Tiểu luận phân tích thực phẩm Ứng dụng quang phổ hấp thu UV VIS trong phân tích thực phẩm

Trường ĐH Cơng nghiệp TP Hồ Chí Minh

GVHD: Lê Nhất Tâm

MỤC LỤC

1.1. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG FE TRONG NƯỚC:......................................8
1.1.1. Cơ sở của phương pháp:......................................................................8
1.1.2. Các phản ứng xảy ra:...........................................................................8
1.1.3.Quy trình phân tích...............................................................................8
1.1.4. Cách tiến hành......................................................................................9
1.1.4.1.Xây dựng phương trình đường chuẩn:...........................................9
1.1.4.2. Yếu tố ảnh hưởng đến phép đo...................................................10
1.1.5. Kết quả:..............................................................................................10
1.2. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG FE TRONG MẪU THỰC PHẨM:.............10
1.2.1. Cơ sở của phương pháp:....................................................................10
1.2.2. Các phản ứng xảy ra:..........................................................................11
1.2.3.Quy trình phân tích:............................................................................11
1.2.4. Cách tiến hành....................................................................................11
1.2.4.1.Chuẩn bị mẫu:..............................................................................11
1.2.4.2.Xây dựng phương trình đường chuẩn:.................................................12
1.2.4.3. Yếu tố ảnh hưởng đến phép đo...................................................13
1.2.5. Kết quả:..............................................................................................13
2. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PHOSPHO TRONG NƯỚC BẰNG CÁCH
TẠO DẪN XUẤT THUỐC THỬ AMONI MOLIPDAT........................................13
1
Ứng dụng quang phổ hấp thu UV-VIS trong phân tích thực phẩm


Trường ĐH Cơng nghiệp TP Hồ Chí Minh

GVHD: Lê Nhất Tâm

2.1. Cơ sở của phương pháp:.......................................................................14
2.2.Các phản ứng xảy ra:.............................................................................14
2.3. Quy trình phân tích:..............................................................................15
2.4.Cách tiến hành........................................................................................15
2.4.1. Thuốc thử.......................................................................................15
2.4.1.1. Dung dịch axit sulfuric, c(H2SO4) ≈ 9 mol/l...............................15
2.4.1.2. Dung dịch axit sulfuric, c(H2SO4) ≈ 4,5 mol/l............................15
2.4.1.3. Dung dịch axit sulfuric, c(H2SO4) ≈ 2 mol/l...............................15
2.4.1.4. Dung dịch natri hydroxit, c(NaOH) = 2 mol/l............................16
2.4.1.5. Dung dịch axit ascobic,  = 100g/l.............................................16
2.4.1.6. Molipdat trong axit, Dung dịch I................................................16
2.4.1.7. Molipdat trong axit, dung dịch II................................................16
2.4.1.8. Dung dịch bổ chính độ đục – màu..............................................16
2.4.1.9. Dung dịch natri thiosulphat pentahydrat,  = 12,0 g/l................17
2.4.1.10. Dung dịch chuẩn gốc octophosphat, p = 50 mg/l...................17
2.4.1.11. Dung dịch chuẩn octophosphat, p = 2 mg/l............................17
2.4.1.12. Axit clohydric,  (HCl) = 1,19 g/ml.........................................17
2.4.1.13. Axit clohydric, c (HCl) = 2,5 mol/l...........................................17
2.4.2. Thiết bị, dụng cụ................................................................................18
2.4.2.1. Máy đo phổ.................................................................................18
2.4.2.2. Bộ phận gắn thiết bị lọc..............................................................18
2
Ứng dụng quang phổ hấp thu UV-VIS trong phân tích thực phẩm


Trường ĐH Cơng nghiệp TP Hồ Chí Minh

GVHD: Lê Nhất Tâm

2.4.2.3. Dụng cụ thủy tinh........................................................................18
2.4.3.Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu...................................................................18
2.4.3.1. Lấy mẫu.......................................................................................18
2.4.3.2. Chuẩn bị mẫu thử........................................................................18
2.5.Kết quả...................................................................................................20
3. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG TMA TRONG MẪU THỦY SẢN.................21
3.1. Cơ sở của phương pháp.........................................................................21
3.2. Các phản ứng xảy ra..............................................................................21
3.3.Quy trình phân tích:...............................................................................22
3.4.Cách tiến hành:.......................................................................................22
3.5.Kết quả:..................................................................................................23
4.XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG URE BẰNG THUỐC THỬ DMAB...............23
4.1. Cơ sở của phương pháp:.......................................................................23
4.2. Các phản ứng xảy ra:............................................................................24
4.3. Quy trình phân tích:..............................................................................24
4.4.Cách tiến hành:.......................................................................................24
4.5. Kết quả :................................................................................................26
5. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTEIN.......................................................26
5.1.PHƯƠNG PHÁP LOWRY:.......................................................................26
5.1.1. Cơ sở của phương pháp:....................................................................26
5.1.2. Các phản ứng xảy ra:.........................................................................26
3
Ứng dụng quang phổ hấp thu UV-VIS trong phân tích thực phẩm


Trường ĐH Cơng nghiệp TP Hồ Chí Minh

GVHD: Lê Nhất Tâm

5.1.3.Quy trình phân tích:............................................................................27
5.1.4.Cách tiến hành:....................................................................................28
5.1.4.1.Lấy mẫu........................................................................................28
5.1.4.2.Xây dựng phương trình đường chuẩn..........................................28
5.1.4.3.Yếu tố ảnh hưởng đến phép đo....................................................29
5.1.5.Kết quả:...............................................................................................29
5.2.PHƯƠNG PHÁP BCA ..............................................................................29
5.2.1.Cơ sở của phương pháp:.....................................................................29
5.2.2.Các phản ứng xảy ra:..........................................................................30
5.2.3.Quy trình phân tích:............................................................................30
5.2.4.Cách tiến hành ....................................................................................30
5.2.4.1.Lấy mẫu........................................................................................30
5.2.4.2.Xây dựng phương trình đường chuẩn..........................................30
5.2.4.3.Yếu tố ảnh hưởng đến phép đo....................................................31
5.2.5.Kết quả:...............................................................................................31
5.3.PHƯƠNG PHÁP BRANDFORD..............................................................31
5.3.1. Cơ sở của phương pháp:....................................................................31
5.3.2.Các phản ứng xảy ra:..........................................................................32
5.3.3.Quy trình phân tích.............................................................................32
5.3.4.Cách tiến hành ....................................................................................32
5.3.4.1.Lấy mẫu........................................................................................32
4
Ứng dụng quang phổ hấp thu UV-VIS trong phân tích thực phẩm


