Tải bản đầy đủ (.pdf) (132 trang)

(Luận án tiến sĩ) nghiên cứu điều kiện lên men cordyceps sinensis tạo sinh khối giàu selen và khảo sát hoạt tính sinh học

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (6.47 MB, 132 trang )

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

Lê Quốc Phong

NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN
Cordyceps sinensis TẠO SINH KHỐI GIÀU
SELEN VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 9 42 02 01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS.TSKH. Ngơ Kế Sương

TP Hồ Chí Minh – Năm 2021


LỜI CẢM ƠN
Để hồn thành chương trình Nghiên cứu sinh và Luận án Tiến sĩ, tôi đã nhận
được sự quan tâm, chia sẻ, hỗ trợ của rất nhiều thầy cô, anh chị, các bạn bè cùng khoá,
đồng nghiệp tại các đơn vị.
Xin trân trọng cám ơn PGS.TSKH Ngô Kế Sương, người thầy đáng kính đã
ln động viên, hướng dẫn, góp ý kiến để tơi hồn thiện Luận án. Trân trọng cám ơn
TS. Đinh Minh Hiệp đã hỗ trợ, giúp đỡ, chia sẻ trong suốt quá trình thực hiện Luận


án.
Xin trân trọng cám ơn các thầy cô giáo của Viện Sinh học Nhiệt đới, Học Viện
Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Trường
ĐH Khoa học Tự nhiên- Đại học Quốc gia Tp. Hồ Chí Minh đã truyền đạt kiến thức,
góp ý cho tơi trong suốt q trình học tập và thực hiện đề tài.
Trân trọng cám ơn các bạn trong nhóm nghiên cứu (TS. Trần Minh Trang, ThS.
Nguyễn Tài Hoàng) đã dành nhiều tâm huyết, thời gian, hỗ trợ tơi hồn thành Luận
án.
Trân trọng cám ơn Trung ương Đồn TNCS Hồ Chí Minh, cơ quan tôi công tác
trong suốt thời gian thực hiện Luận án, đã chia sẻ, tạo mọi điều kiện thuận lợi để tơi
hồn thành chương trình học tập và nghiên cứu.
Và cuối cùng, tơi xin dành tình cảm, sự biết ơn đối với gia đình, những người
ln mong mỏi, âm thầm quan tâm, động viên, khích lệ để tơi hoàn thành Luận án.
Trân trọng cám ơn.


1

MỞ ĐẦU
Nấm Đông trùng Hạ thảo Cordyceps sinensis (đồng tên: Ophiocordyceps
sinensis) là loài nấm dược liệu quý được sử dụng phổ biến trong Y học cổ truyền
Trung Hoa. Adenosine và cordycepin là hai dược chất quý được xem là chất chỉ thị
về hoạt tính sinh học quan trọng cho lồi nấm này. Các nghiên cứu hiện đại chứng
minh các hoạt chất từ C. sinensis có khả năng tăng cường miễn dịch, chống lão hóa,
kháng viêm, kháng ung thư và hỗ trợ điều trị các bệnh liên quan đến phổi, thận, và
các bệnh mạn tính khác như đái tháo đường. Hiện nay, C. sinensis tự nhiên ngày càng
hiếm do việc khai thác quá mức đi kèm với biến đổi khí hậu. Do đó, nghiên cứu ni
cấy nhân tạo loại nấm q này nhận được nhiều quan tâm trong vài thập kỷ qua. Sử
dụng môi trường bán rắn tạo quả thể và mơi trường lỏng nhân thu sinh khối lồi nấm
này là hai hướng tiếp cận phổ biến. Trong đó, nhân ni sinh khối nấm mang tính

ứng dụng thực tiễn cao vì công nghệ này không chỉ sản xuất sinh khối nấm có thành
phần các hoạt chất tương tự như tự nhiên, mà cịn có thể triển khai sản xuất ở quy mơ
cơng nghiệp trong thời gian ngắn cùng với chi phí thấp hơn so với kỹ thuật nuôi cấy
quả thể. Nhiều phương pháp nuôi cấy lỏng cải tiến được thử nghiệm để nâng cao giá
trị hoạt chất và hoạt tính sinh học của sinh khối nấm C. sinensis. Nghiên cứu ảnh
hưởng của các nguyên tố khoáng vi lượng đến khả năng sản xuất sinh khối và các
hợp chất thứ cấp là một chủ đề nhận được nhiều quan tâm hiện nay. Trong đó, selen
(Se) được xem là một tiền chất đầy tiềm năng trong việc nâng cao dược tính sinh học
của nấm Đông trùng Hạ thảo này.
Hơn thế nữa, Se là thành phần của acid amin 21 gọi là selenocysteine. Nguyên
tố này còn tham gia vào cấu trúc của nhiều enzyme kháng oxy hóa như glutathione
peroxidase, iodothyronine deiodinases và thioredoxin reductase có chức năng sinh lý
quan trọng như kháng oxy hóa, kháng ung thư, tăng cường miễn dịch, ức chế HIV và
chống lão hóa. Sự tham gia của Se trong hệ thống miễn dịch có thể được kết hợp với
một số cơ chế, bao gồm cả các hoạt động gia tăng sản xuất tế bào miễn dịch NK
(Natural killer cell), các tế bào lympho T, lympho B, interferon C và làm thụ thể có
ái lực cao với interleukin-2, kích thích miễn dịch do vắc-xin gây ra. Bên cạnh đó, Se
cịn có vai trị quan trọng trong chuyển hóa iốt, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng nồng


2
độ Se trong huyết thanh ở những trẻ bị bướu cổ thường thấp hơn so với trẻ có kích
thước tuyến giáp bình thường. Như vậy, sự thiếu hụt Se có thể tác động xấu đến sức
khỏe.
Mặc dù nước ta có một số dược liệu chứa Se như: tỏi, nấm linh chi và quả nhàu
nhưng hàm lượng Se trong các loại dược liệu này thường thấp và không ổn định. Từ
năm 2003 – 2005, Bộ Y tế khuyến khích và định hướng những nghiên cứu sản xuất
Se hữu cơ có khả dụng sinh học cao. Đề án “Chiến lược quốc gia về dinh dưỡng giai
đoạn 2011-2020 và tầm nhìn đến năm 2030” (689/TH ngày 29/6/2011) nhấn mạnh
phòng chống thiếu vi chất dinh dưỡng hiện nay, trong đó có liên quan đến Se. Chính

vì lẽ đó, đề tài “Nghiên cứu điều kiện lên men Cordyceps sinensis tạo sinh khối
giàu selen và khảo sát hoạt tính sinh học” được thực hiện với:
Mục tiêu tổng quát của nghiên cứu:
Sản xuất sinh khối nấm C. sinensis giàu Se có hoạt tính sinh học được cải thiện
và tạo nguồn Se có khả dụng sinh học cao.
Mục tiêu cụ thể của nghiên cứu:
(1) Xây dựng quy trình lên men sản xuất sinh khối nấm C. sinensis giàu Se.
(2) Đánh giá một số hoạt tính sinh học của các hoạt chất chứa Se từ sinh khối
nấm C. sinensis giàu Se.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn:
Ý nghĩa khoa học: Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp các dữ liệu khoa học về
ảnh hưởng của Se đến sự sản xuất sinh khối và hoạt tính sinh học của sinh khối nấm
Cordyceps sinensis, khả năng tích lũy Se trong sinh khối nấm. Đồng thời, cơng trình
này sẽ giúp hiểu rõ thêm các dạng Se hữu cơ trong nấm.
Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả tạo tiền đề cơ sở kỹ thuật nhằm chuyển giao công
nghệ để sản xuất và ứng dụng sinh khối C. sinensis giàu Se có hoạt tính sinh học cao
trong việc phát triển các sản phẩm thực phẩm bổ sung, bảo vệ sức khỏe.


