Nghiên cứu điều kiện lên men cordyceps sinensis tạo sinh khối giàu selen và khảo sát hoạt tính sinh học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN
Cordyceps sinensis TẠO SINH KHỐI GIÀU
SELEN VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CƠNG NGHỆ SINH HỌC

TP Hồ Chí Minh – Năm 2021


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

V
V

HỌC
VIỆN
KHOA
HỌC
VÀ
CÔNG
NGHỆ

-

NGHIÊ
N CỨU
ĐIỀU
KIỆN
LÊN
MEN
Cordyceps
sinensis
TẠO SINH
KHỐI
GIÀU
SELEN VÀ
KHẢO SÁT
HOẠT TÍNH
SINH HỌC


Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 9 42 02 01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CƠNG
NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI
HƯỚNG
DẪN
KHOA

HỌC:
P
G
S.
TS
K
H.
Ng
ơ
Kế
Sư
ơn
g

TP Hồ Chí Minh –
Năm 2021


LỜI CẢM ƠN
Để hồn thành chương trình Nghiên cứu sinh và Luận án Tiến sĩ, tôi đã nhận
được sự quan tâm, chia sẻ, hỗ trợ của rất nhiều thầy cô, anh chị, các bạn bè cùng khoá,
đồng nghiệp tại các đơn vị.
Xin trân trọng cám ơn PGS.TSKH Ngô Kế Sương, người thầy đáng kính đã
ln động viên, hướng dẫn, góp ý kiến để tơi hồn thiện Luận án. Trân trọng cám ơn
TS. Đinh Minh Hiệp đã hỗ trợ, giúp đỡ, chia sẻ trong suốt quá trình thực hiện Luận
án.
Xin trân trọng cám ơn các thầy cô giáo của Viện Sinh học Nhiệt đới, Học Viện
Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Trường
ĐH Khoa học Tự nhiên- Đại học Quốc gia Tp. Hồ Chí Minh đã truyền đạt kiến thức,
góp ý cho tơi trong suốt q trình học tập và thực hiện đề tài.

Trân trọng cám ơn các bạn trong nhóm nghiên cứu (TS. Trần Minh Trang, ThS.
Nguyễn Tài Hoàng) đã dành nhiều tâm huyết, thời gian, hỗ trợ tơi hồn thành Luận
án.
Trân trọng cám ơn Trung ương Đồn TNCS Hồ Chí Minh, cơ quan tôi công tác
trong suốt thời gian thực hiện Luận án, đã chia sẻ, tạo mọi điều kiện thuận lợi để tơi
hồn thành chương trình học tập và nghiên cứu.
Và cuối cùng, tơi xin dành tình cảm, sự biết ơn đối với gia đình, những người
ln mong mỏi, âm thầm quan tâm, động viên, khích lệ để tơi hoàn thành Luận án.
Trân trọng cám ơn.


LỜI CAM ĐOAN

Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu này là của riêng tơi. Các số liệu, kết
quả trình bày trong Luận án này là trung thực và chưa từng được ai cơng bố trong bất
kỳ cơng trình nào khác.

Người thực hiện


MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT................................................................................... i
DANH MỤC HÌNH ....................................................................................................v
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................ vii
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .......................................................................................3
1.1. Nấm Cordyceps sinensis ..................................................................................3
1.1.1. Đặc điểm, phân bố ......................................................................................3
1.1.2. Hoạt tính sinh học.......................................................................................4
1.2. Selen và vai trị sinh học của selen ..................................................................6

1.2.1. Nguồn selen hiện nay .................................................................................6
1.2.2. Vai trò của selen đối với cơ thể ..................................................................7
1.2.3. Con đường chuyển hóa selen ở nấm.........................................................11
1.3. Nuôi trồng nấm Cordyceps ............................................................................13
1.3.1 Nuôi trồng Cordyceps................................................................................13
1.3.2. Các nghiên cứu về nuôi cấy Cordyceps bổ sung selen.............................15
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...........................17
2.1. Vật liệu...........................................................................................................17
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ...............................................................................17
2.1.2. Hóa chất ....................................................................................................17
2.1.3. Thiết bị......................................................................................................17
2.2. Nội dung nghiên cứu......................................................................................18
2.3. Địa điểm và thời gian thực hiện.....................................................................18
2.3.1. Địa điểm thực hiện: ..................................................................................18
2.3.2. Thời gian thực hiện...................................................................................18
2.4. Phương pháp nghiên cứu ...............................................................................18
2.4.1. Chuẩn bị giống..........................................................................................18


2.4.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của Se đến C. sinensis trên môi trường PGA và môi
trường lỏng PS ......................................................................................................18
2.4.2.1. Khảo sát sự ảnh hưởng của Se đến C. sinensis trên môi trường PGA
.......................................................................................................................18
2.4.2.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của Se đến C. sinensis trên môi trường lỏng
PS ..................................................................................................................19
2.4.3 Phương pháp ni cấy thích nghi cải tiến .................................................19
2.4.4. Tối ưu hóa mơi trường và điều kiện ni cấy Cordyceps sinensis trên môi
trường lỏng bổ sung selen .....................................................................................20
2.4.3.1. Sàng lọc thành phần môi trường bằng Plackett – Burman ..............20
2.4.3.2. Tối ưu hóa thành phần mơi trường bổ sung selen bằng mơ hình đáp

