm tính <2 điểm
1+: 2-4 điểm
2+: 5-6 điểm 3+:7-8 điểm
- Đánh giá biểu hiện chỉ số phân bào Ki67:
+ Cách nhuộm màu: nhân tế bào u bắt màu nâu
+ Cách đánh giá: thấp (<14%), cao (≥14%)
- Đánh giá thụ thể HER2 trên tiêu bản HMMD:
+ Cách nhuộm màu: nhuộm màng tế bào
+ Cách đánh giá:


15

Âm tính

0: màng tế bào u xâm lấn khơng bắt màu.
1(+): màng tế bào u xâm lấn bắt màu rải rác, nhạt.
Dương tính
2(+): màng tế bào u bắt màu hồn toàn, mỏng, nhạt ≥ 10% tế bào u
3(+): màng tế bào u bắt màu hoàn toàn, dày, đậm ≥ 10% tế bào u
2.2.3.6. Kỹ thuật lai tại chỗ gắn hai màu [36],[37],[38]:
Chọn mẫu mơ đã xác định có vùng UTV xâm nhập rõ, kết quả
nhuộm HER2 đã biết khi nhuộm bằng kỹ thuật HMMD.
Cắt lát mỏng, trải lên trên tiêu bản chuyên dụng cho kỹ thuật này.
Ủ tiêu bản và tiến hành quy trình lai tại chỗ.
Nguyên tắc kỹ thuật của xét nghiệm HER2 Dual ISH:
Quy trình kỹ thuật xét nghiệm INFORM HER2 Dual ISH trên máy
nhuộm tự động BenchMark, Ventana của hãng Roche.
Bảng 2.2. Hóa chất sử dụng và vai trị trong quy trình lai tại chỗ
STT
Tên hóa chất
Diễn giải vai trò
INFORM HER2
Hỗn hợp chứa đoạn dò gen HER2 và
1
DUAL ISH DNA
CEP17, bắt cặp đặc hiệu với trình tự đặc
PROBE CKTL
trưng cho gen HER2 và CEP17 tương ứng
ULTRAVIEW RED Bộ kit tạo màu đỏ, gắn đặc hiệu với đoạn
2
ISH DIG
dị CEP17 và cho phản ứng tạo tín hiệu
DETECTION KIT
màu đỏ khi quan sát dưới kính hiển vi

ULTRAVIEW SISH Bộ kit tạo màu đen, gắn đặc hiệu với đoạn
3
DNP DETECTION
dò gen HER2, và cho phản ứng tạo tín hiệu
KIT
màu đen khi quan sát dưới kính hiển vi
Dung dịch đệm tạo môi trường tối ưu cho
4
HybReady Solution
phản ứng lai của đoạn dò với gen HER2
và CEP17
Cell Conditioning
Dung dịch tiền xử lý mẫu ở màng tế bào
5
Solution (CC2)
UltraView Silver
Dung dịch rửa nghiêm ngặt sau phản ứng lai
6
Wash II
7
ISH PROTEASE 3
Enzyme dùng trong tiền xử lý mẫu ở nhân
HER2 Dual ISH 3-in- Mẫu mơ chứng
8
1
Dung dịch dầu khống bảo vệ mẫu mơ
9
LCS
khơng bị khơ trong q trình phản ứng
10

