Luận văn nghiên cứu khả năng nhân nhanh lan hài trần liên (paphiopedilum tranlienianum) bằng phương pháp in vitro

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (833.82 KB, 70 trang )

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
----------o0o---------

ĐỖ NGỌC HÀ
Tên đề tài:
“NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN NHANH LAN HÀI TRẦN LIÊN
(Paphiopedilum tranlienianum) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Công nghệ sinh học

Lớp

: K48 - CNSH

Khoa

: CNSH – CNTP

Khoá học

: 2015 – 2020

Giảng viên HD

: ThS. Nguyễn Thị Tình

Thái Nguyên, năm 2020

i

LỜI CẢM ƠN
Được sự đồng ý của Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công
nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, trong thời gian thực tập tốt nghiệp em
đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu khả năng nhân nhanh lan Hài Trần Liên
(Paphiopedilum tranlienianum) bằng phương pháp in vitro”.
Lời đầu tiên trong khoá luận này em xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám
hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực
phẩm cùng các thầy cô giáo trong Khoa đã tạo điều kiện tḥn lợi cho em hoàn
thành khóa ḷn tớt nghiệp này.
Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân
thành tới cô giáo ThS. Nguyễn Thị Tình giảng viên khoa Công nghệ Sinh học
và Công nghệ Thực phẩm đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ và hướng dẫn em trong
thời gian thực hiện đề tài.
Đồng thời, em xin cảm ơn các thầy cơ và các anh chị kỹ tḥt viên trên
phịng cấy mô tế bào thực vật Khoa CNSH-CNTP đã tạo điều kiện giúp đỡ và
hướng dẫn cho em trong suốt thời gian thực tập, cảm ơn bạn bè đã hết lòng
động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.
Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình đã tạo điều kiện vật chất và luôn là
chỗ dựa tinh thần cho em trong suốt thời gian thực tập.
Trong quá trình thực tập, cũng như là quá trình làm báo cáo thực tập thời
gian có hạn nên đề tài khơng thể tránh khỏi những sai sót. Em rất mong nhận

được những ý kiến đóng góp của thầy cơ và các bạn để đề tài của em được hoàn
thiện hơn Thực phẩm cùng các thầy cô giáo trong Khoa đã tạo điều kiện tḥn
lợi cho em hoàn thành khóa ḷn tớt nghiệp này.

ii

Lời cuối em xin kính chúc các thầy, cô giáo trong nhà trường, trong khoa
Công nghệ Sinh học và Công nghệ thực phẩm, cùng các bạn sinh viên có sức
khoẻ, thành công trong cuộc sống.
Thái Nguyên, ngày

tháng

năm

Sinh viên thực hiện

Đỗ Ngọc Hà

iii

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Các nhóm lan Hài Việt Nam theo thứ hạng bảo tồn của Tổ chức Bảo
tồn Thiên nhiên Quốc tế (IUCN) .................................................... 8
Bảng 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian khử trùng của
H2O2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng (sau 14 ngày nuôi cấy) . 34
Bảng 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến khả năng
tái sinh phôi lan ............................................................................. 36

Bảng 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân
nhanh phôi Trần liên (sau 6 tuần nuôi cấy) .................................. 38
Bảng 4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với Kinetin
đến khả năng nhân nhanh phôi của lan Hài Trần liên ................... 40
Bảng 4.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin và TDZ
đến khả năng nhân nhanh giống (sau 30 ngày nuôi cấy) ............. 42
Bảng 4.6. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ
cây lan hài Trần liên (sau 6 tuần nuôi cấy) .................................... 45
Bảng 4.7 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính
đến khả năng ra rễ cây lan hài Trần liên (sau 6 tuổi nuôi cấy) ..... 47
Bảng 4.8. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể tới khả năng sinh trưởng
và phát triển của lan Trần liên ...................................................... 49

iv

DANH MỤC HÌNH, BIỂU ĐỒ
Hình 2.1: Hình ảnh về cây lan Hài Paphiopedilum tranlienianum ................ 13
Hình 3.1. Quả lan Hài Trần Liên .................................................................... 23
Hình 3.2: Sơ đồ nghiên cứu nhân giống loài lan Hài Trần liên ...................... 26
Biểu đồ 4.1. Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm (%) lan Hài Trần Liên................. 35
Biểu đồ 4.2. Tỷ lệ tái sinh phôi lan (%) ......................................................... 37
Biểu đồ 4.3. Hệ số nhân chồi (lần) lan chịu ảnh hưởng của nồng độ BA ..... 39
Biểu đồ 4.4. Hệ số nhân chồi (lần) lan chịu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp
với Kinetin .................................................................................... 41
Biểu đồ 4.5. Hệ số nhân chồi (lần) lan chịu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp
với Kinetin và TDZ ....................................................................... 43
Biểu đồ 4.6. Tỷ lệ mẫu ra rễ lan chịu ảnh hưởng của nồng độ NAA ............ 45
Biểu đồ 4.7. Hệ số nhân chồi (lần) lan chịu ảnh hưởng của nờng đợ NAA kết
hợp với than hoạt tính ................................................................... 47

Biểu đồ 4.8. Tỷ lệ sống lan ảnh hưởng của giá thể ........................................ 49

v

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
B5

: Gamborg cs, 1976

BAP

: 6-Benzyl amino purine

CS

: Cộng sự

CT

: Công thức

CV

: Coeficient of Variation – Hệ số biến động

Đ/C

: Đối chứng

LSD

: Least Singnificant DifferenceTest

MS

: Murashighe và Skoog, 1962

MT

: Môi trường

GA3

: Gibberellic acid

NAA

: α-Napthalene acetic acid

IAA

: Indole-3-acetic acid

IBA

: Indole-3-butyric acid

IUCN

:

International Union

for Conservation

of Nature

and

Natural Resources - Liên minh Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế
P.