ứng bề mặt Box -Behnken.............................................................................21
2.4.3.3. Tối ưu hóa điều kiện ni cấy bằng mơ hình đáp ứng bề mặt Doptimal...........................................................................................................23
2.4.5. Phương pháp thu nhận cao chiết...............................................................24
2.4.5.1. Cao chiết tổng ..................................................................................24
2.4.5.2. Cao chiết phân đoạn .........................................................................25
2.4.5.3. Cao chiết CPS ..................................................................................25
2.4.5.4. Thu nhận EPS...................................................................................25
2.4.5.5. Thu nhận IPS....................................................................................26
2.4.6. Khảo sát hoạt tính sinh học của cao chiết.................................................26
2.4.6.1. Khả năng bắt gốc tự do ABTS .........................................................26
2.4.6.2. Khả năng bắt gốc tự do DPPH .........................................................26
2.4.6.3. Xác định năng lực khử .....................................................................27
2.4.6.4. Xác định khả năng bảo vệ DNA ......................................................27
2.4.6.5. Hoạt tính ức chế xanthine oxidase ...................................................27
2.4.6.6. Đánh giá hoạt tính kháng viêm ........................................................28


2.4.6.7. Hoạt tính ức chế α-glucosidase ........................................................28
2.4.6.8. Khảo sát khả năng gây độc tế bào ....................................................28
2.7. Định lượng selen trong nấm Cordyceps sinensis...........................................29
2.7.1. Phân tích selen tổng ..................................................................................29
2.7.2. Phân tích selen nguyên dạng ....................................................................29
2.7.3. Phân tích FT-IR ........................................................................................30
2.8. Thử nghiệm độc tính cấp của sinh khối nấm Cordyceps sinensis giàu selen 30
2.9. Phương pháp xử lý số liệu .............................................................................30
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN..............................................................31
3.1 Về ảnh hưởng của selen đến sự phát triển của nấm Cordyceps sinensis ........31
3.1.1 Ảnh hưởng của selen đến sự phát triển của tơ nấm Cordyceps sinensis ...31
3.1.2 Ảnh hưởng của selen đến sản xuất sinh khối của nấm Cordyceps sinensis
...............................................................................................................................33

3.1.3 Về nâng cao khả năng phát triển và sản xuất sinh khối của nấm Cordyceps
sinensis trên môi trường bổ sung selenate bằng phương pháp ni cấy thích nghi
cải tiến ...................................................................................................................36
3.2 T ối ưu hóa môi trường và điều kiện nuôi cấy để nâng cao chuyển hóa selen
trong sinh kh ối n ấ m Cordyceps sinensis ...............................................................41
3.2.1 Sàng lọc các thành phần môi trường ảnh hưởng đến sự sản xuất sinh khối
và tích lũy selen của nấm Cordyceps sinensis ......................................................41
3.2.2 Tối ưu hóa thành phần mơi trường ............................................................48
3.2.3 Tối ưu hóa điều kiện ni cấy ...................................................................52
3.2.4 Thảo luận ...................................................................................................57
3.3 Xác định thành phần hoạt chất và dạng selen chuyển hóa trong nấm Cordyceps
sinensis ..................................................................................................................60
3.3.1 Thu nhận cao chiết từ sinh khối nấm và dịch nuôi cấy .............................60
3.3.2. Hàm lượng selen trong cao chiết ..............................................................61
3.3.3 Sự hiện diện của selen trong các cao chiết chứa polysaccharide ..............62
3.4 Về hoạt tính sinh học của nấm Cordyceps sinensis giàu selen.......................64


3.4.1 Hoạt tính kháng oxy hóa............................................................................64
3.4.1.1. Hoạt tính bắt gốc tự do ABTS .........................................................64
3.4.1.2. Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH .........................................................66
3.4.1.3. Hoạt tính kháng oxy hóa thơng qua năng lực khử ...........................67
3.4.1.4. Hoạt tính kháng oxy hóa dựa trên khả năng bảo vệ tính nguyên vẹn
của DNA........................................................................................................68
3.4.2. Khả năng ức chế xanthine oxidase ...........................................................69
3.4.3. Hoạt tính kháng viêm in vitro...................................................................70
3.4.4. Hoạt tính ức chế α–glucosidase ................................................................72
3.4.5. Hoạt tính ức chế tăng sinh của tế bào ung thư..........................................73
3.4.6 Thảo luận chung về hoạt tính sinh học ......................................................76
3.5 Đề xuất quy trình ni cấy sản xuất nấm Cordyceps sinensis giàu selen ......81

