BÙI THỊ KIM CHI ĐỊNH LƯỢNG LINEZOLID TRONG HUYẾT TƯƠNG KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BÙI THỊ KIM CHI

ĐỊNH LƯỢNG LINEZOLID TRONG
HUYẾT TƯƠNG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HA NỘI – 2021


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BÙI THỊ KIM CHI
MÃ SINH VIÊN: 1601080

ĐỊNH LƯỢNG LINEZOLID TRONG
HUYẾT TƯƠNG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn
1. PGS.TS. Lê Đình Chi
2. Th.s Ngô Quang Trung
Nơi thực hiện
Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia

HÀ NỘI - 2021


LỜI CẢM ƠN

Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn vơ cùng sâu sắc tới PGS.TS.Lê Đình Chi và ThS. Ngơ
Quang Trung – những người đã dành rất nhiều thời gian hướng dẫn, giúp đỡ, định
hướng và luôn cho tôi những ý kiến quý báu trong suốt quá trình thực hiện khóa
luận tốt nghiệp.
Tơi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô, anh chị Viện Công nghệ Dược phẩm
Quốc gia đã ln tạo điều kiện và giúp đỡ tơi hồn thành đề tài này.
Tôi cũng xin cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, các thầy cô trường Đại học
Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt q trình học tập và
nghiên cứu.
Cuối cùng tơi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè đã ln sắt cánh bên tơi,
động viên và khích lệ tơi giúp tơi hồn thành đề tài này.
Hà Nội, ngày 06 tháng 6 năm 2021
Sinh viên

Bùi Thị Kim Chi


MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................ 1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN ................................................................................ 3
1.1.

Tổng quan về kháng sinh linezolid ........................................................... 3

1.1.1. Công thức hóa học ................................................................................... 3
1.1.2. Tính chất lí hóa ........................................................................................ 3
1.1.3. Dược lí, dược động học............................................................................ 3

1.1.4. Một số dạng thuốc và hàm lượng............................................................. 4
1.2.

Một số phương pháp định lượng linezolid đã được sử dụng ................. 5

1.3.

Thẩm định phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học ............. 11

1.3.1. Độ chọn lọc .............................................................................................. 12
1.3.2. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính ......................................................... 12
1.3.3. Giới hạn định lượng dưới ......................................................................... 13
1.3.4. Độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày ..................................... 13
1.3.5. Tỉ lệ thu hồi ( hiệu suất chiết) .................................................................. 14
1.3.6. Đánh giá khả năng nhiễm chéo ................................................................ 14
1.3.7. Độ ổn định ................................................................................................ 14
CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............... 16
2.1.

Nguyên liệu, thiết bị ................................................................................... 16

2.1.1. Hóa chất – chất chuẩn .............................................................................. 16
2.1.2. Các hóa chất dung mơi ............................................................................. 16
2.1.3. Thiết bị, dung cụ ...................................................................................... 16
2.1.4. Đối tượng nghiên cứu .............................................................................. 16
2.2.

Nội dung và phương pháp nghiên cứu ..................................................... 16

2.2.1. Chuẩn bị mẫu ........................................................................................... 16

2.2.2. Xây dựng phương pháp phân tích ............................................................ 18
2.2.3. Thẩm định phương pháp phân tích .......................................................... 19


2.2.4. Phương pháp xử lí kết quả ....................................................................... 21
CHƯƠNG III: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ ................................................... 22
3.1.

Kết quả xây dựng phương pháp phân tích .............................................. 22

3.1.1. Khảo sát, xác định điều kiện sắc kí và lựa chọn chuẩn nội ..................... 22
3.1.2. Khảo sát, lựa chọn điều kiện xử lí mẫu ................................................... 27
3.1.3. Kết quả xây dựng phương pháp định lượng ............................................ 27
3.2.

Kết quả thẩm định...................................................................................... 28

3.2.1. Độ phù hợp hệ thống phân tích ................................................................ 28
3.2.2. Độ đặc hiệu .............................................................................................. 29
3.2.3. Xác định giới hạn định lượng (LLOQ) .................................................... 31
3.2.4. Xây dựng và đường chuẩn và khoảng tuyến tính .................................... 31
3.2.5. Độ đúng, độ chính xác phương pháp ....................................................... 32
3.2.6. Xác định tỉ lệ thu hồi ................................................................................ 36
3.2.7. Độ nhiễm chéo ......................................................................................... 38
3.2.8. Độ ổn định ................................................................................................ 38
3.3.

Bàn luận....................................................................................................... 42

3.3.1. Chất chuẩn sử dụng trong khóa luận........................................................ 42

3.3.2. Đặc điểm nền mẫu.................................................................................... 42
3.3.3. Khả năng ứng dụng .................................................................................. 43
CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................... 44
4.1.

Kết luận ....................................................................................................... 44

4.1.1. Về xây dựng phương pháp phân tích ....................................................... 44
4.1.2. Về thẩm định phân tích ............................................................................ 44
4.2.