Trường ĐH Cơng nghiệp TP Hồ Chí Minh

GVHD: Lê Nhất Tâm

5.3.4.2.Xây dựng phương trình đường chuẩn..........................................32

5.3.4.3.Yếu tố ảnh hưởng đến phép đo....................................................33
5.4.PHƯƠNG PHÁP PHỔ UV........................................................................33
5.4.1.Cơ sở của phương pháp:.....................................................................33
5.4.2.Quy trình phân tích:............................................................................33
5.4.3.Cách tiến hành ...................................................................................34
5.4.3.1.Xây dựng phương trình đường chuẩn..........................................34
5.4.3.2.Yếu tố ảnh hưởng đến phép đo....................................................34
5.5. PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL.................................................................35
5.5.1. Cơ sở của phương pháp:....................................................................35
5.5.2. Các phản ứng xảy ra:.........................................................................35
5.5.3.Quy trình phân tích:............................................................................35
5.5.4 Cách tiến hành……………………………………………………….35
5.5.5 Kết quả………………………………………………………………36
6. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ BẰNG PHƯƠNG PHÁP DNS
(Dinitrosalycylic).....................................................................................................36
6.1.Cơ sở của phương pháp:........................................................................36
6.2. Các phản ứng xảy ra:............................................................................37
6.3. Quy trình phân tích…………………………………………………. 37
6.4.Cách tiến hành: ......................................................................................37
6.5.Kết quả:..................................................................................................38
7. XÁC ĐỊNH CADIMI BẰNG TẠO PHỨC DITHIZON.............................38
5
Ứng dụng quang phổ hấp thu UV-VIS trong phân tích thực phẩm


Trường ĐH Cơng nghiệp TP Hồ Chí Minh

GVHD: Lê Nhất Tâm

7.1.Ngun tắc.............................................................................................38

7.2.Các phương trình phản ứng....................................................................39
7.3.Qui trình phân tích.................................................................................39
7.4.Cách tiến hành........................................................................................39
7.4.1.Xây dựng phương trình đường chuẩn.............................................39
7.4.2. Yếu tố ảnh hưởng...........................................................................40
7.5.Kết quả...................................................................................................40
8.XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MN TRONG NƯỚC.......................................40
8.1.Cơ sở của phương pháp:........................................................................40
8.2.Các phản ứng xảy ra:.............................................................................40
8.3.Quy trình phân tích:...............................................................................40
8.4.Cách tiến hành:.......................................................................................41
8.5.Kết quả:..................................................................................................41
9. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NITRAT TRONG NƯỚC..............................42
9.1. Cơ sở của phương pháp:.......................................................................42
9.2.Các phản ứng xảy ra:.............................................................................42
9.3.Quy trình phân tích:...............................................................................42
9.4.Cách tiến hành:.......................................................................................43
9.5.Kết quả:..................................................................................................43
DANH SÁCH TÀI LIỆU THAM KHẢO

6
Ứng dụng quang phổ hấp thu UV-VIS trong phân tích thực phẩm


Trường ĐH Cơng nghiệp TP Hồ Chí Minh

GVHD: Lê Nhất Tâm

Nhận xét của GVHD: ............................................................................
..................................................................................................................

...................................................................................................................................
...................................................................................................................................
...................................................................................................................................
...................................................................................................................................
...................................................................................................................................
...................................................................................................................................
...................................................................................................................................
...................................................................................................................................
...................................................................................................................................
...................................................................................................................................
...................................................................................................................................
...................................................................................................................................
...................................................................................................................................
...................................................................................................................................
...................................................................................................................................
...................................................................................................................................
...................................................................................................................................
...................................................................................................................................
...................................................................................................................................
...................................................................................................................................
...................................................................................................................................
...................................................................................................................................
1. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG FE BẰNG TẠO DẪN XUẤT VỚI THUỐC
THỬ 1-10 PHENANTROLIN
1.1. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG FE TRONG NƯỚC:
1.1.1. Cơ sở của phương pháp:
Chuyển tồn bộ Fe (III) có trong mẫu về Fe(II), sau đó cho tạo phức với 1,10phenanthroline ở pH = 2.9-3.5. Phức tạo ra có màu vàng cam hoặc đỏ có bước sóng cực
đại λ = 510 nm.

7

Ứng dụng quang phổ hấp thu UV-VIS trong phân tích thực phẩm


Trường ĐH Cơng nghiệp TP Hồ Chí Minh

GVHD: Lê Nhất Tâm

1.1.2. Các phản ứng xảy ra:
Đun cách thủy với hydroxyamin trong mơi trường acid để chuyển Fe (III) có mặt về
Fe (II) và lên màu với thuốc thử 1,10 – phenantrolin ở pH từ 2.9 đến 3.5. Fe(II) và 1,10phenanthroline tạo phức có màu vàng cam/đỏ [(C 12H8N2)3Fe]2+. Bước sóng cực đại λ =
510 nm trong dung dịch đệm Amoni axetat (pH=8). Do 1,10-phenanthroline chỉ liên kết
với sắt(II) và sắt(II) dễ bị oxi hóa thành sắt(III), do đó cần thêm Hydroxylamin để khử
toàn bộ sắt(III) thành sắt(II).
2NH4OH + Fe3+ → N2O + H2O + Fe2+
N

Fe2+ +

→ Phức đỏ cam

N

1,10 phenantroline

1.1.3.Quy trình phân tích
Mẫu nước Vml

+ Hidroxylamin + Đệm Amoni axetat Phức đỏ camĐo ở λ = 510

nm Ax

1.1.4. Cách tiến hành
1.1.4.1.Xây dựng phương trình đường chuẩn:
Hàm lượng sắt có trong nước được xác định bằng phương pháp tạo phức với 1-10
phenanthrolin có những thơng số được cho trong bảng dưới đây:
Stt ống chuẩn