10X EZ PREP
Dung dịch khử paraffin


16

11

SOLUTION
Hematoxylin II

Dung dịch nhuộm nhân
Dung dịch làm xanh nhân sau khi nhuộm
12
BLUING REAGENT
hematoxylin II
Nguyên tắc kỹ thuật của xét nghiệm HER2 DISH:
Gen HER2 được phát hiện bằng đoạn dị có gắn dinitrophenyl (DNP)
kết hợp với kit tạo màu bạc UltraView Silver ISH DNP (SISH), cho tín
hiệu màu đen khi quan sát dưới kính hiển vi. CEP17 được phát hiện
bằng đoạn dị có gắn digoxigenin (DIG), kết hợp với kit tạo màu đỏ
UltraView Red ISH DIG Detection kit, cho tín hiệu màu đỏ khi quan sát
dưới kính hiển vi. Với quy trình sử dụng 2 đoạn dị cùng lúc kết hợp với
2 kit tạo màu khác nhau, dưới kính hiển vi quang học bác sĩ Giải phẫu
bệnh có thể dễ dàng quan sát được gen HER2 và CEP17 kết hợp với
hình thái mô học một cách dễ dàng.
* Cách đánh giá HER2 bằng kỹ thuật Dual-ISH ( theo ASCO/CAP
2013) [60]
- Không biểu hiện rõ:
HER2/CEP17 < 2 và số lượng bản sao gen HER2 ≥ 4 và < 6 tín

hiệu/TB
- Âm tính:
HER2/CEP17 < 2 và số lượng bản sao gen HER2 < 4 tín hiệu/TB
- Dương tính:
HER2/CEP17 ≥ 2 và số lượng bản sao gen HER2 ≥4 tín hiệu/tế bào
HER2/CEP17 ≥ 2 và số lượng bản sao gen HER2<4 tín hiệu/TB
HER2/CEP17 < 2 và số lượng bản sao gen HER2 ≥6 tín hiệu/TB
2.2.4. Các biến số nghiên cứu
2.2.4.1. Đặc điểm chung
- Nhóm tuổi: <30, 30-39, 40-49, 50-59, ≥60
- Tình trạng kinh nguyệt: cịn kinh nguyệt, mãn kinh/tiền mãn kinh
- Vị trí u: trái, phải, hai bên
- Định khu: ¼ trên ngồi, ¼ dưới ngồi, ¼ trên trong, ¼ dưới trong,
vùng trung tâm
2.2.4.2. Giải phẫu bệnh
- Kích thước u: ≤2cm, >2-5cm, >5cm
- Phân loại tế bào học:
+ Quá sản biểu mô tuyến không điển hình, khả năng ác tính
+ UTBM tuyến vú
- Độ mô học: độ I, độ II, độ III theo Scaff-Bloom-Richardson cải biên
- Phân loại mô học: theo phân loại WHO 2012


17

- Phân loại TNM theo UICC và AJCC (2003)
- Phân giai đoạn theo TNM: theo Tổ chức Y tế Thế giới (2003)
2.2.4.3. Hóa mơ miễn dịch, phân nhóm phân tử, kỹ thuật lai tại chỗ gắn
hai màu
- HMMD: ER, PR, HER2: (-), (+), (++), (+++); Ki-67: thấp, cao.

- Phân nhóm phân tử: phân nhóm lịng ống A, phân nhóm lịng ống
B, phân nhóm HER2, phân nhóm giống đáy; điểm cắt Ki-67 là 14%.
- Lai tại chỗ gắn hai màu: HER2: khơng khuếch đại, khuếch đại
2.2.4.4. Mối liên quan giữa tình trạng HER2 bằng kỹ thuật DISH với
HMMD, với phân nhóm phân tử và các yếu tố tiên lượng kinh điển
- Tương quan của sự khuếch đại gen HER2/DISH với sự bộc lộ thụ
thể HER2/HMMD
- Tương quan giữa phân nhóm phân tử dựa trên HMMD và lai tại chỗ
với một số yếu tố tiên lượng kinh điển
2.2.5. Xử lý số liệu
2.2.5.1. Thống kê mô tả
2.2.5.2. Khảo sát mối liên quan
Lập bảng thống kê tần suất, tỷ lệ và liên quan với mức ý nghĩa p<0,05.
2.3. ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU KHOA HỌC
Đề cương nghiên cứu của đề tài đã được hội đồng khoa học của Sở
Khoa học Công nghệ Tỉnh Thừa Thiên Huế phê duyệt.
Chương 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. HOÀN THIỆN QUY TRÌNH LAI TẠI CHỖ GẮN HAI MÀU
TRÊN MÁY BENCHMARK GX TẠI BỆNH VIỆN TRƯỜNG
ĐHYD HUẾ
3.1.1. Quy trình lai tại chỗ của nhà sản xuất khuyến cáo
Bảng 3.1. Quy trình lai tại chỗ của nhà sản xuất khuyến cáo
STT
Các bước
Thời gian
Mild
8 phút
Standard 12 phút
1