Kiến nghị ..................................................................................................... 45


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
AN

Chất phân tích (Analyte)

Bđm

Bình định mức

CT

Chiết tách

CV

Hệ số biến thiên

EMA

Cơ quan quản lí Dược Châu Âu (European Medicines Agency)

HPLC

Sắc kí lỏng cao áp (High performance liquid chromatography)

HQC

Mẫu kiểm tra ở nồng độ cao (High quality control)

HT

Huyết tương

HTT

Huyết tương trắng

IPA

Isopropyl alcohol

IS

Chuẩn nội (Internal standard)

LCMS

Sắc kí lỏng khối phổ (Liquid chromatography - Mass spectrometry)

LLOQ

Giới hạn định lượng dưới (Lower limit of quantitation)

LNZ

Linezolid

LQC

Mẫu kiểm tra ở nồng độ thấp (Low quality control)

MeCN

Acetonitril

MeOH

Methanol

MP

Methylparaben

MQC

Mẫu kiểm tra ở nồng độ giữa (Medium quality control)

MS

Khối phổ (Mass - spectrometry)

MS-MSSRM

Đầu dị khối phổ, cơ lập ion cần chọn

PDA

Đầu dị photometric diode array

PTHQ

Phương trình hồi quy

QC

Mẫu kiểm tra (Quality control)

R

Hệ số tương quan

SKĐ

Sắc kí đồ

STT

Số thứ tự


TB

Trung bình

TEA

Triethanolamine

ULOQ

Giới hạn định lượng trên (Upper limit of quantitation)

US- FDA

Cơ quan quản lí thuốc và thực phẩm Mỹ (United Statesb- Food and
Drug Administration)

UV-VIS

Detector hấp thụ

WS-CC

Dung dịch chuẩn pha dãy dung dịch đường chuẩn

WS-QC

Dung dịch chuẩn pha dung dịch kiểm soát

Rs

Độ phân giải (Resolution)


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Một số phương pháp định lượng Linezolid trong huyết tương bằng
HPLC ..................................................................................................................... 5
Bảng 2.1. Các chất dùng trong nghiên cứu ........................................................ 16
Bảng 2.2. Đường chuẩn gốc trong nước WS-C .................................................. 17
Bảng 2.3. Cách chuẩn bị đường chuẩn trong huyết tương, mẫu huyết tương
trắng .................................................................................................................... 17
Bảng 2.4. Cách chuẩn bị các dung dịch kiểm tra gốc trong nước...................... 18
Bảng 2.5. Cách chuẩn bị các mẫu kiểm tra trong huyết tương .......................... 18
Bảng 3.1. Đánh giá độ ổn định hệ thống ............................................................ 28
Bảng 3.2. Đánh giá độ đặc hiệu phương pháp ................................................... 30
Bảng 3.3. Xác định giới hạn định lượng dưới (LLOQ)....................................... 31
Bảng 3.4. Đường chuẩn và sự tuyến tính ............................................................ 32
Bảng 3.5. Kết quả phân tích mẫu LLOQ trong ngày .......................................... 33
Bảng 3.6. Kết quả phân tích mẫu LQC trong ngày ............................................ 33
Bảng 3.7. Kết quả phân tích mẫu MQC trong ngày ........................................... 34
Bảng 3.8. Kết quả phân tích mẫu HQC trong ngày ............................................ 34
Bảng 3.9. Kết quả phân tích độ đúng, độ chính xác khác ngày .......................... 35
Bảng 3.10. Kết quả độ thu hồi của Linezolid ...................................................... 36
Bảng 3.11. Kết quả độ thu hồi của Methylparaben ............................................ 37
Bảng 3.12. Kết quả phân tích khả năng nhiễm chéo .......................................... 38
Bảng 3.13. Kết quả độ ổn định của các dung dịch chuẩn .................................. 39

Bảng 3.14. Độ ổn định mẫu HT sau thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng ............... 39
Bảng 3.15. Độ ổn định mẫu HT sau 3 chu kì đơng – rã đơng ............................ 40
Bảng 3.16. Độ ổn định mẫu HT sau xử lí ở nhiệt độ phòng ............................... 41
Bảng 3.17. Độ ổn định dài ngày của mẫu huyết tương ...................................... 41


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cấu tạo phân tử của Linezolid .............................................................. 3
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình xử lí mẫu .................................................................... 19
Hình 3.1. Sắc kí đồ với IS là acid benzoic .......................................................... 22
Hình 3.2. Sắc kí đồ với IS là aspirin ................................................................... 23
Hình 3.3. Sắc kí đồ với IS là salicylic ................................................................. 23
Hình 3.4. Sắc kí đồ với IS là methylparaben....................................................... 24
Hình 3.5. Phổ hấp thụ UV – VIS của Linezolid .................................................. 24
Hình 3.6. Phổ hấp thụ UV – VIS của Methylparaben ......................................... 24
Hình 3.7. Sắc kí đồ mẫu huyết tương ở tỉ lệ MeCN : Acid (25:75) .................... 25
Hình 3.8. sắc kí đồ mẫu huyết tương ở tỉ lệ MeCN : Acid (30:70) ..................... 25
Hình 3. 9. Sắc kí đồ mẫu huyết tương ở tỉ lệ MeCN:Acid (40:60) ..................... 26
Hình 3.10. Sắc kí đồ mẫu huyết tương ở tỉ lệ MeCN : Acid (50:50) .................. 26
Hình 3.11. Tủa protein trong huyết tương bằng methanol ................................. 27
Hình 3.12. Tủa protein trong huyết tương bằng aceronitril ............................... 27
HÌnh 3.13. Sắc kí đồ huyết tương trắng .............................................................. 29
Hình 3.14. Sắc kí đồ huyết tương trắng thêm LNZ ............................................. 29
Hình 3.15. Sắc kí đồ huyết tương trắng thêm LNZ và IS .................................... 30


ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, kháng kháng sinh đang là một vấn đề nghiêm trọng trong chữa trị
nhiếm khuẩn, cả nhiễm khuẩn bệnh viện và nhiễm khuẩn cộng đồng, trên thế
giới nói chung và tại Việt Nam nói riêng. Tình trạng đa kháng đã xảy ra ở nhiều

chủng gram âm và gram dương, phổ biến như Streptococcus pneumoniae, tụ cầu
vàng kháng methicillin (MRSA),… Nguyên nhân của hiện tượng này rất đa
dạng nhưng việc sử dụng kháng sinh khơng hợp lí hoặc lạm dụng kháng sinh là
những nguyên nhân phổ biến nhất. Trong khi các kháng sinh đã có đang dần bị
kháng thì sự ra đời của các kháng sinh mới với cơ chế tác dụng chống lại vi
khuẩn khơng cịn nhiều nữa, điều này đặt ra một bài toán là cần tối ưu hóa hiệu
quả điều trị của các kháng sinh đã có để làm chậm lại sự kháng kháng sinh của
vi khuẩn. Một trong các cách được áp dụng hiệu quả và phổ biến hiện nay là
hiệu chỉnh liều theo nguyên tắc PK/PD. Mục đích của chiến thuật này là duy trì
nồng độ thuốc tại vị trí nhiễm khuẩn trong khoảng thời gian thích hợp có khả
năng tối ưu hóa tác dụng diệt khuẩn và hiệu quả điều trị của từng kháng
sinh.[19]
Linezolid, một kháng sinh mới nhóm oxazolidinone có những tiềm năng trong
điều trị lâm sàng hiện nay. Linezolid có cơ chế ức chế quá trình tổng hợp protein
của vi khuẩn khác với các nhóm kháng sinh khác, và hạn chế sự kháng chéo của
các vi khuẩn; phổ tác dụng của linezolid chủ yếu là gram dương và có tác dụng
nhạy cảm với tụ cầu kháng methicillin và kháng vancomycin, khuẩn cầu kháng
vancomycin, phế cầu kháng penicillin. Linezolid lại là một kháng sinh phụ thuộc
vào thời gian, tức là hiệu quả lâm sàng của nó được dự đốn tốt nhất bởi phần
trăm thời gian mà nồng độ thuốc trong máu vẫn ở trên nồng độ MIC [15]. Để có
được thời gian chính xác mà nồng độ Linezolid trong máu trên MIC thì cần định
lượng Linezolid trong máu bệnh nhân sau khi sử dụng ở các thời điểm theo phác
đồ điều trị. Định lượng Linezolid trong máu bệnh nhân cần thiết lập một phương
pháp định lượng có độ nhạy, độ chính xác cao, nhanh chóng và có thể ứng dụng
để cho kết quả phù hợp với điều kiện trên lâm sàng tại Việt Nam. Ngoài ra
phương pháp định lượng Linezolid trong huyết tương này có thể ứng dụng thêm
1


để phục vụ các nghiên cứu về lâm sàng khác hoặc áp dụng trong thử tương

đương sinh học.
Nhằm cung cấp một phương pháp kĩ thuật để phục vụ theo dõi điều trị trên lâm
sàng, đề tài “Định lượng Linezolid trong huyết tương” được xây dựng với mục
tiêu:
1. Khảo sát một số điều kiện sắc kí.
2. Xây dựng phương pháp định lượng Linezolid trong huyết tương.
3. Thẩm định phương pháp vừa xây dựng.

2


CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về Linezolid
1.1.1. Công thức hóa học
- Cơng thức hóa học.

Hình 1.1. Cấu tạo phân tử của Linezolid
- Công thức phân tử: C16H20FN3O4 [9]
- Khối lượng phân tử: 337,35 g/mol [9]
- Tên khoa học: (S)-N-[[3-[3-fluoro-4-(4-morpholinyl) phenyl]-2-oxo-5oxazolidinyl]methyl)-acetamid.[9]
1.1.2. Tính chất lí hóa, độ ổn định
- Tinh thể màu trắng [18]
- Nhiệt độ nóng chảy: 181,5 - 182,5˚C [18]
- LogP= 0,9 [18]
- Linezolid tan ít trong nước (3 mg/mL), tan nhẹ trong ethanol và ethyl acetat
[18]
- Linezolid là 1 base yếu với pKa= 1,8, điều này cho thấy linezolid tồn tại chủ
yếu ở dạng khơng ion hóa khi ở dung dịch có pH trên 4,0 [9]
- Bước sóng hấp thụ của linezolid trong ethanol là 253 nm [18]
1.1.3. Dược lí, dược động học

1.1.3.1. Dược lí
Linezolid là một kháng sinh tổng hợp thuộc nhóm kháng sinh mới,
oxazolidinon, một loại kháng sinh có nhiều ứng dụng lâm sàng trong điều trị các
bệnh nhiễm khuẩn gây ra bởi các vi khuẩn Gram dương. Linezolid cũng có tác
dụng trên một số loại vi khuẩn Gram âm và một số vi khuẩn kị khí, một số sinh
vật nhạy cảm như tụ cầu kháng methicillin và kháng vancomycin, khuẩn cầu
3