0

1

2

3

4

M
1

Dung dịch chuẩn (mL)
Mẫu
HCl đậm đặc (mL)
Dung dịch NH2OH.HCl

0
0

1
0

2
0

3
0
0.5
1

4
0

M
2

0
3

0
3

(mL)

8
Ứng dụng quang phổ hấp thu UV-VIS trong phân tích thực phẩm


Trường ĐH Cơng nghiệp TP Hồ Chí Minh

GVHD: Lê Nhất Tâm

NaOH (30%)
0.5
Đệm NH3C2H3O2 (mL)
3
V dd phenanthroline (mL)
1
H2O (mL)
4
3
2
1
0
C ppm
0
1
2
3
4
- Cách tiến hành xác định sắt trong mẩu chuẩn như quy trình trên.

1
?

1
?

- Mẫu trắng : tương tự như mẫu chuẩn như quy định trên.
- Xây dựng đường chuẩn nhưng thay dung dịch làm việc bằng nước cất.
- Xây dựng phương trình đường chuẩn A = f(CFe).

- Nồng độ sắt trong mẫu được xác định dựa vào phương trình đường chuẩn
- Độ hấp thụ mol của phức sắt(II) phenanthroline tại 510 nm bằng 11100 M-1cm-1.
Chú ý: Để lọai bỏ sai lệch trong mật độ quang khi nối với máy so màu sử dụng, một
hệ số điều chỉnh được ghi trên máy so màu dùng trong thí nghiệm. Mật độ quang quan
sát được cần phải nhân với hệ số này để thu được mật độ quang đúng của dung dịch
phức sắt.

1.1.4.2. Yếu tố ảnh hưởng đến phép đo
- Các chất oxi hóa mạnh : có thể loại trừ bằng cách thêm dư chất khử Hydroxyamin
- Cyanua, nitrit, photphat( polyphotphat ảnh hưởng nhiều hơn octophotphat): loại trừ
bằng cách đun sôi với acid
- Các ion kim loại crom, kẽm ( khi nồng độ của chúng gấp 10 lần nồng độ sắt);
coban, đồng( khi nồng độ chúng gấp 5 lần nồng độ sắt); niken (khi nồng độ của nó gấp 2
lần sắt); bimut,cadimi, thủy ngân molypdat tạo kết tủa với phenantrolin. Loại trừ bằng
cách thêm dư phenantrolin, trong đó vẫn khơng loại trừ đc ảnh hưởng của các ion kim
loại thì phải sử dụng phương pháp chiết tách các ion kim loại cản trở.
- Nếu mẫu có màu, xử lý mẫu bằng cách đun sơi mẫu với acid HCl 1:1, hay đốt
nhẹ, phần tro còn lại được hịa tan bằng acid.
- Phương pháp phenalthrolin có thể xác định hàm lượng sắt nhỏ nhất là 10µg/l.

9
Ứng dụng quang phổ hấp thu UV-VIS trong phân tích thực phẩm


Trường ĐH Cơng nghiệp TP Hồ Chí Minh

GVHD: Lê Nhất Tâm

1.1.5. Kết quả:
ppmFe =

1.2. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG FE TRONG MẪU THỰC PHẨM:
1.2.1. Cơ sở của phương pháp:
Mẫu thực phẩm được tro hóa, sau đó tro được hịa tan bằng HCl rồi định mức đến
thể tích biết trước. Sắt trong dung dịch được khử tồn bộ về Fe(II), sau đó cho tạo phức
với 1,10-phenanthroline ở pH = 2.9-3.5. Phức tạo ra có màu vàng cam hoặc đỏ có bước
sóng cực đại λ = 510 nm.

1.2.2. Các phản ứng xảy ra:
Đun cách thủy với hydroxyamin trong môi trường acid để chuyển Fe (III) có mặt về
Fe (II) và lên màu với thuốc thử 1,10 – phenantrolin ở pH từ 2.9 đến 3.5. Fe(II) và 1,10phenanthroline tạo phức có màu vàng cam/đỏ [(C 12H8N2)3Fe]2+. Bước sóng cực đại λ =
510 nm trong dung dịch đệm Amoni axetat (pH=8). Do 1,10-phenanthroline chỉ liên kết
với sắt(II) và sắt(II) dễ bị oxi hóa thành sắt(III), do đó cần thêm Hydroxylamin để khử
tồn bộ sắt(III) thành sắt(II).
2NH4OH + Fe3+ → N2O + H2O + Fe2+
Fe2+ +

N
N

→ Phức đỏ cam

1,10 phenantroline

1.2.3.Quy trình phân tích:
Mẫu m (g) Than hóa Tro hóa Hịa tan bằng nước nóng Vđm Vxđ 1-10 phenanthrolin
Chuẩn sắt Pha dãy chuẩn + 1-10 phenanthrolin y=ax + b

10
Ứng dụng quang phổ hấp thu UV-VIS trong phân tích thực phẩm

Trường ĐH Cơng nghiệp TP Hồ Chí Minh

GVHD: Lê Nhất Tâm

1.2.4. Cách tiến hành
1.2.4.1.Chuẩn bị mẫu:
- Cân chính xác một lượng mẫu đồng nhất cho vào chén nung. Tiến hành đun nhẹ để
làm bay hơi bớt mẫu. Chuyển chén cân vào lò nung, đặt nhiệt độ 450oC
- Tiến hành nung ở nhiệt độ trên khoảng 2h thì làm nguội cho vào 1ml MgNO 3 50%.
Tiếp tục nung cho đến khi hồn tồn.
- Hịa tan tro bằng 5ml HCl đậm đặc, đậy nắp kín đồng hồ rồi đun nóng cho đến cạn.
Thêm tiếp 3ml HCl nữa rồi đun nóng.
- Rửa mặt kính bằng nước nóng, hịa tan tro bằng nước nóng, tiến hành lọc, rửa, định
mức 100ml.