3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Nấm Cordyceps sinensis
1.1.1. Đặc điểm, phân bố
Cordyceps sinensis là lồi nấm kí sinh trên ấu trùng loài bướm đêm Thitarodes
(Hepialus) armoricanus thuộc họ Hepialidae sống dưới đất (hình 1.1) [1]. Đây là lồi
nấm đặc hữu của vùng cao nguyên Tây Tạng và các vùng đồng cỏ núi cao xung quanh
khu vực dãy Himalaya như Bhutan, Trung Quốc và Nepal ở độ cao 3500-5000 m so
với mực nước biển [2]. Giá trị dược liệu của loài nấm này đã được ghi nhận cách đây
2000 năm ở Trung Quốc cũng như các nước phương Đông với những tác dụng như

cải thiện chức năng gan thận, chữa đổ mồ hôi đêm, bệnh tiểu đường, máu nhiễm mỡ,
các bệnh về tim, hồi phục sức khỏe, tăng tuổi thọ và nâng cao thể trạng cơ thể [3] [4].

C. sinensis ngoài tự nhiên. Hình có nguồn gốc từ cơng bố của
Shrestha và cộng sự (2013) [5]
Đến năm 2007, Sung và cộng sự đã tiến hành phân tích mối quan hệ giữa 162
lồi Cordyceps bằng việc phân tích 5 - 7 locus bao gồm ribosome tiểu phần nhỏ và
tiểu phần lớn (nrSSU và dnrLSU), nhân tố kéo dài 1α (tef1), hai tiểu đơn vị lớn nhất
của RNA polymerase II (rpb1 và rpb2), β-tubulin (tub) và ti thể ATP6 (atp6) và xếp
Cordyceps sinensis vào chi Ophiocordyceps và đổi tên là Ophiocordyceps sinensis


4
[6], tuy là cùng tên song C. sinensis vẫn được sử dụng phổ biến trong giới khoa học
hiện nay.
1.1.2. Hoạt tính sinh học
Với sự phát triển của khoa học hiện nay, người ta đã tìm ra được những hợp
chất có trong nấm C. sinensis. Chính những hoạt chất này đóng vai trò quan trọng,
quyết định giá trị dược liệu của lồi nấm này, chúng gồm có: (i) Các hợp chất nitơ:
adenine, adenosine, cordyceamides, cordycedipeptide, cordycepin, cordymin,
cordysinin,

dideoxyadenosine,

guanine,

guanosine,

hypoxanthine,


inosine,

thymidine, thymine, uracil, uridine; (ii) Sterol: campesterol, cholesterol, daucosterol,
ergosterol, sitisterol, stigmasterol; (iii) Polysaccharide và dẫn xuất: cordysinocan,
glucan, heteroglycan, mannitol, mannoglucan; (iv) Các protein, acid amin:
cadaverine, carboline, cordymin, flazin, methylpyrimidine, perlolyrine, putrescine,
spermidine, spermine, tryptophan; (v) Acid phenolic: acetovanillone, acid
hydroxybenzoic, acid protocatechuic, acid salicylic, acid syringic, acid vanillic; (vi)
Isoflavone: daidzein, genistein, glycitein, orobol; (vii) Acid béo: acid docosanoic,
acid lauric, acid lignoceric, acid linoleic, acid myristic, acid oleic, acid palmitic, acid
palmitoleic, acid pentadecanoic, acid stearic, acid succinic; (viii) Các vitamin, các
hợp chất bay hơi và các loại khoáng như Zn, Mg, Mn, Fe, Se, …. [7].
Y học hiện đại đã chứng minh nấm Cordyceps có các hoạt tính như điều hịa
miễn dịch, kháng oxy hóa, ức chế hình thành khối u, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng
di căn và tìm ra được một số cơ chế tác động chính lên các con đường sinh hóa của
cơ thể. Do đó việc sử dụng Cordyceps không chỉ giới hạn trong tăng cường sức khỏe,
mà còn được sử dụng trong phòng trị các bệnh về hô hấp, bệnh về thận, gan, tim
mạch, tăng lipid máu, rối loạn miễn dịch, hỗ trợ điều trị ung thư (bảng 1.1)


5
Bảng 1.1.

Hoạt tính sinh học của nấm Cordyceps sinensis [8]

Hoạt tính

Cơ chế tác động

Miễn dịch


Tăng cường hàm lượng IgG, IgG1 và IgG2b đặc hiệu ovalbumin.
Kích thích đại thực bào giải phóng IL-lβ, TNF-α và INF-γ bằng việc
kích thích con đường IkB–NF-kB. Cảm ứng sự sinh trưởng của tế bào
T và tiết IL-2, IL-6 và IL-8.

Kháng

Giảm sự sản xuất NO, IL-12, TNF-α và các cytokine gây viêm. Khóa

viêm

các NF-kB thơng qua giảm biểu hiện tín hiệu điều hịa kinase nội bào.

Kháng oxy

Duy trì GPx và hoạt động SOD trong tế bào. Kích thích sự hoạt hóa

hóa

của GPx, CAT và SOD đồng thời giảm hàm lượng lactate
dehydrogenase và malondialdehyde. Tăng điều hòa hoạt động của
superoxide dismutase 1 chứa kẽm- đồng và ức chế sự tích lũy
lipofusin.

Gây ra

Ức chế sự phosphoryl hóa tyrosine của Bcl-2 và Bcl-xL oncoprotein.

apoptosis


Kích thích apoptosis thơng qua con đường caspase/MAPK. Tăng
cường phosphoryl hóa và biểu hiện p53.

Kháng

Bằng con đường miễn dịch và kháng oxy hóa. Kháng khối u bằng con

khối u

đường apoptosis. Điều hịa con đường tín hiệu như con đường tín hiệu
MAPK có vai trị quan trọng trong quá trình xâm lấn và di cư của tế
bào ung thư, hoạt hóa con đường tín hiệu PKC có tác dụng kháng
khối u trực tiếp. Ức chế sự tiết các yếu tố liên quan đến xâm lấn và
di cư như MMP-2, MMP-9 và uPA.

Bảo vệ tim

Ngăn chặn sự tích tụ cholesterol. Ức chế hoạt tính cholesterol

mạch

esterase. Hỗ trợ chữa bệnh đột quỵ do thiếu máu cục bộ do thiếu oxy
và glucose. Tách chuỗi Aα của fibrinogen và chuỗi α của fibrin nhằm
ngăn chặn huyết khối.

Bảo vệ

Ức chế sự tăng trưởng của tế bào mesangial ở thận thông qua con


thận

đường PDGF/ERK và TGF-β1/Smad. Ức chế PDGF homodimer BB,
nguyên nhân gây ra viêm và sản xuất ROS. Ức chế sự tăng sinh của
tế bào trung mô cầu thận thông qua con đường PDGF/ERK và TGFβ1/Smad.