Cell Conditioning 2
Extended 8 phút
2
ISH-Protease 3
8 phút (mẫu Xenograft) 16 phút (mẫu mô)
3
Denaturation
20 phút
4
Hybridization
6 giờ
72 độ C (mẫu mô người)
5
Stringency wash
76 độ C (mẫu Xenograft)


18

6
7
8
9
10
11

SISH Multimer
Silver Chromogen
Red ISH Multimer
Red Chromogen

Counterstain
Post Counterstain

16 phút
4 phút
24 phút
8 phút
Hematoxyllin II-8 phút
Bluing Reagent-4 phút

3.1.2. Q trình chuẩn hóa các bước kỹ thuật lai tại chỗ Dual ISH
Bảng 3.2. Tóm tắt q trình chuẩn hóa các bước kỹ thuật lai tại chỗ
Dual ISH
Mẫu
Tiến
Số
Kết quả
Ngày
trình
test
Xenograff
Kết quả tốt, tín hiệu đen đỏ rõ
slide (Mẫu
nét chứng tỏ hóa chất và máy
CC2: 8chứng của
móc
hoạt
động
tốt.
12-8

hãng,
Thảo luận: Dựa trên khuyến
Protease
24/7/
nhằm để
cáo của hãng cho mẫu
2: 2 phút
1
2017 kiểm tra sự
Xenograft, Protease 2 mạnh
Stringency
hoạt động
hơn protease 3 là 4 lần vì vậy
Washs:
của máy
bộc lộ 2 phút với protease 2 sẽ
76ºC
móc và
tương đương 8 phút với
hóa chất)
protease 3.
Tín hiệu đen và đỏ rõ nét, khử
paraffin tốt, nhưng màu nhân
mờ nhạt, không phân biệt rõ
giữa các nhân.
Thảo luận: Nhờ có sự tham
CC2: 12’khảo từ các bệnh viện khác:
12’-12’
“Nếu sử dụng quy trình
Mẫu Her

Protease
khuyến cáo từ hãng thì mẫu
âm tính,
2: 6’
mô người sẽ bộc lộ không đủ
25/7/
Her 2+,
Extend
1
tốt để cho tín hiệu tối ưu” nên
2017
Her 3+
paraffin
chúng tơi đã sử dụng CC2:
trên cùng
(khử hết
12’-12’-12’, protease 2: 6’
một slide
paraffin
thay vì phải bắt đầu chạy thử
trên mẫu
nghiệm dựa trên quy trình
mơ)
khuyến cáo của hãng CC2: 8’12’-8’ và protease 3: 16’.
Màu nhân mờ nhạt là do xử lý
màng nhân hơi quá mức nên
giảm thời gian protease xuống.


19

26/7/
2017

27/7
và
28/7/
2017

Mẫu Her
âm tính,
Her 2+,
Her 3+
trên cùng
một slide

CC2: 12’12’-12’
Protease
2: 4'
Extend
paraffin

1

Kết quả tốt, tín hiệu đen và đỏ
đều rõ nét, nhân tế bào xanh,
khơng bị nhuộm nền, khử
paraffin tốt.