3.5.1 Thành phần các hoạt chất sinh học trong nấm ..........................................81
3.5.2. Đánh giá độc tính cấp của sinh khối C. sinensis giàu Se trên chuột ........83
3.5.3 Đánh giá các chỉ tiêu an tồn thực phẩm...................................................84
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................89
NHỮNG ĐĨNG GĨP MỚI CỦA LUẬN ÁN .........................................................90
DANH MỤC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ .........................................................91
TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................93
PHỤ LỤC ................................................................................................................104


i

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết

Tiếng Anh

tắt
ABTS

Tiếng Việt

2,2 - azinobis - (3-

2,2 - azinobis - (3-

ethylbenzothiazoline - 6 -

ethylbenzothiazoline - 6 -

sulphonate)

sulphonate)

apoER2

apolipoprotein E receptor 2

apolipoprotein E receptor 2

BuOH

Butanol

Butanol

BSA

Bovine serum albumin

Albumin huyết thanh bê

CPT

Camptothecin

Camptothecin

DCF

2’,7’-dichlorofluorescein

2’,7’-dichlorofluorescein

DCFH

Dichlorodihyddrofluorescein

Dichlorodihyddrofluorescein

DCFH-DA

Dichloro-Dihydro-

Dichloro-Dihydro- Fluorescein

Fluorescein

Diacetate

Diacetate
DMSO

Dimethylsulfoxide

Dimethylsulfoxide

DNA

Deoxyribonucleic acid

Deoxyribonucleic acid

DPPH

2,2 - diphenyl - 1 -

2,2 - diphenyl - 1 -

picrylhydrazyl

picrylhydrazyl

ĐC

Đối chứng

EPS

Exopolysaccharide

Polysaccharide ngoại bào

EtOAc

Ethylacetate

Ethylacetate

EtOH

Ethanol

Ethanol

FT-IR

Fourier-transform infrared

Quang phổ hồng ngoại

spectroscopy


ii
Chữ viết

Tiếng Anh

tắt
Hep G2

Liver hepatocellular

Tiếng Việt
Tế bào ung thư gan Hep G2

carcinoma
IC50

Inhibitory concentration 50%

Nồng độ ức chế 50%

ICP-MS

Inductively coupled plasma

Khối phổ plasma ghép cảm ứng

Mass spectrometry
Jurkat

Jurkat Cell Line

Dòng tế bào Jurkat

IPS

Intrapolysacharide

Polysaccharide nội bào

MeOH

Methanol

Metanol

MT

Môi trường

MCF-7

Breast cancer cell line

Tế bào ung thư vú

NK cells

Natural Killer cells

Tế bào sát thủ tự nhiên

NT

Nghiệm thức

nrSSU và

The partial small subunit of

dnrLSU

rDNA (nrSSU) and the partial

Tiểu đơn vị nhỏ và tiểu đơn vị lớn

large subunit of rDNA

(nrLSU)
OD

Optical Density

Mật độ quang

PBS

Phosphate buffer saline

Đệm PBS

PE

Petroleum ether

Ete dầu hỏa

PGA

Potato glucose agar

Mơi trường PGA

PG

Potato glucose

Mơi trường PG

PS

Mơi trường PS

PTN

Phịng thí nghiệm

ROS

Reactive oxygen species

Gốc oxy hóa


iii
Chữ viết

Tiếng Anh

tắt
RNI

Tiếng Việt

Recommended Nutrition

Lượng dùng khuyến cáo hàng

Intakes

ngày cho người

SOD

Superoxide dismutase

Superoxide dismutase

SRB

Sulforhodamin B assay

Thử nghiệm độc tính SRB

Se-EPS

Seleno-exopolysaccharide

Seleno-exopolysaccharide

Se-IPS

Seleno-intracellular

Seleno-intracellular

polysaccharide

polysaccharide

Se-Pr

Seleno-protein

Seleno-protein

SeNPs

Selenium nanoparticles

Hạt nano selen

Sul1p/Sul2p

Kênh vận chuyển Sul1p/Sul2p

MMP-2

Matrix Metalloproteinase-2

Matrix Metalloproteinase-2

MMP-9

Matrix Metalloproteinase -9

Matrix Metalloproteinase -9

uPA

Urokinase-type plasminogen

Urokinase-type plasminogen

activator

activator

Mitogen-activated protein

Mitogen-activated protein kinas

MAPK

kinas
PDGF/ERK

TGF-β1

Platelet-derived growth

Platelet-derived growth

factor/Extracellular signal-

factor/Extracellular signal-

regulated kinase

regulated kinase

Transforming growth factor

Transforming growth factor beta 1

beta 1
ROS

Reactive oxygen species

Các chất oxy hóa mạnh

PKA

protein kinase A

protein kinase A

PKC

protein kinase C

protein kinase C


iv
Chữ viết
tắt

TRAP

Tiếng Anh

Tiếng Việt

The trp RNA-binding

The trp RNA-binding attenuation

attenuation protein

protein

T helper cells

Tế bào hỗ trợ T

IFNγ

Interferon gamma

Interferon gamma

XO

Xanthine oxidase

Xanthine oxidase

T CD

4+


v

DANH MỤC HÌNH
C. sinensis ngồi tự nhiên ...........................................................................3
Một số cấu trúc của seleno-đường .............................................................8
Sơ đồ chuỗi phản ứng giữa selente và glutathione......................................8
Con đường biến dưỡng chuyển hóa thành những dạng hợp chất Se khác
nhau ở Saccharomyces cerevisiae .............................................................................12
(A) Sự phát triển của nấm Cordyceps sinensis trên môi trường PGA bổ sung
selenite và selenate từ 0 đến 40 mgSe/L ở thời điểm 15 ngày. (B) Đường kính lan tơ
của nấm Cordyceps sinensis trên mơi trường PDA có bổ sung selen từ 0 đến 40
mgSe/L sau 15 ngày. .................................................................................................32
(A) Sự phát triển của nấm Cordyceps sinensis trên mơi trường lỏng có bổ
sung selenite và selenate ở nồng độ 30 mgSe/L sau 40 ngày. (B) Sinh khối nấm
Cordyceps sinensis trên môi trường lỏng bổ sung selen từ 0 – 30 mgSe/L sau 40 ngày.
Ba nguồn selen tương ứng là selenite, selenate và selenoure. ..................................35
(A) So sánh sự sản xuất sinh khối (cột) và hấp thụ selen (đường gạch nối)