6
Hoạt tính

Cơ chế tác động

Sức khỏe

Kích thích tế bào Leydig và tế bào hoàng thể hạt tiết ra steroid sinh

sinh sản

dục. Tăng khả năng sản xuất E2, đây là hormone quan trọng nhất ảnh
hưởng đến nỗn bào. Hoạt hóa con đường truyền tải tín hiệu PKA và
PKC và kết hợp với Ars hoạt hóa con đường cAMP-PKA-StAR để
tạo ra steroidogenesis.

Phịng

Điều hòa steroidogene buồng trứng để ngăn ngừa mất xương và lỗng

ngừa lỗng

xương do thiếu estrogen. Giảm hoạt tính alkaline phosphatase huyết


xương

thanh, hoạt tính TRAP, hàm lượng CTX và IFN-γ.

1.2. Selen và vai trò sinh học của selen
1.2.1. Nguồn selen hiện nay
Se được Jacob Berzelius Jöns phát hiện năm 1817 trong chất thải của quá trình
khai thác quặng pyrit [9]. Trong đất, Se tồn tại chủ yếu ở dạng selenite (SeO32−) và
selenate (SeO42−), một lượng nhỏ dạng hữu cơ do hoạt động của vi sinh vật và thực
vật tạo ra [9]. Ngồi ra, Se cịn tồn tại trong nước nhưng phụ thuộc vào hàm lượng Se
trong đất, đá nơi đó và hoạt động của vi sinh vật cũng như vi tảo ở trong nước [9].
Như đa phần các nguyên tố khác, Se tồn tại ở cả dạng vô cơ và hữu cơ. Ở dạng vơ cơ,
Se ở các dạng oxy hóa như -2, 0, +4 và +6 như natri selenide, natri selenate, natri
selenite,…. Còn ở dạng hữu cơ, chúng gắn trực tiếp vào các hợp chất hữu cơ hoặc
liên kết cộng hóa trị với mạch carbon như selenomethionine, selenocysteine, dimethyl
selenide, selenodiglutathione,… [9] [10].
Hiện nay, con người sử dụng Se hữu cơ chủ yếu thông qua thực phẩm thường
ngày như rau, củ quả, thịt, trứng, sữa,… Ngoài ra, đối với những người thiếu Se có
thể bổ sung các loại thuốc hoặc thực phẩm chức năng giàu Se. Tùy từng khu vực địa
lý mà thực phẩm tại nơi đó có hàm lượng Se khác nhau. Một số thực vật như hành,
tỏi, cải wasabi, nấm có khả năng tích lũy Se tốt với hàm lượng Se dao động từ 0,01
đến 0,55μg/g. Đối với những lồi động vật dưới nước như cá, sị cũng là nguồn cung
cấp Se đáng kể: cá biển (0,11 - 0,97μg/g), cá nước ngọt (0,18 - 0,68μg/g). Các sản
phẩm thịt có hàm lượng Se khoảng 0,08 đến 0,73μg/g. Trong sản phẩm sữa, hàm
lượng Se tỉ lệ nghịch với hàm lượng chất béo và dao động từ 0,01 đến 0,55μg/g [11].


7
1.2.2. Vai trò của selen đối với cơ thể

Hiện nay, 25 gen mã hóa seleno-protein đã được xác định ở genome người.
Selenoprotein có những chức năng khác nhau, bao gồm hoạt tính kháng oxy hóa, chức
năng miễn dịch, sự trao đổi chất hormon tuyến giáp, vận chuyển và cân bằng nội môi
Se và trao đổi chất ở xương và cơ tim [9] [12] [13]. Đối với hệ miễn dịch, nhiều
nghiên cứu đã cho thấy sự hiện diện của lượng lớn Se trong lách, gan và hạch bạch
huyết. Vì vậy, thiếu hụt Se sẽ gây ảnh hưởng xấu đến hệ miễn dịch. Se kích thích
hình thành kháng thể và hoạt hóa tế bào T hỗ trợ cùng với tế bào T gây độc và tế bào
NK. Hơn nữa, Se cũng có vai trò quan trọng trong điều trị bệnh nhân nhiễm HIV, một
số kết quả tích cực trong q trình điều trị như làm chậm sự tiến triển bệnh, tăng tế
bào T CD4+ và giảm các triệu chứng bệnh đi kèm như tiêu chảy [12] [14] [15].
Ở não, Se đóng vai trị rất quan trọng, nếu thiếu hụt Se, mơ não là nơi được ưu
tiên nhận Se trước tiên. Một số selenoprotein đặc trưng đã được chứng minh có khả
năng chống lại sự thối hóa thần kinh bằng cách loại bỏ các gốc tự do (ROS) và tăng
cường kháng oxy hóa. Trong đó, selenoprotein P có vai trị đặc biệt trong việc vận
chuyển Se bằng cách gắn chúng lên các thụ thể bề mặt như apoER2 [13] [14].
Đối với vấn đề sinh sản ở nam giới, Se từ lâu đã được công nhận là cần thiết
để sinh tổng hợp testosterone, sự hình thành và phát triển bình thường của tinh trùng.
Trong pha sớm của quá trình hình thành tinh trùng, GPx4 có vai trị như là peroxidase
giúp bảo vệ tinh trùng khỏi những tác nhân oxy hóa, trong khi đó, ở pha muộn, có vai
trị trong sự hình thành phần đi giúp tinh trùng có thể di động. Đối với nam giới bị
hiếm muộn do vấn đề di chuyển của tinh trùng, bổ sung Se 100μg/ngày sẽ giúp tăng
khả năng hoạt động của tinh trùng và có khoảng 11% chúng có khả năng thụ tinh [14]
[15].
Đối với tuyến giáp, đây là cơ quan có hàm lượng Se cao nhất trong cơ thể. Do
đó, tuyến giáp khơng chỉ phụ thuộc vào iod mà cịn cả Se. Se có vai trị khác nhau
trong tuyến giáp như iodothyronine deiodinase (Dio1, Dio2) phụ thuộc Se, sản xuất
hormon thyroid, triiodothyronine (T3) từ tiền chất của chúng và thyroxine (T4) [12]
[15].
Đối với bệnh về tim mạch, thiếu hụt Se, peroxit lipid có thể tích tụ trong máu
và gây tổn thương mạch máu và mô. Các nghiên cứu trước đây cho thấy Se có khả



8
năng chống lại sự oxy hóa lipid và giảm kết tụ tiểu cầu, kháng viêm từ đó giảm khả
năng mắc các bệnh về tim mạch [12] [14] [15].
Đối với ung thư, trong những năm gần đây, các nghiên cứu về Se trong việc
điều trị các loại ung thư ngày càng phổ biến, trên cả mơ hình động vật, người và trên
hầu hết các cơ quan với nhiều loại ung thư khác nhau như phổi, bàng quang, đại trực
tràng, gan, tuyến giáp, tuyến tiền liệt [12] [14] [15].
Bên cạnh selenoprotein, Se cịn được tích lũy vào polysaccharide. Các nghiên
cứu hiện nay chủ yếu tập trung vào selenopolysaccharide từ vi khuẩn hoặc nấm (hình
1.2).

