NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG MÔ HÌNH XƠ GAN TRÊN CHUỘT NHẮT BẰNG CARBON TETRACLORID

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC
‫ﷴﷴﷴﷴ‬

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG MƠ HÌNH XƠ GAN
TRÊN CHUỘT NHẮT BẰNG HĨA CHẤT

Khóa luận tốt nghiệp đại học hệ chính quy
Ngành: Sinh học
(Chương trình đào tạo tài năng)

HÀ NỘI-2019


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC
‫ﷴﷴﷴﷴ‬

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG MƠ HÌNH XƠ GAN
TRÊN CHUỘT NHẮT BẰNG HĨA CHẤT

Khóa luận tốt nghiệp đại học hệ chính quy
Ngành: Sinh học
(Chương trình đào tạo tài năng)
Cán bộ hướng dẫn:

HÀ NỘI-2019

Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Sinh học
LỜI CẢM ƠN


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Sinh học
MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN........................................................................................................
1

MỤC LỤC..............................................................................................................
2

DANH MỤC CÁC BẢNG ....................................................................................
4

DANH MỤC CÁC HÌNH.....................................................................................
5

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU...................................................
6

MỞ ĐẦU .............................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN............................................................................... 3
1.1

Cấu trúc cơ bản của tiểu thùy gan .......................................................... 3

1.2

Bệnh xơ gan ............................................................................................... 3

1.2.1 Thực trạng bệnh xơ gan ............................................................................ 3
1.2.2 Tiến trình bệnh lý xơ gan ......................................................................... 4
1.2.3 Nguyên nhân gây xơ gan .......................................................................... 4
1.2.4 Cơ chế bệnh sinh của xơ gan.................................................................... 5
1.2.5 Tiêu chí đánh giá xơ gan........................................................................... 8
1.2.5.1 Kiểm tra chức năng gan ........................................................................ 8
1.2.5.2 Sinh thiết gan.......................................................................................... 9
1.3

Các mơ hình gây xơ gan trên động vật ................................................. 10

1.4

Cơ chế gây bệnh bằng carbon tetrachloride (CCl4) ............................ 11

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............. 13
2.1

Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu......................... 13

2.1.1

Đối tượng nghiên cứu ......................................................................... 13

2.1.2

Vật liệu nghiên cứu ............................................................................. 13

2.1.3

Địa điểm và thời gian nghiên cứu...................................................... 14

2.2

Nội dung nghiên cứu ............................................................................... 14

2.3

Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 14

2.3.1

Phương pháp gây dựng mơ hình ....................................................... 14


Khóa luận tốt nghiệp
2.3.2

Khoa Sinh học

Phương pháp đánh giá hiệu quả gây xơ gan và điều trị xơ gan..... 15

2.3.2.1 Đánh giá thay đổi trọng lượng, tình trạng tồn thân...................... 15
2.3.2.2 Xác định các chỉ số huyết học ............................................................ 16

2.3.2.3 Xác định hoạt độ các thơng số sinh hóa............................................ 17
2.3.2.4 Đánh giá cấu trúc mô học gan ........................................................... 20
2.3.3

Phương pháp xử lý số liệu .................................................................. 27

2.3.4

Đạo đức nghiên cứu ............................................................................ 27

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN...................................................... 29
3.1

Thời gian gây xơ gan trên chuột nhắt trắng bằng CCl4...................... 29

3.2

Tình trạng chuột...................................................................................... 34

3.3

Kết quả xét nghiệm huyết học................................................................ 36

3.4

Kết quả xét nghiệm hóa sinh.................................................................. 38

3.5

Kết quả mơ học........................................................................................ 41

3.5.1

Sự thay đổi hình ảnh đại thể gan....................................................... 42

3.5.2

Tổn thương vi thể cấu trúc gan ......................................................... 43

3.6

Mức độ xơ hóa gan.................................................................................. 46

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................... 51
1.

Kết luận .................................................................................................... 51

2.