bởi nấm Cordyceps sinensis giữa hai phương pháp nuôi cấy truyền thống và cải tiến
sau 40 ngày. (B) Hình thái sợi nấm phát triển trên môi trường thạch sau 14 ngày và
(C) sự sản xuất sinh khối của nấm trên môi trường lỏng theo các nghiệm thức tương
ứng sau 40 ngày.........................................................................................................37
So sánh hàm lượng các hợp chất chứa selen (µg/g) trong sinh khối nấm
được ni bằng phương pháp truyền thống (PP1) và phương pháp cải tiến (PP2) ..39
Bề mặt đáp ứng của sinh khối nấm Cordyceps sinensis theo hai yếu tố...51
Bề mặt đáp ứng của sinh khối C. sinensis theo hai yếu tố ........................55

So sánh hiệu suất chiết cao (%) giữa sinh khối nấm giàu selen (Se) và sinh
khối nấm đối chứng khơng có selen (ĐC) ................................................................61
Hàm lượng selen trong các cao chiết từ nấm ni trên mơi trường bổ sung
selen

...............................................................................................................62
Kết quả phân tích FTIR của các hợp chất Se-EPS, Se-IPS.......................64


vi
Hoạt tính kháng oxy hóa dựa trên khả năng bắt gốc tự do ABTS .........65
Hoạt tính kháng oxy hóa dựa trên khả năng bắt gốc tự do DPPH .........67
Kết quả bảo vệ DNA của các mẫu cao chiết ..........................................69
Hoạt tính kháng viêm dựa trên khả năng bảo vệ sự biến tính albumin bởi
nhiệt độ

...........................................................................................................71
Hoạt tính gây độc tế bào ung thư MCF7 ................................................74
Khả năng gây độc tế bào của các cao chiết trên tế bào fibroblast...........76
Quy trình cơng nghệ ni cấy nấm C. sinensis giàu Se ..........................86


vii

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Hoạt tính sinh học của nấm Cordyceps sinensis.........................................5
Bảng 1.2. Lượng Se cần thiết cho cơ thể hàng ngày .................................................10
Bảng 1.3. Một số thành phần môi trường nuôi cấy nấm Cordyceps .........................14
Bảng 2.1. Các biến trong ma trận Plackett-Burman..................................................21
Bảng 2.2. Ma trận thiết kế thí nghiệm Plackett – Burman ........................................21

Bảng 2.3.

Nồng độ các yếu tố sử dụng trong Box – Behnken ..............................22

Bảng 2.4. Thiết kế Box - Behnken ............................................................................22
Bảng 2.5. Thiết kế Box – Behnken ...........................................................................24
Bảng 2.6. Mức khảo sát của các yếu tố sử dụng trong D-optimal ............................24
Bảng 3.1. Trọng lượng sinh khối nấm của các nghiệm thức theo Plackett – Burman ..
...............................................................................................................44
Bảng 3.2. Kết quả phân tích ANOVA của mơ hình ..................................................45
Bảng 3.3. Lượng Se tổng trong sinh khối của các nghiệm thức theo Plackett - Burman
...............................................................................................................47
Bảng 3.4. Phân tích ANOVA về mức độ ảnh hưởng của các yếu tố khảo sát đến lượng
Se tổng trong sinh khối nấm......................................................................................48
Bảng 3.5. Sản lượng sinh khối nấm Cordyceps sinensis (g/L) của các nghiệm thức
theo Box – Behnken. .................................................................................................49
Bảng 3.6. Kết quả phân tích ANOVA của mơ hình Box – Behnken ........................50
Bảng 3.7. Trọng lượng sinh khối C. sinensis ở các nghiệm thức theo D-optimal ....53
Bảng 3.8. Kết quả phân tích ANOVA của mơ hình D-optimal ................................54
Bảng 3.9. Hàm lượng Se ở các nghiệm thức (µg/g)..................................................55
Bảng 3.10. Kết quả phân tích ANOVA của mơ hình D-optimal ..............................56
Bảng 3.11. So sánh kết quả một số nghiên cứu về thành phần môi trường ..............58
Bảng 3.12. Giá trị ∆OD của các cao chiết tại nồng độ 2000µg/mL..........................68


viii
Bảng 3.13. Giá trị IC50 trong khảo sát khả năng ức chế XO của một số cao chiết từ
sinh khối nấm C. sinensis ..........................................................................................70
Bảng 3.14. Phần trăm ức chế α - glucosidase ở nấm C. sinensis ..............................73
Bảng 3.15. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư Jurkat của các mẫu cao chiết tại nồng độ

thử nghiệm 100µg/mL...............................................................................................75
Bảng 3.16. Thành phần hoạt chất trong sinh khối nấm C. sinensis giàu selen .........82
Bảng 3.17. Kết quả khảo sát độc tính cấp đường uống của sinh khối nấm ..............83
Bảng 3.18. Khối lượng (g) của chuột nhắt trên mơ hình độc tính cấp ......................84
Bảng 3.19. Phân loại cấp độ độc dựa vào LD50 ........................................................84
Bảng 3.20. Các chỉ tiêu an toàn thực phẩm của nấm C. sinensis giàu Se .................85