1.2.4.2.Xây dựng phương trình đường chuẩn:
- Hút 10ml dịch sau khi định mức, thêm 1ml Hydroxylamin.
- Sau 5 phút thêm 5ml đệm Acetat, 1ml 1-10 phenanthrolin
- Đo độ hấp thu ở bước sóng 510 nm.
- Từ độ hấp thu, xác định hàm lượng sắt qua phương trình đường chuẩn.
Quy trình tiến hành như sau:
Stt ống chuẩn

0

1

2

3

4

M
1

Dung dịch chuẩn Fe
10ppm(mL)
Mẫu

2+

M
2

0

1

2

3

4

0

0

0

0

0

0

0

1

1

0
Dung dịch NH2OH.HCl

1

Đệm NH3C2H3O2 (mL)
V dd phenanthroline (mL)

5
1

0

(mL)

- Mẫu trắng : tương tự như mẫu chuẩn như quy định trên.
- Xây dựng đường chuẩn nhưng thay dung dịch làm việc bằng nước cất.
- Xây dựng phương trình đường chuẩn A = f(CFe).

11
Ứng dụng quang phổ hấp thu UV-VIS trong phân tích thực phẩm


Trường ĐH Cơng nghiệp TP Hồ Chí Minh

GVHD: Lê Nhất Tâm

- Nồng độ sắt trong mẫu được xác định dựa vào phương trình đường chuẩn
- Độ hấp thụ mol của phức sắt(II) phenanthroline tại 510 nm bằng 11100 M-1cm-1.
Chú ý: Để lọai bỏ sai lệch trong mật độ quang khi nối với máy so màu sử dụng, một
hệ số điều chỉnh được ghi trên máy so màu dùng trong thí nghiệm. Mật độ quang quan
sát được cần phải nhân với hệ số này để thu được mật độ quang đúng của dung dịch
phức sắt.

1.2.4.3. Yếu tố ảnh hưởng đến phép đo
- Các chất oxi hóa mạnh : có thể loại trừ bằng cách thêm dư chất khử Hydroxyamin
- Cyanua, nitrit, photphat( polyphotphat ảnh hưởng nhiều hơn octophotphat): loại trừ
bằng cách đun sôi với acid
- Các ion kim loại crom, kẽm ( khi nồng độ của chúng gấp 10 lần nồng độ sắt);
coban, đồng( khi nồng độ chúng gấp 5 lần nồng độ sắt); niken (khi nồng độ của nó gấp 2
lần sắt); bimut,cadimi, thủy ngân molypdat tạo kết tủa với phenantrolin. Loại trừ bằng
cách thêm dư phenantrolin, trong đó vẫn không loại trừ đc ảnh hưởng của các ion kim
loại thì phải sử dụng phương pháp chiết tách các ion kim loại cản trở.
- Nếu mẫu có màu, xử lý mẫu bằng cách đun sôi mẫu với acid HCl 1:1, hay đốt
nhẹ, phần tro còn lại được hòa tan bằng acid.

- Phương pháp phenalthrolin có thể xác định hàm lượng sắt nhỏ nhất là 10µg/l.

1.2.5. Kết quả:
ppmFe =

12
Ứng dụng quang phổ hấp thu UV-VIS trong phân tích thực phẩm


Trường ĐH Cơng nghiệp TP Hồ Chí Minh

GVHD: Lê Nhất Tâm

2. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PHOSPHO TRONG NƯỚC BẰNG CÁCH
TẠO DẪN XUẤT THUỐC THỬ AMONI MOLIPDAT
Photpho tồn tại trong nước chủ yếu dưới dạng photphat và được chia làm 3
loại:
- Photphat hữu cơ, là dẫn xuất hữu cơ của axit photphoric như ADN, ARN
(vật chất di truyền, photpholipit (cấu tạo nên màng tế bào). Trong nước tự nhiên nó
thường tồn tại dưới dạng hợp chất lơ lửng, xác sinh vật chưa được phân hủy hồn
tồn.

Tuy

nhiên,

chúng

dần

bị

vi

sinh

vật

chuyển

về

dạng

vơ

cơ.

- Polyphotphat: là dạng tụ hợp của ortophotphat, không bền và dễ dàng bị
thủy phân để chuyển về ortophotphat. Polyphotphat tạo được phức với nhiều kim
loại,

có

ứng

dụng

trong

chống

ăn

mịn

và

xử

lý

nước

- Ortophotphat là dạng bền vững nhất của photphat trong tự nhiên, nó tạo
thành từ q trình phong hóa, bào mịn đất đá và được phóng thích dưới dạng ion
photphat đi vào môi trường nước. Ortophotphat trong đất thường bị các keo giữ
chặt, nhờ quá trình trao đổi ion xảy ra ở rễ, ortophotphat được cây hấp thụ như một
dưỡng chất. Ngoài ra, ortophotphat trong nước cũng là nguồn thức ăn cho tảo.
Bình thường, hàm lượng photphat trong nước khơng cao, nhưng các hoạt động của
con người trực tiếp hoặc gián tiếp làm gia tăng hàm lượng photphat trong nước

2.1. Cơ sở của phương pháp:
Phản ứng giữa ion octophosphat và một dung dịch axit chứa molipdat và ion
antimon tạo ra phức chất antimon phosphomolipdat.
Khử phức chất bằng axit ascorbic tạo thành phức chất molipden màu xanh đậm. Đo
độ hấp thụ ở λ = 880nm của phức chất để xác định nồng độ octophosphat.
Xác định polyphosphat và một số hợp chất phospho hữu cơ bằng cách thủy phân
chúng với axit sulfuric để chuyển sang dạng octophosphat phản ứng với moliopdat.
Một số hợp chất phospho hữu cơ được chuyển thành octophosphat bằng vô cơ hóa

với pesulfat. Nếu cần xử lý cẩn thận thì vơ cơ hóa với axit nitric – axit sulfuric.