20 mẫu

bệnh có
Her âm
tính, Her
2+, Her 3+

CC2: 1212-12
Protease
2: 4'
Extend
paraffin

10

Kết quả: 95% số mẫu đạt yêu
cầu: bắt tín hiệu đều, đẹp, tín
hiệu đen đõ rõ nét, nhân bộc lộ
vừa đủ, khơng có tín hiệu nền.
Tuy nhiên 5% số mẫu (1 trên
20 mẫu) vẫn chưa được tối ưu,
tín hiệu vẫn chưa được rõ nét
(chủ yếu tín hiệu đỏ).
Đối với trường hợp này, sau
khi kiểm tra lại mẫu mô vẫn
đảm bảo các yêu cầu về thời
gian bảo quản, thời gian cố
định; Chúng tôi đã lấy mẫu mô
UTV vị trí khác cũng của bệnh
nhân này để tiến hành kỹ thuật
lai lần 2, cho kết quả tốt tương
tự như trên.

3.1.3. Quy trình lai tại chỗ đã được hồn thiện sau khi thử nghiệm
và tối ưu hóa
Bảng 3.3. Quy trình lai tại chỗ đã được hoàn thiện sau khi thử
nghiệm và tối ưu hóa
STT
Các bước quy trình
Thời gian
Mild
12 phút
Standard 12 phút
1
Cell Conditioning 2
Extended 12 phút
2
ISH-Protease 2
4 phút
3
Denaturation
20 phút
4
Hybridization
6 giờ
5
Stringency wash
72 độ C
6
SISH Multimer
16 phút
7

Silver Chromogen
4 phút
8
Red ISH Multimer
24 phút


20

9
10
11

Red Chromogen
Counterstain
Post Counterstain

8 phút
Hematoxyllin II-8'
Bluing Reagent-4'

3.2. CÁC ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Bệnh nhân mắc bệnh UTV trẻ nhất là 32 tuổi, bệnh nhân lớn tuổi
nhất là 91 tuổi. Tuổi phát hiện trung bình là 55,43 ± 13,12 tuổi. Nhóm
tuổi mắc bệnh cao nhất là 50-59 tuổi (33,0%) và ≥ 60 tuổi (31,0%).
Đa số bệnh nhân mắc bệnh UTV đã mãn kinh (59,0%). Vị trí tổn thương
thường ở vú phải (54,0%) và ¼ trên ngồi chiếm 53,0%.
3.3. ĐẶC ĐIỂM GIẢI PHẪU BỆNH, HĨA MƠ MIỄN DỊCH,
PHÂN NHĨM PHÂN TỬ VÀ KHUẾCH ĐẠI GEN HER2
3.3.1. Kết quả xét nghiệm tế bào học và mô bệnh học

96,0% UTBM tuyến vú được chẩn đoán đúng bằng xét nghiệm tế bào
học. Với xét nghiệm mô bệnh học, UTBM xâm nhập loại không đặc biệt
chiếm đa số (68,0%), UTBM tiểu thùy xâm nhập chiếm 15,0% là loại
mô học thường gặp thứ hai.
3.3.2. Các đặc điểm giải phẫu bệnh
Đa số UTV đến khám và điều trị khi u đã lớn, hơn 80,0% kích thước
u trên 2cm; trong đó 71,0% các trường hợp ở giai đoạn T2 (>2-5cm). Di
căn hạch nách cùng bên chiếm 60,0%; giai đoạn bệnh thường gặp là giai
đoạn II (77,0%). Độ mô học của 68 trường hợp UTBM xâm nhập loại
không đặc biệt cho thấy độ II chiếm ưu thế (66,2%).
3.3.3. Kết quả xét nghiệm HMMD ER, PR, Ki67 và HER2
Tỷ lệ ER, PR dương tính và chỉ số phân bào Ki67 cao lần lượt là
54,0%; 50,0% và 61,0%. Dương tính với HER2 trên HMMD là 31,0%;
trong đó dương tính mạnh (3+) chiếm 17,0%.
3.3.4. Kết quả lai tại chỗ gắn hai màu xác định sự khếch đại gen
HER2 và phân nhóm phân tử
3.3.4.1. Xác định tình trạng HER2 trên HMMD và DISH
Tất cả các trường hợp HER2(-) và (3+) trên HMMD đều phù hợp với
kết quả lai tại chỗ. 7/17 trường hợp có HER2(2+) trên HMMD thì có
khuếch đại gen khi lai tại chỗ (41,2%).3.3.4.2. Phân nhóm phân tử dựa
trên HMMD và lai tại chỗ gắn hai màu
Nhóm lịng ống A chiếm tỷ lệ cao nhất (31,0%), sau đó là nhóm lịng
ống B (28,0%) và nhóm bộ ba âm tính (23,0%), nhóm HER2 thấp nhất,
chiếm 18,0%.


