Hoàn thiện phương pháp và nghiên cứu sự đa dạng di truyền của cây mắm đen

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
***000***





KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP



HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA
DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY MẮM ĐEN (Avecinnia officinalis)
Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ
BẰNG KỸ THUẬT RAPD



Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2003 - 2007
Sinh viên thực hiện: NGÔ TRẦN VŨ


Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2007

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

************




KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP



HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA
DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY MẮM ĐEN (Avecinnia officinalis)
Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ
BẰNG KỸ THUẬT RAPD





Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện:
TS. BÙI MINH TRÍ NGÔ TRẦN VŨ





Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2007

iii
LỜI CẢM TẠ

Con xin thành kính ghi ơn Ba, Mẹ cùng ngƣời thân trong gia đình luôn quan
tâm, tạo điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập.
Tôi xin chân thành cảm ơn:
- Ban giám hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm đã tạo điều kiện cho tôi trong suốt
thời gian học tập và thực tập.
- Các Thầy, Cô giáo trong bộ môn CNSH và các Thầy, Cô đã trực tiếp giảng dạy
trong suốt quá trình học tập 4 năm qua.
- Thầy Bùi Minh Trí đã tận tình hƣớng dẫn và động viên trong suốt thời gian
thực hiện đề tài.
- Các anh chị trong Trung tâm Phân tích Hoá sinh Trƣờng Đại học Nông Lâm đã
tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
- Các anh chị ở Ban quản lý rừng Cần Giờ đã tận tình giúp đỡ tôi trong thời gian
làm đề tài.
- Toàn thể lớp CNSH29 thân yêu đã động viên và giúp đỡ tôi trong suốt 4 năm
học.



Tp. Hồ Chí Minh Tháng 9 năm 2007
Sinh viên thực hiện
Ngô Trần Vũ

iv

TÓM TẮT

Ngô Trần Vũ, Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh. Tháng 9/2007 “HOÀN
THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY
MẮM ĐEN (Avecinnia officinalis) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP
MẶN CẨN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD”
Giáo viên hƣớng dẫn:
TS. BÙI MINH TRÍ
Rừng ngập mặn Cần Giờ đƣợc xem là “lá phổi xanh” của Thành phố với chức
năng điều hòa không khí, giảm ô nhiễm môi trƣờng xử lý nƣớc thải của Thành phố,
thu nhận khí CO
2
và cho ra khí O
2
do hoạt động công nghiệp. Để có một chiến lƣợc
lâu dài và bền vững thì việc đánh giá mức độ di truyền của quần thể này nhằm có
chiến lƣợc bảo tồn nguồn gen quý hiếm.
Kết quả đạt đƣợc:
- Thu thập 50 mẫu lá mắm đen với những đặc điểm hình thái cây khác nhau.
- Xác định điều kiện bảo quản cho tối ƣu.
- Hoàn thiện qui trình ly trích DNA.
- Primer OPA10 và OPA5 không cho kết quả phản ứng RAPD-PCR.
- Primer OPD18 cho sản phẩm nhƣng chƣa đƣợc tối ƣu.

- Primer 1 cho một band kích thƣớc 400bp nên không có ý nghĩa trong nghiên
cứu đa dạng di truyền.
- Bƣớc đầu khảo nghiệm primer OPAC10, xác định điều kiện tối ƣu cho primer.
- Nghiên cứu đa dạng di truyền cây mắm trên primer OPAC10 của 11 mẫu thu
đƣợc trung bình 5,4 band/mẫu. Tỷ lệ đồng hình 62,5% và tỷ lệ đa hình 37,5%
trong đó 5 band đồng hình và 3 band đa hình. Phân tích trên phân mềm
NTSYSpc 2.1, cây phân nhóm di truyền cho đồng hình khá cao. Cây phân
nhóm di truyền chia làm 2 nhóm, nhóm I có hệ số đồng dạng di truyền cao
0,875-1. Nhóm 2 thu đƣợc một nhánh do không đủ điều kiện thực hiện trên
nhiều mẫu.




v

SUMMARY

Ngo Tran Vu, Nong Lam University, 9/2007. “RESEARCH ON METHOD
DEVELOPMENT AND GENETIC DIVERSITY EVALUATION OF Avecinnia
officinalis IN CAN GIO MANGROVE BIOPHERE RESERVE AREA BY RAPD-
PCR”.
Supervisor:
Bui Minh Tri
Can Gio mangrove forest was economic and environmental value, it was very
important for air-condition and waste water treatment of Ho Chi Minh City. Can Gio
mangrove forest had rich and diversified floristic composition. So, studying genetic
diversity of Avecinnia officinalis tree aimed conserve genetic resource gene.
The obtained results were:
- To collect 50 samples leaf with many tree different characteristic.

- Optimized process extraction DNA for Avecinnia officinalis tree.
- Optimized RAPD-PCR reaction for primer OPAC10.
- To use software NTSYSpc 2.1 analyses for 11 samples. Polymorphism had 3
band and rate 37, 5%, isomorphism had 5 band and rate 62, 5%.








vi
MỤC LỤC

Trang tựa
Lời cảm tạ ........................................................................................................................... iii
Tóm tắt ................................................................................................................................ iv
Summary ............................................................................................................................. v
Mục lục ............................................................................................................................... vi
Danh sách các bảng ............................................................................................................ ix
Danh sách các hình ............................................................................................................. x
Danh sách các chữ viết tắt .................................................................................................. xi
Chƣơng 1: GIỚI THIỆU ................................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................................ 1
1.2. Mục đích, yêu cầu và giới hạn đề tài ....................................................................... 2
1.2.1. Mục đích .................................................................................................................. 2
1.2.2. Yêu cầu .................................................................................................................... 2
1.2.3. Giới hạn đề tài ......................................................................................................... 2
Chƣơng 2: TỒNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................................. 3