GSSeGalNAc

MeSeGalNAc

MeSeGluNAc

MeSeGalNH2

Một số cấu trúc của seleno-đường [16]
Một số thử nghiệm trước đây cho thấy selenopolysaccharide có khả năng
kháng khối u như: Selenopolysaccharide (SeGLP-2B-1) từ nấm Ganoderma lucidum
có khả năng cảm ứng tế bào MCF-7 theo con đường apoptosis [17], seleno Sargassum fusiforme (Harv.) Setch. polysaccharide (Se-SFPSI) - cải thiện hoạt tính
CAT, SOD, GSH-Px trên chuột mang khối u S180 (dòng tế bào ung thư Sarcoma)
sau 10 ngày thử nghiệm [18], selenopolysaccharide (ISPS) từ nấm C. sinensis cũng
cho thấy khả năng kháng oxy hóa mạnh, giảm lượng glucose trong máu và tăng cường
khả năng miễn dịch trên mơ hình chuột [19]. Năm 1988, tại Hội nghị về Se trong sinh
học và y dược được tổ chức ở Tubingen (Đức), Seko và cộng sự đã cho thấy selenite

phản ứng với glutathione và H2Se tạo ra superoxide O2•- (hình 1.3). Kết quả là những
gốc tự do này tấn công gây tổn thương tế bào [20].

4GSH
SeO32-

GSSG

GSH

GSSeSG

GSSG GSH
GSSeH

GSSG

O2

H2Se

Sơ đồ chuỗi phản ứng giữa selente và glutathione

O2•Seo(1)


9
Nếu sử dụng Se quá cao sẽ gây độc mãn tính với các biểu hiện đặc trưng như
rụng tóc, móng tay giịn, rối loạn tiêu hóa, phát ban, hơi thở có mùi tỏi và hoạt động
bất thường của hệ thống thần kinh. Ảnh hưởng xấu khác có liên quan là rối loạn chức

năng nội tiết, tổng hợp các hormon tuyến giáp và hormon tăng trưởng và sự chuyển
hóa các yếu tố tăng trưởng tương tự insulin. Đặc biệt là chế độ ăn uống với lượng Se
quá cao, liên quan đáng kể với sự suy giảm T3 (triiodothyronin), suy yếu các tế bào
sát thủ tự nhiên và nhiễm độc gan.
Bệnh Keshan lần đầu tiên được mô tả trong y học Trung Quốc cách đây hơn
100 năm. Năm 1935, người ta mới khám phá ra rằng sự thiếu hụt Se là yếu tố gây
bệnh chủ yếu. Biểu hiện điển hình là mệt mỏi sau khi vận động nhẹ, rối loạn nhịp tim,
hồi hộp, chán ăn, suy tim, tim phì đại. Có sự tương đồng địa lý trong sự phân bố bệnh
Keshan, các bệnh cơ trắng liên quan đến Se và vitamin E ở động vật [21] [22]. Bệnh
xương khớp (osteoarthropathy) có liên quan đến hàm lượng Se thấp đã được phát
hiện ở nhiều trẻ em từ 5-13 tuổi ở Trung Quốc và một số ít tại phía đơng Siberia.
Bệnh có đặc trưng là hoại tử khớp, thối hóa đầu xương của khớp cánh tay, ngón chân
dẫn đến rút cấu trúc ngón tay, các xương dài kéo theo sự tăng trưởng chậm và còi cọc
[21] [22]. WHO và FAO đã đưa ra hàm lượng Se cần sử dụng hàng ngày cho cơ thể,
tùy vào độ tuổi, giới tính và cân nặng mà có hàm lượng khác nhau, số liệu như trong
bảng 1.2. Ngoài ra, ngưỡng giới hạn trên được WHO khuyến nghị là khoảng
400μg/ngày đối với người lớn, với trẻ nhỏ là 45 - 280μg/ngày tùy theo độ tuổi [23].


10
Bảng 1.2.

Lượng Se cần thiết cho cơ thể hàng ngày

Cân nặng (kg)

RNI* (μg/ngày)

0 - 6 tháng


6

6

7 - 12 tháng

9

10

1 - 3 tuổi

12

17

4 - 6 tuổi

19

22

7 - 9 tuổi

25

21

Nữ, 10 - 18 tuổi


49

26

Nam, 10 - 18 tuổi

51

32

Nữ,
19 - 65 tuổi
65+ tuổi

55
54

26
25

Nam,
19 – 65 tuổi
65+ tuổi

65
64

34
33


Nhóm tuổi
Trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ

Thanh thiếu niên

Người trưởng thành

Phụ nữ có thai
Có thai từ 4-6 tháng
Có thai từ 7-9 tháng

28
30

Phụ nữ cho con bú
0 – 6 tháng sau sinh
7 – 12 tháng sau sinh

35
42

*RNI: Lượng dùng khuyến cáo hằng ngày cho người


11
1.2.3. Con đường chuyển hóa selen ở nấm
Selen có cùng đặc tính lý hóa tương tự lưu huỳnh (S) do đó, trong q trình
biến dưỡng ở nấm, kênh vận chuyển sulfate được sử dụng để Se có thể hấp thụ vào
tế bào và khả năng hấp thụ Se tỉ lệ nghịch với sự có mặt của S. Nghiên cứu cơ chế và
con đường chuyển hóa Se trong một số lồi nấm cịn hạn chế. Do vậy, những thơng

tin về vai trị của các enzyme tham gia trong q trình chuyển hóa Se trong các loại
nấm, đặc biệt là nấm C. sinensis vẫn chưa được tìm hiểu rõ. Tuy nhiên, vấn đề này
đã được ít nhiều làm rõ trên đối tượng là nấm men như Saccharomyces cerevisiae,
Candida utilis, Yarrowia lipolytica.
Cơ chế liên kết bên ngoài của Se
Liên kết ngoại bào của Se dựa trên sự hấp phụ hóa học, q trình này phụ thuộc
vào các nối ion hoặc phức hợp Se và các polymer của vách tế bào protein,
phospholipid hoặc polysaccharide. Mức độ hấp thụ sinh học bị ảnh hưởng mạnh mẽ
bởi tính kỵ nước của bề mặt thành tế bào nấm men. Dựa trên những nghiên cứu trước
đây về sự hấp thụ Se trên vách tế bào nấm men và polysaccharide trên vách tế bào
cho thấy mannan và glucan đều có thể hấp thụ Se, đây cũng được xem là một cơ chế
bảo vệ tế bào không cho sự di chuyển quá nhiều Se vào chất nguyên sinh (hình 1.4)
[24].
Sự hấp thụ nội bào của Se
Sự vận chuyển Se thường thông qua các kênh vận chuyển chủ động, ở nấm
men 2 kênh Sul1p/Sul2p được sử dụng để vận chuyển Se [25]. Ngoài ra, một số
nghiên cứu khác cho thấy các kênh vận chuyển phosphate và acid monocarboxylic
cũng có vai trị trong quá trình hấp thu Se [24]. Đầu tiên, Se+6 (SeO42-) được chuyển
thành APSe nhờ enzyme ATP sulfurylase. Sản phẩm được tạo thành trong phản ứng
được xúc tác bởi PAPSe reductase thành Se+4 (SeO32-). Sau đó, sự khử Se+4 được xúc
tác bởi sulfate reductase sử dụng NADPH như một chất khử để tạo thành selenua
hydrogen (H2Se) (hình 1.4).


