Bài giảng Công nghệ protein và enzyme: Chương 2 - TS. Nguyễn Xuân Cảnh

•9/18/2020

CHƢƠNG 2. ENZYME
• Giới thiệu chung
• Phân nhóm enzyme
• Cơ chế xúc tác enzyme
• Động học phản ứng enzyme
• Phƣơng pháp xác định hoạt độ enzyme
• Sàng lọc cơ chất cho enzyme

Một số khái niệm chung
• Enzyme là chất xúc tác sinh học, có mặt trong tất cả các cơ thể sống
• Chúng thúc đẩy một phản ứng xảy ra mà khơng có mặt trong sản phẩm cuối
cùng.
• Ngoại trừ một nhóm nhỏ RNA có tính xúc tác (ribozym), tất cả enzyme đều có
bản chất là protein.
• Tính chất xúc tác phụ thuộc vào cấu tạo của protein.
• Một số enzyme cấu tạo gồm toàn những phân tử L-amino acid liên kết với
nhau tạo thành, gọi là enzyme một thành phần
• Đa số enzyme là những protein phức tạp gọi là enzyme hai thành phần. Phần
protein gọi là apoenzyme, phần khơng phải protein gọi là nhóm ngoại hay
coenzyme.

•1


•9/18/2020

Nhóm ngoại: Có thể là hợp chất hữu cơ (coenzyme) nhƣ vitamin, NAD…
hoặc ion kim loại

Phân loại enzyme/ Enzyme Classification (EC)
Cách gọi tên: tên cơ chất đặc hiệu + tên của loại phản ứng + ase
Phân loại: enzyme chia thành 06 lớp gồm;
• Oxydoreductase: xúc tác cho phản ứng oxy hố - khử.
• Transpherase: xúc tác cho phản ứng chuyển vị các nhóm từ một phân tử này
đến một phân tử khác.
• Hydrolase: xúc tác cho phản ứng thuỷ phân cũng là vận chuyển các nhóm
chức năng nhưng chất nhận ln là phân tử nước.
• Lyase: xúc tác cho phản ứng thêm các nhóm vào nối đơi, hoặc tạo thành nối
đơi bằng cách loại các nhóm.
• Isomerase: xúc tác cho phản ứng đồng phân hố, chuyển vị các nhóm trong
nội bộ phân tử tạo dạng đồng phần.
• Ligase: xúc tác cho phản ứng tạo thành liên kết C-C, C-O, C-S và C-N bằng
phản ứng ngưng tụ kèm theo phản ứng cắt đứt liên kết giàu năng lượng của các
nucleosid trisphosphate, (thường là ATP).

•2


•9/18/2020

• Mỗi lớp chia thành nhiều tổ, mỗi tổ chia thành nhiều nhóm, mỗi nhóm
có nhiều enzym khác nhau.
• Trong bảng phân loại, ký hiệu enzym thường gồm 04 chữ số ngăn cách
nhau bởi dấu “.”: số thứ nhất chỉ lớp, số thứ 2 chỉ tổ, số thứ 3 chỉ nhóm, số
thứ tư chỉ enzym.
• Ví dụ: enzym mang ký hiệu EC 2.6.1.6 là enzym leucine transaminase
thuộc nhóm Transferases (lớp 2), xúc tác phản ứng chuyển vị nhóm có
chứa Nitơ (tổ 6/ Transferring nitrogenous groups), nhóm chứa Nitơ đó là
nhóm amin từ Leucine (nhóm 6)

• Phản ứng:
L-leucine+ 2-oxoglutarate = 4-methyl-2-oxopentanoate + L-glutamate

Giới thiệu hệ thống phân loại enzyme quốc tế
/>
•3


•9/18/2020

•4


•9/18/2020

•5


•9/18/2020

•6


•9/18/2020

•7


•9/18/2020

Lớp 1. Oxidoreductase
•
•
•
•
•

Xúc tác phản ứng oxy hóa khử. Cơ chất bị oxy hóa được coi là chất cho H.
Tên enzyme: Chất cho: Chất nhận oxidoreductase.
Tên thông dụng sẽ là Dehydrogenase
Tên Reductase cũng có thể dùng trong trường hợp chất nhận là O2
Con số thứ 2 của các enzyme thuộc nhóm oxidoreductases (ngoại trừ 11, 13,
14 hoặc 15) chỉ nhóm trong chất cho hydrogen sẽ bị oxi hóa: nhóm -CHO-, CHO hoặc –CO-COOH
• Con số thứ 3, ngoại trừ EC 1.11, EC 1.13, EC 1.14 và EC 1.15 chỉ ra dạng
chất nhận tham gia vào phản ứng xúc tác: NAD(P)+, Cytochrome, Oxy (O),
S-S
•