1

MỞ ĐẦU
Nấm Đông trùng Hạ thảo Cordyceps sinensis (đồng tên: Ophiocordyceps
sinensis) là loài nấm dược liệu quý được sử dụng phổ biến trong Y học cổ truyền
Trung Hoa. Adenosine và cordycepin là hai dược chất quý được xem là chất chỉ thị
về hoạt tính sinh học quan trọng cho lồi nấm này. Các nghiên cứu hiện đại chứng
minh các hoạt chất từ C. sinensis có khả năng tăng cường miễn dịch, chống lão hóa,
kháng viêm, kháng ung thư và hỗ trợ điều trị các bệnh liên quan đến phổi, thận, và
các bệnh mạn tính khác như đái tháo đường. Hiện nay, C. sinensis tự nhiên ngày càng
hiếm do việc khai thác quá mức đi kèm với biến đổi khí hậu. Do đó, nghiên cứu ni
cấy nhân tạo loại nấm q này nhận được nhiều quan tâm trong vài thập kỷ qua. Sử
dụng môi trường bán rắn tạo quả thể và mơi trường lỏng nhân thu sinh khối lồi nấm
này là hai hướng tiếp cận phổ biến. Trong đó, nhân ni sinh khối nấm mang tính
ứng dụng thực tiễn cao vì công nghệ này không chỉ sản xuất sinh khối nấm có thành
phần các hoạt chất tương tự như tự nhiên, mà cịn có thể triển khai sản xuất ở quy mơ
cơng nghiệp trong thời gian ngắn cùng với chi phí thấp hơn so với kỹ thuật nuôi cấy
quả thể. Nhiều phương pháp nuôi cấy lỏng cải tiến được thử nghiệm để nâng cao giá
trị hoạt chất và hoạt tính sinh học của sinh khối nấm C. sinensis. Nghiên cứu ảnh
hưởng của các nguyên tố khoáng vi lượng đến khả năng sản xuất sinh khối và các
hợp chất thứ cấp là một chủ đề nhận được nhiều quan tâm hiện nay. Trong đó, selen
(Se) được xem là một tiền chất đầy tiềm năng trong việc nâng cao dược tính sinh học

của nấm Đông trùng Hạ thảo này.
Hơn thế nữa, Se là thành phần của acid amin 21 gọi là selenocysteine. Nguyên
tố này còn tham gia vào cấu trúc của nhiều enzyme kháng oxy hóa như glutathione
peroxidase, iodothyronine deiodinases và thioredoxin reductase có chức năng sinh lý
quan trọng như kháng oxy hóa, kháng ung thư, tăng cường miễn dịch, ức chế HIV và
chống lão hóa. Sự tham gia của Se trong hệ thống miễn dịch có thể được kết hợp với
một số cơ chế, bao gồm cả các hoạt động gia tăng sản xuất tế bào miễn dịch NK
(Natural killer cell), các tế bào lympho T, lympho B, interferon C và làm thụ thể có
ái lực cao với interleukin-2, kích thích miễn dịch do vắc-xin gây ra. Bên cạnh đó, Se
cịn có vai trị quan trọng trong chuyển hóa iốt, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng nồng


2
độ Se trong huyết thanh ở những trẻ bị bướu cổ thường thấp hơn so với trẻ có kích
thước tuyến giáp bình thường. Như vậy, sự thiếu hụt Se có thể tác động xấu đến sức
khỏe.
Mặc dù nước ta có một số dược liệu chứa Se như: tỏi, nấm linh chi và quả nhàu
nhưng hàm lượng Se trong các loại dược liệu này thường thấp và không ổn định. Từ
năm 2003 – 2005, Bộ Y tế khuyến khích và định hướng những nghiên cứu sản xuất
Se hữu cơ có khả dụng sinh học cao. Đề án “Chiến lược quốc gia về dinh dưỡng giai
đoạn 2011-2020 và tầm nhìn đến năm 2030” (689/TH ngày 29/6/2011) nhấn mạnh
phòng chống thiếu vi chất dinh dưỡng hiện nay, trong đó có liên quan đến Se. Chính
vì lẽ đó, đề tài “Nghiên cứu điều kiện lên men Cordyceps sinensis tạo sinh khối
giàu selen và khảo sát hoạt tính sinh học” được thực hiện với:
Mục tiêu tổng quát của nghiên cứu:
Sản xuất sinh khối nấm C. sinensis giàu Se có hoạt tính sinh học được cải thiện
và tạo nguồn Se có khả dụng sinh học cao.
Mục tiêu cụ thể của nghiên cứu:
(1) Xây dựng quy trình lên men sản xuất sinh khối nấm C. sinensis giàu Se.
(2) Đánh giá một số hoạt tính sinh học của các hoạt chất chứa Se từ sinh khối

nấm C. sinensis giàu Se.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn:
Ý nghĩa khoa học: Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp các dữ liệu khoa học về
ảnh hưởng của Se đến sự sản xuất sinh khối và hoạt tính sinh học của sinh khối nấm
Cordyceps sinensis, khả năng tích lũy Se trong sinh khối nấm. Đồng thời, cơng trình
này sẽ giúp hiểu rõ thêm các dạng Se hữu cơ trong nấm.
Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả tạo tiền đề cơ sở kỹ thuật nhằm chuyển giao công
nghệ để sản xuất và ứng dụng sinh khối C. sinensis giàu Se có hoạt tính sinh học cao
trong việc phát triển các sản phẩm thực phẩm bổ sung, bảo vệ sức khỏe.