21

3.4. MỐI LIÊN QUAN GIỮA PHÂN NHÓM PHÂN TỬ VÀ CÁC
YẾU TỐ TIÊN LƯỢNG KINH ĐIỂN

Phân nhóm phân tử của UTV có sử dụng lai tại chỗ để xác định sự
khuếch đại gen HER2 cho thấy có mối liên quan có ý nghĩa thống kê với
độ mơ học (độ ác tính của tế bào u, p<0,05) và sự phân chia nhân tế bào
(sự phân bào, p<0,01).
Chương 4
BÀN LUẬN
4.1. HOÀN THIỆN QUY TRÌNH LAI TẠI CHỖ GẮN HAI MÀU
TRÊN MÁY BENCHMARK GX TẠI BỆNH VIỆN TRƯỜNG
ĐHYD HUẾ
Hai sự điều chỉnh có sự khác biệt rõ nhất của quy trình đã hồn thiện
của chúng tơi so với quy trình khuyến cáo của nhà sản xuất đó là Cell
Conditioning 2 (CC2) và ISH-Protease.
CC2: là hóa chất tiền xử lý, giúp làm tan màng sinh học tế bào để tạo
thuận lợi cho các đoạn dò gen đi vào tiếp cận với nhân tế bào. Quá trình
thường diễn ra qua 3 bước với thời gian theo quy trình khuyến cáo như
sau: Mild (8 phút), Standard (12 phút) và Extended (8 phút). Tuy nhiên,
nhờ có sự tham khảo từ các bệnh viện khác: “Nếu sử dụng quy trình
khuyến cáo từ hãng thì mẫu mơ người sẽ bộc lộ khơng đủ tốt để cho tín
hiệu tối ưu” (Bệnh viện Bạch Mai và Bệnh viện K Hà Nội) nên chúng tơi
đã sử dụng quy trình CC2 với thời gian được khuyến cáo nên thay đổi là
12’-12’-12’ để đảm bảo các màng tế bào biểu mô được bộc lộ tối đa. Do
đó, chúng tơi khơng phải mày mị từng bước, thử các tổ hợp thời gian
khác nhau… mà chọn phương án tối ưu đã được áp dụng trên các máy
cùng thương hiệu, cùng nguồn hóa chất sinh phẩm của một công ty và đã
mang lại hiệu quả thiết thực cho việc thực hiện thành công kỹ thuật này.
ISH-Protease: là enzym giúp bộc lộ nhân của tế bào, tạo thuận lợi cho
các đoạn dò gen HER2 và CEP17 dễ dàng di chuyển và gắn vào trong vị
trí thích hợp tương ứng.
Đầu tiên, khi thực hiện trên mẫu Xenograft (là mẫu mô chứng của
hãng, nhằm để kiểm tra sự hoạt động của máy móc và hóa chất), dựa

trên khuyến cáo của hãng cho mẫu Xenograft, Protease 2 mạnh hơn
protease 3 là 4 lần vì vậy chúng tơi để 2 phút với protease 2 vì nó sẽ
tương đương 8 phút với protease 3 theo khuyến cáo. Kết quả rất tốt, các
tín hiệu đen của gen HER2 và đỏ của CEP17 rõ nét, điều này chứng tỏ
rằng máy móc và hóa chất, sinh phẩm của chúng tôi hoạt động tốt.