2.1. Tổng quan về khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn ............................................. 3
2.1.1. Giới thiệu khu vực dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn ............................................ 3
2.1.2. Vai Trò của khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ .................................. 4
2.2. Một số khái niệm về đa dạng sinh học .................................................................... 5
2.2.1. Đa dạng sinh học ..................................................................................................... 5
2.2.2 Sự đa dạng di truyền ................................................................................................ 5
2.2.3. Ý nghĩa của việc nghiên cứu và bảo vệ sự đa dạng di truyền ................................. 6
2.3. Đặc điểm sinh vật học và hình thái học của cây mắm đen ..................................... 6
2.3.1. Hình thái học ........................................................................................................... 6
2.3.2. Phân bố ................................................................................................................... 8
2.3.3. Vai trò của rừng mắm ............................................................................................. 9
2.4. Các kỹ thuật trong tách chiết DNA ......................................................................... 9
2.4.1. Các thông tin di truyền ............................................................................................ 9
2.4.2. Phƣơng pháp tách chiết DNA ............................................................................... 10



vii
2.4.3. Đánh giá chất lƣợng DNA ..................................................................................... 11
2.4.3.1. Định lƣợng DNA bằng quang phổ kế .................................................................. 11
2.4.3.2. Định tính DNA bằng phƣơng pháp điện di .......................................................... 12
2.5. PCR (polymerase chain reaction) .......................................................................... 12
2.5.1. Nguyên tắc ............................................................................................................ 12
2.5.2. Thành phần cơ bản của phản ứng PCR ................................................................. 14
2.5.3. Các yếu tố ảnh hƣởng tới PCR .............................................................................. 14
2.5.4. Ƣu điểm và nhƣợc điểm ........................................................................................ 14
2.6. Một số chỉ thị phân tử trong nghiên cứu đa dạng sinh học .................................. 15
2.6.1. Chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) ............................... 15
2.6.2. Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) ..................................... 16
2.6.3. Chỉ thị AFLP ......................................................................................................... 17

Chƣơng 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ............................................................... 20
3.1. Nội dung đề tài ...................................................................................................... 20
3.2. Thời gian thực hiện đề tài ...................................................................................... 20
3.3. Vật liệu .................................................................................................................. 20
3.3.1. Mẫu mắm đen ........................................................................................................ 20
3.3.2. Hóa chất thí nghiệm .............................................................................................. 21
3.3.2.1. Các hóa chất dùng trong ly trích DNA .................................................................. 21
3.3.2.2. Hóa chất dùng trong kiểm tra định lƣợng DNA ................................................... 22
3.3.2.3. Hóa chất dùng trong định tính DNA ..................................................................... 22
3.3.2.4. Hóa chất dùng để phản ứng RAPD ....................................................................... 22
3.3.3. Trang thiết bị ......................................................................................................... 22
3.4. Phƣơng pháp ......................................................................................................... 23
3.4.1. Đối tƣợng nghiên cứu ............................................................................................ 23
3.4.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ...................................................................................... 23
3.4.3. Cách bố trí thí nghiệm .......................................................................................... 23
3.4.4. Phƣơng pháp ly trích DNA .................................................................................... 23
3.4.4.1. Quy trình ly trích mẫu tƣơi Doyle và Doyle (1988).............................................. 23
3.4.4.2. Quy trình ly trích DNA bằng nitơ lỏng ................................................................. 24
3.4.4.3. Định tính DNA bằng phƣơng pháp điện di .......................................................... 25



viii
3.4.4.4. Phƣơng pháp định lƣợng DNA bằng quang phổ kế .............................................. 25
3.4.5. Thực hiện phản ứng RAPD-PCR .......................................................................... 26
3.4.5.1. Primer sử dụng ...................................................................................................... 26
3.4.5.2. Bố trí thí nghiệm .................................................................................................... 26
3.4.6. Phân tích kết quả bằng phần mềm NTSYSpc ....................................................... 30
Chƣơng 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................... 32
4.1. Thu thập mẫu tại các tiểu khu rừng ngập mặn Cần Giờ ........................................ 32

4.2. Bảo quản và ly trích vật liệu di truyền ................................................................. 33
4.2.1. Bảo quản ................................................................................................................ 33
4.2.2. Ly trích vật liệu di truyền ...................................................................................... 33
4.3. Kết quả phản ứng RAPD-PCR .............................................................................. 37
Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................................... 45
5.1. Kết luận ................................................................................................................. 45
5.2. Đề nghị .................................................................................................................. 45
Chƣơng 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................... 47


















ix
DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1. Thành phần hóa chất dung dịch ly trích EB .................................................... 19

Bảng 3.2. Thành phần hóa chất TE 1X ............................................................................ 19
Bảng 3.3. Danh sách các primer dùng trong nghiên cứu ................................................. 23
Bảng 3.4. Thành phần hóa chất cho phản ứng RAPD-PCR của thí nghiệm 1 ................. 24
Bảng 3.5. Chu trình nhiệt cho phản ứng RAPD-PCR của thí nghiệm 1 .......................... 24
Bảng 3.6. Thành phần hóa chất cho phản ứng RAPD-PCR của thí nghiệm 2 ................ 25
Bảng 3.7. Chu trình nhiệt cho phản ứng RAPD-PCR của thí nghiệm 2 .......................... 25
Bảng 3.8. Thành phần hóa chất cho phản ứng RAPD-PCR của thí nghiệm 3 ................. 26
Bảng 3.9. Chu trình nhiệt cho phản ứng RAPD-PCR của thí nghiệm 3 .......................... 26
Bảng 3.10. Thành phần hóa chất cho phản ứng RAPD-PCR của thí nghiệm 4 ................. 27
Bảng 3.11. Chu trình nhiệt cho phản ứng RAPD-PCR của thí nghiệm 4 .......................... 27
Bảng 4.1. Bảng OD của 6 mẫu nghiền theo qui trình cải tiến.......................................... 34