3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Nấm Cordyceps sinensis
1.1.1. Đặc điểm, phân bố
Cordyceps sinensis là lồi nấm kí sinh trên ấu trùng loài bướm đêm Thitarodes
(Hepialus) armoricanus thuộc họ Hepialidae sống dưới đất (hình 1.1) [1]. Đây là lồi
nấm đặc hữu của vùng cao nguyên Tây Tạng và các vùng đồng cỏ núi cao xung quanh
khu vực dãy Himalaya như Bhutan, Trung Quốc và Nepal ở độ cao 3500-5000 m so
với mực nước biển [2]. Giá trị dược liệu của loài nấm này đã được ghi nhận cách đây
2000 năm ở Trung Quốc cũng như các nước phương Đông với những tác dụng như
cải thiện chức năng gan thận, chữa đổ mồ hôi đêm, bệnh tiểu đường, máu nhiễm mỡ,
các bệnh về tim, hồi phục sức khỏe, tăng tuổi thọ và nâng cao thể trạng cơ thể [3] [4].

C. sinensis ngoài tự nhiên. Hình có nguồn gốc từ cơng bố của
Shrestha và cộng sự (2013) [5]
Đến năm 2007, Sung và cộng sự đã tiến hành phân tích mối quan hệ giữa 162
lồi Cordyceps bằng việc phân tích 5 - 7 locus bao gồm ribosome tiểu phần nhỏ và
tiểu phần lớn (nrSSU và dnrLSU), nhân tố kéo dài 1α (tef1), hai tiểu đơn vị lớn nhất

của RNA polymerase II (rpb1 và rpb2), β-tubulin (tub) và ti thể ATP6 (atp6) và xếp
Cordyceps sinensis vào chi Ophiocordyceps và đổi tên là Ophiocordyceps sinensis


4
[6], tuy là cùng tên song C. sinensis vẫn được sử dụng phổ biến trong giới khoa học
hiện nay.
1.1.2. Hoạt tính sinh học
Với sự phát triển của khoa học hiện nay, người ta đã tìm ra được những hợp
chất có trong nấm C. sinensis. Chính những hoạt chất này đóng vai trò quan trọng,
quyết định giá trị dược liệu của lồi nấm này, chúng gồm có: (i) Các hợp chất nitơ:
adenine, adenosine, cordyceamides, cordycedipeptide, cordycepin, cordymin,
cordysinin,

dideoxyadenosine,

guanine,

guanosine,

hypoxanthine,

inosine,

thymidine, thymine, uracil, uridine; (ii) Sterol: campesterol, cholesterol, daucosterol,
ergosterol, sitisterol, stigmasterol; (iii) Polysaccharide và dẫn xuất: cordysinocan,
glucan, heteroglycan, mannitol, mannoglucan; (iv) Các protein, acid amin:
cadaverine, carboline, cordymin, flazin, methylpyrimidine, perlolyrine, putrescine,
spermidine, spermine, tryptophan; (v) Acid phenolic: acetovanillone, acid
hydroxybenzoic, acid protocatechuic, acid salicylic, acid syringic, acid vanillic; (vi)

Isoflavone: daidzein, genistein, glycitein, orobol; (vii) Acid béo: acid docosanoic,
acid lauric, acid lignoceric, acid linoleic, acid myristic, acid oleic, acid palmitic, acid
palmitoleic, acid pentadecanoic, acid stearic, acid succinic; (viii) Các vitamin, các
hợp chất bay hơi và các loại khoáng như Zn, Mg, Mn, Fe, Se, …. [7].
Y học hiện đại đã chứng minh nấm Cordyceps có các hoạt tính như điều hịa
miễn dịch, kháng oxy hóa, ức chế hình thành khối u, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng
di căn và tìm ra được một số cơ chế tác động chính lên các con đường sinh hóa của
cơ thể. Do đó việc sử dụng Cordyceps không chỉ giới hạn trong tăng cường sức khỏe,
mà còn được sử dụng trong phòng trị các bệnh về hô hấp, bệnh về thận, gan, tim
mạch, tăng lipid máu, rối loạn miễn dịch, hỗ trợ điều trị ung thư (bảng 1.1)


5
Bảng 1.1.

Hoạt tính sinh học của nấm Cordyceps sinensis [8]

Hoạt tính
Miễn dịch

Cơ chế tác động
Tăng cường hàm lượng IgG, IgG1 và IgG2b đặc hiệu ovalbumin.
Kích thích đại thực bào giải phóng IL-lβ, TNF-α và INF-γ bằng việc
kích thích con đường IkB–NF-kB. Cảm ứng sự sinh trưởng của tế bào
T và tiết IL-2, IL-6 và IL-8.

Kháng

Giảm sự sản xuất NO, IL-12, TNF-α và các cytokine gây viêm. Khóa

viêm

các NF-kB thơng qua giảm biểu hiện tín hiệu điều hịa kinase nội bào.