Kiến nghị .................................................................................................. 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 52

.

.


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Sinh học
DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1: Hệ thống tính điểm trong xơ gan theo METAVIR................................. 23
Bảng 2: Ảnh hưởng của CCl4 tới các chỉ số huyết học của chuột ..................... 37
Bảng 3: Ảnh hưởng của CCl4 tới các chỉ số sinh hóa của chuột....................... 39
Bảng 4: Giai đoạn xơ hóa gan của các nhóm chuột thí nghiệm theo thang
điểm của METAVIR............................................................................................. 47

.

.


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Sinh học
DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1: Chuột nhắt trắng (BALB/c) 8-10 tuần tuổi............................................ 13
Hình 2: Cách tiêm dưới da.................................................................................. 15
Hình 3: Cân chuột............................................................................................... 16
Hình 4: Lấy máu mắt chuột................................................................................. 16
Hình 5: Thao tác lấy mẫu.................................................................................... 20
Hình 6: Quy trình thí nghiệm.............................................................................. 28
Hình 7: Sự thay đổi trọng lượng chuột trong 3 tháng ........................................ 34
Hình 8: Tình trạng lơng chuột ............................................................................ 35
Hình 9: Tình trạng phân chuột............................................................................ 36
Hình 10: Cấu trúc đại thể gan chuột các nhóm.................................................. 42

Hình 11: Cấu trúc vi thể gan chuột các nhóm nhuộm H&E............................... 43
Hình 12: Hình ảnh ứ mật trong tế bào gan bị thối hóa (nhuộm H&E)............ 44
Hình 13: Cáu trúc vi thể gan các nhóm dưới kính hiển vi điện tử truyền qua ... 45
Hình 14: Cấu trúc vi thể gan chuột sau khi tiêm CCl4 (nhuộm ba màu
Masson)............................................................................................................... 46
Hình 15: Cấu trúc vi thể gan các nhóm dưới kính hiển vi điện tử truyền qua ... 49

.

.


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Sinh học

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU

.

AASLD

Hiệp hội Nghiên cứu bệnh gan Hoa Kỳ
(American Association for the Study of Liver
Diseases)

ALP

Alkaline phosphatase

ALT

Alanine transaminase

AST

Aspartate transaminase

BCG

Bromocresol green

BOD

Bilirubin oxidase

CCl3

Tricholoromethyl

CCl3OO

Tricholoromethylperoxy

CCl4

Carbon tetrachloride

CHER

Cholesterol esterase

DEN

Diethylnitrosamine

DMN

Dimethylnitrosamine

ECM

Exatracellular matrix

GGT

Glutamyltransferase

HBV

Virus viêm gan B (Hepatitis B virus)

HCC

Ung thư gan (Hepatocellular carcinoma)

HCV

Virus viêm gan C (Hepatitis C virus)

HE

Hematoxylin-eosin

HSC

Tế bào gốc tạo máu (Haematopoietic stem cell)

MCD

Methionine choline-deficient

MCV

Thể tích trung bình hồng cầu
(Mean Corpuscular Volume)

MFB

Myofibroblast

MFOs

Micrsomal mixed function oxidase
.


Khóa luận tốt nghiệp

.

Khoa Sinh học

MNP

Matrix metalloproteinase

NADH

Nicotinamide adenine dinucleotide

NAFLD

Bệnh gan nhiễm mỡ không do rượu
(Non-alcoholic fatty liver disease)

NCHS

Trung tâm Thống kê Y tế Quốc gia
(National Coalition for Sexual Health)

PAS

Periodic acid Schiff

PBS

Phosphate buffered saline

PBS

Xơ mật nguyên phát (Primary biliary cirrhosis)

PDGF

Yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu cầu
(Platelet-dierived growth factor)

POD

Peroxidae

PSC

Viêm xơ đường mật nguyên phát
(Primary sclerosing cholangitis)

SEM

Kính hiển vi điện tử quét
(Scanning electron microscopes)

TAA

Thioacetamid

TEM

Kính hiển vi điện tử truyền qua
(Transmission electron microscopes)

TGF-β

Yếu tố tăng trưởng chuyển dạng β
(Transforming growth factor – β)

TIMP

Tissue inhibitor of metalloproteinase

WHO

Tổ chức Y tế Thế giới
(World Health Organization)

.