: Paphiopedilum tranlienuanum

tranlienuanum
P. malipoens

: Paphiopedilum malipones

WPM

: Woody Plant Medium – Lioyd và Mc Cown, 1980

vi

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... i
DANH MỤC BẢNG ........................................................................................ iii

DANH MỤC HÌNH, BIỂU ĐỒ ....................................................................... iv
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .................................................................. v
MỤC LỤC ........................................................................................................ vi
PHẦN 1. MỞ ĐẦU .......................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................... 1
1.2 Mục đích nghiên cứu ................................................................................... 1
1.3 Yêu cầu của đề tài ....................................................................................... 2
1.4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài ....................................... 2
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3
2.1. Tổng quan về Lan Hài ................................................................................ 3
2.1.1. Phân loại và nguồn gốc ........................................................................... 3
2.1.2. Đặc điểm hình thái .................................................................................. 4
2.1.3. Sinh thái................................................................................................... 6
2.1.4. Hiện trạng cây lan Hài Việt Nam ............................................................ 7
2.2 Tổng quan về Hài Trần Liên (Paphiopedilum tranlienianum) .................. 11
2.2.1 Nguồn gốc và sự phân bố của Hài Trần Liên (Paphiopedilum
tranlienianum) ở Việt Nam ............................................................................. 11
2.2.2 Hình Thái................................................................................................ 12
2.2.3. Các điều kiện cơ bản để ni trờng lồi lan Hài Trần Liên .................. 13
2.3.4. Tổng quan về môi trường nuôi cấy và các thành phần dinh dưỡng sử dụng
trong nghiên cứu môi trường nhân nhanh lan Hài Trần Liên ......................... 14
2.4. Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô lan hài trên thế giới và trong nước
......................................................................................................................... 19

vii

2.4.1. Trên thế giới .......................................................................................... 19
2.4.2. Trong nước ............................................................................................ 21
PHẦN 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

......................................................................................................................... 23
3.1. Vật liệu, hoá chất và thiết bị nghiên cứu.................................................. 23
3.1.1. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu.............................................................. 23
3.1.2. Hoá chất sử dụng ................................................................................... 23
3.1.3. Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu................................................................. 24
3.2. Phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu .............................................. 24
3.2.1. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................... 24
3.2.2. Địa điểm nghiên cứu ............................................................................. 24
3.2.3. Thời gian nghiên cứu ............................................................................ 25
3.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 25
3.4. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 25
3.4.1. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy in vitro .................................................. 25
3.4.2. Phương pháp nghiên cứu quy trình nhân giớng .................................... 26
3.4.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm.............................................................. 31
3.5. Phương pháp thu thập, xử lý số liệu và chỉ tiêu đánh giá ........................ 31
3.5.1. Thu thập số liệu ..................................................................................... 31
3.5.2. Các chỉ tiêu theo dõi.............................................................................. 31
PHẦN 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................... 34
4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian của chất khử trùng
H2O2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng ......................................................... 34
4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến khả năng tái
sinh phôi lan Hài Trần Liên ............................................................................ 36
4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ một số Cytokinine đến khả
năng nhân nhanh cây lan Hài Trần Liên ......................................................... 38

viii

4.3.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh
chồi của cây lan Hài Trần Liên ....................................................................... 38

4.3.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với Kinetin đến
khả năng nhân nhanh phôi lan hài Trần Liên .................................................. 40
4.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA, Kinetine, TDZ đến khả
năng nhân nhanh giống cây ............................................................................. 42
4.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA và than hoạt tính đến khả
năng ra rễ cây lan ............................................................................................ 44
4.4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của
cây lan ............................................................................................................. 44
4.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả năng
ra rễ của cây lan hài Trần liên ......................................................................... 46
4.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể tới khả năng sinh trưởng và phát
triển của lan ..................................................................................................... 48
Phần 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................ 51
5.1. Kết luận .................................................................................................... 51
5.2. Kiến nghị .................................................................................................. 51
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 52

1

PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1.Đặt vấn đề
Lan Hài là loài hoa đẹp có giá trị thẩm mĩ và kinh tế cao. Được người yêu
hoa trong và ngoài nước tìm kiếm, điều này đã dẫn đến hầu hết các loài lan hài
trên thế giới cũng như của Việt Nam rơi vào mức báo đợng nguy cơ tụt chủng
ngồi tự nhiên.
Hài Trần Liên (hài Bắc Thái) là một trong số loài lan hài đặc hữu của Việt
Nam, có khu phân bớ hẹp (khu vực Bắc Kạn và Thái Nguyên), hiện lan hài
Trần Liên được tìm thấy ở khu vực đệm của Hờ Ba Bể - nơi xuất hiện nhiều

loài phong lan, địa lan có giá trị thẩm mỹ.
Hài Trần Liên được nhiều nhà sưu tầm lan quan tâm bởi kiểu dáng độc
đáo với điểm nhấn cánh mơi của hoa ́n cong giớng hình chiếc hài và hai cánh
bên lượn sóng, màu đỏ thẫm, hấp dẫn người chơi lan.
Hài Trần Liên tái sinh bằng phôi nếu kết hợp được với lồi nấm cợng sinh,
do đó khả năng tái sinh trong tự nhiên thấp, đây là ngun nhân thứ 2 khiến
lồi hoa có giá trị này được liệt kê vào phụ lục 1 của công ước CITES và danh
mục Thực vật rừng, Động vật rừng nguy cấp, q hiếm (nhóm 1) của Nghị định
sớ 32/2006/NĐ –CP ngày 30/3/2006.
Xuất phát từ thực tiễn trên em tiến hành đề tài: “Nghiên cứu khả năng
nhân nhanh lan Hài Trần Liên (Paphiopedilum tranlienianum) bằng
phương pháp in vitro”.
1.2 Mục đích nghiên cứu
- Nghiên cứu thành công quy trình nhân nhanh giống lan hài trần liên từ
phôi bằng phương pháp in vitro.