x
DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1. Hình dáng cây mắm đen ................................................................................... 6
Hình 2.2. Lá và hoa của cây mắm đen .............................................................................. 7
Hình 2.3. Trái của cây mắm đen ....................................................................................... 7
Hình 2.4. Nguyên tắc hoạt động của phản ứng PCR ...................................................... 12
Hình 2.5. Nguyên tắc của kỹ thuật RFLP ....................................................................... 14
Hình 2.6. Nguyên tắc hoạt động của kỹ thuật RAPD ..................................................... 15
Hình 4.1. Bản đồ vị trí lấy mẫu mắm đen ở Cần Giờ ..................................................... 32
Hình 4.2. Ly trích DNA theo qui trình Doyle và Doyle (1988) ..................................... 33
Hình 4.3. Ly trích theo qui trình Doyle và Doyle (1988) cải tiến ................................. 34
Hình 4.4. Ly trích DNA theo qui trình nitơ lỏng ........................................................... 36
Hình 4.5. Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RAPD-PCR với primer OPA10 và
OPA5 .............................................................................................................. 37
Hình 4.6. Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RAPD-PCR với primer RAH8 ............. 38
Hình 4.7. Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RAPD-PCR với primer 1 ...................... 39
Hình 4.8. Kích thƣớc band phản ứng RAPD-PCR của primer 1 .................................... 39
Hình 4.9. Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RAPD-PCR với primer OPAC10 ......... 40
Hình 4.10. Kết quả điện di sản phẩm của thí nghiệm 2 .................................................... 41
Hình 4.11. Kết quả điện di sản phẩm của thí nghiệm 3 .................................................... 41
Hình 4.12. Kết quả điện di sản phẩm RAPD-PCR của mồi OPAC10 khi đã tối ƣu ........ 42
Hình 4.13. Cây phân nhóm di truyền của 11 mẫu mắm đen ............................................ 43

xi
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT


A1, A2, A3… Mẫu 1, mẫu 2, mẫu 3…
AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism
Bp: Base pairs
CNSH Công nghệ sinh học
CTAB: Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide
ĐBSCL Đồng Bằng Sông Cửu Long
dNTP:

Deoxyribonucleotide triphosphate
EB: Extraction buffer
EDTA: Ethylene Diamine Tetra acetic Acid
GPS Global Position System
L: Lƣợng
Nđ: Nồng độ
OD: Optical density
PCR: Polymerase Chain Reaction
RAPD: Random Amplified Polymorphic DNA
RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism
TAE: Tris – Acetate – EDTA
TE: Tris – EDTA

WWF: World Wildlife Fund (quỹ quốc tế về bảo tồn thiên nhiên)









1
Chƣơng 1
GIỚI THIỆU

1.1. Đặt vấn đề
Mắm là một nhóm các loại cây rừng ngập mặn, phân bố trong các vùng bờ biển
nằm trong khoảng giữa triều lên và triều xuống về phía Nam của Bắc chí tuyến. [13]
Trƣớc đây, ở Việt Nam cây mắm dùng làm ghe, thuyền, cất nhà và làm củi.
Ngày nay, cây mắm cũng cung cấp nguyên liệu cho việc chế biến dƣợc và cung cấp
sắc tố cho công nghiệp. [15]
Trong chiến tranh chống Mỹ, rừng ngập mặn Cần Giờ phải chịu hàng ngàn tấn
bom đạn cùng với đó là một lƣợng hóa chất khổng lồ đã đổ xuống đây làm cho rừng bị
tàn phá khủng khiếp. Do vậy, từ năm 1978 huyện Cần Giờ đã tiến hành khôi phục lại
hệ sinh thái rừng ngập mặn, sau 22 năm khôi phục tổ chức UNESCO đã công nhận là
“khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ” vào ngày 21/02/2000.[10]
Khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ có vai trò vô cùng quan trọng về kinh tế và môi
trƣờng, là khu làm sạch môi trƣờng sinh thái, môi trƣờng nƣớc và không khí Thành
phố đã bị ô nhiễm nghiêm trọng. Rừng ngập mặn Cần Giờ vừa là rừng phòng hộ, vừa
là rừng bảo vệ Thành phố Hồ Chí Minh [2]. Vì thế việc nghiên cứu đa dạng di truyền
của cây mắm là vô cùng cấp thiết nhằm có chiến lƣợc quản lý và phát triển khu dự trữ

sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ. Chúng ta cũng có thể tìm ra chỉ thị phân tử cho
cây mắm và bảo tồn nguồn gene quý.
Đƣợc sự phân công của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học Trƣờng Đại học Nông
Lâm Tp. Hồ Chí Minh dƣới sự hƣớng dẫn của thầy Bùi Minh Trí chúng tôi đã thực
hiện đề tài “HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG
DI TRUYỀN CỦA CÂY MẮM ĐEN (Avicennia officinalis) Ở KHU DỰ TRỮ
SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD”.





2
1.2. Mục đích, yêu cầu và giới hạn đề tài
1.2.1. Mục đích
 Thiết lập và hoàn thiện quy trình ly trích DNA của cây mắm đen.
 Tối ƣu hóa phƣơng pháp RAPD cho cây mắm đen.
 Thông qua kỹ thuật RAPD đánh giá mức độ đa dạng di truyền của quần thể
mắm đen.
 Tìm ra chỉ thị phân tử cho họ mắm giúp cho quá trình chọn giống.
1.2.2. Yêu cầu
 Thu thập mẫu lá cây mắm đen.
 Ly trích DNA mẫu lá cây mắm đen.
 Hoàn thiện kỹ thuật RAPD cho cây mắm đen.
 Đánh giá đa dạng di truyền của quần thể cây mắm đen.
 Mô tả quan hệ di truyền của các mẫu cây mắm đen bằng phần mềm NTSYSpc.
1.2.3. Giới hạn đề tài
 Đề tài chỉ nghiên cứu quần thể một số tiểu khu trong khu dự trữ sinh quyển
rừng ngập mặn.
 Số lƣợng mẫu nghiên cứu còn ít.