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Sinh học
MỞ ĐẦU

1.

Lý do chọn đề tài

Xơ gan là nguyên nhân tử vong đứng thứ 11 trên thế giới, và thứ 10 tại
Việt Nam với hơn 1 triệu ca tửvong theo thống kê vào năm 2015[19]. Bệnh lý
này được đặc trưng trên mô bệnh bởi sự xơ hóa lan tỏa, đảo lộn cấu trúc tế

bào gan, hình thành các nốt có cấu trúc bất thường phát triển lan tỏa khắp các
tiểu thùy gan sẽ dẫn đến suy giảm chức năng gan, tăng áp lực tĩnh mạch cửa
và từ đó có thể gây ra biến chứng trên nhiều cơ quan như bệnh não gan, hội
chứng gan thận, hội chứng gan phổi, xuất huyết tiêu hóa do giãn vỡ tĩnh mạch
thực quản, ung thư hóa… có thể dẫn tới tử vong[45].
Hiện nay, chưa có phương pháp điều trị hiệu quả xơ hóa gan. Các
phương pháp điều trị mới chỉ dừng lại ở điều trị triệu chứng hoặc ghép gan.
Vì vậy, việc xây dựng mơ hình bệnh lý xơ gan trên động vật vẫn hết sức cần
thiết để nghiên cứu sâu hơn về cơ chế bệnh sinh và áp dụng các phương pháp
điều trị hiệu quả. Các mơ hình xơ gan trên động vật (chuột nhắt, chuột cống,
thỏ, lợn,…) với nhiều phương pháp gây xơ hóa khác nhau như sử dụng tác
nhân hóa học, phương pháp thắt ống dẫn mật, phương pháp miễn dịch,… đã
được xây dựng trong nhiều thập kỉ qua.Trong đó,mơ hình gây xơ gan bằng
hóa chất được sử dụng rộng rãi và phổ biến bởi độ lặp lại cao, dễ thực hiện,
chi phí khơng q cao và đặc biệt, mơ hình gây xơ gan bằng cacbon
tetracloride là một lựa chọn mang những ưu điều trên, đồng thời mơ hình này
cịn mang nhiều đặc điểm tương đồng về quá trình hình thành và phát triển xơ
gan trên người[12].
Tại Việt Nam, đã có một số tác giả nghiên cứu xây dựng mơ hình này
trên chuột cống và chuột nhắt với mức liều khác nhau của cacbon
tetrachloride trong các khoảng thời gian khác nhau. Tuy nhiên, các nghiên
cứu chưa đi sâu vào tối ưu thời gian gây xơ gan và tối ưu mức độ tổn thương

.
s

1

.

Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Sinh học

giải phẫu bệnh trên động vật thực nghiệm tương ứng với các tổn thương xơ
gan trên người[3,4,6].
Dựa vào những lý do trên, với mong muốn xác định được các điều kiện
tiến hành mơ hình phù hợp, chúng tôi đã lựa chọn đề tài nghiên cứu với nội
dung “Nghiên cứu xây dựng mơ hình xơ gan trên chuột nhắt bằng hóa
chất”.
2.

Mục tiêu nghiên cứu
Khảo sát thời gian gây xơ gan trên chuột nhắt trắng bằng hóa

chất carbon tetracloride.
Đánh giá các thương tổn cơ bản gây bởi carbon tetracloride trên
gan của động vật thí nghiệm.
3.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Với nghiên cứu này, chúng ta có thể hiểu hơn về q trình gây

xơ hóa gan trên chuột nhắt bằng hóa chất
Trên cơ sở nghiên cứu này, giúp chúng ta tạo mơ hình để đánh
giá tác dụng chống xơ hóa gan của các loại thuốc trong thời gian thích hợp.