22

Khi thực hiện lai tại chỗ trên mẫu mô bệnh ung thư vú, chúng tơi đã
tham khảo quy trình điều chỉnh từ các bệnh viện và đã thử nghiệm với
thời gian ủ Protease 2 là 6 phút. Kết quả cho thấy tín hiệu đen và đỏ rõ
nét, khử paraffin tốt, nhưng màu nhân mờ nhạt, không phân biệt rõ giữa
các nhân nếu tế bào có nhiều nhân hay 2 nhân của 2 tế bào đứng cạnh
nhau. Sau khi thảo luận, chúng tôi nhận định rằng: Màu nhân mờ nhạt là
do xử lý màng nhân hơi quá mức, và nên giảm thời gian protease 2
xuống còn 4 phút, như vậy cũng tương đương với khuyến cáo của hãng
là ủ protease 3 trong 16 phút. Kết quả lai tại chỗ: Kết quả tốt, tín hiệu
đen đỏ rõ nét, nhân xanh, khơng bị nhuộm nền, khử paraffin tốt.
Sau đó, chúng tơi tiến hành lai tại chỗ cho 20 mẫu mô ung thư vú với
quy trình đã hồn thiện gồm CC2: 12’-12’-12’; Protease 2: 4' và Extend
paraffin. Kết quả: 95% số mẫu đạt yêu cầu: bắt tín hiệu đều, đẹp, tín hiệu
đen đõ rõ nét, nhân bộc lộ vừa đủ, khơng có tín hiệu nền. Tuy nhiên 5% số
mẫu (1 trên 20 mẫu) vẫn chưa được tối ưu, tín hiệu vẫn chưa được rõ nét
(chủ yếu tín hiệu đỏ của nhiễm sắc thể 17).
Đối với trường hợp này, sau khi kiểm tra lại mẫu mô vẫn đảm bảo các
yêu cầu về thời gian bảo quản, thời gian cố định; Chúng tôi đã lấy mẫu mơ
UTV vị trí khác cũng của bệnh nhân này để tiến hành kỹ thuật lai lần 2, cho
kết quả tốt tương tự như trên.
Sau khóa huấn luyện, với quy trình kỹ thuật đã được hoàn thiện như

ở bảng 3.3, các KTV của Bộ môn/Khoa giải phẫu bệnh chúng tôi đã tiếp
tục thực hiện các đợt lai cho 80 bệnh nhân ung thư vú khác vào cuối năm
2017 và giữa năm 2018.
4.2. CÁC ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Đa số bệnh nhân mắc bệnh ung thư vú đã mãn kinh (59,0%). Nghiên
cứu của Nguyễn Văn Chủ (2015) cũng cho thấy rằng ung thư vú gặp ở
nhóm đã mãn kinh chiếm tỷ lệ cao hơn (51,7%). Rối loạn nội tiết là yếu tố
nguy cơ cao cho ung thư vú nhưng cũng là cứu cánh hiện nay cho phụ nữ bị
ung thư vú với hiệu quả cao của thuốc điều trị ức chế nội tiết cho nhóm
bệnh nhân dương tính với nội tiết tố (ER, PR) trên kết quả nhuộm hóa mơ
miễn dịch. Hầu như tất cả phụ nữ có ung thư vú ER(+) nên xem xét điều trị
nội tiết. Ngay cả các khối u nhỏ (<1 cm) nếu chưa di căn hạch sẽ có nguy cơ
tái phát thấp hơn với việc sử dụng điều trị nội tiết.
4.3. ĐẶC ĐIỂM GIẢI PHẪU BỆNH, HĨA MƠ MIỄN DỊCH,
PHÂN NHĨM PHÂN TỬ VÀ KHUẾCH ĐẠI GEN HER2
4.3.1. Kết quả xét nghiệm tế bào học và mô bệnh học
Xét nghiệm tế bào học trong chẩn đốn ung thư vú có độ chính xác,
độ nhạy cao với 96% các trường hợp phù hợp hoàn toàn và 4% phù hợp