 Chƣa đủ điều kiện tiến hành kiểm tra tất cả các primer và các tổ hợp các primer.
 Thời gian thực hiện ngắn từ 05/05/2007 đến 01/09/2007.









3
Chƣơng 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Tổng quan về khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn
2.1.1. Giới thiệu khu vực dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn
Khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ nằm ở vùng ven biển vịnh Gềnh Rái và cửa
sông Đồng Nai với hệ sinh thái rừng ngập mặn đặc trƣng, có diện tích gần 71,370 ha.
Rừng ngập mặn đƣợc xem là hệ sinh thái quan trọng, điển hình ở vùng ven biển nhiệt
đới không chỉ cung cấp lâm sản có giá trị mà còn là nơi cƣ trú của nhiều loài hải sản,
chim nƣớc, chim di cƣ và một số loài động vật lƣỡng cƣ trên cạn. [10]
Rừng ngập mặn Cần Giờ có cấu trúc địa chất khác xa khu vực rừng ngập mặn
Minh Hải, nền thổ nhƣỡng chủ yếu là các loại đất phát triển giàu hữu cơ, bị mặn nặng
và đất phèn tiềm tàng cận duyên nên hệ sinh thái môi trƣờng rừng ngập mặn Cần Giờ
mang nét đặc thù riêng so với các rừng ngập mặn khác của Việt Nam. [2]
Tên gọi và phân bố:
Tên chính thức: Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ, Tp Hồ Chí
Minh.
Tên ngắn gọn: Khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ.

Vĩ độ Bắc: 10
0
22’14” – 10
0
37’39”
Kinh độ Đông: 106
0
46’12” – 107
0
00’59”
Phía Bắc giáp với huyện Long Thành của tỉnh Đồng Nai.
Phía Đông giáp biển Vũng Tàu.
Phía Nam giáp với sông Đồng Tranh.
Phía Tây giáp với huyện Nhà Bè của Thành phố HCM.[10]
Khí hậu Cần Giờ chia làm hai mùa rõ rệt, mùa mƣa từ tháng 5 – 10 và mùa
nắng từ tháng 11 – 4, nhiệt độ trung bình ở đây 25,8
0
C. Địa hình khá bằng và bị chia
cắt bởi các sông lớn nhƣ: sông Sài Gòn, sông Đồng Nai, sông Đồng Tranh. Tạo nên
những đảo nhỏ liên kết với nhau. Mức độ mặn giảm dần khi đi vào nội địa. Tại Bình



4
Khánh độ ngập mặn chỉ xấp xỉ 0,6 – 1%, tại Dần Xầy đã xấp xỉ 2% và tại Hào Võ là
3%. Tùy theo mùa và lƣợng nƣớc do các sông Sài Gòn và Đồng Nai cung cấp mà độ
mặn chênh lệch khác nhau. Do vậy, chúng đã tạo nên sự phong phú về tiềm năng và sự
đa dạng sinh học trong vùng. Đã có trên 100 loài thực vật tự nhiên trong đó có 51 loài
có giá trị kinh tế để làm nguyên liệu cho tiểu thủ công nghiệp và một số cây thuốc
chữa bệnh. Phần quan trọng hơn với thảm thực vật chịu mặn ở Cần Giờ là có khả năng

cung cấp chất hữu cơ cho đất và đây là nguồn dinh dƣỡng quan trọng cho vi sinh vật
bậc thấp sinh sống, đồng thời là nguồn dinh dƣỡng không thể thiếu cho sinh vật phù du
tham gia vào dây chuyền thức ăn và liên hệ với động thực vật trong rừng ngập mặn.
[2]
Tại rừng ngập mặn Cần Giờ chủ yếu là sự hiện diện của cây đƣớc (Rhziophora
apiculata), cây mắm trắng (Avicennia alba), đƣng (Rhzophora mucronata), vẹt
(Sonneratia alba), xu (Xylocarpus spp), cóc (Lumnizera spp), chà là (Phoenix
paludosa), giá (Excoecaria aagallocha), mắm đen (Avicennia officinalis), v.v… và nó
thể hiện quy luật diễn thế thảm thực vật rừng ngập mặn, theo độ cao địa một hình rõ
rệt và nhạy cảm. [14]
2.1.2. Vai trò của khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ
Điều tiết khí hậu, giảm thiểu ô nhiễm không khí. Rừng ngập mặn Cần Giờ với
độ che phủ cao chính là “lá phổi xanh” của Thành phố. Đây là vùng xử lý khí độc, góp
phần làm bầu không khí trong lành, điều tiết nhiệt độ, độ ẩm, ngăn cản gió bão. Với
một Thành phố trên 5 triệu ngƣời cùng với hàng chục đô thị, khu công nghiệp ở Bà
Rịa - Vũng Tàu, Đồng Nai, hàng ngàn cơ sở sản xuất, hàng triệu xe có động cơ mà
không có rừng này chắc chắn sức khỏe của ngƣời dân sẽ bị ảnh hƣởng xấu. [13]
Xử lý nƣớc thải và các tác nhân ô nhiễm từ đất liền. Các bãi bồi vùng rừng ngập
mặn vừa có tác dụng ngăn sóng, cản trở xói mòn bờ biển, vừa có giá trị to lớn trong
việc phân hủy theo cơ chế sinh hóa các tác nhân ô nhiễm từ Thành phố, các khu công
nghiệp do sông thải ra. Nếu bê tông hóa các bãi bồi này phần lớn chất ô nhiễm sẽ đƣợc
chuyển ra vịnh Gành Rái gây ô nhiễm biển, gây suy giảm nghề thủy sản và du lịch cho
Cần Giờ, Vũng Tàu, Đồng Nai, Long An. Nhiều nghiên cứu cho thấy muốn làm sạch
các kênh Nhiêu Lộc, Thị Nghè, Tân Hóa - Lò Gốm, Tham Lƣơng và xử lý nƣớc thải
sinh hoạt khu vực Thành phố Hồ Chí Minh phải cần đến 300 - 500 triệu USD để xây