.

2

.


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Sinh học
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1

Cấu trúc cơ bản của tiểu thùy gan

Tiểu thùy gan là đơn vị chức năng của gan. Mỗi tiểu thùy có tĩnh mạch
trung tâm, đổ vào tĩnh mạch gan và chảy vào tĩnh mạch chủ. Ngoại vi của mỗi
tiểu thùy, nơi tập trung ống dẫn mật, các nhánh tĩnh mạch cửa và động mạch
gan. Các tế bào gan được phân chia bởi các xoang, từ ngoại vi vào trung tâm
tiểu thùy gan. Các xoang này nhận máu từ tĩnh mạch cửa và động mạch gan.
Cấu trúc này cho phép các tế bào gan loại các chất ra khỏi máu hoặc có thể giải
phóng các chất vào máu khi nó qua các xoang.
Trong tiểu thùy gan cũng chứa các mao quản mật nằm giữa màng tế bào
các tế bào gan liền kề. Các tế bào gan sản xuất mật đổ vào mao quản mật, đổ
vào ống mật ở ngoại vi thùy gan, góp vào ống mật lớn rồi góp vào ống gan trái
và phải, tạo thành cây gan mật[21].
Cấu trúc trên đây cũng là cơ sở để tiến hành đánh giá các tổn thương đối
với gan ở mức tế bào, mô thông qua việc đánh giá tổn thương của khoảng cửa,
tĩnh mạch trung tâm tiểu thùy, các bè gan, ống mật….
1.2

Bệnh xơ gan

1.2.1 Thực trạng bệnh xơ gan
Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) (2015) xơ gan là
nguyên nhân gây tử vong đứng hàng thứ 11 trên thế giới, gây ra hơn 1 triệu ca tử
vong[19]. Tại Mỹ theo thông báo của Trung tâm Thống kê Y tế Quốc gia
(NCHS) năm 2015 có 42.443 ca tử vong do xơ gan chiếm tỷ lệ 13,2 ca/100.000
dân[15]. Tỷ lệ tử vong do xơ gan khá cao ở hầu hết các nước Châu Á và Châu
Phi, nơi có tình trạng viên gan B và C mạn tính khá phổ biến, trong đó Ai Cập,
Moldova và Mơng Cổ có tỷ lệ tử vong do xơ gan cao nhất trên thế giới. Trên
thực tế, tỷ lệ bệnh nhân xơ gan có thể cao hơn so với các số liệu đã công bố do
bệnh nhân xơ gan ở giai đoạn cịn bù thường khơng có triệu chứng và hầu hết
.

3

.


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Sinh học

các trường hợp chỉ được phát hiện khi đã xuất hiện các biến chứng, và nhiều
nước trên thế giới khơng có con số thống kê chính xác, đặc biệt là Châu Phi[19].
Tỷ lệ tử vong trong vòng 1 năm của bệnh nhân xơ gan dao động từ 1% đến 57%
tùy thuộc vào giai đoạn bệnh[27]. Bên cạnh đó, gần 59% bệnh nhân xơ gan sẽ
xuất hiện cổ trướng trong 10 năm và gần một nửa số ca xuất hiện cổ trướng sẽ tử
vong trong vòng 2 năm[47].
Tại Việt Nam, xơ gan là nguyên nhân tử vong đứng thứ 10. Bên cạnh đó,