kháng vancomycin, phế cầu kháng penicillin. Oxazolidinone ức chế vi khuẩn
tổng hợp protein bằng cách liên kết với vị trí P tiểu phân 50S của ribosom.
Linezolid ức chế sự tổng hợp protein của vi khuẩn thông qua cơ chế hoạt động
khác với các tác nhân kháng khuẩn khác. Do đó, khả năng đề kháng chéo giữa
linezolid và các nhóm kháng sinh khác là khó xảy ra.[2]
1.1.3.2. Dược động học
a. Hấp thụ
Linezolid được hấp thụ nhanh chóng và hồn tồn theo đường uống. Nồng độ
thuốc trong máu đạt cao nhất trong vòng 2 giờ sau khi uống, sinh khả dụng tuyệt
đối của thuốc theo đường uống là 100%.
Trong trường hợp sử dụng đường tiêm tĩnh mạch liều 600 mg ngày 2 lần, nồng
độ thuốc cao nhất và thấp nhất trong máu được ghi nhân là 15,1 mg/L và 3,68
mg/L.
Trong một nghiên cứu về liều 600 mg ngày 2 lần, nồng độ thuốc cao nhất và
thấp nhất trong máu được ghi nhận là 21,2 mg/L và 6,15 mg/L.[2]
b. Phân bố
Thể tích phân bố khoảng 40 - 50 L trong cơ thể người trưởng thành khỏe mạnh,
và xấp xỉ toàn bộ lượng nước trong cơ thể. Tỉ lệ liên kết với protein huyết tương
là 31% và không phụ thuộc vào nồng độ.[2]
c. Chuyển hóa
Linezolid được chuyển hóa chủ yếu bằng q trình oxy hố vịng morphin, chủ

yếu là tạp dẫn xuất acid cacboxylic mạch hở khơng cịn hoạt tính sinh học. Chất
chuyển hóa điển hình là acid aminoethoxyacetic (PNU-142300) và hydroxyethyl
glycine (PNU-142586).[2]
d. Thải trừ
Linezolid chủ yếu được bài tiết trong nước tiểu trong điều kiện ổn định dưới
dạng các chất chuyển hóa và một phần thuốc gốc. Thời gian bán thải của thuốc
trung bình khoảng 5 - 7 giờ. Độ thanh thải ngồi thận chiếm khoảng 65% độ
thanh thải của linezolid.[2]
1.1.4. Dạng thuốc và hàm lượng
4


Linezolid được US - FDA cấp phép lưu hành tại Mỹ vào năm 2000. Cho đến
nay, thuốc được sản xuất chủ yếu dưới dạng viên nén bao phim 600 mg, dung
dịch truyền tĩnh mạch 2 mg/mL và hỗn dịch uống.[2] [9]
1.2. Một số phương pháp định lượng
Một số phương pháp được sử dụng để định lượng Linezolid trong huyết tương
bằng HPLC được thể lệt kê trong bảng 1.1.
Bảng 1.1. Một số phương pháp định lượng Linezolid
trong huyết tương bằng HPLC
Năm

Xử lí mẫu

Điều kiên săc kí

1999

Chiết pha rắn. sau đó rửa

[20]

giải bằng methanol.

mm, 5 µm, MAC-MOD,

Dịch chiết methanol được

Chadds Ford, PA).

- Cột Zorbax RXC8, 4,6 × 150

cơ bằng hơi nitơ ở 40˚C.

- Nhiệt điều cột: khơng có

Cắn được tái hịa tan vào

- Pha động: H2O : MeCN

dung dịch pha động.
Thể tích tiêm 100 µL

LLOQ
(mg/L)
0,01

(80:20)
- Tốc độ dịng: 1 mL/phút
- Detector: UV/VIS

- IS: PNU-101145, PNU100766
- Thời gian phân tích: 14 phút

2001

Kết tủa protein bằng

- Cột Nucleosil-100 5C18 (

[6]

HClO4 7%, li tâm, hòa tan

Macherey and Nagel), 4 × 125

phần nổi với dung dịch

mm, 5 µm.

đệm acetat pH 3.5.

- Nhiệt điều cột: 25˚C

Thể tích tiêm 1 mL

- Pha động: MeCN : đệm
CH3COONa : H2O
(180:100:720)
- Tốc độ dòng: 1.3 mL/phút
5

0,2


- Detector: UV/VIS
- IS: khơng có
- Thời gian phân tích: 10 phút
2001

Chiết pha rắn

[21]

Thể tích tiêm 10 µL

- Cột Shim Pack CLC-CN C18,

0,1

4,6 x 150 mm, 5 µm.
- Nhiệt điều cột: 25˚C
- Pha động: MeCN : đệm
CH3COONa : H2O
(180:100:720)
- Tốc độ dòng: 1 mL/phút
- Detector: MS-MS-SRM
- IS: N-carbobenzoxy-3-fluoro4-morpholinylaniline.
- Thời gian phân tích: 6 phút

2003

Kết tủa bằng MeCN, li

[7]

tâm, cơ cắn và tái hịa tan
bằng hỗn hợp nước và
MeCN (80:20).
Thể tích tiờm 20 àL

- Ct Spherimage-80 ODS2, 4

0,2

ì 125 mm, 5 µm.
- Pha động: MeCN: đệm acetat
25 mM pH 5(20:80)
- Tốc độ dịng: 1 mL/phút
- Detector: UV
- IS: khơng có
- Thời gian phân tích: 7 phút

2004

Chiết pha rắn

[22]

Thể tích tiêm 20 µL

- Cột Zorbax Eclipse XDB C8
của Agilent Technologies, 3,0
× 100 mm, 3,5 µm.
- Nhiệt điều cột: khơng có
- Pha động: Pha A: TEA 0,4%
pH 4 điều chỉnh bằng aicd
photphoric
Pha B: MeCN
6

0,02


Pha động chạy gradient.
- Tốc độ dòng: 1,3 mL/phút
- Detector: UV/VIS
- IS: levofloxacin
- Thời gian phân tích: 15 phút
2006

Kết tủa protein bng hn

[5]

hp Cl3CCOOH 5%:

4,6 ì150 mm, 5 àm.