5
dựng các công trình. Nhƣ vậy, giá trị kinh tế vùng sinh thái ngập mặn Cần Giờ Nhà Bè

trong việc xử lý chất thải cũng có thể tính đến nhiều trăm triệu USD. Điều này ít nhà
qui hoạch, nhà kinh tế tính tới. [13]
Vùng sinh thái ngập mặn Cần Giờ có giá trị kinh tế cao về mặt thủy sản. Đây là
vùng sinh sản, cƣ trú và phát triển của nhiều loài tôm, cá, cua. Thực tế đã chứng minh
rằng ở Thái Lan, Malaixia, ở ĐBSCL cũng nhƣ ở Cần Giờ, nơi nào rừng ngập mặn bị
phá nhiều cũng dẫn tới suy giảm nguồn lợi thủy sản và năng suất tôm nuôi do mất nơi
cƣ trú và gia tăng ô nhiễm nguồn nƣớc. [13]
2.2. Một số khái niệm về đa dạng sinh học
2.2.1. Đa dạng sinh học
Đa dạng sinh học có nghĩa là sự phong phú, đa dạng của các dạng sống hiện
đang tồn tại trên Trái đất.
Theo quỹ quốc tế về bảo tồn thiên nhiên – WWF (World Wildlife Fund) (1989),
đa dạng sinh học đƣợc định nghĩa nhƣ sau: “Đa dạng sinh học là sự phồn thịnh của sự
sống trên trái đất, là hàng triệu loài thực vật, động vật và vi sinh vật, là các gen chứa
đựng trong các loài và là những hệ sinh thái vô cùng phức tạp tồn tại trong môi
trƣờng”.
Đa dạng sinh học đƣợc biết ở ba mức độ.
 Sự đa dạng của hệ sinh thái.
 Sự đa dạng của loài.
 Sự đa dạng di truyền hay là sự đa dạng nguồn gen bên trong loài.
2.2.2. Sự đa dạng di truyền
Các cá thể trong một quần thể thƣờng có bộ gen khác nhau. Sự đa dạng về bộ
gen đƣợc biểu hiện qua sự khác nhau về gen giữa các cá thể. Những alen khác nhau
của cùng một gen có thể làm cho sự phát triển các đặc điểm sinh lý ở mỗi cá thể khác
nhau là khác nhau. Những cây trồng đƣợc lai ghép hay những động vật đƣợc lai tạo từ
những bộ gen khác nhau có thể tạo ra những giống cây trồng, vật nuôi cho năng suất
cao, khả năng chống chịu sâu bệnh tốt.
Trong quá trình sinh sản hữu tính, kiểu gen của các cá thể trong quần thể sẽ
tăng lên do kết quả tái tổ hợp.

6
Các gen đa hình là nguyên nhân dẫn đến sự tồn tại các kiểu gen dị hợp trong
quần thể. Sự khác biệt về kiểu gen của các cá thể trong quần thể cho phép các quần thể
này thích nghi hơn với những thay đổi môi trƣờng.
2.2.3. Ý nghĩa của việc nghiên cứu và bảo vệ sự đa dạng di truyền
Đa dạng di truyền là đòi hỏi của bất kỳ loài nào để đảm bảo sự sinh sản, chịu
đựng bệnh tật và khả năng thích nghi với điều kiện môi trƣờng luôn luôn thay đổi.
Bảo tồn nguồn gen không chỉ nhằm ngăn chặn sự tuyệt chủng của một loài mà
bảo tồn nguồn gen còn nhằm ngăn chặn sự mất mát của các gen, các phức hợp gen và
các kiểu hình, ngăn chặn sự tuyệt chủng các nòi địa lý (landraces) mà vốn gen của
chúng bị suy giảm nghiêm trọng tới mức một số gen và một số phức hợp gen có thể bị
mất đi, tiềm năng di truyền của loài bị giảm mạnh, và trong trƣờng hợp xấu nhất là sự
tuyệt chủng của loài.
2.3. Đặc điểm sinh vật học và hình thái học của cây mắm đen
Tên Việt Nam: Cây mắm đen
Tên Latin: Avicennia officinalis
Giới (regnum): Plantae
Ngành (divisio): Magnoliophyta
Lớp (class): Magnoliopsida
Bộ (ordo): Lamiales
Họ (familia): Avicenniaceae
Chi (genus): Avicennia
2.3.1. Hình thái học
Hình dáng : Cây mắm đen cao tối đa có thể tới 20 m, đƣờng kính đến 0,7 m,
thân hình trụ, tƣơng đối suôn, có khi thẳng với thân trụ cao 6 – 10 m, cành non có lông
tơ trơn, vỏ mỏng không nứt màu xám đen, rễ phổi hình đũa, thƣờng chia đôi. [11]

7










Hình 2.1. Hình dáng cây mắm đen
Lá: Lá đơn, mọc đối, đầu tròn lúc cây còn nhỏ, sau có hình trứng ngƣợc, dài
6 – 8 cm, rộng 2,5 – 4 cm, chân nêm, bìa lá thƣờng cuốn xuống, mặt trên xanh, trơn,
mặt dƣới có lông rất mịn, sát, màu vàng hung, gân rõ, các đầu gân phụ cong ở đầu, nối
với bìa, cuống lá trơn dài 0,5 – 1 cm.[11]
Hình 2.2. Lá và hoa của cây mắm đen
Hoa: Hoa nhỏ, dài 10 mm, vàng, có mùi thơm, hợp thành phát hoa kép dày ở
ngọn, thƣờng có 3 nhánh hoa, mỗi hoa có lá bắc phụ nhỏ hình bầu dục, có lông tơ, đài
hoa không rụng, lớn, các tai đài bằng nhau, hình bầu dục, có lông trắng mịn ở dƣới
thấp, dài 5 – 6 mm, màu đen, vành hoa lớn, hình ống, dài bằng đài, màu vàng cam,
ngoài trơn, dài 2 – 4 mm, dính ở dƣới, trên có 4 thùy không bằng nhau rụng sớm, 4