12

Con đường biến dưỡng chuyển hóa thành những dạng hợp chất
Se khác nhau ở Saccharomyces cerevisiae; A: Sulfurylase ATP; B: APSe Kinase; C:
PAPSe reductase; D: sulphate reductase; E: Homocysteine synthase; F:
Methioninesynthase; G: adenosylomethionine synthase; H: Methyltransferase; I:

adenosylhomocysteine hydrolase; K: Cystathionine-β-synthase; L: Cystathionine-γlyase;

M:

Se-methyltransferase;

acetylhomoserine;
Selenocystathionine;

SeHCys:
SeCys:

N:

Synthase γ-glu-Cys; O-Ac-Hser:

Homoselenocysteine;
Selenocysteine;

O-

Se-Cystathionine:

SeMeCys:Seleno-methyl-

selenocysteine; SeMet: Selenomethionine; SeMetoxđ: Selenomethionine dạng oxy hóa;
SeAM: Se-adenosyl-selenomethionine; SeAHCys: Adenosyl Homo-seleno Cysteine;
SAM: S-adenosylmethionine. Hình được mơ phỏng từ Kieliszek và cộng sự (2015)
[24]
H2Se có khả năng xâm nhập vào bên trong tế bào một cách thụ động, là chất

chuyển hóa trung gian chính trong con đường sinh tổng hợp tất cả các hợp chất chứa
Se diễn ra trong tế bào vi sinh vật. Nó tiếp tục được chuyển hóa thành các hợp chất
hữu cơ bao gồm các seleno amino acid (hình 1.4) [24]. Tóm lại, q trình tích lũy Se
ở nấm men là một tiến trình hình thành nhiều Se-protein khác nhau. SeMet là dạng
cơ bản của Se trong tế bào nấm men trong đó nó có thể cấu tạo hơn 90% tổng hàm
lượng Se trong nấm men. SeMet là dạng hấp thu nhiều nhất ở người và động vật. Nó
thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa, tăng cường miễn dịch của cơ thể và kích thích hoạt


13
động của một số enzyme sửa sai DNA [24]. Ngoài ra, SeMet kết hợp không đặc hiệu
thành protein thay thế cho methionine và được lưu giữ trong các mô. Ở nấm men,
methylselenocysteine là hợp chất được biết đến nhiều nhất bởi hoạt tính kháng ung
thư của chúng. Ở người và động vật, methylselenocysteine bị chuyển thành
methylselenol (CH3SeH) cũng là một chất kháng ung thư mạnh.
1.3. Nuôi trồng nấm Cordyceps
1.3.1 Nuôi trồng Cordyceps
Do nhu cầu sử dụng Cordyceps sinensis ngày càng lớn nên số lượng khai thác
ngoài tự nhiên ngày càng hạn chế. Chính vì vậy, để duy trì nguồn dược liệu quý hiếm
này, các nhà khoa học đã nỗ lực nghiên cứu nuôi cấy nhân tạo nấm Cordyceps sinensis
mang lại lợi ích lâu dài cho con người. Hiện nay, ni cấy Cordyceps sinensis có thể
tiến hành theo hai phương pháp là nuôi cấy lỏng và bán rắn. Nuôi cấy lỏng là phương
pháp chủ yếu dùng một lượng nhỏ bào tử Cordyceps sinensis cấy vào môi trường
lỏng đã khử trùng. Sinh khối Cordyceps sinensis dạng sợi được thu hoạch bằng cách
lọc dịch ni cấy, sau đó sấy khơ. Phương pháp này tạo sản phẩm chất lượng tốt,
đồng nhất có chất lượng ít biến đổi, phù hợp sản xuất quy mô lớn và dễ kiểm sốt các
thơng số tăng trưởng trong các bồn ni cấy lớn. Tuy nhiên phương pháp này có thể
gây thất thốt một số hợp chất ngoại bào [26].
Ni cấy bán rắn được dùng để tạo quả thể Cordyceps sinensis. Bào tử
Cordyceps sinensis được đưa vào môi trường bán rắn đã khử trùng, thường là hạt ngũ

cốc hoặc hỗn hợp ngũ cốc, ấu trùng côn trùng với độ ẩm tương đối khoảng 45 - 50%.
Ưu điểm của phương pháp này là có thể giữ những hợp chất ngoại bào, giúp duy trì
được hoạt tính của Cordyceps sinensis và có hình thái tương đồng với tự nhiên nên
có giá trị cao [26] [27]. Hiện nay, nuôi cấy quả thể C. sinensis đã bước đầu thành
công, Cao và cộng sự (2015) đã nuôi cấy thành công quả thể C. sisnensis trên môi
trường bán rắn gạo, bột nhộng tằm và dịch dinh dưỡng; tuy nhiên, thời gian nuôi cấy
rất dài (140 ngày) [28]. Năm 2017, trung tâm Ligno Biotech Sdn. Bhd, Malaysia đã
nuôi cấy thành công quả thể C. sinensis [4]. Gần đây, năm 2019 Liu và cộng sự cũng
đã nuôi cấy thành công C. sinensis trên ấu trùng Thitarodes xiaojinensis trong điều
kiện nhân tạo [29]. Do q trình ni cấy rất phức tạp, thời gian phát triển dài ngày
nên sản xuất C. sinensis bằng phương pháp nuôi cấy bán rắn tốn kém hơn nhiều so


14
với phương pháp ni cấy lỏng và vì thế phương pháp nuôi cấy lỏng vẫn được coi là
chiến lược tối ưu cho việc sản xuất loài nấm này.
Bảng 1.3.

Một số thành phần môi trường nuôi cấy nấm Cordyceps
Thành phần môi trường

Chủng nấm

Tham khảo

Cordyceps

Maltose 20g/L, glycerol 8g/L, tryptone 5g/L,

Xiao và cộng


jiangxiensis

cao nấm men 10g/L, KH2PO4 1g/L và CaCl2

sự (2004) [30]

JXPJ 0109

0,5g/L

Cordyceps

Saccharose 6% (w/v), polypeptone 1% (w/v)

Kim và cộng

militaris C738

và K2HPO4 0,05% (w/v)

sự (2003) [31]

Cordyceps

Saccharose 30g/L, cao chiết bò 4g/L, acid

Singh và cộng

sinensis


folic 10mgSe/L, CaCl2 1g/L và ZnCl2 500g/L.

sự (2014) [32]

Cordyceps

Saccharose 50g/L, peptone 10g/L và cao nấm

Dong và cộng

sinensis

men 3g/L.

sự (2005) [33]

Cordyceps

Saccharose 20g/L, bột đậu nành 4g/L, cao

Lin và cộng sự

guangdongensis

chiết bò 5g/L và KNO3 10g/L.