MeOH (3:1), ly tâm, thêm

(Phenomenex, Pennant Hills,

NaOH.

NSW, Australia).

Thể tích tiêm 20 µL

- Cột PhenoSphere-NEXT C18,

0,2

- Nhiệt điều cột: khơng có
- Pha động: MeCN: acid
CH3COOH 2.67mM (25:75)
- Tốc độ dòng: 1 mL/phút
- Detector: PDA
- IS: eperezolid
- Thời gian phân tích: 10 phút

2009

Kết tủa protein bằng

[4]

MeOH, lắc xoáy, ly tâm ở

- Cột Atlantis C18, 4,6 ì 150
mm, 3 àm.

4C, dch ni c cụ

(Waters, Milan, Italia).

cặn, tái hòa tan cắn bằng

- Nhiệt điều cột: 35˚C

hỗn hợp pha động.

- Pha động: chương trình

Thể tích tiêm 40 µL

0,312

gradient
Pha A: đệm dihydro phosphat
Pha B: MeCN.
- Tốc độ dòng: 1 mL/phút
- Detector: UV
- IS: quinoxaline mono kali
phosphat.
- Thời gian phân tích: 28 phút

2010

Chiết lỏng lỏng bằng hỗn

- Cột Symmetry C18, 2,1 × 150
7

0,05


[23]

hợp dung dịch methanol:

mm, 5 µm.

dichlo- methan (1:9), lắc

(Waters, Milford, MA).

xốy, li tâm, thu phần

- Nhiệt điều cột: 25˚C

dung mơi hữu cơ đem đi

- Pha động: MeCN: đệm

cơ cặn, hịa tan cắn vào

ammonium acetat 0,5% pH =

pha động.

4,4 (16:84)

Thể tích tiêm 20 µL

- Tốc độ dịng: 0,4 mL/phút
- Detector: UV/VIS
- IS: khơng có
- Thời gian phân tích: 12 phút

2010

Kết tủa protein bằng dung

[8]

dịch acid perchloric 65%,

- Cột X Bridge C18, 4,6 ì 150
mm, 3,5 àm.

sau ú li tõm, thu dch

- Nhiệt điều cột: 35˚C

trong.

- Pha động: MeCN: acid

Thể tích tiêm 20 µL

0,2

photphoric 0,05% (25:75)
- Tốc độ dịng: 1 mL/phút
- Detector: UV/VIS
- IS: acid para-toluic
- Thời gian phân tích: 12 phút

2013

Kết tủa protein bằng

- Cột LiChrospher 100RP-18, 4

[10]

MeOH, ly tâm, thu dch.

ì 250 mm, 5 àm. (Merk,

Th tớch tiờm 50 àL

Darmstadt, Germany).

0,25 0,5

- Nhiệt điều cột: 22 ± 1 ˚C
- Pha động: MeCN: đệm
KH2PO4 50mM (26:74)
- Tốc độ dòng: 1 mL/phút

- Detector: UV/DAD
- IS: eperezolid
- Thời gian phân tích: 9 phút
2013

Chiết pha rắn

- Cột X-Tera RP-18, 4,6 × 250
8

0,025


[13]

Thể tích tiêm 25 µL

mm, 5 µm. (Waters Corp.,
Milford, MA, USA).
- Nhiệt điều cột: 30˚C
- Pha động: MeCN: đệm
KH2PO4 50mM (40:60)
- Tốc độ dòng: 1 mL/phút
- Detector: UV
- IS: 6,7-dimethyl-2,3-di-(2pyridyl)-quinoxaline.
- Thời gian phân tích: 12 phút

2015

Chiết lỏng lỏng với ethyl

[14]

acetat, li tâm, sau đó cơ

- Cột Capcell Pak C18 MG, 4,6

0,5

ì 150 mm, 5 àm.

cn phn ni v hũa tan

(Shiseido Co, Tokyo, Japan).

cắn vào acetonitril.

- Nhiệt điều cột: 40˚C

Thể tích tiêm 20 µL

- Pha động: MeCN:
tetrahydrofuran: dd đệm acetat
0.5% pH = 4,4 (17:5:78)
- Tốc độ dòng: 0,8 mL/phút
- Detector: UV
- IS: o-ethoxybenzamide
- Thời gian phân tích: 10 phút

2016

Chiết pha rắn

[17]

Thể tớch tiờm 10 àL

- Ct Zorbex XDB C18, 2,1 ì
50 mm, 5 µm. (Agilent
Technologies Ltd, Bangalore).
- Pha động:
A: Ammonium format 10 mM,
0,5% acid formic
B: MeCN chứa 0,5% acid formic
C: MeCN
D: MeCN: IPA: Aceton
9