13
Ứng dụng quang phổ hấp thu UV-VIS trong phân tích thực phẩm


Trường ĐH Cơng nghiệp TP Hồ Chí Minh

GVHD: Lê Nhất Tâm

2.2.Các phản ứng xảy ra:

Phản ứng với amoni molipdat (NH4)2MoO4 cho kết tủa vàng
H3PO4 + 12(MoO4)2- + 3(NH4)+ + 21H+ → (NH4)3H4[P(Mo2O7)6] kết
tủa + 10H2O
Cho phức này tác dụng với chất khử sẽ tạo ra phức màu xanh đậm: Khi đó Mo 2O7 sẽ
chuyển về MoO42-

2.3. Quy trình phân tích:
Mẫu thử: Mẫu ban đầu mẫu lọc rửa màng lọc dịch lọc 40ml mẫu thử + 1ml acid
arcobic, +2 ml acid molipdat, + H2O đến 50 ml A
Mẫu trắng: Chuẩn orthophosphate (0.04 mg/l →0.4 mg/l) + 1ml acid arcobic, +2 ml acid
molipdat, + H2O đến 50 ml A0

2.4.Cách tiến hành
Xác định octophosphat

2.4.1. Thuốc thử
Chỉ dùng các thuốc thử loại phân tích và dùng nước có hàm lượng phospho khơng
đáng kể so với nồng độ phospho nhỏ nhất trong mẫu cần xác định.

Với hàm lượng phosphat thấp, cần dùng nước cất hai lần với dụng cụ cất hoàn toàn
bằng thủy tinh

2.4.1.1. Dung dịch axit sulfuric, c(H2SO4) ≈ 9 mol/l
Cho 500 ml ± 5 ml nước vào cốc 2 l. Thêm cẩn thận, vừa khuấy vừa làm lạnh 500
ml ± 5 ml axit sulfuric,  = 1,84 g/ml. Khuấy đều và để dung dịch nguội đến nhiệt độ
phòng.

14
Ứng dụng quang phổ hấp thu UV-VIS trong phân tích thực phẩm


Trường ĐH Cơng nghiệp TP Hồ Chí Minh

GVHD: Lê Nhất Tâm

2.4.1.2. Dung dịch axit sulfuric, c(H2SO4) ≈ 4,5 mol/l
Cho 500 ml ± 5 ml nước vào cốc 2 l. Thêm cẩn thận, vừa khuấy vừa làm nguội 500
ml ± 5 ml axit sulfuric (2.4.1.1). Khuấy đều và để dung dịch nguội đến nhiệt độ phòng.

2.4.1.3. Dung dịch axit sulfuric, c(H2SO4) ≈ 2 mol/l
Cho 300 ml ± 3 ml nước vào cốc 1 l. Thêm cẩn thận 110 ml ± 2 ml dung dịch axit
sulfuric (2.4.1.1) vừa khuấy đều vừa làm nguội. Pha lỗng với nước trong bình định mức
500 ml ± 2 ml và trộn đều.

2.4.1.4. Dung dịch natri hydroxit, c(NaOH) = 2 mol/l
Hòa tan 80 g ± 1 g natri hydroxyt dạng hạt trong nước, làm lạnh và pha loãng với
nước tới 1 l.

2.4.1.5. Dung dịch axit ascobic,  = 100g/l

Hòa tan 10 g ± 0,5 g axit ascobic (C6H8O6) trong 100 ml ± 5 ml nước.
CHÚ THÍCH: Dung dịch này ổn định trong hai tuần nếu giữ trong bình thủy tinh
màu nâu trong tủ lạnh và có thể sử dụng được lâu nếu dung dịch này vẫn là khơng màu.

2.4.1.6. Molipdat trong axit, Dung dịch I.
Hịa tan 13 g ± 0,5 g amoni heptamolipdat ngậm bốn nước [(NH 4)6Mo7O24.4H2O)]
trong 100 ml ± 5 ml nước. Hòa tan 0,35 g ± 0,05 g antimon kali tartrat ngậm 1/2 nước
[K(SbO)C4H4O8.1/2 H2O] trong 100 ml ± 5 ml nước.
Cho dung dịch molipdat vào 300 ml ± 5 ml dung dịch axit sulfuric (2.4.1.1), khuấy
liên tục. Thêm dung dịch tartrat và trộn đều.
CHÚ THÍCH: Thuốc thử này ổn định ít nhất trong hai tháng nếu được giữ trong
bình thủy tinh màu nâu.

2.4.1.7. Molipdat trong axit, dung dịch II.
Hòa cẩn thận 230 ml ± 0,5 ml dung dịch axit sulfuric (2.4.1.1) trong 70 ml ± 5 ml
nước, làm nguội. Hòa tan 13 g ± 0,5 g amoni heptamolipdat ngậm bốn nước
[(NH4)6Mo7O24.4H2O)] trong 100 ml ± 5 ml nước. Thêm dung dịch axit và trộn đều. Hòa
tan 0,35 g ± 0,05 g antimon kali tartrat ngậm 1/2 nước [K(SbO)C 4H4O8.1/2 H2O] trong
100 ml ± 5 ml nước. Thêm dung dịch axit – molipdat và trộn đều.
Dùng các thuốc thử này khi mẫu đã được axit hóa bằng axit sulfuric (2.4.1.2).

15
Ứng dụng quang phổ hấp thu UV-VIS trong phân tích thực phẩm


Trường ĐH Cơng nghiệp TP Hồ Chí Minh

GVHD: Lê Nhất Tâm

CHÚ THÍCH: Thuốc thử này ổn định ít nhất trong hai tháng nếu được bảo quản

trong bình thủy tinh màu nâu.

2.4.1.8. Dung dịch bổ chính độ đục – màu
Trộn hai phần thể tích dung dịch axit sulfuric (2.4.1.2) và một phần thể tích axit
ascorbic (2.4.1.5).
CHÚ THÍCH: Thuốc thử này ổn định trong vài tuần nếu được bảo quản trong bình
thủy tinh nâu và để trong tủ lạnh.