2

1.3 Yêu cầu của đề tài
- Xác định nồng độ và thời gian khử trùng mẫu trong dung dịch H2O2 đến
hiệu quả tạo vật liệu vô trùng.
- Xác định được ảnh hưởng của loại môi trường nuôi cấy đến khả năng tái
sinh phôi của cây Hài Trần Liên
- Xác định được ảnh hưởng của nồng độ một số Cytokinine đến khả năng
nhân nhanh Hài Trần Liên
- Xác định được ảnh hưởng của nồng độ NAA và than hoạt tính đến khả
năng ra rễ cây Hài Trần Liên.
- Xác định ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây Hài Trần Liên.
1.4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài

* Ý nghĩa khoa học của đề tài
- Giúp sinh viên củng cố và hệ thống lại các kiến thức đã học và bổ sung
vào kiến thức lý thuyết được học thông qua hoạt động thực tiễn
- Giúp bản thân sinh viên học hỏi kiến thức, tích lũy được kinh nghiệm
thực tế cũng như tác phong làm việc, nghiên cứu khoa học phục vụ cho cho
công tác sau này.
* Ý nghĩa thực tiễn
Đề xuất được quy trình nhân nhanh giống lan hài Trần Liên
(paphiopedilum tranlienianum) bằng phương phán ni cấy in vitro, góp phần
bảo tờn giớng hoa quý hiếm trước nguy cơ tuyệt chủng đồng thời tạo nguồn vật
liệu cho nghiên cứu khoa học.

3

PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về Lan Hài
2.1.1. Phân loại và nguồn gốc
2.1.1.1. Phân loại
Lan Hài là một nhóm rất khác biệt trong họ lan. Chúng dễ dàng được nhận
ra bởi cấu trúc hoa khác thường với một cánh hoa giữa hình túi sâu trông giống
một chiếc hài nằm ở vị trí thấp nhất của hoa. Chiếc môi đặc sắc và hình dạng
khác thường của hoa tạo nên vẻ bề ngoài dễ dàng phân biệt lan Hài với các loài
lan khác. Vì vậy nó trở thành tên chung của loài lan này.
Về mặt thực vật học, các loài lan Hài tḥc vào 5 chi là:
- Chi Cypripedium có khoảng 50 loài, thường được gọi là hài Vệ nữ, phân
bố ở các vùng ôn đới và núi của bán cầu bắc.
- Chi Mexipedium, chi Phragmipedium và chi Selenipedium gồm khoảng
25 loài phân bố ở vùng nhiệt đới châu Mĩ.

- Chi Paphiopedilum có khoảng 75 loài phân bớ ở vùng nhiệt đới châu Á
từ Nam Ấn Độ và Đông Hymalaya đến Philippine, New Guinea và Quần đảo
Solomon.
Ở Việt Nam các loài lan Hài đều thuộc chi Paphipedilum, thuộc tông
Cypripedioideae, họ phụ Epidendroideae, họ lan (Orchidaceae), bộ lan
(Orchidales), phân lớp hành (Liliidae), lớp một lá mầm (Monocotyledoneae),
ngành hạt kín (Angiospermatophyta), giới thực vật (Plantae).[1]
2.1.1.2. Ng̀n gớc
Chi Paphiopedilum có ng̀n gớc từ vùng lục địa Đơng Nam Á, trong đó
có Việt Nam. Các loài nguyên thuỷ nhất của chi này được tìm thấy chủ yếu ở

4

Trung Quốc và Bắc Việt Nam, mỗi loại trong chi này đều có khu phân bớ rất
hạn chế.
Hầu như tất cả các loài lan đều bắt nguồn từ các tổ tiên kiểu hypoxis có
sáu mảnh bao hoa (ba mảnh bao vòng ngoài gọi là ba lá đài và ba mảnh bao
vòng trong gọi là ba cánh hoa) và sáu nhị đực (ba nhị đực ở vòng ngoài và ba
nhị đực ở vòng trong). Xu hướng tiến hoá của họ Lan là giảm số lượng nhị đực
và sự dính liền giữa nhị đực hữu thụ với nhị cái là sự biến đổi hoa cơ bản nhất
dẫn đến sự tiến hoá của họ Lan. Sự giảm liên tục số lượng nhị đực dẫn đến sự
hình thành các nhóm lan có ba, hai hay một nhị đực tồn tại trong hoa. Trong họ
Lan, chi lan Hài (thuộc tông Cypripedioideae) là dòng tiến hoá có hai nhị đực
còn tờn tại trong hoa
2.1.2. Đặc điểm hình thái
Các loài lan Hài (Paphiopedilum) ở Việt Nam có thể có hình dạng bên
ngoài rất đa dạng tuy nhiên chúng đều mang những đặc điểm hình thái:
- Dạng cây: Là các loài thân cỏ có kích thước trung bình với thân mang
nhiều lá mọc thành hai hàng xếp thành hình quạt, đơi khi có dạng thân bò. Tất