0,0004


(60:25:15).
Chương trình chạy gradient
- Tốc độ dịng: 0,4 mL/phút
- Detector: MS
- IS: citrizine.
- Thời gian phân tích: 9 phút
Hiện tại trong nước chưa có nghiên cứu cụ thể về định lượng linezolid trong
huyết tương. Một số phương pháp phân tích được nước ngoài sử dụng như:
HPLC/UV-VIS, HPLC/DAD, LCMS,…và sử dụng các cách xử lí mẫu như:

chiết pha rắn, kết tủa protein, chiết lỏng lỏng…
LC-MS là phương pháp có độ chọn lọc và độ nhạy cao, giới hạn phát hiện thấp,
thường dùng để phân tích các chất có hàm lượng “siêu vết” trong mẫu phức tạp
[1]. Tuy nhiên, thiết bị hệ thống LC-MS lại không phổ biến ở Việt Nam nên các
phương pháp sử dụng MS sẽ ít có tính ứng dụng, các cơ sở điều trị khó có thể
đáp ứng.
HPLC/UV-VIS và HPLC/DAD đều là phương pháp phân tích sử dụng detector
UV-VIS sử dụng phổ biến trong sắc kí lỏng. Đặc điểm của phương pháp này là
chọn lọc với các chất có cấu trúc hoặc nhóm chức chưa bão hịa, có độ chọn lọc
và độ nhạy tốt, được sử dụng nhiều tại Việt Nam.[1]
Chiết pha rắn là một quá trình tách chất phân tích từ mẫu bằng một chất rắn, sau
đó rửa giải bằng dung mơi thích hợp [1]. Ưu điểm của kĩ thuật này là nền mẫu
sạch, rất chọn lọc (tùy thuộc bản chất chất phân tích để lựa chọn pha rắn và dung
mơi rửa giải thích hợp), tỉ lệ thu hồi cao, hạn chế hiện tượng pha loãng mẫu, khả
năng tái tạo cao, hiệu quả với nhiều loại nền mẫu và dễ dàng áp dụng tự động
hóa. Kĩ thuật có nhược điểm lớn nhất là thiết bị hệ thống tốn kém, không dễ thực
hiện tại Việt Nam, bên cạnh đó quy trình xử lí phức tạp, cần nhân lực có chun
mơn mới có thể phát huy được hiệu quả.[24], [3]
Chiết lỏng - lỏng cũng là một kĩ thuật được sử dụng phổ biến trong xử lí mẫu
sinh học để chuyển chất phân tích hịa tan trong dịch sinh học sang dung mơi thứ
hai khơng hịa tan trong dịch sinh học, dung môi hữu cơ hay được sử dung trong
10


kĩ thuật này [1]. Chiết lỏng – lỏng có ưu điểm là loại bỏ được các muối vô cơ,
mẫu tương đối sạch, không cần thiết bị đắt tiền, dễ dàng áp dụng với nhiều cơ sở
phân tích ở Việt Nam. Tuy nhiên, kĩ thuật này phụ thuộc vào khả năng phân bố
của chất phân tích trong hai pha dung mơi, để đảm bảo thu được nhiều chất phân
tích thường dùng lượng dung môi hữu cơ lớn, gây tốn kém; làm trên quy mô
nhiều mẫu sẽ tốn thời gian do không thể tự động hóa kết nối vs GC hoặc

HPLC.[24] [3]
Kĩ thuật kết tủa protein là kĩ thuật dùng dung dịch acid hoặc dung mơi hữu cơ
làm biến tính protein, các protein sẽ kết tủa và được loại ra khỏi mẫu sinh học.
Phương pháp này đơn giản, nhanh chóng, dễ thực hiện nên khá phổ biến. Nhược
điểm của kĩ thuật này là mẫu bị pha loãng (tỉ lệ pha loãng thường dùng là 1:3),
chỉ loại được protein, các thành phần khác trong dịch sinh học có thể gây ảnh
hưởng đến nền mẫu và gây hại cho cột. [3] [16]
Phương pháp nội chuẩn là đưa chất chuẩn nội vào trong mẫu phân tích và trong
dung dịch chuẩn đối chiếu. Phương pháp này cho kết quả đáng tin cậy nhất (sai
số cực tiểu khoảng 0,5 – 1,0%) giúp giảm thiểu sai số trong quá trình xử li mẫu,
đặc biệt với các mẫu huyết tương có nồng độ nhỏ. [1]
Trên cơ sở tham khảo các nghiên cứu đã được công bố và trong khuôn khổ điều
kiện tiến hành khóa luận, đề tài được xây dựng với quy trình xử lí mẫu là tủa
protein, sử dụng hệ thống HPLC với detector DAD để định lượng Linezolid
trong huyết tương, kết hợp sử dụng chất nội chuẩn để hạn chế sai số xử lí mẫu.
Việc lựa chọn nội chuẩn nên ưu tiên các chất không xuất hiện đồng thời trong
quá trình điều trị với Linezolid của bệnh nhân. Phương pháp xử lí mẫu đơn giản,
khơng tốn kém, yêu cầu lượng mẫu nhỏ, thời gian phân tích mẫu ngắn phù hợp
với theo dõi điều trị. Phân tích bằng HPLC-DAD phổ biến, khơng tốn kém, có
độ nhạy, độ chính xác và chọn lọc phù hợp cho giám sát điều trị linezolid trên
lâm sàng.
1.3. Thẩm định phương pháp định lượng thuốc trong dịch sinh học
Thẩm định phương pháp là một quy trình được thực hiện để khẳng định kết quả
phân tích đáng tin cậy. Đây là một nội dung bắt buộc với các phương pháp nói
11