2.4.1.9. Dung dịch natri thiosulphat pentahydrat,  = 12,0 g/l.
Hòa tan 1,20 g ± 0,05 g natri thiosulphat ngậm năm nước (Na 2S2O3.5H2O) trong 100
ml ± 5 ml nước. Thêm 0,05 g ± 0,005 g natri cacbonat (Na2CO3) làm chất bảo quản.
CHÚ THÍCH: Thuốc thử này ổn định ít nhất trong bốn tuần nếu bảo quản trong bình
thủy tinh màu nâu

2.4.1.10. Dung dịch chuẩn gốc octophosphat, p = 50 mg/l
Sấy khô vài gam kali dihydrogen phosphat tới khối lượng không đổi ở 105 oC. Hòa
tan 0,2197 g ± 0,0002 g KH2PO4 trong khoảng 800 ml ± 10 ml nước trong bình định mức
1 000 ml. Thêm 10 ml ± 0,5 ml dung dịch axit sulfuric (2.4.1.2) và thêm nước tới vạch.
Có thể sử dụng sung dịch chuẩn gốc sẵn có ở thị trường.
Dung dịch này ổn định ít nhất trong ba tháng nếu được bảo quản trong bình thủy
tinh nút kín. Nên bảo quản ở khoảng 4oC trong tủ lạnh.

2.4.1.11. Dung dịch chuẩn octophosphat, p = 2 mg/l.
Dùng pipet lấy 20 ml ± 0,01 ml dung dịch chuẩn gốc octophosphat (2.4.1.10) cho
vào bình định mức nước 500 ml. Thêm nước tới vạch và trộn đều.
Chuẩn bị dung dịch trong ngày phân tích.
CHÚ THÍCH: 1 ml dung dịch chuẩn chứa 2 µg P

2.4.1.12. Axit clohydric,  (HCl) = 1,19 g/ml
2.4.1.13. Axit clohydric, c (HCl) = 2,5 mol/l

Cẩn thận thêm 200 ml ± 10 ml axit clohydric (2.3.1.12) vào 500 ml ± 10 ml nước.
Khuấy và làm nguội đến nhiệt độ phòng, làm đầy tới 1 000 ml bằng nước.

16
Ứng dụng quang phổ hấp thu UV-VIS trong phân tích thực phẩm


Trường ĐH Cơng nghiệp TP Hồ Chí Minh

GVHD: Lê Nhất Tâm

2.4.2. Thiết bị, dụng cụ
2.4.2.1. Máy đo phổ
Loại “lăng kính”, loại chia vạch hoặc loại kính lọc, loại có khả năng đạt được các
cuvet dày từ 10 mm đến 50 mm.
Máy đo phổ được chọn cần thích hợp để đo độ hấp thụ trong vùng khả kiến và vùng
hồng ngoại gần của quang phổ. Bước sóng nhạy nhất là 880 nm, nếu chấp nhận thấp hơn
độ có thể đo ở 700 nm.
CHÚ THÍCH: Giới hạn phát hiện của phương pháp này sẽ tốt hơn nếu sử dụng máy
đo phổ với cuvet 100 mm.

2.4.2.2. Bộ phận gắn thiết bị lọc
Để giữ bộ lọc màng với kích thước lỗ 0,45 µm.

2.4.2.3. Dụng cụ thủy tinh
Trước khi sử dụng, tất cả dụng cụ thủy tinh cần rửa với dung dịch axit HCl
(2.4.1.13), ở khoảng nhiệt độ từ 40 oC đến 50oC và tráng kỹ với nước. Không dùng chất
tẩy rửa chứa phosphat.
Dụng cụ thủy tinh chỉ dùng cho xác định phospho. Sau khi dùng cần rửa sạch như
trên, che đậy và giữ cho tới khi cần dùng.

Đồ thủy tinh dùng cho giai đoạn tạo màu thỉnh thoảng cần tráng với dung dịch natri
hydroxyt (2.4.1.4), tiếp theo cần tráng kỹ bằng nước (2.4.1) để loại trừ cặn các phức chất
có màu có xu hướng bám thành màng mỏng trên thành đồ thủy tinh.

2.4.3.Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu
2.4.3.1. Lấy mẫu
Lấy mẫu phịng thí nghiệm vào lọ polyetylen, polyvinyl clorua hoặc tốt nhất là bình
thủy tinh. Trong trường hợp nồng độ phosphat thấp, nhất thiết phải dùng bình thủy tinh.

2.4.3.2. Chuẩn bị mẫu thử
Lọc mẫu (2.4.1.1) trong vòng 4 h sau khi lấy mẫu, nếu mẫu đã được giữ lạnh, cần
đưa về nhiệt độ trong phòng trước khi lọc.

17
Ứng dụng quang phổ hấp thu UV-VIS trong phân tích thực phẩm


Trường ĐH Cơng nghiệp TP Hồ Chí Minh

GVHD: Lê Nhất Tâm

Rửa sạch màng lọc có kích thước lỗ 0,45 µm bằng cách cho 200 ml nước ấm từ
30 C đến 40oC chảy qua để loại bỏ các phosphat. Loại bỏ phần nước rửa này. Lọc mẫu
qua màng lọc và đổ bỏ 10 ml dịch lọc đầu tiên. Lấy phần dịch lọc cịn lại cho vào bình
thủy tinh sạch, khơ để xác định ngay octophosphat (2.4.1.4).
o

Nếu dịch lọc có pH nằm ngoài khoảng từ 3 đến 10, điều chỉnh bằng dung dịch
NaOH (2.4.1.4) hoặc dung dịch H2SO4 (2.4.1.3).
Thời gian lọc phải không quá 10 min. Nếu cần thiết, dùng bộ lọc có đường kính lớn

hơn.
Cần phải kiểm tra hàm lượng phospho của màng lọc hoặc phải rửa như đã mô tả.
Các màng lọc bán sẵn trên thị trường không chứa phospho cũng phải rửa như mơ tả trên
đây.