cả các loài đều có thân rễ nhưng đa sớ rất ngắn[1]
- Lá: thường có dạng lá dài gấp đơi, hình trứng ngược hay bầu dục thn
và mở rợng. Mỡi lá có đớt ở gớc, dưới đó là bẹ lá hình chữ V xếp lợp xít lên
nhau trên thân. Độ dài của lá có thể từ 3- 50 cm. Mặt trên của lá có thể có màu
xanh lá cây hoặc khảm bởi các mảng đậm nhạt không đều với các gân màu
xanh lá nởi rõ. Mặt dưới lá có các đớm tím dày đặc hoặc vết tím xỉn chỉ thấy rõ
ở gần gốc lá. Lá của các loài điển hình cho điều kiện sống khô đều dày, mọng
nước và cứng [1]
- Cụm hoa: thường thẳng đứng hay cong. Mợt sớ loài có ćng hoa nằm
ngang, mợt sớ loài lại có ćng hoa chúc x́ng, nhưng hầu hầu các loài đều có
ćng hoa dựng đứng. Phần lớn các loài chỉ có mợt hoa riêng lẻ. Tuy nhiên

5

cũng có loài có cụm hoa mang hai hoa, song rất hiếm. Trục cụm hoa có lơng tơ
dầy và ngắn hay có lơng nhung hoặc nhẵn. Lá hoa của cụm hoa gấp đơi và có
hình dạng rất khác nhau tùy từng loài, từ hình múi giáo hay hình trứng và có
chóp nhọn đến hình bầu dục tròn. Lá hoa thường có ít lơng tơ hơn các phần
khác của cụm hoa nhưng nói chung thường có lơng ở mép và lơng cứng gần
giữa ở mặt ngoài lá, ở một số loài có lá hoa nhẵn.[1]
- Hoa: Gờm hai lá đài ở vòng ngoài, một lá đài lưng, một lá đài hợp và ba
cánh hoa ở vòng trong. Lá đài lưng thường lớn, hướng thẳng lên trên và thường
nổi bật với các vạch hay chấm ở mặt trong. Lá đài lưng nằm đối diện với lá đài
hợp ở vị trí thấp hơn và hướng xuống phía dưới. Lá đài hợp nằm phía sau của
mơi thường có mợt màu tới xỉn và kém nổi bật hơn so với lá đài lưng. Cả hai lá
đều thường có lơng tơ dày ở mặt ngoài[1]
Hai cánh hoa bên đều dễ dàng nhận thấy ở hai bên lá đài và thường hơi
xoè xuống dưới theo chiều ngang. Chúng có thể có hình thìa, bầu dục, trứng
rợng hay tròn. Cánh hoa hình mũi giáo hẹp, xoắn ốc hẹp dần từ gốc lên đến

đỉnh. Cánh hoa giữa thứ ba biến dạng rõ rệt thành một môi giống như cái bao
hoặc hình chiếc hài. Môi dạng túi sâu và phồng lên, hình giầy, có lơng ở mặt
trong và nhẵn ở mặt ngoài.[1]
Nhị bất thụ của vòng ngoài và nhuỵ cái hợp thành cột nhị- nhuỵ. Hai nhị
đực hữu thụ của vòng trong có chỉ nhị ngắn dính liền ở phía sau núm nhuỵ và
hai bên cuốn cột. Bầu dưới, một ô, đỉnh noãn bên là điểm đặc trưng của chi
này. Hầu hết các loài lan Hài, bầu có lơng tơ, hình trụ, màu xanh lá cây hay đỏ
tía xỉn [1]
- Qủa: Dạng quả nang, khơ, dài, có mợt ơ với ba van rộng và ba van hẹp.
Qủa mở ở gần đỉnh bằng 6 rãnh nứt. Qủa thường chín trong điều kiên tự nhiên
sau khi thụ phấn từ sáu đến mười tháng [1]

6

- Hạt: Có hình bầu dục, hình con śt chỉ ngắn,dạng thn dài hay hẹp và
thường có chiều dìa từ 0,4 – 1,1 mm. Phôi nhỏ, dài từ 0,3 – 0,4 mm. Hạt khơng
có nợi nhũ do đó rất khó nảy mầm trong điều kiện tự nhiên [1]
- Rễ: Rễ chùm, có mợt lớp mơ xớp bọc xung quanh các rễ thật, lớp màng
xớp này có vai trò trong việc giữ nước và ngăn chặn ánh sáng gay gắt. Sau khi
rễ trưởng thành thì có dạng sợi mảnh với hệ floem phát triển mạnh và khơng có
các búi nấm xung quanh rễ [1].
2.1.3. Sinh thái
Các loài lan Hài ở Việt Nam có thể chia thành hai nhóm riêng. Mợt nhóm
phân bố ở vùng núi đá vôi phía Bắc Việt Nam từ đợ cao mặt nước biển lên đến
1600m, nhóm còn lại phân bớ ở khu vực có đá mẹ silicat, đá phiến và cát kết ở
độ cao từ 700-2200m. Ngoài ra, có mợt vài cá thể trong nhóm này còn mọc
bám ở các khe nứt hay rìa của các vách núi dựng đứng đá granit.
Lan Hài của Việt Nam có thể sống trên đất, bám đá và phụ sinh mùn. Các
loài sớng trên đất thường mọc ở nơi có ít ánh sáng của tán cây rừng, ở nơi sườn

núi dốc, các nền đất có nhiều lá rơi bị phân huỷ mạnh và giàu chất mùn. Các
loài lan Hài mọc trên đá thường mọc dưới bóng cây của kiểu rừng ít khép tán,
chủ yếu là các mỏm đá và ngay bên dưới các đường đỉnh. Các loài phụ sinh
mùn chủ yếu sống bám trên vỏ cây gỗ trong các vùng rừng mây mù ẩm độ cao
1200-1500m.
Tại Việt Nam, lan Hài thường phân bớ ở vùng có lượng mưa lớn, ẩm đợ
cao. Tuy nhiên do đặc trưng là vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên chúng
thường phải trải qua mợt giai đoạn khô hạn. Sự xuất hiện lá dày, dai và mọng
nước là hướng thích nghi tớt để cây có thể sớng sót được qua đợt khơ hạn định
kỳ và chúng sẽ nhanh chóng phục hời khi mùa mưa trở lại. Độ ẩm xung quanh
rễ, kiểu đất và độ pH, sự có mặt của các nấm rễ, tác nhân thụ phấn và cường độ