Việt Nam là một trong 3 quốc gia nằm ở phía Tây Thái Bình Dương có tỷ lệ
nhiễm viêm gan virut cao nhất, ước tính khoảng 8,7 triệu người mặc viêm gan B
và 1 triệu người mắc viêm gan C mạn tính (2016); trong đó, tỷ lệ bệnh nhân
viêm gan mạn tính chuyển thành xơ gan là khá cao[58].
1.2.2 Tiến trình bệnh lý xơ gan
Xơ gan thể hiện cho giai đoạn cuối của quá trình xơ hóa gan, phản ứng
chữa lành cho tổn thương gan mạn tính. Xơ gan đặc trưng bởi sự biến dạng các
nhu mô gan liên quan đến dải xơ và hình thành các nốt sần cũng như thay đổi
lưu lượng máu. Q trình xơ hóa tự nhiên bắt đầu với một giai đoạn dài không
triệu chứng, được gọi là giai đoạn bù lại, sau đó là một giai đoạn tiến triển nhanh
được gọi là xơ gan mất bù, có dấu hiện lâm sàng là tăng huyết áp cổng và hoặc
sự sai hỏng chức năng gan. Những biến chứng khác có thể phát triển bao gồm
tràn dịch màng bụng, hội chứng gan thận, hội chứng gan phổi, viêm phúc mạc
do vi khuẩn tự phát có thể làm trầm trọng thêm quá trình bệnh. Ung thư biểu mơ
tế bào gan (HCC) có thể phát triển ở bất kỳ giai đoạn nào của xơ gan.Ghép gan
thường được sử dụng là biện pháp duy nhất để điều trị xơ gan và có thể cải thiện
khả năng sống sót và chất lượng cuộc sống ở những bệnh nhân bệnh gan giai
đoạn cuối được lựa chọn[45].
1.2.3 Nguyên nhân gây xơ gan

.

4

.


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Sinh học

Xơ gan xảy ra do nhiều nguyên nhân khác nhau, là kết quả của quá trình
tổn thương gan lâu dài. Nguyên nhân phổ biến ở các nước phương Tây là do gan
nhiễm mỡ do nghiện rượu, nhiễm virus viêm gan C mạn tính và bệnh gan nhiễm
mỡ không do rượu (NAFLD). Trong khi viêm gan B mạn tính là nguyên nhân
chính gây xơ gan ở khu vực châu Á – Thái Bình Dương. Một số nguyên nhân
khác do tổn thương ống mật như xơ mật nguyên phát (PBS – Primary biliary
cirrhosis), viêm xơ chai đường mật nguyên phát (PSC – Primary sclerosing
cholangitis) và viêm gan tự miễn dịch, hay do các bệnh di truyền (bệnh Wilson,
hemochromatosis, thiếu hụt alpha-1 antitrypsin, hyperoxaluria và oxalosis),
thuốc, chất độc, ký sinh trùng.... Một số trường hợp là tự phát hoặc không rõ
nguyên nhân. Trong những thập kỷ gần đây, NAFLD đã trở thành nguyên nhân
hàng đầu gây bệnh gan mạn tính ở các nước phương Tây như Hoa Kỳ, với tỷ lệ
cao tới 30% trong dân số nói chung[64].
Trong số các nguyên nhân trên, rượu và nhiễm virut viêm gan là 2 nguyên
nhân hay gặp nhất. Theo thống kê của Hiệp hội Nghiên cứu bệnh gan Hoa Kỳ
(AASLD) rượu là nguyên nhân hay gặp nhất của bệnh gan trên toàn thế giới
được biệt ở các nước phát triển. Năm 2006, Perz J.F. và cộng sự tổng hợp 43
nghiên cứu trên khắp thế giới về nguyên nhân xơ gan cho thấy 57% căn nguyên
xơ gan trên toàn thế giới là do nhiễm virut viêm gan trong đó 30% do HBV và
27% do HCV[9].
Tại Việt Nam, nguyên nhân xơ gan chủ yếu do virut, ngoài ra rượu cũng
là nguyên nhân đáng kể và tăng nhiều trong những năm gần đây. Theo nghiên
cứu của Vũ Văn Khiên, Bùi Văn Lạc, Mai Hồng Bàng cho thấy trong các
nguyên nhân gây xơ gan nguyên nhân do virut viêm gan B chiếm 55%, 20% do
rượu, 5% do virut viêm gan C, do rượu và virut viêm gan B chiếm 5% và 15%
do các nguyên nhân khác[1].
1.2.4 Cơ chế bệnh sinh của xơ gan

.