Phần mẫu thử
Thể tích phần mẫu thử lớn nhất dùng là 40,0 ml. Thể tích này phù hợp để xác định
nồng độ octophosphat tới p = 0,8 mg/l khi dùng cuvet dày 10 mm. Thể tích phần mẫu
thử nhỏ hơn cần được dùng để tạo thuận lợi khi xác định nồng độ phosphat cao hơn như
trình bày trong Bảng 1. Tương tự, nồng độ phosphat thấp có thể xác định được bằng cách
đo độ hấp thụ trong cuvet dày 40 mm hoặc 50 mm.
Bảng 1 – Nồng độ và thể tích mẫu
Nồng độ
octophosphat

Thể tích phần mẫu
thử

Chiều dày cuvet
mm

mg/l

ml

0,0 đến 0,8

40,0

10

0,0 đến 1,6

20,0

10

0,0 đến 3,2

10,0

10

0,0 đến 6,4

5,0

10

0,0 đến 0,2

40,0

40 hoặc 50

Thử mẫu trắng
Tiến hành thử mẫu trắng song song với phân tích mẫu, theo đúng quy trình, cùng
một lượng thuốc thử nhưng dùng thể tích nước tương ứng thay cho mẫu thử.

Chuẩn bị dãy dung dịch hiệu chuẩn

Dùng pipet lấy tương ứng, ví dụ 1,0 ml; 2,0 ml; 3,0 ml; 4,0 ml; 5,0 ml; 6,0 ml; 7,0
ml; 8,0 ml; 9,0 ml; 10,0 ml dung dịch chuẩn octophosphat (2.4. 1.11) cho vào bình định
mức 50 ml. Pha loãng với nước tới khoảng 40 ml. Những dung dịch này chứa các nồng độ
octophosphat p = 0,04 mg/l đến 0,4 mg/l.

18
Ứng dụng quang phổ hấp thu UV-VIS trong phân tích thực phẩm


Trường ĐH Cơng nghiệp TP Hồ Chí Minh

GVHD: Lê Nhất Tâm

Tạo màu
Thêm vào mỗi bình 1 ml dung dịch axit ascorbic (2.4.1.5) tiếp theo là 2 ml dung
dịch axit molipdat I (2.4.1.6). Thêm nước tới vạch và lắc kỹ.
Quá trình tiến hành cho các khoảng nồng độ phosphat khác được nêu ở Bảng 1.
CHÚ THÍCH: Độ hấp thụ đo ở 700 nm bị giảm khoảng 30% độ nhạy so với đo ở
880 nm.

Đo phổ
Đo độ hấp thụ của mỗi dung dịch bằng máy đo phổ (2.4.2.1) sau 10 min và 30 min ở
bước sóng 880 nm, hoặc 700 nm nếu chấp nhận độ nhạy thấp hơn. Dùng nước để đối
chứng.

Dựng đường chuẩn
Vẽ đồ thị hấp thụ (theo trục y) và hàm lượng phospho (theo trục x), (mg/l), của dãy
dung dịch hiệu chuẩn. Tương quan giữa độ hấp thụ (trục y) với hàm lượng phospho (trục
x) là tuyến tính. Xác định độ dốc của đồ thị.
Thường xuyên kiểm tra lại tính tuyến tính của đồ thị, đặc biệt là khi dùng mẻ hóa

chất mới.

Quy trình chuẩn
Dùng pipet lấy lượng mẫu thử đã định . Vs vào bình định mức dung tích 50 ml và
pha loãng với nước tới 40 ml ± 2 ml, nếu cần. Nếu mẫu thử chứa asenat thì phải khử bằng
thiosulphat trong môi trường axit thành asenit. Việc khử được định lượng cho asenat đến
nồng độ ít nhất là 2 mg As/lit, được trình bày như sau:
Dùng pipet chuyển nhiều nhất là 40 ml mẫu thử vào bình định mức 50 ml. Thêm 0,4
ml dung dịch axit sulfuric (2.4.1.2), 1 ml dung dịch axit ascobic (2.4.1.5) và 1 ml dung
dịch thiosulphat (2.4.1.9) khuấy và để quá trình khử kéo dài 10 min ± 1 min. Thêm 2 ml
dung dịch axit molipdat II (2.4.1.7). Thêm nước tới vạch, khuấy đều.

Trường hợp mẫu bị đục
Nếu mẫu thử đục và/hoặc có màu, làm như sau:
Thêm 3 ml thuốc thử bổ chính độ đục – màu vào phần thể tích mẫu thử đã chọn. Pha
loãng thành 50 ml và đo độ hấp thụ.
Nếu mẫu thử chứa chất gây cản trở asenat đã được xử lý bằng thiosulphat, phải đo
trong vòng 10 min, nếu không mẫu sẽ bị nhạt màu.

2.5.Kết quả
Nồng độ octophosphat, p, biểu thị bằng miligam trên lít được tính theo công thức:

19
Ứng dụng quang phổ hấp thu UV-VIS trong phân tích thực phẩm


Trường ĐH Cơng nghiệp TP Hồ Chí Minh

GVHD: Lê Nhất Tâm

Trong đó,
A là độ hấp thụ của mẫu thử
Ao là độ hấp thụ của dung dịch mẫu trắng
f là hàm số độ dốc đồ thị hiệu chuẩn ,tính theo lít trên miligam (l/mg);
Vmax là thể tích mẫu (50 ml) của mẫu thử (ml);
Vs là thể tích thực của mẫu thử (ml).

3. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG TMA TRONG MẪU THỦY SẢN
3.1. Cơ sở của phương pháp
Xác định hàm lượng TMA trong mẫu thủy sản bằng cách tạo phức với acid picric và
đo ở bước sóng λ = 410 nm.

3.2. Các phản ứng xảy ra

20
Ứng dụng quang phổ hấp thu UV-VIS trong phân tích thực phẩm


Trường ĐH Cơng nghiệp TP Hồ Chí Minh

GVHD: Lê Nhất Tâm

CH3-NH-CH3 + H-CH=O
NH3 + H-CH=O

CH3-N(CH2OH)-CH3 (1)
CH2OH-N(CH2OH)- CH2OH

(2)

(1) Và (2) không tạo phức được với acid picric
TMA tạo phức kết hợp được với acid picric

đem dung dịch đo ở λ =

410nm

3.3.Quy trình phân tích:

3.4.Cách tiến hành:
TMA
0,01mg/ml
Dịch xác
định
Nước

0
0

4

1
1

3

2
2

2

3
3

1

4
4

0

M1

M2

3

3

1

1

21
Ứng dụng quang phổ hấp thu UV-VIS trong phân tích thực phẩm


Trường ĐH Cơng nghiệp TP Hồ Chí Minh

HCHO

Toluen

GVHD: Lê Nhất Tâm

1
1

1
10

1
10

1
10

1
10

1
10

1
10

3

3

3

3

3

3

3

0
K2CO3
1g/1ml
Acid
picric

Lắc-hút 8-9ml lớp trên vào ống nghiệm có chứa 0,1g Na2SO4
Lắc đều, hút 5ml cho vào ống nghiệm
5
5
5
5
5
5

5

Lắc đều đo ở bước sóng ʎ=410nm

3.5.Kết quả:

mgTMA/100g=Cx×××

4.XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG URE BẰNG THUỐC THỬ DMAB
4.1. Cơ sở của phương pháp:
Làm mất màu dung dịch huyền phù của mẫu thử. Khuấy dung dịch này và lọc. thêm
vào dịch lọc dung dịch 4-dimethyl-amino-benzaldehyde (4DMAB) và đo độ hấp thụ
quang học trên máy đo phổ ở bước sóng 420nm

4.2. Các phản ứng xảy ra:

22
Ứng dụng quang phổ hấp thu UV-VIS trong phân tích thực phẩm


Trường ĐH Cơng nghiệp TP Hồ Chí Minh

GVHD: Lê Nhất Tâm

4.3. Quy trình phân tích:
Cân mẩu
Hút dịch trong

Than hoạt hóa
+DMAB

Bình định mức Carrez

Lắc đều, cách thủy

Lắc đều

Chuẩn

Vđm
Đo phổ

ʎ=420nm.

4.4.Cách tiến hành:
1. Phần mẫu thử:
Cân, chính xác đến 1mg, khoảng 2g mẫu thử.
Đối với mẫu có hàm lượng ure lớn hơn 3% (m/m), có thể giảm phần mẫu thử xuống
1 g hoặc pha lỗng dung dịch mẫu để nồng độ khơng vượt quá 50mg ure/500ml.
Đối với mẫu có hàm lượng ure thấp, phần mẫu thử có thể tăng lên sao cho dịch lọc
thu được phải trong và khơng có màu.

2. Chuẩn bị dung dịch mẫu thử:
Chuyển phần mẫu thử cùng 1g than hoạt hố vào bình định mức 500ml . Thêm
400ml nước, 5ml Carrez I và 5 ml dung dịch Carrez II . Lắc đều bình trên máy lắc trong
30 phút. Định mức đến vạch bằng nước cất, lắc đều và lọc qua giấy lọc định tính, tốc độ
chậm.

23
Ứng dụng quang phổ hấp thu UV-VIS trong phân tích thực phẩm


Trường ĐH Cơng nghiệp TP Hồ Chí Minh

GVHD: Lê Nhất Tâm

Nếu dịch lọc vẫn có màu thì chuẩn bị lại dịch lọc như điều nhưng tăng thêm lượng
than hoạt hóa.

3. Lên màu:
Dùng pipét hút 5ml dịch lọc trong, không màu cho vào ống nghiệm, dùng pipet hút thêm
vào đó 5ml dung dịch 4 - DMAB
Lắc đều vào để đứng ống nghiệm trong nồi cách thuỷ 15 phút ở nhiệt độ 20oC.

4. Mẫu trắng:
Chuẩn bị mẫu trắng song song với mẫu kiểm tra, các bước tiến hành tương tự và
lượng các thuốc thử cho vào cũng tương đương như chuẩn bị mẫu thử chỉ khác là khơng
có dịch mẫu.

5. Chuẩn bị đồ thị chuẩn:
Dùng pipét lần lượt hút 1ml, 2ml, 4ml, 5ml và 10ml dung dịch ure chuẩn vào 5 bình định
mức 100ml. Định mức đến vạch bằng nước cất. Như vậy 1ml dung dịch chuẩn chứa 10g,
20g, 40g, 50g và 100g ure.
Từ các dung dịch chuẩn này dùng pipét hút chính xác lần lượt mỗi bình 5ml cho vào
ống nghiệm . Thêm vào mỗi ống nghiệm 5ml thuốc thử 4-DMAB và lắc đều. Đo độ hấp
thụ của các dung dịch ở bước sóng 420nm trên máy đo phổ kế . Hiệu chỉnh với dung dịch
chuẩn 5ml thuốc thử 4 - DMAB và 5ml nước.
Xây dựng đồ thị chuẩn với trục tung là các giá trị độ hấp thụ và trục hồnh là nồng
độ ure tính theo g/ml.

6. Đo phổ:
Chuyển dung dịch mẫu thử đã chuẩn bị vào cuvét và đo độ hấp thụ trên máy phổ kế
ở bước sóng 420nm, hiệu chỉnh với mẫu trắng
Chú thích - Nếu mẫu chứa các hợp chất nitơ như các axit amin, thì tiến hành đo độ
hấp thụ ở bước sóng 435nm.

24
Ứng dụng quang phổ hấp thu UV-VIS trong phân tích thực phẩm


Trường ĐH Cơng nghiệp TP Hồ Chí Minh

GVHD: Lê Nhất Tâm

7. Số phép xác định:
Tiến hành xác định hai phép xác định các phần thử trên cùng một mẫu thử.

4.5. Kết quả :
Hàm lượng ure có trong mẫu thử, tính theo phần trăm khối lượng, được biểu thị
bằng công thức sau :

Trong đó :
C là lượng ure có trong dung dịch lọc của mẫu thử được xác định từ đường chuẩn,
tính bằng g/ml.
m là khối lượng mẫu thử, tính bằng g.

5. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTEIN
5.1.PHƯƠNG PHÁP LOWRY:
5.1.1. Cơ sở của phương pháp:
Phương pháp được phát triển bởi Lowry (1951) dựa trên cơ sở phản ứng màu của
thuốc thử Folin-Ciocalteau với liên kết peptide trong protein, peptide và các acid amin
thơm (tyrosine, tryptophan,histidine) trong mơi trường kiềm thích hợp.

5.1.2. Các phản ứng xảy ra:
Phản ứng tiến hành qua hai giai đoạn cơ bản:

25
Ứng dụng quang phổ hấp thu UV-VIS trong phân tích thực phẩm