Kháng oxy

Duy trì GPx và hoạt động SOD trong tế bào. Kích thích sự hoạt hóa

hóa

của GPx, CAT và SOD đồng thời giảm hàm lượng lactate
dehydrogenase và malondialdehyde. Tăng điều hòa hoạt động của
superoxide dismutase 1 chứa kẽm- đồng và ức chế sự tích lũy
lipofusin.

Gây ra

Ức chế sự phosphoryl hóa tyrosine của Bcl-2 và Bcl-xL oncoprotein.

apoptosis

Kích thích apoptosis thơng qua con đường caspase/MAPK. Tăng
cường phosphoryl hóa và biểu hiện p53.

Kháng

Bằng con đường miễn dịch và kháng oxy hóa. Kháng khối u bằng con

khối u

đường apoptosis. Điều hịa con đường tín hiệu như con đường tín hiệu
MAPK có vai trị quan trọng trong quá trình xâm lấn và di cư của tế
bào ung thư, hoạt hóa con đường tín hiệu PKC có tác dụng kháng
khối u trực tiếp. Ức chế sự tiết các yếu tố liên quan đến xâm lấn và
di cư như MMP-2, MMP-9 và uPA.

Bảo vệ tim

Ngăn chặn sự tích tụ cholesterol. Ức chế hoạt tính cholesterol

mạch

esterase. Hỗ trợ chữa bệnh đột quỵ do thiếu máu cục bộ do thiếu oxy
và glucose. Tách chuỗi Aα của fibrinogen và chuỗi α của fibrin nhằm
ngăn chặn huyết khối.

Bảo vệ

Ức chế sự tăng trưởng của tế bào mesangial ở thận thông qua con

thận

đường PDGF/ERK và TGF-β1/Smad. Ức chế PDGF homodimer BB,
nguyên nhân gây ra viêm và sản xuất ROS. Ức chế sự tăng sinh của
tế bào trung mô cầu thận thông qua con đường PDGF/ERK và TGFβ1/Smad.


6
Hoạt tính

Cơ chế tác động

Sức khỏe

Kích thích tế bào Leydig và tế bào hoàng thể hạt tiết ra steroid sinh

sinh sản

dục. Tăng khả năng sản xuất E2, đây là hormone quan trọng nhất ảnh
hưởng đến nỗn bào. Hoạt hóa con đường truyền tải tín hiệu PKA và
PKC và kết hợp với Ars hoạt hóa con đường cAMP-PKA-StAR để
tạo ra steroidogenesis.

Phịng

Điều hòa steroidogene buồng trứng để ngăn ngừa mất xương và lỗng

ngừa lỗng

xương do thiếu estrogen. Giảm hoạt tính alkaline phosphatase huyết

xương

thanh, hoạt tính TRAP, hàm lượng CTX và IFN-γ.

1.2. Selen và vai trò sinh học của selen
1.2.1. Nguồn selen hiện nay
Se được Jacob Berzelius Jöns phát hiện năm 1817 trong chất thải của quá trình
khai thác quặng pyrit [9]. Trong đất, Se tồn tại chủ yếu ở dạng selenite (SeO32−) và
selenate (SeO42−), một lượng nhỏ dạng hữu cơ do hoạt động của vi sinh vật và thực

vật tạo ra [9]. Ngồi ra, Se cịn tồn tại trong nước nhưng phụ thuộc vào hàm lượng Se
trong đất, đá nơi đó và hoạt động của vi sinh vật cũng như vi tảo ở trong nước [9].
Như đa phần các nguyên tố khác, Se tồn tại ở cả dạng vô cơ và hữu cơ. Ở dạng vơ cơ,
Se ở các dạng oxy hóa như -2, 0, +4 và +6 như natri selenide, natri selenate, natri
selenite,…. Còn ở dạng hữu cơ, chúng gắn trực tiếp vào các hợp chất hữu cơ hoặc
liên kết cộng hóa trị với mạch carbon như selenomethionine, selenocysteine, dimethyl
selenide, selenodiglutathione,… [9] [10].
Hiện nay, con người sử dụng Se hữu cơ chủ yếu thông qua thực phẩm thường
ngày như rau, củ quả, thịt, trứng, sữa,… Ngoài ra, đối với những người thiếu Se có
thể bổ sung các loại thuốc hoặc thực phẩm chức năng giàu Se. Tùy từng khu vực địa
lý mà thực phẩm tại nơi đó có hàm lượng Se khác nhau. Một số thực vật như hành,
tỏi, cải wasabi, nấm có khả năng tích lũy Se tốt với hàm lượng Se dao động từ 0,01
đến 0,55μg/g. Đối với những lồi động vật dưới nước như cá, sị cũng là nguồn cung
cấp Se đáng kể: cá biển (0,11 - 0,97μg/g), cá nước ngọt (0,18 - 0,68μg/g). Các sản
phẩm thịt có hàm lượng Se khoảng 0,08 đến 0,73μg/g. Trong sản phẩm sữa, hàm
lượng Se tỉ lệ nghịch với hàm lượng chất béo và dao động từ 0,01 đến 0,55μg/g [11].