chung và phân tích chất trong dịch sinh học nói riêng, bao gồm cả phân tích
thuốc trong huyết tương. Hiện nay ở Việt Nam, quy trình thẩm định phân tích
thuốc trong huyết tương được tiến hành dựa trên hướng dẫn US-FDA, EMA. Đề

tài khóa luận này được tiến hành dựa trên cả hướng dẫn US-FDA và EMA như
sau:
1.3.1. Độ chọn lọc
Độ chọn lọc là khả năng phương pháp phân tích có thể phân biệt và định lượng
chất phân tích với sự có mặt của các thành phần khác trong mẫu.
Tiến hành phân tích trên 06 mẫu huyết tương trắng có nguồn gốc khác nhau và
06 mẫu tự tạo có chứa chất chuẩn nội và chất phân tích ở nồng độ thấp của
đường chuẩn (nồng độ LLOQ dự kiến) trong từng nền huyết tương trắng tương
ứng. Ghi lại sắc kí đồ (SKĐ), đáp ứng pic và các thông số pic của các mẫu trắng
và mẫu chuẩn. Phương pháp HPLC được coi là chọn lọc đối với chất phân tích
(AN) và chuẩn nội (IS) khi:
- Trên SKĐ của mẫu chuẩn, các pic của chất phân tích và IS được nhận diện rõ
ràng và không bị ảnh hưởng bởi các pic khác (S/N không dưới 3).
- Tại thời điểm lưu của chất phân tích, đáp ứng pic của từng mẫu LLOQ phải
gấp ít nhất 5 lần đáp ứng pic của mẫu trắng tương ứng; tại thời điểm trùng
với thời gian lưu của IS, đáp ứng pic của từng mẫu LLOQ phải gấp ít nhất 20
lần đáp ứng pic của mẫu trắng tương ứng. [11] [12]
1.3.2. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính
Đường chuẩn là đường biểu diễn mối quan hệ giữa đáp ứng pic của thiết bị và
nồng độ chất phân tích trong mẫu. Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ của
chất phân tích (AN) có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ AN với tỷ lệ đáp
ứng AN/IS.
Đường chuẩn phải có tối thiểu 6 nồng độ, bao phủ toàn bộ khoảng tuyến tính,
các dung dịch chuẩn được chuẩn bị trên cùng nền mẫu. Đường chuẩn phải có hệ
số tương quan R khơng dưới 0,98 (xác định bằng phương pháp bình phương tối
thiểu) và đáp ứng các điều kiện sau:

12

- Độ đúng nằm trong khoảng 85 - 115%, riêng điểm có nồng độ thấp nhất của
đường chuẩn (LLOQ) cho phép độ đúng trong khoảng 80 - 120%.
-

Ít nhất 75% số điểm của đường chuẩn đạt được tiêu chuẩn trên, bao gồm cả
mẫu LLOQ và mẫu có nồng độ cao nhất của đường chuẩn. [12] [11]

1.3.3. Giới hạn định lượng dưới (LLOQ)
Giới hạn định lượng dưới (LLOQ) là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong
một mẫu cho kết quả định lượng đáng tin cậy, có độ đúng và độ chính xác phù
hợp. Nồng độ chuẩn thấp nhất trên đường chuẩn được chấp nhận là LLOQ khi:
- Pic của chất phân tích phải nhận diện rõ ràng, khơng bị ảnh hưởng bởi các
thành phần khác (S/N không dưới 3).
- Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của chất phân tích, đáp ứng pic của mẫu
LLOQ phải gấp ít nhất 5 lần đáp ứng pic của mẫu trắng.
- Nồng độ chất phân tích tính được từ đường chuẩn phải đạt từ 80 - 120% so
với nồng độ lí thuyết.
- Độ chính xác thể hiện bằng giá trị CV khi tiến hành phân tích trên ít nhất 5
mẫu LLOQ độc lập khơng q 20%. [12] [11]
1.3.4. Độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày
Độ đúng là giá trị phản ánh mức độ gần sát của kết quả nồng độ chất phân tích
thu được từ phương pháp phân tích so với nồng độ lí thuyết. Độ chính xác của
phương pháp phản ánh mức độ thống nhất giữa các kết quả riêng biệt khi lặp lại
quy trình phân tích nhiều lần trên cùng mẫu thử đồng nhất. Độ chính xác được
biểu diễn bằng giá trị CV. Độ chính xác bao gồm độ chính xác trong ngày và độ
chính xác khác ngày.
Độ đúng và độ chính xác được thực hiện trên 04 mức nồng độ khác nhau
(LLOQ, LQC, MQC, HQC), mỗi nồng độ tiến hành ít nhất 5 mẫu.
- LLOQ là điểm có nồng độ thấp nhất của đường chuẩn.
- LQC (low quality control) là mẫu kiểm tra ở nồng độ thấp, có nồng độ LNZ

bằng khoảng 2 - 3 lần nồng độ thấp nhất của đường chuẩn (LLOQ).
- MQC (medium quality control) là mẫu kiểm tra ở nồng độ giữa, có nồng độ
LNZ bằng khoảng 40 - 60% nồng độ cao nhất của đường chuẩn (ULOQ).
13