5

.


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Sinh học

Xơ hóa gan là kết quả đáp ứng làm lành tổn thương gan lặp đi lặp lại. Có
4 thay đổi cơ bản trong mơ gan xơ hóa so với mơ gan bình thường: (1) tái sắp
xếp mô học, (2) thay đổi vi cấu trúc của chất nền ngoại bào (ECM –
Extracellular matrix), (3) tăng hàm lượng ECM, (4) thay đổi thành phần của
ECM[14]. Sau tổn thương gan cấp tính (như viêm gan viruts), các tế bào như mô
tăng sinh và thay thế các tế bào hoại tử hoặc bị chết theo chu trình. Quá trình
này liên quan đến phản ứng viêm và tích tụ có giới hạn chất nền ngoại bào. Nếu
tổn thương gan vẫn tiếp diễn, sự tái sinh của gan không đủ để phục hồi, các tế
bào gan sẽ bị thay thế bởi lượng lớn chất nền ngoại bào, bao gồm sợi collagen.
Khi xơ hóa phát triển, bệnh tiến triển từ các dải collagen thành sự xơ hóa bắc
cầu dẫn tới hình thành xơ gan[18].
Ở giai đoạn tiến triển, lượng ECM trong gan tăng khoảng 6 lần so với
bình thường bao gồm collagen (typ I, II và IV), fibronectin, undulin, elastin,
laminin, hyaluronan và proteoglycan. Tế bào hình sao (HSC) là các tế bào sản
xuất ECM chủ yếu trong mô gan tổn thương. Trong gan bình thường, tế bào
hình sao cư trú ở khoang Disse và là nơi dự trữ vitamin A chủ yếu. Sau tổn
thương gan mạn tính, các tế bào hình sao được hoạt hóa và chuyển thành các
nguyên bào sợi. Các tế bào này sẽ di chuyển và tích tụ ở những vùng mô cần sửa
chữa, tiết ra một lượng lớn collagen và chất nền ngoại bào, cuối cùng dẫn đến xơ
hóa gan[18]. Ngồi các tế bào hình sao, ECM cịn có nguồn gốc từ nhiều loại

tếbào khác như các tế bào có nguồn gốc từ tủy xương. Trong nghiên cứu của
Kisscleva và cộng sự năm 2006 cho thấy các tế bào sợi từ tủy xương có thể biệt
hóa thành nguyên bào sợi cơ (MFB) sản xuất collagen nhờ TGF – β. Bên cạnh
đó, một số bằng chứng cho thấy tế bào trung mơ ở khoảng của có liên quan đến
q trình xơ hóa[63]. Ngồi ra, các ngun bào sợi cơ có nguồn gốc từ q trình
chuyển dạng biểu mơ – trung mơ đóng vai trị quan trọng trong q trình phát
sinh xơ hóa liên quan đến các bệnh về ứ mật[56].
Hoạt hóa tế bào hình sao là sự kiện trung tâm trong xơ hóa gan[18]. Q
trình này được khởi phát bởi nhiều yếu tố bao gồm các cytokin (đặc biệt là TGF
.

6

.


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Sinh học

– β, yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu cầu, các gốc oxy hoạt động, các tế bào
chết theo chương trình…)[30]. Quá trình hoạt hóa tế bào hình sao trải qua 2 giai
đoạn chính: giai đoạn khởi đầu và giai đoạn duy trì. Giai đoạn khởi đầu có liên
quan đến những thay đổi sớm về biểu hiện gen và kiểu hình đáp ứng với các
cytokin và các kích thích khác, chủ yếu liên quan đến các kích thích cận tiết.
Trong khi đó, giai đoạn duy trì là kết quả của các kích thích này trong việc duy
trì kiểu hình.Trong giai đoạn khởi đầu, những thay đổi sớm nhất của các tế bào
hình sao có thể là do kích thích cận tiết bởi các tế bào lân cận, bao gồm: tế bào
nội mô mao mạch hình sin, tế bào Kupffer, tế bào gan và tiểu cầu. Các tế bào
nội mơ có thể tham gia vào sự chuyển đổi yếu tố tăng trưởng TGF – β sang dạng