8
tiểu nhị, bầu noãn hình nón, có lông trắng mịn, vòi nhụy hình sợi dài trắng, có lông
rậm, đầu nhụy chẻ hai, uốn cong. [11]
Trái: Trái là manh nang hình trứng gốc tròn, đầu có mũi nhọn, dài 2 – 3 cm có
khi đến 3,8 cm. Mầm xanh đỏ dợt, vỏ đầy lông vàng mịn, 01 hột, không phôi nhũ, nẩy
mầm trƣớc khi trái rụng. [11]
Hình 2.3. Trái của cây mắm đen
2.3.2. Phân bố
Rừng Sát Việt Nam (Cà Mau, Long Hải) Pakistan, Ấn Ðộ, Myanma, Philippin,
Malaixia, Inđônexia, Nouvelle Guinee, Saloman, Caroline,... là loại cây ƣa sáng, sinh
trƣởng nhanh, thuộc loại chịu đất kiềm, thích nghi với các loại đất (bùn, cát, sét) và
các độ mặn của nƣớc (mặn, lợ, ngọt), cho chồi gốc. Tại Cà Mau, cây trổ hoa vào đầu
mùa mƣa (4 - 6 dƣơng lịch), cho trái vào cuối mùa mƣa (9 - 11 dƣơng lịch), vài giờ
sau khi rụng, cây mầm hút nƣớc lớn ra, làm vỡ lớp vỏ trái bao ngoài. Rừng sát Việt
Nam thƣờng chiếm những diện tích mới bồi ven biển, mực thủy triều lên xuống hàng
ngày. Nói chung, "Ðất bùn có nƣớc triều lên xuống hàng ngày" là đất sinh trƣởng, phát
triển thích hợp của loài cây gỗ này. Tại Cà Mau, cây có thể cao đến 22 – 25 m với đƣờng
kính 15 – 20 cm. [11]
2.3.3. Vai trò của rừng mắm đen
Mắm đen là loại cây có sinh khối lớn, gỗ mắm đen đƣợc sử dụng rộng rãi đóng
nhà cửa, đóng vật dụng, làm bè thuyền, cung cấp nguyên liệu cho làm giấy, nguyên
liệu cho làm dƣợc phẩm, cung cấp sắc tố cho công nghiệp thuộc da. [15]



9
Đặc điểm của cây mắm đen là có rễ đất và rễ phổi. Rễ phổi có nhiệm vụ hấp thụ
dƣỡng khí, là biện pháp sinh tồn khi nền đất ngập mặn. Rễ phổi cũng là "kiến trúc" của

thiên nhiên thích ứng để bảo vệ đất bồi [15]. Bên cạnh đó, rừng mắm đen có vai trò
quan trọng hơn là làm cân bằng hệ sinh thái, làm dịu mát khí hậu, cung cấp một lƣợng
lớn O
2
và cùng với đó là hấp thu một lƣợng lớn CO
2
làm môi trƣờng trong lành. Ngoài
ra, rừng mắm đen là nơi cƣ trú của nhiều loài động vật hoang dã quý hiếm. [2]
Do vậy, việc nghiên cứu tính đa dạng di truyền của cây mắm đen là vô cùng
quan trọng nhằm giúp cho chúng ta có chiến lƣợc quản lý và bảo vệ để bảo tồn nguồn
gene quý hiếm ở Việt Nam nói riêng và trên thế giới nói chung. Cây mắm đen ở Việt
Nam cũng nhƣ trên thế giới thật sự chƣa có tài liệu nghiên cứu kĩ về tính đa dạng di
truyền của quần thể cây này.
2.4. Các kỹ thuật trong tách chiết DNA
2.4.1. Các thông tin di truyền
Theo lý thuyết trung tâm của sinh học phân tử (Crick, 1958), thông tin di truyền
đƣợc mang bởi chuỗi DNA (hay RNA ở vài virus), qua các giai đoạn sao chép và dịch
mã, sẽ đƣợc chuyển thành các trình tự amino acid của protein.
Nucleic acid, vật liệu mang thông tin di truyền của các hệ thống sống, là một
polymer hình thành từ các monomer là nucleotide. Mỗi nucleotide gồm ba thành phần:
Nhóm phosphate, đƣờng pentose (đƣờng 5C) và một base hữu cơ (vì các nucleotide
chỉ khác nhau ở base nên ngƣời ta thƣờng dùng từ “base” thay cho “nucleotide”).
Các base hữu cơ thuộc hai nhóm: Các purine gồm Adenine (A) và Guanine (G),
các pyrimidine gồm Thymine (T), Cytosine (C) và Uracine (U). Các nucleotide đƣợc
nối với nhau bằng liên kết phosphodiester tạo thành chuỗi dài.
Nucleic acid gồm hai loại phân tử có cấu tạo rất giống nhau là deoxyribonucleic
acid (DNA) và ribonucleic acid (RNA). DNA cũng nhƣ RNA đƣợc tạo bởi nhiều
nucleotid nối nhau nhờ các cầu nối ester. Tuy nhiên, có ba đặc tính của DNA giúp ta
phân biệt DNA và RNA.
 Đƣờng của DNA là deoxyribose, trong khi đó đƣờng của RNA là ribose.

 Các base tạo nên các nucleotid của DNA là A, G, C, và T. Các base tạo nên
nucleotid của RNA là A, G, C và U.