7

ánh sáng là các nhân tố quan trọng trong sự hình thành và phát triển của quần
thể lan Hài.
Trong rừng nguyên sinh, lan Hài phân bố đều nhau ở các hướng của sườn
núi. Nhưng trong các vùng rừng đã bị x́ng cấp, lan Hài có khuynh hướng
phát triển ở các sườn núi phía Bắc, đông Bắc và tây Bắc của núi. Ngày nay,
thường chỉ tìm thấy lan Hài mọc thành từng đám nhỏ. Các nơi sống tự nhiên
bị phá huỷ bởi con người,sự thay đổi các điều kiện môi trường và việc thu hái
lan để bán là những nguyên nhân chính gây ra sự tuyệt chủng nhanh chóng của
lan Hài trên khắp các vùng của Việt Nam.[1]
2.1.4. Hiện trạng cây lan Hài Việt Nam
Hiện nay, nhu cầu về hoa tươi nói chung và hoa lan nói riêng trên thế
giới cũng như trong nước đang ngày càng gia tăng. Vì vậy việc trồng lan đã trở
thành một ngành kinh tế của nhiều nước trên thế giới và nhiều nước đang phát
triển khu vực Đông Nam Á.
Lan Hài là chủng họ lan có giá trị thương mại cao nhất, được u

cḥng, sưu tầm, tìm kiếm nhiều nhất thế giới. Với sự hiện hữu của hơn 20
loài thuộc chi Paphiopedilum, Việt Nam là mợt trong các q́c gia có ng̀n
lan Hài tự nhiên phong phú nhất. Không những phong phú về chủng loại, Việt
Nam còn có nhiều loài lan đặc hữu có giá trị thẩm mĩ cao, được thế giới ưa
chuộng. Điều này đã tạo nên tình trạng thu thập và xuất khẩu lan Hài một cách
ồ ạt, không kiểm soát, dẫn đến việc lan Hài ngày càng hiếm trong tự nhiên.
Đồng thời với tình trạng môi trường tự nhiên bị khai thác cạn kiệt như hiện
nay, lan Hài càng biến mất nhanh chóng[2]
Lan Hài và các lồi tḥc bợ Lan là những loài thực vật bị đe dọa biến mất
trước tiên khi mơi trường sớng tự nhiên bị suy thối. Nền kinh tế phát triển nhanh
chóng dẫn đến ơ nhiễm mơi trường cùng với diện tích rừng nguyên sinh bị suy giảm

8
nhanh chóng do hoạt đợng khai thác làm giảm đi nơi sống tự nhiên của lan Hài gây
ra nguy cơ tuyệt chủng nhiều loài lan Hài ở Việt Nam hiện nay [1].

Dựa trên những nghiên cứu thực địa gần đây, tình trạng bảo tồn các loài
lan Hài trong tự nhiên theo tiêu chuẩn các thứ hạng về mức độ đe doạ tuyệt
chủng của tổ chức bảo tồn thiên nhiên Quốc tế (IUCN) được tổng kết ở bảng
2.1.
Bảng 2.1. Các nhóm lan Hài Việt Nam theo thứ hạng bảo tồn của Tổ
chức Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế (IUCN)
Tình trạng
Đã bị tuyệt chủng
ngoài thiên nhiên
Đang bị tuyệt chủng
trầm trọng

Tên loài

(tiếng Latinh)

Tên loài
(tiếng Việt)

P. vietnamense

Hài Việt

p. delenatii

Hài Đỏ

P.  aspersum

Chưa rõ tên gọi

P. barbigerum var. lokianum

Hài Lộc

P. callosum

Hài Vân

P. dianthum

Hài Xoắn

P. emersonii

Hài Hương Lan

P. gratrixianum

Hài Đuôi công

Đang bị tuyệt chủng P. hangiannum

Hài Hằng

P. helenae

Hài hê len

P. henryanum

Hài Henry

P.  herrmannii

Hài Herman

P. malipoense var. jackii

Hài Jack

P. malipoense

Hài Giáp

P. micranthum

Hài Mốc Hồng

9

Tình trạng

Tên loài
(tiếng Latinh)
P. purpuratum

Tên loài
(tiếng Việt)
Hìa Tía

P. tralienianum

Hài Trần liên

P. appletonianum

Hài Cánh Sen

P. concolor
Sắp bị tuyệt chủng

P. hirsutissimum var.

chiwuawnum
P. hirsutissimum var. esquirolai
P. villosun var. annamense

Thiếu dẫn liệu

Hài Gia Định
Hài Tiên biến dị
Hài Tiên
Hài Lông

P.  affine

Hài Hoà

P.  datalanse

Chưa rõ tên gọi

P. villosum var. boxalli

Chưa rõ tên gọi

Trên thực tế, mức độ đe doạ tuyệt chủng đối với tất cả các loài lan Hài
Việt Nam được chỉ ra ở bảng trên đây đã bị thay đổi nhiều trong thời gian gần
đây do sự suy giảm nhanh các quần thể được biết. Trong những năm gần đây,
qua các đợt điều tra thực địa đã phát hiện ra tốc độ phá huỷ mạnh mẽ trên diện
rộng của những khu rừng còn sót lại của Việt Nam, chủ yếu trên các đỉnh núi
đá vôi [12],[13],[14]
Sự thay đổi môi trường sống do con người gây nên và việc thu mua với số