Các enzyme thuộc lớp này: dehydrogenases, reductases

•

Ví dụ: lactate dehydrogenase (NAD+), acyl CoA dehydrogenase (FAD),
ketoacyl-ACP reductase (NADPH/H+).

•8


•9/18/2020

Dehydrogenase
Dehydrogenase: enzyme oxi hóa một cơ chất bằng cách chuyển 1 hoặc nhiều
hydride (H-) tới một chất nhận, thường là NAD+/NADP+ hoặc một flavin
coenzyme như FAD or FMN.
•

Aldehyde dehydrogenase (oxy hóa aldehyde)

•

Acetaldehyde dehydrogenase (chuyển acetaldehyde tới acetic acid)

•

Alcohol dehydrogenase

•

Glutamate dehydrogenase (enzyme chuyển hóa glutamate thành αKetoglutarate và ngược lại).

•

Lactate dehydrogenase

•

Pyruvate dehydrogenase (trong chu trình TCA, chuyển hóa Pyruvate thành
Acetyl CoA)

•

Glucose-6-phosphate dehydrogenase (liên quan đến con đường pentose
phosphate)

•

Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (liên quan đến đường phân)

Acetaldehyde dehydrogenase
•

Vai trị quan trọng trong q trình chuyển hóa ethanol

•

Ethanol ------------------------------ acetaldehyde --------------------------- Acetic acid
Alcohol dehydrogenase
Acetaldehyde dehydrogenase

•9


•9/18/2020

Reductase
• Reductase là enzyme xúc tác cho phản ứng khử
• Ví dụ một số enzyme reductase
• 5-alpha reductase
• Dihydrofolate reductase
• HMG-CoA reductase

• Methemoglobin reductase
• Ribonucleotide reductase
• Thioredoxin reductase
• E. coli nitroreductase
• Methylenetetrahydrofolate reductase

Lớp 2. Transferase
•

Là những enzym vận chuyển nhóm, chẳng hạn: methyl, glycosyl

•

Tên enzyme: donor: acceptor grouptransferase

•

Tên thơng dụng thường đặt theo acceptor grouptransferase hoặc donor
grouptransferase. Chất cho thường là một cofactor (Coenzyme).

•

Một số phản ứng xúc tác được mơ phỏng: X-Y + Z = X + Z-Y

•

Hoặc chuyển nhóm Y từ X sang Z hoặc cắt đứt liên kết X-Y khi có sự tham
gia của Z.

•

Việc giải thích chỉ mang tính tương đối, vì vậy người ta thường đặt tên theo
kiểu Y-transferase.
Các enzyme thuộc lớp này: kinases, aminotransferases, thiolases
Ví dụ:
glucokinase (ATP),
aspartate aminotransferase (PLP),
b-ketothiolase

•
•

•10


•9/18/2020

Glucokinase
• Glucokinase (EC 2.7.1.2) là một enzyme
xúc tác phản ứng phosphoril hóa Glucose
 Gluco-6-phosphate.
• Q trình glucokinase xảy ra ở các tế bào
gan, tụy, ruột và não người và các động vật
có xương sống.
• Đột biến gene mã hóa cho enzyme này sẽ
dẫn đến các bệnh đái đường, tụt đường
huyết.

Aspartate transaminase
•

Enzyme này xúc tác phản ứng chuyển
hóa thuận nghịch aspartate và alphaketoglutarate

thành

oxaloacetate

và

glutamate
•

Enzyme này là một trong những cơ sở
để đánh giá chức năng gan.