10
 Phân tử DNA thông thƣờng đƣợc tạo bởi hai chuỗi nucleotid, trong khi đó RNA
thông thƣờng chỉ có một chuỗi. Tuy nhiên, có vài trƣờng hợp ngoại lệ RNA của
một số virus có hai chuỗi nucleotide.
Ở sinh vật Eucaryote, thông tin di truyền là phân tử DNA, là một chuỗi xoắn
kép gồm hai mạch đơn, mỗi mạch đơn là một chuỗi nucleotide. Mỗi nucleotide gồm
nhóm phosphate, đƣờng deoxyribose và một trong bốn loại base (A, C, G, T). Hai
mạch đơn liên kết với nhau nhờ liên kết hydro, giữa NH
2
và CO, N và NH. Do đó, A
bổ sung cho T có hai nối hydrogen, G bổ sung cho C có ba nối hydrogen, tỷ lệ giữa
A/T=1 và G/C=1. Tuy nhiên, tỷ lệ (A+T)/(G+C) rất hay thay đổi giữa các DNA khác
nhau và đặc trƣng cho loài. Mỗi mạch đơn là một trình tự có định hƣớng với một đầu
là 5’ phosphate tự do và một đầu là 3’ hydroxyl tự do (hƣớng quy ƣớc là 5’ 3’).
Hƣớng của hai mạch đơn trong chuỗi xoắn kép ngƣợc nhau và gọi chúng là hai mạch
đối song song. Hai mạch đơn liên kết với nhau bởi tính chất bổ sung. Chính tính chất
này giải thích đƣợc cấu trúc chặt chẽ của phân tử DNA, đặc biệt là cách thức tự sao
chép để tạo ra hai phân tử con từ một phân tử. [9]
2.4.2. Phƣơng pháp tách chiết DNA
Phƣơng pháp tách triết DNA cơ bản gồm ba bƣớc:
Bƣớc1: Phá màng tế bào và màng nhân (Eucaryote). Thông thƣờng ngƣời ta
nghiền tế bào, mô trong hợp chất tẩy (nhƣ SDS, sarcosyl) và Proteinase (Proteinase
K). Hỗn hợp này sẽ phá vỡ màng tế bào và màng nhân, giải phóng DNA ra môi trƣờng
đồng thời phá hủy các protein liên kết với DNA.
Bƣớc 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu là các

protein. Mẫu đƣợc lắc thật mạnh trong dung dịch Phenol và Chloroform, dung dịch
Phenol và Chloroform có tác dụng làm biến tính protein đồng thời không hòa tan acid
nucleic. Protein khi bị biến tính sẽ không hòa tan trong pha nƣớc có chứa acid nucleic
và sau khi ly tâm sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha nƣớc và pha Phenol:Chloroform.
Pha nƣớc có chứa acid nucleic đƣợc thu nhận lại.
Bƣớc 3: Tủa acid nucleic. Mục đích tủa là nhằm thu acid nucleic dƣới dạng cô
đặc, một mặt bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme, mặt khác ta có thể hòa
tan chúng lại trong dung dịch theo nồng độ mong muốn. Có hai phƣơng pháp tủa
thƣờng dùng :



11
 Tủa trong Ethanol (Ethylic alcohol), việc tủa này đƣợc thực hiện trong môi
trƣờng có lực ion cao (nồng độ muối cao) và nồng độ Ethanol cao (2,5 dung
tích Ethanol/1dung tích mẫu), nhiệt độ thấp tạo thuận lợi cho việc tủa.
 Tủa trong Isopropanol, điểm khác biệt so với phƣơng pháp trên là không cần sự
hiện diện của muối, thể tích Isopropanol/thể tích mẫu là 1/1. Các DNA có phân
tử trọng lƣợng nhỏ không bị tủa. Do đó, có thể loại chúng ra khi dùng cách tủa
trong Isopropanol.
Trong hai phƣơng pháp trên có thể thu acid nucleic bằng ly tâm. Sau đó cặn tủa
rửa trong Ethanol 70% để loại các muối hoặc Isopropanol còn dính lại trên mẫu. [5]
Một số vấn đề gặp phải khi ly trích DNA:
 Có lẫn tạp RNA trong mẫu.
 Lẫn tạp chất Polysaccharide trong mẫu DNA.
 DNA bị đứt gẫy.
2.4.3. Đánh giá chất lƣợng DNA
2.4.3.1. Định lƣợng DNA bằng quang phổ kế
Phƣơng pháp này cho phép ƣớc lƣợng tƣơng đối nồng độ nucleic acid có trong
mẫu sau khi ly trích đƣợc. Nguyên tắc của phƣơng pháp này dựa vào sự hấp thụ mạnh

ánh sáng tử ngoại ở bƣớc sóng 260 nm của các base purine và pyrimidine. Giá trị mật
độ quang (OD: Optical density) ở bƣớc sóng 260 nm của các mẫu đo cho phép xác
định nồng độ nucleic acid trong mẫu dựa vào tƣơng quan: 1 đơn vị OD
260nm
tƣơng ứng
với nồng độ 50 µg/ml cho dung dịch chứa DNA mạch kép và 40 µg/ml cho một dung
dịch RNA hay DNA sợi đơn.
Tuy nhiên, cách tính này chỉ đúng với dung dịch chứa nucleic acid sạch. Để
kiểm tra độ sạch của dung dịch, ngƣời ta đo thêm giá trị OD
280nm
. Tại bƣớc sóng
280 nm, protein có mức hấp thụ cao nhất, nhƣng các protein cũng hấp thu bƣớc sóng ở
260 nm nhƣ các nucleic acid và do đó làm sai lệch giá trị thật của nồng độ nucleic
acid. Tỉ số OD
260nm
/OD
280nm
là tỉ số cho thấy độ tinh sạch của DNA. [5]
Tỉ số OD
260nm
/OD
280nm
= 1,8 đối với DNA tinh khiết.
Tỉ số OD
260nm
/OD
280nm
= 2 đối với RNA tinh khiết.