lượng lớn để buôn bán hiện nay là nhân tố chính làm suy giảm nhanh chóng sớ
lượng các loài lan Hài. Tất nhiên, việc phá huỷ nơi sống tự nhiên của chúng có
liên quan đến tớc đợ phát triển kinh tế và sự gia tăng dân số của Việt Nam. Các
loài lan Hài rất nhạy cảm với sự thay đổi của môi trường nên bị đe doạ tuyệt
chủng nhiều hơn và sẽ biến mất trước tiên sau khi nơi sống tự nhiên của chúng
bị suy thoái.

10

Yếu tố thứ hai dẫn đến sự tuyệt chủng của các loài lan Hài ở Việt Nam
trong những năm gần đây là việc thu hái trên diện rộng của người dân địa
phương để bán và xuất khẩu một lượng lớn các loài lan Hài mọc trong tự nhiên
ra nước ngoài. Do khơng có biện pháp quản lý có hiệu quả việc thu mẫu các
loài thực vật hoang dã với sự giàu có nởi bật của lan Hài đặc hữu của Việt Nam
đã khuyến khích việc thu thập các loài lan từ thiên nhiên với số lượng lớn trên
toàn bộ lãnh thở.[1]
Nếu khơng có các biện pháp bảo vệ các khu rừng nguyên sinh khẩn cấp
và hiệu quả thì chắc chắn các sinh vật sẽ phải đối mặt với nguy cơ tuyệt chủng
trong tương lai gần. Điều này sẽ kéo theo sự tuyệt chủng của một số lượng lớn
các loài hiếm và đặc hữu.
Trước tình hình lan Hài cạn kiệt ngoài thiên nhiên, nhiều chương trình
quốc gia về bảo tồn loài hoa quý này đã được triển khai,chủ yếu là thu thập,
phân loại, nghiên cứu về các loài lan Hài và bảo tồn môi trường sống tự nhiên
của chúng. Một công trình hợp tác quốc tế về lĩnh vực này là mơ tả các giớng
lan Hài ở Việt Nam của nhóm tác giả Leonid Averyanov, Phillip Cribb, Phan
Kế Lộc và Nguyễn Tiến Hiệp năm 2004 [1]
Một mạng lưới rộng khắp các khu bảo tồn đã được thành lập ở Việt Nam.
Đặc biệt hàng loạt các khu bảo tồn đã đang bảo tồn các loài lan Hài như:
- Khu bảo tồn Ngọc Linh (Kon Tum), Chue Yang Sinh (Đắc Lắc), Núi Bà

(Lâm Đờng) bảo tờn lồi P. appletonianum.
- Khu bảo tờn Mom Ray (Kon tum), Thung Đa Nhim (Lâm Đồng) đang
bảo tồn lồi P. callosum.
- Vườn Q́c Gia Ba Bể, khu bảo tờn Cát Bà (Hải Phịng), Hữu Liên (Lạng
Sơn), Pà Cò (Hịa Bình), khu bảo tờn Thượng Đa Nhim (Lâm Đờng) đang bảo
tồn P.dalatensis.

11

- Vườn Q́c Gia Hồng Liên Sơn (Lào Cai), Phong Quang (Hà Giang),Pà
Cò (Hòa Bình) đang bảo tờn lồi P. dianthum, P.micranthum.
- Khu bảo tồn Na Hang (Tuyên Quang) đang bảo tờn lồi P. emersoii,
P.hangianum, P. malipoense varijackii.
- Vườn q́c gia Tam Đảo, Hồng Liên Sơn đang bảo tờn lồi
P.gratrixianum.
- Khu bảo tồn Trùng Khánh (Cao Bằng) đang bảo tồn lồi P. helanae.
- Vườn q́c gia Ba Bể, khu bảo tồn Na Hang, Hữu Liên, Pà Cồ, Phong
Nha đang bảo tờn lồi P. malipoense
Bên cạnh đó, nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu và ứng dụng phương pháp
nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro nhằm nhân nhanh số lượng lớn lan Hài.
Đầu tiên phải kế đến PGS. TS. Dương Tấn Nhựt, người đầu tiên nuôi cấy thành
công lan hài Hờng năm 2005. Sau đó đã có nhiều nhà nghiên cứu khác đã nuôi
cấy in vitro thành công nhiều loài lan Hài khác như hài Hằng, hài Tam Đảo
bằng các phương pháp nuôi cấy mô khác nhau, Khoa CNSH – CNTP trường
Đại học Nông Lâm Thái Nguyên bước đầu đã thành công nhân giống bằng
phương pháp in vitro một số loài lan Hài như: Hài Vệ Nữ, Hài Hằng, Hài Helen.
2.2 Tổng quan về Hài Trần Liên (Paphiopedilum tranlienianum)
2.2.1 Nguồn gốc và sự phân bố của Hài Trần Liên (Paphiopedilum
tranlienianum) ở Việt Nam

2.2.1.1 Nguồn gôc
Lan

hài Trần

liên

- Paphiopedilum Tranlienianum là

một

loài

lan hài nhỏ, là dài khoảng 8-15cm màu xanh bóng. Loài này có hoa tao nhã với
lá đài lưng trắng có sọc tía nâu, cánh hoa tía nâu lượn sóng rất mạnh ở mép,
môi nâu tía và nhị lép vàng tươi. Hài Trần Liên là loài đặc hữu hẹp ở Việt Nam,
cây ưa râm mát, nở hoa khoảng tháng 9-12, độ bền của hoa khá dài 25-30 ngày.
Lan Hài Trần Liên được mô tả chính thống năm 1988 dựa trên một cây sống

12

được nhập khẩu từ Việt Nam và được đặt theo tên người Việt Nam đã xuất khẩu
nó, bà Trần Ngơ Liên.
2.2.1.2 Phân bố
Lan Hài Trần Liên được phân bố ở việt nam ở các tỉnh : Cao Bằng, Bắc
Kạn, Tuyên Quang (Na Hang) và Thái Nguyên (Đồng Hỷ): Mỏ Ba
2.2.2 Hình Thái
- Lan Hài Trần Liên là loài lan đất, cây mọc thành khối. Cây mọc trên
tầng đá vôi, lớp lá mục và trên rêu.