Oxaloacetate + glutamate ⇌ aspartate + α-ketoglutarate

•11


•9/18/2020

Lớp 3. Hydrolase
• Xúc tác các phản ứng thủy phân
• Phổ biến gặp: Peptidase, glycosidase, lipase,
phosphatase.
• Trypsin, amylase, triacylglycerol lipase, fructose-

1,6-bisphosphatase

Peptidase
Protease (còn gọi là peptidase hoặc proteinase) thủy
phân protein (liên kết peptide).
Có 6 nhóm protease
• Serine protease
• Threonine protease
• Cysteine protease
• Aspartate protease
• Metalloprotease
• Glutamic acid protease

•12


•9/18/2020

Serine protease
•

Trung tâm hoạt động có Serine

•

Chủ yếu có mặt ở các đường tiêu hóa

•

Tồn tại dưới dạng zymogen, bị ức chế bởi serine proteinase
inhibitors

•

Thành viên: Nhóm chymotrypsin, subtilisin

•

Nhóm Chymotrypsin: ở eukaryote gồm Chymotripsin, trypsin,
elastase.

•

Nhóm subtilisin: ở prokaryote

Threonine protease

•

Threnonine proteases là một họ
của

các

enzyme

thủy

phân

protein có chứa Threonine (Thr)

trong trung tâm hoạt động.
•

Là một trong các protease thuộc
họ proteasome

•13


•9/18/2020

Cystein protease
• Cystein protease thường có mặt trong hoa quả: đu đủ,
dứa, vả, kiwi. Lượng protease có nhiều khi quả cịn
chưa chín. Thường dùng làm mềm thịt.
• Các cysteine protease có cơ chế xúc tác chung liên
quan đến sự có mặt của trung tâm xúc tác chứa nhóm
lưu huỳnh của cystein. Phản ức xúc tác xảy ra theo kiểu
ái nhân (nucleophill).

Aspartic proteases
•

Aspartic proteases sử dụng gốc aspartate cho việc xúc tác cơ
chất.

•

Enzyme này có 2 aspartate bảo thủ cao ở trong trung tâm hoạt động
(aspartyl protease). Enzyme này bị ức chế bởi pepstatin. pH tối ưu

trong vùng acid.

•

Aspartic proteases bao gồm: pepsins, cathepsins, và renins. Chúng
có cấu trúc gồm 2 domain (do sự lặp gene).

•

HIV-1 protease thuốc chính trong điều trị HIV

•

Chymosin (hay "rennin")  đơng tụ sữa

•

Renin

 điều hịa huyết áp, Vtế bào

•

Cathepsin D

 marker cho ung thư vú

•

Pepsin

 Enzyme con đường tiêu hóa

•

Plasmepsin  khả năng kháng bệnh sốt rét

•

Nepenthesin

 nguồn gốc thực vật (giống pepsin)

•14


•9/18/2020

Metalloproteinase
•

Sử dụng các cofactor là kim loại (Zn, Co)

•

Metalloproteinase có 2 subgroup:

•

Exopeptidases metalloexopeptidases (EC number: 3.4.17).

•

Endopeptidases: metalloendopeptidases (3.4.24)

•

Xử lý metalloproteinase bằng các chất chelate (EDTA) sẽ dẫn đến
ức chế hoàn tồn.

•

EDTA, EGTA thường gắn với các ion kim loại hóa trị 2 (hay gặp
trong đệm tách chiết DNA, RNA)

Glycosidase
• Glycoside hydrolases thủy phân liên kết glycosid.

Có vai trị quan trọng trong việc phân giải các sinh khối
sinh học (carbohydrate).
• Các enzyme quan trọng trong nhóm này:
• Cellulase, amylase, lysozyme, neuraminidase

•15


•9/18/2020

Amylase

• Alpha amylase
• Beta amylase
• Gamma amylase

Alpha amylase
•

α-Amylase (EC 3.2.1.1) cịn gọi là 1,4-α-D-glucan glucanohydrolase
hoặc glycogenase. α-Amylase thuộc nhóm metalloenzymes (cần sự
có mặt của Ca2+).

•

Enzyme thủy phân ngẫu nhiên các liên kết glycosid trong phân tử
polysacharide (glycogen, tinh bột).

•

Sản phẩm cuối cùng là các đường maltotriose, maltose, glucose và
các dextrin (tùy thuộc vào nguồn cơ chất).