- HQC (high quality control) là mẫu kiểm tra ở nồng độ cao, có nồng độ LNZ
bằng khoảng 70 - 90% nồng độ ULOQ.
Độ đúng trong ngày và khác ngày phải nằm ngồi khoảng 85 – 115%, độ chính
xác trong ngày và khác ngày có giá trị CV khơng q 15%. Riêng nồng độ
LLOQ, cho phép độ đúng nằm trong khoảng 80 – 120%, giá trị CV không quá
20%.[12]
1.3.5. Tỉ lệ thu hồi (hiệu suất chiết)
Tỉ lệ thu hồi là giá trị phản ánh khả năng tìm lại của chất phân tích và chuẩn nội
sau q trình chiết tách xử li mẫu. Tỉ lệ thu hồi được xác định bằng cách so sánh
kết quả đáp ứng của các mẫu QC có qua chiết tách với đáp ứng của các mẫu
chuẩn có cùng nồng độ khơng xử lí qua chiết tách. Tỉ lệ thu hồi của chất phân
tích và chuẩn nội phải ổn định.
So sánh kết quả phân tích của các mẫu qua chiết tách ở 3 mức nồng độ (LQC,
MQC, HQC) với các mẫu chuẩn có nồng độ tương ứng không qua chiết tách (tỉ
lệ thu hồi 100%) phải thỏa mãn:
- Tỉ lệ thu hồi của AN và IS không nên quá cao (dưới 110%) hay quá thấp
(trên 30%).
- Tỉ lệ thu hồi tại mỗi mức nồng độ khác nhau có giá trị CV khơng q 15%.
- Tỉ lệ thu hồi trung bình tại các mức nồng độ khác nhau nằm trong khoảng 85
- 115%.[12]
1.3.6. Đánh giá khả năng nhiễm chéo
Tiến hành xử lí mẫu theo phương pháp đã xây dựng trên 6 mẫu huyết tương
trắng, 6 mẫu chuẩn pha trong huyết tương ở nồng độ LLOQ, 6 mẫu chuẩn pha
trong huyết tương ở nồng độ ULOQ. Phân tích sắc kí các mẫu huyết tương trắng

xen kẽ sau mẫu ULOQ.
Mẫu được coi là khơng bị nhiễm chéo trong q trình phân tích khi tại thời điểm
trùng với thời gian lưu của chất phân tích, đáp ứng pic của từng mẫu trắng
không được lớn hơn 20% so với đáp ứng pic trung bình của mẫu LLOQ và tại
thời điểm trừng với thời gian lưu của IS, đáp ứng pic của từng mẫu trắng không
được lớn hơn 5% so với đáp ứng pic trung bình của mẫu LLOQ. [11]
14


1.3.7. Độ ổn định
Các mẫu phân tích trong dịch sinh học trải qua q trình lấy mẫu, xử lí, bảo
quản mẫu (ngắn hạn, dài ngày), qua chu kỳ đông lạnh – rã đơng và q trình
phân tích mẫu nên cần đánh giá độ ổn định của chất phân tích. Độ ổn định được
đánh giá bằng cách so sánh kết quả phân tích các mẫu sau bảo quản với các mẫu
mới chuẩn bị ít nhất 3 lần lặp lại ở mỗi mức nồng độ khác nhau (LQC và HQC).
Trong thẩm định phương pháp cần đánh giá các loại độ ổn định sau:
- Độ ổn định của dung dịch chuẩn gốc, dung dịch chuẩn làm việc sau thời gian
ngắn và/hoặc thời gian dài.
Yêu cầu: Nồng độ của dung dịch sau bảo quản phải sai khác với nồng độ dung
dich mới pha không quá 2%.
- Độ ổn định của mẫu huyết tương bao gồm:
+ Độ ổn định sau 3 chu kì đơng – rã đông.
+ Độ ổn định sau thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng.
+ Độ ổn định sau thời gian dài ở nhiệt độ bảo quản.
+ Độ ổn định của mẫu sau xử lí.
Các mẫu huyết tương được coi là ổn định ở điều kiện nghiên cứu nếu nồng độ
của mẫu sau bảo quản sai khác so với nồng độ ban đầu không quá 15% và giá trị
CV giữa các lần phân tích khơng q 15%.[11] [12]

15

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1. Hóa chất – chất chuẩn
Bảng 2.1. Các chất chuẩn dùng trong nghiên cứu
STT
1

Tên
Linezolid (LNZ)

Nguồn gốc
Dung dịch tiêm

Hàm lượng
2 mg/mL

truyền Linod, Ahlcon
Parenterals (I)
Limited
2

Methylparaben

Chuẩn dược điển Việt

99,64%

Nam, Viện Kiểm

nghiệm Thuốc Trung
Ương
2.1.2. Các hóa chất dung mơi
- Dung mơi tinh khiết HPLC: acetonitril (Fisher, Đức)
- Hóa chất dung mơi tinh khiết phân tích: acid phosphoric
- Huyết tương trắng: viện huyết học và truyền máu trung ương.
2.1.3. Thiết bị, dụng cụ
- Hệ thống HPLC Agilent Technologies 1260 Infinity
- Cột VertiSepTM GES C18 HPLC (4,6 mm ì 250 mm; 5àm) (Thỏi Lan)
- Cân phân tích AND GF-224A.
- Máy li tâm lạnh Hettich Mikro 220R
- Tủ lạnh âm sâu (-30) Sanyo Biomedical Freezer
- Máy siêu âm
- Máy lắc xoáy Votex Mixer K
- Máy lọc hút chân không
2.1.4. Đối tượng nghiên cứu
- Mẫu tự tạo là mẫu huyết tương trắng thêm chuẩn Linezolid.
2.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Chuẩn bị mẫu
16