12
2.4.3.2. Định tính DNA bằng phƣơng pháp điện di
Nguyên tắc của phƣơng pháp này dựa vào đặc tính của các nucleic acid. Đó là
các đại phân tử tích điện âm nên khi chịu tác động của một điện trƣờng, chúng sẽ di
chuyển về cực dƣơng của điện trƣờng. Tính linh động của các phân tử này đƣợc phân
tích trên bảng gel, nó phụ thuộc vào hai yếu tố: Khối lƣợng phân tử và nồng độ các
chất cấu thành gel. Việc lựa chọn các loại gel cũng nhƣ nồng độ các chất tạo thành gel
tùy thuộc kích thƣớc trung bình của các đoạn phân tử nucleic acid cần phân tách.
 Gel agarose: Là loại gel thông dụng nhất, dùng để phân tách những đoạn DNA
có kích thƣớc từ 0,5 – 200 kb. Dùng điện di phƣơng ngang.
 Gel polyacrylamide: Đƣợc dùng để phân tách những đoạn có kích thƣớc nhỏ,
dƣới 1000 bp. Dùng điện di phƣơng thẳng đứng.
2.5. PCR (Polymerase Chain Reaction)
Phản ứng PCR do K. B. Mullis (Nobel hóa học, 1993) phát minh ra năm 1985.
Đây là phƣơng pháp in vitro để nhân bản nhanh một đoạn DNA nào đó mà chỉ cần một
khối lƣợng mẫu ban đầu rất nhỏ. Kỹ thuật này có độ nhạy rất cao và đƣợc ứng dụng
trong nhiều lĩnh vực nhƣ sinh học phân tử, chẩn đoán, di truyền quần thể và phân tích
pháp y.
2.5.1. Nguyên tắc
Tất cả Taq DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ
khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn
oligonucleotide có khả năng bắt cặp bổ sung đầu 3’ của khuôn. Taq DNA polymerase
sẽ kéo dài mồi để hình thành sợi mới.
Hiện tƣợng trên chính là cơ sở của phản ứng PCR. Nếu đƣợc cung cấp hai mồi
(mồi xuôi và mồi ngƣợc) có khả năng bắt cặp chuyên biệt với hai đầu của một trình tự
DNA, phản ứng PCR sẽ nhân bản trình tự nằm giữa hai mồi này.

13

Hình 2.4. Nguyên tắc phản ứng PCR
Phản ứng PCR gồm 3 bƣớc:
Bƣớc 1: Biến tính.
Giai đoạn này đƣợc thực hiện ở nhiệt độ cao (94 – 95
0
C) trong vòng 30 giây
đến 1 phút, làm cho phân tử DNA mạch kép tách thành 2 mạch đơn. Chính 2 mạch
đơn này đóng vai trò là mạch khuôn cho sự tổng hợp 2 mạch bổ sung mới.
Bƣớc 2: Bắt cặp.
Nhiệt độ phản ứng giảm xuống để primer bắt cặp với các mạch của DNA khuôn
theo nguyên tắc bổ sung.
Ở giai đoạn này nhiệt độ đƣợc hạ thấp cho phép các primer bắt cặp với DNA
khuôn, nhiệt độ này dao động trong khoảng 30 – 70
0
C, kéo dài trong khoảng 30 giây
đến 1 phút, tùy thuộc vào nhiệt độ nóng chảy T
m
(melting temperature) của các primer
sử dụng. Giai đoạn này gọi là giai đoạn lai.
Bƣớc 3: Kéo dài dây mới nhờ primer.
Nhiệt độ đƣợc tăng lên 72
0
C giúp cho Taq DNA polymerase hoạt động tốt nhất.
Thời gian của giai đoạn này tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA khuếch đại, thƣờng
kéo dài từ 30 giây đến vài phút.
Một chu kỳ gồm 3 bƣớc trên đƣợc lặp đi lặp lại nhiều lần. Kết quả sau cùng ta

có thể thu nhận số lƣợng lớn bản sao trình tự DNA. Tổng số DNA khuếch đại sau phản
ứng PCR đƣợc tính theo công thức:
Tổng DNA khuếch đại =

m
*
2
n
m: Số bản sao ban đầu của DNA mẫu.



14
n: Số chu kỳ.
2.5.2. Thành phần cơ bản của phản ứng PCR
 DNA bản mẫu (DNA template).
 Mồi xuôi (primer forward) và mồi ngƣợc (primer reverse).
 dNTPs (dATP, dTTP, dGTP, dCTP).
 Dung dịch đệm cho phản ứng PCR (PCR buffer).
 MgCl
2
.
 Taq DNA polymerase.
 Nƣớc cất 2 lần, khử ion.
2.5.3. Các yếu tố ảnh hƣởng tới PCR
 Tỷ lệ lí tƣởng trong đoạn mồi vào khoảng 50% GC để nhiệt độ bắt cặp của mồi
là không quá thấp.
 Các đoạn mồi không nên chứa hơn ba nucleotid giống nhau xếp liên tiếp.
 Tránh sử dụng các đoạn mồi nhân các đoạn gen phụ.
 Hai đoạn mồi không có trình tự bổ sung lẫn nhau.

 Độ dài của đoạn mồi là 17 - 25 nucleotide (cho PCR bình thƣờng).
2.5.4. Ƣu điểm và nhƣợc điểm
 Ƣu điểm: Cho kết quả nhanh, nhạy, đặc hiệu, chỉ cần một lƣợng mẫu nhỏ có
thể thực hiện.
 Nhƣợc điểm: Có thể cho phản ứng dƣơng tính dã, không phân biệt đƣợc sinh
vật sống hay chết.
2.6. Một số chỉ thị phân tử trong nghiên cứu đa dạng sinh học
2.6.1. Chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
Trong số các chỉ thị phân tử, chỉ thị RFLP đƣợc sử dụng đầu tiên trong việc lập
bản đồ gen của con ngƣời (Botstein và ctv, 1980), sau đó đƣợc cải biên để ứng dụng
cho việc lập bản đồ (mapping) ở cây trồng. RFLP là thể đa hình đáng tin cậy nhất, có
thể đƣợc dùng cho những phân tích chính xác về kiểu gen.
RFLP đƣợc định nghĩa là tính đa hình về chiều dài các đoạn cắt giới hạn, biểu
hiện sự khác nhau về kích thƣớc các phân đoạn DNA đƣợc cắt bằng các enzyme cắt
giới hạn.