2.2.2.1. Dạng lá
- Hình dải cỡ 18*1.7 cm, mặt trên màu lục bóng với mép nhạt hơn, mặt
dưới màu lục nhạt với nhiều chấm màu tím ở gớc. Lá bắc hình trứng, cỡ 1.72.5*1.6cm, lơng ngắn ở gân giữa và mép tận cùng.
2.2.2.2. Dạng hoa
Cụm hoa: có ćng dài 7-15cm, thường mang 1 hoa. Hoa : Rợng 5.5-6cm
- Lá đài có lơng ngắn ở mặt ngồi, lá đài gắn trục hoa màu trắng.Gân
tròn cỡ 3*3-3.5cm.Lá đài kia màu lục nhạt, hình trứng, cỡ 2.5*1.1-1.8cm.Cánh
hoa màu tía- nâu với chóp màu lục,hình khn,cỡ 3-3.4*0.7-0.9 cm, bóng. Mép
lượn sóng, có lơng trắng,gớc có nhiều lơng nâu- tía nhạt. Mơi màu đỏ- nâu
thẫm,cỡ 3.7-3.9*1.6cm,
- Nhị lép, hình trứng ngược, 8-10*7-9 mm, có mủ bóng. Bầu dài 3-4 cm,
phủ đầy lông ngắn nâu nhạt. Bông 5-6cm rộng,6-7cm cao.
2.2.2.3. Dạng quả
- Dạng quả nang dài, 3 gờ, hình trụ, mở ở gần đỉnh bằng 6 rãnh nứt. Quả
chín trong điều kiện tự nhiên sau khi thụ phấn từ 6 đến 10 tháng.
2.2.2.4. Dạng gốc
- Gốc chuyển thành màu lục so với màu tía - nâu với chóp màu lục
2.2.2.5. Rễ

13

Rễ chùm, màu nâu, có lớp mơ xớp bọc xung quanh các rễ thật, lớp màng
xớp này có vai trò trong việc giữ nước và ngăn chặn ánh sáng gay gắt. Sau khi
rễ trưởng thành thì có dạng sợi mảnh với hệ floem phát triển mạnh và khơng có
các búi nấm xung quanh rễ.

Hình 2.1: Hình ảnh về cây lan Hài Paphiopedilum tranlienianum
2.2.3. Các điều kiện cơ bản để nuôi trờng lồi lan Hài Trần Liên
2.2.3.1. Nhiệt đợ, đợ ẩm, ánh sáng

- Nhiệt độ: Lan Hài được phân chia thành 2 nhóm chính, theo quy luật
chung, những cây có lá màu xanh thường thích sớng ở nơi có nhiệt đơ lạnh đến
trung bình, ban đêm là từ 13-16°C, ban ngày là 18-24°C. Các loài Hài có lá vằn
thích hợp với điều kiện nhiệt từ trung bình đến ấm, ban đêm là 16-18°C, ban
ngày là 21-25°C.
- Ánh sáng: Lan Hài không cần ánh sáng mặt trời đầy đủ. Hầu hết lan Hài
ưa ánh sáng yếu, điều kiện ánh sáng nhân tạo cho các loài lan từ 11.000-22.000
lux. Nếu lá bị vàng hoặc phát hoa ngắn chứng tỏ chúng đang dư ánh sáng, nếu
lá màu xanh đậm và mềm hoặc phát hoa dài, yếu, chúng đang thiếu ánh sáng.

14

- Độ ẩm không khí: Không khí ẩm và lưu thông tốt là rất cần thiết, nhất là
trong mùa hè, giúp giảm thiểu nguy cơ nhiễm nấm bệnh và giữ cho cây khơng
bị khơ quá nhanh. Đợ ẩm có thể được nâng lên bằng cách đặt chậu cây lên trên
các khay sỏi nhẹ với 50% độ ẩm là lý tưởng.
2.2.3.2. Nhu cầu bón phân
Phân bón: Có thể bón phân NPK với tỉ lệ 20:20:20 hoặc 14:14:14, bổ sung
khoáng Ca2+ 40mg/l và Mg2+ 20-30mg/l. Tưới nước đậm trước và sau khi bón
phân, nếu thấy đầu lá bị nâu khơ thì nên dừng hẳn việc tưới phân. Sang chậu
khi giá thể trồng có dấu hiệu mục nát.[4]
2.2.3.3. Giá thể trờng
Trần liên có thể trồng trên giá thể gồm đá vôi trộn thêm chất lá mục, than
củi, xỉ than tổ ong,, sơ dừa, vỏ thơng và có thể tưới thêm phân bón 2 lần/ tuần
trong suốt mùa sinh trưởng của cây lan
2.3.4. Tổng quan về môi trường nuôi cấy và các thành phần dinh dưỡng sử
dụng trong nghiên cứu môi trường nhân nhanh lan Hài Trần Liên
Thành phần môi trường nuôi cấy mô thực vật thay đổi tuỳ theo loài, bộ
phận, các giai đoạn phát triển, phân hoá khác nhau của mẫu cấy và mục đích