7
1.2.2. Vai trò của selen đối với cơ thể
Hiện nay, 25 gen mã hóa seleno-protein đã được xác định ở genome người.
Selenoprotein có những chức năng khác nhau, bao gồm hoạt tính kháng oxy hóa, chức
năng miễn dịch, sự trao đổi chất hormon tuyến giáp, vận chuyển và cân bằng nội môi
Se và trao đổi chất ở xương và cơ tim [9] [12] [13]. Đối với hệ miễn dịch, nhiều
nghiên cứu đã cho thấy sự hiện diện của lượng lớn Se trong lách, gan và hạch bạch
huyết. Vì vậy, thiếu hụt Se sẽ gây ảnh hưởng xấu đến hệ miễn dịch. Se kích thích
hình thành kháng thể và hoạt hóa tế bào T hỗ trợ cùng với tế bào T gây độc và tế bào
NK. Hơn nữa, Se cũng có vai trò quan trọng trong điều trị bệnh nhân nhiễm HIV, một
số kết quả tích cực trong q trình điều trị như làm chậm sự tiến triển bệnh, tăng tế
bào T CD4+ và giảm các triệu chứng bệnh đi kèm như tiêu chảy [12] [14] [15].

Ở não, Se đóng vai trị rất quan trọng, nếu thiếu hụt Se, mơ não là nơi được ưu
tiên nhận Se trước tiên. Một số selenoprotein đặc trưng đã được chứng minh có khả
năng chống lại sự thối hóa thần kinh bằng cách loại bỏ các gốc tự do (ROS) và tăng
cường kháng oxy hóa. Trong đó, selenoprotein P có vai trị đặc biệt trong việc vận
chuyển Se bằng cách gắn chúng lên các thụ thể bề mặt như apoER2 [13] [14].
Đối với vấn đề sinh sản ở nam giới, Se từ lâu đã được công nhận là cần thiết
để sinh tổng hợp testosterone, sự hình thành và phát triển bình thường của tinh trùng.
Trong pha sớm của quá trình hình thành tinh trùng, GPx4 có vai trị như là peroxidase
giúp bảo vệ tinh trùng khỏi những tác nhân oxy hóa, trong khi đó, ở pha muộn, có vai
trị trong sự hình thành phần đi giúp tinh trùng có thể di động. Đối với nam giới bị
hiếm muộn do vấn đề di chuyển của tinh trùng, bổ sung Se 100μg/ngày sẽ giúp tăng
khả năng hoạt động của tinh trùng và có khoảng 11% chúng có khả năng thụ tinh [14]
[15].
Đối với tuyến giáp, đây là cơ quan có hàm lượng Se cao nhất trong cơ thể. Do
đó, tuyến giáp khơng chỉ phụ thuộc vào iod mà cịn cả Se. Se có vai trị khác nhau
trong tuyến giáp như iodothyronine deiodinase (Dio1, Dio2) phụ thuộc Se, sản xuất
hormon thyroid, triiodothyronine (T3) từ tiền chất của chúng và thyroxine (T4) [12]
[15].
Đối với bệnh về tim mạch, thiếu hụt Se, peroxit lipid có thể tích tụ trong máu
và gây tổn thương mạch máu và mô. Các nghiên cứu trước đây cho thấy Se có khả


8
năng chống lại sự oxy hóa lipid và giảm kết tụ tiểu cầu, kháng viêm từ đó giảm khả
năng mắc các bệnh về tim mạch [12] [14] [15].
Đối với ung thư, trong những năm gần đây, các nghiên cứu về Se trong việc
điều trị các loại ung thư ngày càng phổ biến, trên cả mơ hình động vật, người và trên
hầu hết các cơ quan với nhiều loại ung thư khác nhau như phổi, bàng quang, đại trực
tràng, gan, tuyến giáp, tuyến tiền liệt [12] [14] [15].
Bên cạnh selenoprotein, Se cịn được tích lũy vào polysaccharide. Các nghiên

cứu hiện nay chủ yếu tập trung vào selenopolysaccharide từ vi khuẩn hoặc nấm (hình
1.2).

GSSeGalNAc

MeSeGalNAc

MeSeGluNAc

MeSeGalNH2

Một số cấu trúc của seleno-đường [16]
Một số thử nghiệm trước đây cho thấy selenopolysaccharide có khả năng
kháng khối u như: Selenopolysaccharide (SeGLP-2B-1) từ nấm Ganoderma lucidum
có khả năng cảm ứng tế bào MCF-7 theo con đường apoptosis [17], seleno Sargassum fusiforme (Harv.) Setch. polysaccharide (Se-SFPSI) - cải thiện hoạt tính
CAT, SOD, GSH-Px trên chuột mang khối u S180 (dòng tế bào ung thư Sarcoma)
sau 10 ngày thử nghiệm [18], selenopolysaccharide (ISPS) từ nấm C. sinensis cũng
cho thấy khả năng kháng oxy hóa mạnh, giảm lượng glucose trong máu và tăng cường
khả năng miễn dịch trên mơ hình chuột [19]. Năm 1988, tại Hội nghị về Se trong sinh
học và y dược được tổ chức ở Tubingen (Đức), Seko và cộng sự đã cho thấy selenite
phản ứng với glutathione và H2Se tạo ra superoxide O2·- (hình 1.3). Kết quả là những
gốc tự do này tấn công gây tổn thương tế bào [20].

4GSH
SeO32-

GSSG

GSH

GSSeSG

GSSG GSH
GSSeH

GSSG

O2

H2Se

Sơ đồ chuỗi phản ứng giữa selente và glutathione

O2·Seo(1)