(2010) [34]

Cordyceps


Saccharose 24,7g/L, peptone 20g/L,

Kang và cộng

militaris

K2HPO4.3H2O 1,11g/L, MgSO4.7H2O

sự (2014) [35]

0,90g/L, vitamin B1 10mgSe/L, hypoxanthine
5,45g/L và L-alanine 12,23g/L.
Nấm nói chung cũng như Cordyceps nói riêng khá linh hoạt trong việc hấp thu
các hợp chất carbon như polysaccharide, monosaccharide, acid hữu cơ, acid amin,
polycyclic, ligin, cellulose, glucose, saccharose, xylose, maltose, … Nguồn dinh
dưỡng carbon giữ vai trò quan trọng đối với sự hình thành cấu trúc cũng như cung
cấp năng lượng cho tế bào. Nấm sử dụng nguồn carbon bằng cách phân cắt chúng
thành những phân tử nhỏ hơn và đưa vào tế bào. Nitơ là nguyên tố cần thiết cho sự
tổng hợp protein, purine, pyrimidine và một số dẫn xuất của polysaccharide. Những
nguồn nitơ mà nấm sử dụng gồm: nitrat, amon, nitơ hữu cơ như peptone, cao nấm
men,... Ngồi ra, nguồn khống như KH2PO4, K2HPO4, MgSO4, CaCl2 cũng như
vitamin góp phần vào q trình sinh trưởng và phát triển của nấm [36]. Để thu được


15
lượng sinh khối cũng như thành phần và hàm lượng các hợp chất mong muốn trong
nấm cao nhất thì các nhà nghiên cứu đã tiến hành các thí nghiệm để xác định thành
phần dinh dưỡng, nhiệt độ, pH,… tối ưu cho sự tăng trưởng của Cordyceps và tùy
vào từng loài mà có mơi trường tối ưu khác nhau như trong bảng 1.3.

1.3.2. Các nghiên cứu về nuôi cấy Cordyceps bổ sung selen
Để tăng hoạt tính của C. sinensis cũng như giúp bổ sung lượng Se cần thiết
cho cơ thể, chiến lược nuôi cấy làm giàu Se hữu cơ đã được các nhà khoa học quan
tâm. Tuy nhiên, khi bổ sung Se ở nồng độ cao sẽ ảnh hưởng đến sự phát triển của
nấm, vì vậy, những nghiên cứu về khả năng thích nghi, tối ưu thành phần và điều kiện
mơi trường nuôi cấy là vấn đề cấp thiết. Ji và cộng sự (2014) đã tiến hành nuôi cấy
C. sinensis trong mơi trường có bổ sung Se. Kết quả cho thấy khi bổ sung 0,4% Se
thì lượng Se tích lũy trong sinh khối đạt 4789,26 ± 13,0𝜇g/g và có khả năng kháng
lại các khối u trong cổ tử cung trên chuột đồng thời cũng thấy các hoạt tính khác như
catalase, Na+/K+-ATPase và glutathion S transferase được phục hồi [37].
Kết quả nghiên cứu khác của Zheng và cộng sự năm 2014 trên C. sinensis SU1 cho thấy hoạt tính kháng oxy hóa trên nấm được làm giàu Zn, Ge, Se được cải thiện.
Ni cấy được tiến hành với mơi trường lỏng có chứa khoai tây 200g/L, glucose
30g/L, cao chiết nấm men 4g/L, KH2PO4 2g/L, MgSO4.7H2O 1g/L và CMC-Na 2g/L,
pH 6,5 đồng thời tối ưu hóa nồng độ Zn, Ge, Se. Ở nồng độ Zn, Ge, Se lần lượt là
100mgSe/L, 200mgSe/L, 20mgSe/L cho thấy khối lượng chất khơ đạt cao nhất. Hoạt
tính của glutathione peroxidase (GSH-Px) và superoxide dismutase (SOD) trong thử
nghiệm in vivo cũng cao hơn so với đối chứng. Đồng thời phân tích hàm lượng Se
tích lũy trong sinh khối bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) thì
lượng Se đạt được 1260,16 ± 107,12µg/g [38]. Năm 2006, Yang và cộng sự đã tiến
hành nuôi cấy C. sinensis trong mơi trường có bổ sung natri selenite với nồng độ
33,78mgSe/L thì hàm lượng selenopolysaccharide nội bào thu được là 197,35mg/g,
đồng thời cũng cải thiện rõ rệt một số hoạt tính sinh học như kháng oxy hóa, năng lực
khử và thử nghiệm thành cơng trên mơ hình chuột đái tháo đường [19]. Zhang và
cộng sự (2014) đã báo cáo rằng điều kiện nuôi cấy tối ưu của C. militaris giàu Se cho
tỷ lệ chuyển hóa thành Se hữu cơ cao nhất là 20mgSe/L khi nuôi 5 ngày ở pH 7 trong
môi trường lỏng gồm (%w/v): saccharose 3, khoai tây 20, NaNO3 0,2 và KH2PO4 0,5.


16
Với điều kiện này, tỷ lệ chuyển hóa thành Se hữu cơ có thể đạt 18,44%. Kết quả cho

thấy, khi mơi trường có nồng độ Se thấp có thể kích thích sợi nấm C. militaris phát
triển, trong khi Se ở nồng độ cao thì cản trở sự phát triển, do vậy làm giảm tỷ lệ
chuyển hóa thành Se hữu cơ [39]. Những nghiên cứu trước đây của Hu và cộng sự
(2018a, 2018b), Tie và cộng sự (2014) về làm giàu Se trên nấm Cordyceps militaris
cho thấy nấm có khả năng chuyển hóa các dạng Se vơ cơ thành hữu cơ như
selenocystine, selenomethionine và những dạng Se hữu cơ khác thông qua phương
pháp HPLC-ICP-MS [40] [41] [42]. Và có một số nghiên cứu khác đã sử dụng kĩ
thuật pha loãng đồng vị phóng xạ để xác định các dạng hợp chất Se trong nấm [43]
[44].
Ngồi ra, tối ưu hóa mơi trường và điều kiện nuôi cấy bằng phương pháp đáp
ứng bề mặt (RSM) cũng đã được nghiên cứu áp dụng để nâng cao sinh khối và tích
lũy Se qua đánh giá sự tương tác giữa các yếu tố để tìm được điểm cực trị hoặc vùng
tối ưu cho thí nghiệm. Phương pháp này còn giúp tiết kiệm tối đa thời gian và công
sức so với phương pháp tối ưu kinh điển. Do đó, nhiều cơng trình khoa học đã sử
dụng các mơ hình tối ưu như Box-Behnken, D-optimal khi ni cấy làm giàu Se ở
nấm men [45] [46]. Zheng và cộng sự (2014) cũng đã nghiên cứu tối ưu hóa mơi
trường để làm giàu Zn, Ge, Se ở nấm C. sinensis [38], tối ưu hóa mơi trường để thu
nhận seleno-exopolysaccharide (Se-EPS) ở nấm Cordyceps sobolifera [47] và thu
nhận selenopolysaccharide ở nấm C. sinensis [19]. Năm 2016, Huỳnh Thị Diễm Phúc
và cộng sự đã sử dụng mơ hình BCPharSoft để tối ưu hóa mơi trường ni cấy C.
sinensis bổ sung Zn [48].