nuôi cấy như duy trì mô ở trạng thái mô sẹo, tạo rễ, tạo mầm hoặc tái sinh cây
hoàn chỉnh [5]
Thành phần cơ bản của môi trường nuôi cấy mô, tế bào thực vật bao gồm
các thành phần chính sau:
2.3.4.1. Nguồn Cacbon
Mô cấy trong môi trường nuôi cấy in vitro khơngcón khả năng tự dưỡng do
khơng tiến hành quang hợp đầy đủ. Vì vậy, việc bổ sung vào môi trường nuôi
cấy nguồn cacbon hữu cơ là điều kiện bắt buộc. Nguồn Cacbon cung cấp cho
môi trường nuôi cấy thường là các loại đường, phổ biến nhất là saccharose với
hàm lượng từ 20-30 g/l. Ngoài ra còn có thể sử dụng các loại đường khác như

15

fructose, rafinose, sorbitol, glucose, maltose, lactose,....những loại đường này
chỉ dùng trong những trường hợp cá biệt.
2.3.4.2. Các nguyên tố khoáng đa lượng, vi lượng
Các chất vô cơ bao gồm thành phần khoáng đa lượng và khoáng vi lượng
có trong mơi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật được sử dụng như là thành
phần cơ bản để tổng hợp chất hữu cơ. Các dạng ion của ḿi khoáng đóng vai
trò quan trọng trong quá trình vận chuyển xuyên màng, điều hoà áp suất thẩm
thấu và điện thế màng.
- Nguyên tố đa lượng:
Quan trọng nhất là các nguyên tố: N, P, K, Mg, Ca, Na, S [11]
+ Nitơ: Thường được sử dụng ở dạng NO3 - hoặc NH4+, hầu hết các loại
thực vật sẽ sử dụng nguồn nitơ này để đồng hoá và tổng hớp nên các sản phẩm
hữu cơ.
+ Phospho: Nhu cầu phospho của mô và tế bào nuôi cấy là rất cao, P có
tác dụng như hệ thớng đệm giúp ổn định pH môi trường.
+ Kali: Thường dùng ở dạng KNO3, KH2PO4, KCl.6H2O

+ Canxi: Sử dụng chủ yếu là CaNO3.4H2O, CaCl2.6H2O, CaCl2.2H2O
+ Magie : Sử dụng chủ yếu là MgSO4
+ Lưu huỳnh: Chủ yếu là SO4
- Nguyên tố vi lượng: Chủ yếu là Fe, B, Mn, Cu, Zn, I, Ni... các nguyên
tố vi lượng bổ sung với lượng nhỏ vào mơi trường nhưng có vai trò quan trọng
đới với quá trình trao đổi chất, tổng hợp protein, hoạt động phân bào của mô,
tế bào nuôi cấy.
2.3.4.3. Vitamin
Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau.
Đại đa số tế bào thực vật nuôi cấy đều có thể tự tởng hợp vitamin cần thiết,
nhưng sớ lượng thấp, có thể khơng đủ duy trì sự sinh trưởng của nó. Các

16

vitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: Thiamin
(vitamin B1), nicotinic acid, pyridoxine (vitamin B6) và myo-inositol.
Vitamin có tác dụng thúc đẩy sinh trưởng, phát triển của mẫu cấy và trong
nhiều trường hợp nó có vai trò như nguồn cacbon của môi trường nuôi cấy.
- Vitamin B1 (Thiaminee HCl): Là chất bổ sung rất cần thiết cho mơi trường
ni cấy, có vai trò trong trao đởi hydratcacbon và sinh tổng hợp amino acid.
- Vitamin B6 (Pyridocinen): Là coenzzyme quan trọng trong nhiều phản
ứng trao đổi chất.
- Vitamin B3 (Nicotinic acid): Tham gia tạo coenzyme của chuỗi hơ hấp.
- Myo-inositol: Có vai trò trong sinh tởng hợp thành tế bào, màng tế bào,
tham gia vận chuyển đường, các nguyên tố khoáng, trao đổi hyđratcacbon.
2.3.4.4. Các chất hữu cơ tự nhiên
- Nước dừa: Chứa nhiều chất dinh dưỡng như inositol, các amino acid,
đường, các chất tḥc nhóm cytokinin, các chất có hoạt tính auxin.
- Dịch thuỷ phân casein: Chứa nhiều amino acid.

- Dịch chiết nấm men: Có hàm lượng khá cao các vitamin nhóm B.
- Nước ép các loại củ quả: Nước ép cà chua, cà rốt, nước ép chuối xanh…
2.3.4.5. Các thành phần khác
- Agar: Chiết xuất từ rong biển, thành phần của agar gồm một số chất hữu
cơ như acid hữu cơ, acid béo, cùng một số nguyên tố vô cơ như Cu, Fe, Zn...
Ngoài tác dụng tạo gel cho môi trường, agar cũng cung cấp một số chất dinh
dưỡng cho tế bào, mô nuôi cấy.
- Than hoạt tính: Dùng để hấp thụ chất màu, các hợp chất thứ cấp gây ức
chế sinh trưởng của mẫu ni cấy. Ngoài ra, có thể sử dụng mợt sớ chất chống
oxy hoá khác như polyvinyl pyrolodon (PVP), acid ascobic.

Luận văn nghiên cứu khả năng nhân nhanh lan hài trần liên (paphiopedilum tranlienianum) bằng phương pháp in vitro

Tài liệu liên quan

Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về