23

1 phần. Các nghiên cứu và y văn có tỷ lệ khác nhau về giá trị của tế bào
học, tỷ lệ chính xác chung khoảng 75-85%, cho chẩn đốn ung thư vú
thường cao hơn 85-95% tùy theo nghiên cứu.
Về mô bệnh học, loại ung thư vú thường gặp nhất là UTBM xâm
nhập loại không đặc biệt chiếm 68,0%, UTBM tiểu thùy xâm nhập
chiếm 15,0% là khá phù hợp với y văn cũng như các kết quả nghiên cứu
trong nước của Nguyễn Thế Dân (2007), UTBM ống xâm nhập (loại
không đặc biệt) chiếm tỷ lệ 77,9% ; Đoàn Thị Phương Thảo (2012) là

93,7% [9]; Đoàn Phước Thi (2015) cho kết quả thể ống xâm nhập chiếm
77,99%, UTBM thể thùy xâm nhập chiếm 12,13%, UTBM thể nhầy xâm
nhập chiếm 3,73%.
4.3.2. Các đặc điểm giải phẫu bệnh
Hứa Thị Ngọc Hà (2004) nghiên cứu trên 300 trường hợp UTV cho
thấy đa số bệnh nhân đến khám ở T2 (49,7%), di căn hạch nách chiếm
42,0%, độ mô học II chiếm 51,7% [4]. Nghiên cứu của Đoàn Phước Thi
(2016) UTV ở giai đoạn T2 chiếm tỷ lệ cao nhất (56,16%), độ mô học II
chiếm 66,9%. Nguyễn Phúc Duy Quang (2011) cho thấy UTV ở giai
đoạn II chiếm đa số với 57,2%, giai đoạn IIIA chiếm 18,1%.
Như vậy các kết quả nghiên cứu trong nước đều cho kết quả tương đồng
nhau về kích thước u, độ mơ học, di căn hạch và giai đoạn bệnh. Đây là
các yếu tố tiên lượng kinh điển trong UTV đã được công nhận qua nhiều
nghiên cứu và y văn trong nước và trên thế giới như trong phần tổng
quan tài liệu đã tổng hợp.
Độ mô học là sự kết hợp chi tiết các yếu tố về hình thái nhân, sự
biệt hóa và tăng sinh tế bào để phản ánh hình thái mô học, mặc dù
không sử dụng để đánh giá giai đoạn bệnh nhưng nó có ý nghĩa tiên
lượng quan trọng. Dù cách chia độ như thế nào hoặc đối tượng nghiên
cứu khác nhau giữa các tác giả khác nhau nhưng kết quả nghiên cứu đều
thống nhất, tỷ lệ sống thêm giảm dần theo độ mô học tăng dần với sự
khác biệt rất có ý nghĩa. Tầm quan trọng của độ mô học trong tiên lượng
ung thư vú đã được xác định và là thành phần bắt buộc trong chẩn đoán
giải phẫu bệnh.
Việc ghi nhận tình trạng di căn hạch là một trong những tiêu chí quan
trọng hàng đầu bởi vì nó là yếu tố tiên lượng có ý nghĩa nhất liên quan
đến tỷ lệ tái phát và thời gian sống thêm của bệnh nhân, hơn nữa hạch di căn
còn là yếu tố ảnh hưởng đến quyết định chọn lựa phương thức điều trị.
Những bệnh nhân giai đoạn I, II có thời gian sống thêm khơng bệnh
kéo dài hơn, ít tái phát hơn sau điều trị. Việc xác định giai đoạn bệnh và