17

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Chủng nấm Cordyceps sinensis CS-YK2007 được cung cấp bởi TS. Trương

Bình Nguyên, Viện nghiên cứu và ứng dụng nông nghiệp công nghệ cao, Trường Đại
học Đà Lạt, Lâm Đồng.
2.1.2. Hóa chất
Na2SeO3.5H2O, Na2SeO4.12H2O, 2,2’-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6sulfonate) (ABTS), H2O2, FeSO4, Na2S2O8, đệm phosphate (Phosphate-buffered
saline), Trypsin, EDTA, xanthine oxidase, allopurinol, xanthine, α-glucosidase, 1,1diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), ascorbic acid (vitamin C), K3[Fe(CN)6], TCA,
FeCl3,

CTAB, isopropropanol, Hs Taq, albumin (BSA), p-nitrophenyl-α-D-

glucopyranoside, Eagle’s Minimal Essential Medium (EMEM), FBS, L-glutamine,
HEPES, amphotericin B, penicillin G, streptomycin, acid trichloroacetic, SRB, acid
acetic, acid nitric (HNO3 65%), acid chlorhydric (HCl 37%), sodium carbonate,
ammonium acetate, dung dịch H2O2 30%, protease từ Streptomyces griseus, type
XIV, proteinase K từ Tritirachium album, methanol cho HPLC, acetonitrile cho
HPLC, selenocystine, methylselenocysteine, Selenocystamine dihydrochloride,
selenomethionine (Sigma Aldrich). Selen đồng vị làm giàu (77Se-enriched, Isoflex
USA), selen nguyên tố (BDH). Dung dịch Tris ba-zơ (Promega), Mueller Hinton agar
(Himedia), Acarbose (Fisher Scientific), camptothecin (Calbiochem). Thành phần
môi trường nuôi cấy: khoai tây, glucose, saccharose, agar (Việt Nam), cao nấm men,
peptone, KH2PO4, K2HPO4, MgCl2 (Trung Quốc).
2.1.3. Thiết bị
Nồi hấp Jibimed (Trung Quốc); Tủ cấy Shinsaeng (Hàn Quốc); Máy quang
phổ Phoenix (Đức); Hệ thống ICP-MS Agilent 7700x (Mỹ); Kính hiển vi (Trung
Quốc); Máy đo độ ẩm AND MX–50 (Nhật Bản); Tủ sấy MEMMERT (Đức); Máy đo
pH HANNA (Romania); Máy ly tâm Micro 17R (Đức); Cân kỹ thuật PioneerTM


18
Ohaus (Mỹ); Hệ thống NexION 350X Perkin Elmer (Mỹ); Bể điều nhiệt Julabo F34
(Đức).

2.2. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Khảo sát sự ảnh hưởng của selen lên khả năng sản xuất sinh khối
của nấm Cordyceps sinensis
Nội dung 2: Tối ưu hóa mơi trường và điều kiện ni cấy sản xuất sinh khối
nấm Cordyceps sinensis giàu selen
Nội dung 3: Đánh giá hoạt tính sinh học của sinh khối nấm Cordyceps sinensis
giàu selen
2.3. Địa điểm và thời gian thực hiện
2.3.1. Địa điểm thực hiện:
Viện Sinh học Nhiệt đới
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại Học Quốc Gia TP. Hồ Chí Minh
Viện Y Tế Cơng Cộng TP. Hồ Chí Minh
2.3.2. Thời gian thực hiện
Tháng 01/2015 – tháng 6/2020
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Chuẩn bị giống
Giống cấp 1 được thực hiện trên môi trường PGA gồm khoai tây (200g/L),
glucose (20g/L), agar (15g/L). Sau đó, cấy chuyền 1 khoanh giống từ ống giống thạch
nghiêng, nuôi cấy ở 22 ± 2°C, trong 15 ngày. Giống cấp 2 được tiến hành trên môi
trường lỏng PG gồm khoai tây (200g/L), glucose (20g/L). Mỗi bình giống cấy 2
khoanh giống cấp 1 vào bình erlen chứa 200 mL môi trường. Ủ ở 22 ± 2°C, trong 10
ngày.
2.4.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của Se đến sự sinh trưởng C. sinensis trên môi
trường PGA và môi trường lỏng PS
2.4.2.1. Khảo sát sự ảnh hưởng của dạng và nồng độ Se đến C. sinensis trên
môi trường PGA


19
Chuẩn bị môi trường PGA gồm khoai tây (200g/L), glucose (20g/L), KH2PO4

(0,5g/L), MgCl2 (0,1g/L), pepton (6g/L), cao nấm men (4g/L), agar (15g/L). Sau đó,
bổ sung muối selenite (Na2SeO3.5H2O), selenate (Na2SeO4.10H2O) và selenourea
(SeC(NH2)2) với các nồng độ từ 5 – 40mgSe/L (Nồng độ Se trong môi trường được
quy đổi dựa vào thành phần phần trăm của nguyên tố Se trong mỗi muối selenate,
selenite và selenourea) và đổ vào các đĩa petri. Tiến hành cấy 1 khoanh giống cấp 1
(đường kính 1 cm) vào tâm đĩa petri, ủ ở nhiệt độ 22 ± 2°C. Theo dõi tốc độ lan tơ
của sợi nấm ở các thời điểm 5, 10, 15 ngày và xác định đường kính sợi nấm qua kính
trắc vi thị kính.
2.4.2.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của dạng và nồng độ Se đến C. sinensis trên
môi trường lỏng PS
Chuẩn bị 2L môi trường lỏng PS gồm khoai tây (200g/L), saccharose (50g/L),
pepton (6g/L), cao nấm men (4g/L), KH2PO4 (0,5g/L) và MgCl2 (0,1g/L). Hấp khử
trùng 30 phút ở 121°C, pH 6 - 7. Sau đó, bổ sung muối selenite (Na2SeO3), selenate
(Na2SeO4) và selenourea (SeC(NH2)2) với các nồng độ từ 5 – 40mgSe/L. Tiếp theo,
đổ 200mL môi trường ra các hộp nhựa. Nuôi ở nhiệt độ 22 ± 2°C, theo dõi trong 40
ngày. Sinh khối được thu nhận bằng cách lọc qua rây và rửa nhiều lần với nước cất
nhằm loại bỏ hoàn toàn Se cịn lại trong mơi trường bám vào. Sấy khơ ở 60°C. Phân
tích hàm lượng Se có trong sinh khối bằng phương pháp ICP -MS.
2.4.3 Phương pháp ni cấy thích nghi cải tiến
Trong thí nghiệm này, chúng tơi sử dụng loại muối selenate đã chọn ở thí
nghiệm 2.4.2. Phương pháp cải tiến này được tiến hành bằng cách nuôi cấy thích nghi
nấm Cordyceps sinensis trong mơi trường selenate từ thấp đến cao. Phương pháp
được tiến hành dựa trên nghiên cứu của Zhang và cộng sự (2014) [39] như sau: (i)
Kích hoạt hệ sợi nấm C. sinensis trong môi trường PGA với lượng selenate 5mgSe/L
trong 7 ngày. (ii) Sau đó, chuyển các sợi nấm sang môi trường PS lỏng với lượng
selenate tương tự và nuôi ở 22 ± 2°C, trong 10 ngày để thu được hệ sợi nấm. (iii)
Chuyển sợi nấm vào mơi trường PS lỏng có lượng selenate 10mgSe/Lvà ni chúng
ở 22 ± 2°C, trong 10 ngày để có được hệ sợi. (iv) Sau đó, cho sợi nấm vào mơi trường
PS lỏng chứa 7,5mgSe/L selenate cho phục hồi tăng sinh để thúc đẩy sợi nấm phát
triển ở 22 ± 2°C, trong 10 ngày. (v) Sau 10 ngày, chuyển chúng qua môi trường PGA