•

Ở động vật, α-Amylase có pH tối ưu trong khoảng 6,7-7,0.

•16


•9/18/2020

Beta amylase
•

β-Amylase (EC 3.2.1.2) còn gọi là 1,4-α-D-glucan maltohydrolase,
glycogenase, saccharogen amylase.

•

β-amylase được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn, nấm và thực vật.

•

Khác với α-Amylase có khả năng thủy phân ngẫu nhiên, β-Amylase
hoạt động từ đầu không khử, enzyme này thủy phân liên kết α-1,4
glycosid thứ hai và cắt liên kết tạo ra một phân tử maltose.

•

Trong q trình chín của quả, β-amylase phân giải tinh bột tạo các
đường maltose có mùi đặc trưng.

Gamma amylase
• γ-Amylase (EC 3.2.1.3) cịn gọi là glucan 1,4-αglucosidase, amyloglucosidase, exo-1,4-α-glucosidase,
glucoamylase, 1,4-α-D-glucan glucohydrolase).
• Enzyme có khả năng cắt liên kết α 1-4 glycosid cuối
cùng từ đầu không khử của amylose và amylopectin giải

phóng các phân tử gluocose.
• pH tối ưu của γ-amylase trong môi trường acid, pH ~3.

•17


•9/18/2020

Lysozyme
•

Lysozyme

(muramidase

hoặc

N-acetylmuramide

glycanhydrolase) (EC 3.2.1.17) có khả năng phân giải thành tế
bào vi khuẩn.
•

Thủy phân liên kết 1,4-beta-giữa các gốc N-acetylmuramic acid và
N-acetyl-D-glucosamine trong mạch peptidoglycan.

•

Lysozyme có nhiều ở các dịch tiết: nước mắt, nước bọt, sữa người
và các dịch nhày. Ngoài ra có nhiều trong lịng trắng trứng.

Cellulase
• Cellulase gồm 1 nhóm các enzyme được tiết ra chủ yếu

bởi nấm, vi khuản và nguyên sinh động vật có khả năng
thủy phân cellulose.
• Có một ít số động, thực vật cũng có khả năng sản xuất
enzym này.

• Phản ứng: Thủy phân liên kết 1,4-beta-D-glycosidic
trong cellulose, lichenin, và các dạng D-glucan ở ngũ
cốc.

•18


•9/18/2020

Cơ chất cho cellulase

Cellulose
Lichenin (mộc nhĩ, rêu)

Lớp 4. Lyase
• Xúc tác loại bỏ hoặc bổ sung thêm các gốc để tạo thành
hoặc bẻ gãy các nối đơi.
• Các enzyme thuộc nhóm synthase, decarboxylase,
dehydratase
• Ví dụ: citrate synthase, pyruvate decarboxylase (TPP),

fumarase

•19

•9/18/2020

Lyase
•

EC 4.1 phân cắt liên kết carbon-carbon (decarboxylases, aldehyde lyases,
oxo acid lyases

•

EC 4.2  carbon-oxygen: dehydratases

•

EC 4.3  carbon-nitrogen

•

EC 4.4  carbon-sulfur bonds

•

EC 4.5  carbon-halide bonds (halogen)

•

EC 4.6  phosphorus-oxygen (adenylate cyclase và guanylate cyclase)

•

EC 4.99  ferrochelatase

Lớp 5. Isomerase
• Xúc tác các phản ứng làm thay đổi cấu trúc (không phải
thành phần). Sự thay đổi bao gồm: cấu trúc quang học,
hình học, cấu trúc isomer
• Các enzyme thuộc nhóm: isomerases, mutases
• Ví dụ: glucose-6-phosphate isomerase, phosphoglycerate
mutase
• Các enzym chuyển hóa các dạng đồng phân có vai trị
quan trọng khi sản xuất các chất dinh dưỡng vì chúng có
thể chuyển các chất từ dạng cơ thể không thể sang dạng
có thể hấp thụ được.
• Vai trị trong dược phẩm (dạng hoạt động)

•20


•9/18/2020

Isomerase
•

EC 5.1 xúc tác phản ứng racemization (racemases) và
epimerization (epimerases)

•

EC 5.2  isomerization của các dạng đồng phân cis-trans

•

EC 5.3  intramolecular oxidoreductases

•

EC 5.4  intramolecular transferases (mutases)

•

EC 5.5  intramolecular lyases

•

EC 5.99  các loại isomerases khác (bao gồm topoisomerases)

Lớp 6. Ligase
• Xúc tác cho những phản ứng có mặt 2 hợp chất đi kèm
với việc thủy phân một liên kết đi kèm với việc thủy phân
một liên kết phosphoanhydride (ATP)
• Các

enzyme

thuộc

nhóm

này:

synthetases,

carboxylases, polymerases

• Ví dụ: glutamine synthetase (ATP), pyruvate carboxylase
(biotin), DNA polymerase

•21


•9/18/2020

•
•
•
•
•
•

EC 6.1 tạo liên kết carbon-oxygen
EC 6.2  carbon-sulfur
EC 6.3  carbon-nitrogen
EC 6.4  carbon-carbon
EC 6.5  liết kết phosphoric ester (T4 ligase)
EC 6.6  nitrogen-kim loại

T4-ligase

Mammalian ligases

•

DNA ligase I:  Gắn các đoạn DNA Okazaki.

•

DNA ligase II:  tìm thấy ở các tế bào không phân chia (dạng trung
gian của DNA ligase III).

•

DNA ligase III:  phức hợp DNA-protein sửa chữa, để hàn gắn các
DNA trong quá trình sửa chữa.

•

DNA ligase IV:  tạo phức hợp xúc tác kết nối các DNA sợi đơ bị
gẫy. Có vai trị trong quá trình tái tổ hợp sắp xếp các gene để hình
thành kháng thể và các thụ thể của tế bào T trong q trình phát
triển hệ thống miễn dịch.

•22


•9/18/2020

Cơ chế xúc tác của enzyme
Cấu trúc không gian
 Trung tâm hoạt động: 1 phần trong phân tử enzym có chứa các nhóm chức
trực tiếp kết hợp với cơ chất để chuyển hóa thành sản phẩm. Trung tâm hoạt

động khơng có nghĩa là một vùng gồm các amino acid nằm liên tục trên chuỗi
polypeptide mà chúng có thể nằm xa nhau (gần nhau về mặt không gian
 Một số enzyme có thêm vị trí dị lập thể: Là nơi gắn với chất ức chế khơng
cạnh tranh hoặc chất hoạt hố của E.

Cơ chế xúc tác
•

Enzyme  tăng tốc độ phản ứng (giảm hàng rào năng lượng của
phản ứng hay năng lượng hoạt hóa).

•

Liên kết cộng hóa trị có năng lượng liên kết giữa 2 nguyên tử
khoảng 50 đến 200 kcal/mol. Ở nhiệt độ phòng, năng lượng nhiệt
động học khoảng 0.6 kcal/mol  các liên kết hóa cộng hóa trị này
khơng thể bị bẻ gãy nếu như khơng có sự tham gia của các yếu tố
bên ngồi (enzyme).

•

Enzyme sẽ tạo ra một “mơi trường” làm giảm năng lượng hoạt hóa
cần thiết.

•23


•9/18/2020

Free energy

Course of
reaction
without
enzyme

EA
without
enzyme

Course of
reaction
with enzyme

EA with
enzyme
is lower

DG is unaffected
by enzyme

Progress of the reaction

•24


•9/18/2020

Hoạt động của enzyme

Tính đặc hiệu của enzym
1. Đặc hiệu lập thể
• Phần lớn enzyme chỉ tác dụng lên một trong 02 dạng đồng phân
khơng gian của các chất. Ví dụ: Lactacdehydrogenase chỉ tác dụng
lên axit L-lactic mà không tác dụng với D-lactic.
2. Đặc hiệu kiểu phản ứng
• Mỗi enzym chỉ có thể xúc tác cho một trong các kiểu phản ứng
chuyển hóa một cơ chất nhất định.

• Ví dụ: Phản ứng oxy hóa khử, thủy phân, chuyển vị
3. Đặc hiệu cơ chất
• Cơ chất là những chất có khả năng kết hợp vào trung tâm hoạt động
của enzym và bị chuyển hóa dưới tác dụng của enzym.

•25