20
với 15mgSe/L Se và ủ 10 ngày với điều kiện tương tự. (vi) Sau đó, chuyển chúng
sang mơi trường PS lỏng có chứa 15mgSe/L selenate trong 15 ngày cho việc phục
hồi. (vii) Tiếp tục lặp lại tương tự ở bước (iii) và (iv) cho đến nồng độ selenate
25mgSe/L. Sau đó, cấy chuyền sợi nấm ở nồng độ selenate 25mgSe/L qua ống thạch
nghiêng selenate-PGA và giữ ở 4°C. Giống nấm C. sinensis sau khi trải qua q trình
thích nghi này được sử dụng nuôi cấy trên môi trường bổ sung selenate 25mgSe/L
như mục 2.4.2.1 và 2.4.2.2. Giống ban đầu được sử dụng như thí nghiệm đối chứng.
2.4.4. Tối ưu hóa mơi trường và điều kiện nuôi cấy Cordyceps sinensis trên môi
trường lỏng bổ sung selen
Phần này, chúng tôi sử dụng chủng nấm Cordyceps sinensis hoạt hóa trên mơi
trường thạch như kết quả ở mục 2.4.3
2.4.3.1. Sàng lọc thành phần môi trường bằng thiết kế Plackett – Burman
Sử dụng thiết kế Plackett-Burman để sàng lọc các thơng số chính trong một số
lượng lớn các yếu tố của quá trình tối ưu [49]. Sàng lọc thành phần môi trường ảnh
hưởng đến tổng hợp được tiến hành ở 2 mức (-1 và +1) (bảng 2.1). Các nghiệm thức
thiết kế theo Plackett – Burman với các yếu tố được lựa chọn là khoai tây, saccharose,
peptone, cao nấm men, KH2PO4, K2HPO4, MgCl2 được liệt kê trong bảng 2.2, trong
đó X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7 là các biến độc lập. Bố trí 12 thí nghiệm như bảng 2.2.
Mỗi nghiệm thức được thực hiện với 2L môi trường, bổ sung 10% giống cấp 2 và
muối Se vào môi trường để đạt nồng độ cuối cùng theo thí nghiệm 2.3. Sau đó, đổ
200mL mơi trường vào hộp nhựa. Tiến hành nuôi ở nhiệt độ 22 ± 2°C, theo dõi trong
40 ngày. Sinh khối thu nhận bằng cách lọc qua rây, rửa sạch nhiều lần với nước cất
và sấy khơ ở 60°C. Phân tích hàm lượng Se trong sinh khối bằng phương pháp ICPMS.


21
Bảng 2.1.


Các biến trong ma trận Plackett-Burman

Yếu tố

Đơn vị

Ký hiệu

Khoai tây

g/L

Saccharose

Mức
Thấp (-1)

Cao (+1)

X1

150

250

g/L

X2


40

60

Peptone

g/L

X3

5

15

Cao nấm men

g/L

X4

5

15

KH2PO4

g/L

X5


0,5

1.5

K2HPO4
MgCl2

g/L
g/L

X6
X7

0,5
0,1

1,5
1

Bảng 2.2.

Ma trận thiết kế thí nghiệm Plackett – Burman
Các biến

NT

X1

X2


X3

X4

X5

X6

X7

1

-1

1

1

1

-1

-1

-1

2

1


1

-1

1

1

1

-1

3

1

1

-1

-1

-1

1

-1

4


-1

-1

1

-1

1

1

-1

5

-1

1

1

-1

1

1

1


6

-1

1

-1

1

1

-1

1

7

1

-1

1

1

-1

1


1

8

-1

-1

-1

-1

-1

-1

-1

9

1

-1

-1

-1

1


-1

1

10

-1

-1

-1

1

-1

1

1

11

1

1

1

-1


-1

-1

1

12

1

-1

1

1

1

-1

-1

2.4.3.2. Tối ưu hóa thành phần mơi trường bổ sung selen bằng mơ hình Box Behnken
Dựa vào kết quả của thí nghiệm sàng lọc, mơ hình Box – Behnken được sử
dụng để tối ưu hóa mơi trường nuôi cấy nấm C. sinensis bổ sung Se [50]. Mơ hình
thực hiện ở 3 mức (-1, 0 và +1) với 17 nghiệm thức (bảng 2.3, bảng 2.4). Mỗi nghiệm


22
thức được thực hiện với 2L môi trường, bổ sung 10% giống cấp 2 và muối Se vào

môi trường để đạt nồng độ cuối cùng theo thí nghiệm 2.3. Sau đó, đổ 200mL mơi
trường vào hộp nhựa dung tích 650mL. Tiến hành nuôi ở nhiệt độ 22 ± 2°C, theo dõi
trong 40 ngày. Sinh khối được thu nhận và rửa sạch nhiều lần với nước cất và sấy khô
ở 60°C.
Bảng 2.3.

Nồng độ các yếu tố sử dụng trong Box – Behnken

Yếu tố

Đơn vị

Y1
Y2
Y3

g/L
g/L
g/L

Bảng 2.4.

Mức
0
0
0
0

-1
-1

-1
-1

+1
+1
+1
+1

Thiết kế Box - Behnken

Nghiệm thức

Các biến
Y1

Y2

Y3

1

0

-1

-1

2

0


0

0

3

0

0

0

4

1

1

0

5

0

1

1

6


0

-1

1

7

1

0

-1

8

1

0

1

9

-1

0

-1


10

-1

-1

0

11

-1

1

0

12

-1

0

1

13

0

1


-1

14

0

0

0

15

0

0

0

16

1

-1

0

17

0


0

0


23
Hàm lượng Se được phân tích bằng phương pháp ICP-MS. Hàm đáp ứng được
chọn là sinh khối (g/L) hoặc hàm lượng Se (µg/g), mơ hình hóa được biểu diễn bằng
phương trình hồi quy:
A = B0 + B1X1 + B2X2 + B3X3 + B12X1X2 + B13X1X3 + B23X2X3 + B11X12 +
B22X22 + B33X32. Trong đó, B1, B2, B3 là các hệ số bậc 1; B11, B22 và B33 là hệ số bậc
2; B12, B23 và B13 là các hệ số tương tác của từng cặp yếu tố; X1, X2, X3 là các biến
độc lập. Số liệu được phân tích bằng chương trình “Design Expert® 7.0" Stat-Ease,
Inc., Minneapolis, Hoa Kỳ.
2.4.3.3. Tối ưu hóa điều kiện ni cấy bằng mơ hình đáp ứng bề mặt D-optimal
Tiến hành tối ưu hóa điều kiện mơi trường bằng D-optimal được trình bày ở
bảng 2.5 và được lặp lại 3 lần, thí nghiệm được thực hiện ở 3 mức (-1, 0 và +1) (bảng
2.6) với cường độ ánh sáng trắng 8,618µmolphoton/m2/s, ánh sáng đỏ
6,617µmolphoton/m2/s, ánh sáng xanh dương 13,872µmolphoton/m2/s [46]. Mơi
trường gồm khoai tây, saccharose, cao nấm men, peptone, KH2PO4, K2HPO4, MgCl2
thu được từ thí nghiệm tối ưu 2.4.2. Muối Se được bổ sung vào môi trường để Se đạt
nồng độ cuối theo thí nghiệm 2.3. Sau đó, đổ 200mL mơi trường ra hộp nhựa. Ni
ở nhiệt độ 22±2°C, theo dõi trong 40 ngày. Sinh khối thu nhận bằng cách lọc qua rây,
rửa sạch nhiều lần với nước cất 1 lần, sấy khơ ở 60°C. Phân tích hàm lượng Se có
trong sinh khối bằng phương pháp HPLC ICP-MS.


×