hoạt hóa, trở thành tác nhân gây xơ hóa. Tiểu cầu cũng là nguồn kích thích cận
tiết quan trọng, bao gồm các yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu cầu (PDGF),
TGF – β1, yếu tố tăng trưởng biểu bì. Ngồi ra, các tế bào Kupffer có thể tham
gia vào q trình hoạt hóa tế bào hình sao, chúng kích thích tổng hợp chất nền,
tăng sinh tế bào và giải phóng retinoid từ các tế bào hình sao thơng qua hoạt
động của các cytokin (đặc biệt là TGF – β) và các gốc oxy hoạt động. Các tế bào
gan bị phá hủy giải phóng các gốc oxy hoạt động và các chất trung gian gây xơ,
kích thích hoạt hóa HSC và hoạt tính xơ hóa của các ngun bào sợi cơ. Giai
đoạn duy trì kèm theo ít nhất 7 thay đổi quan trọng: (1) tăng sinh, (2) hóa ứng
động, (3) gây xơ hóa, (4) co bóp, (5) thối biến chất nền, (6) mất retinoid, (7)
hóa hướng động bạch cầu và giải phóng cytokin. Những thay đổi này đều làm
tăng lắng đọng chất nền ngoại bào dẫn tới hình thành và tiến triển xơ gan[57].
Sự tích tự ECM là hậu quả của sự tăng tổng hợp và giảm thoái biến chất
nền[16]. Do vậy, tăng cường thối hóa biến chất nền dần trở thành cơ chế chính
của sự hồi phục xơ gan. Yếu tố đóng vai trị quan trọng trong q trình này là
các metalloproteinase (MMP) có tác dụng phân giải chất nền[18]. Q trình
thối biến chất nền diễn ra với sự tham gia của 4 enzyme: MMP – 2, MMP – 9,
stromelysin – 1 và metalloproteinase màng typ 1 hoặc typ 2. Trong đó, MMP –
2 (chủ yếu từ các tế bào hình sao), cùng với MMP – 9 (tiết ra từ các tế bào
.

7

.


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Sinh học

Kupffer) có vai trị chính trong việc phân hủy collagen typ 4. Stromelysin – 1 là
enzyme thối hóa proteoglycan, glycoprotein và hoạt hóa collagenase. Enzyme
metalloproteinase màng typ 1 và typ 2 đóng vai trị hoạt hóa MMP – 2[18]. Sự
giảm hoạt động của các MMP phân giải chất nền chủ yếu là do sự biểu hiện quá
mức của các tác nhân ức chế đặc hiệu metalloproteinase (TIMP) [57]. Tiến triển
xơ hóa gan có liên quan mật thiết với sự tăng TIMP – 1 hoặc TIMP -2 làm giảm
hoạt tính của các MMP phân giải protein, dẫn đến tích tụ ECM. Tăng TIMP – 1
được xem là tác nhân chính thúc đẩy xơ hóa tiển triển. Do vậy, giảm TIMP – 1
là một trong những điều kiện tiên quyết cho phép đảo ngược xơ hóa[57].
1.2.5 Tiêu chí đánh giá xơ gan
1.2.5.1 Kiểm tra chức năng gan
Các xét nghiệm chức năng gan đã được sử dụng thường xuyên trong
nhiều năm như một cuộc điều tra trực tuyến để sàng lọc các bệnh về gan. Các
xét nghiệm phổ biến bao gồm: alanine transaminse (ALT) và aspartate
transaminase (AST), alkaline liver phosphatase (ALP), γ-glutamyltransferase,
bilirubin huyết thanh, prothrombin time và albumin huyết thanh. Chúng phản
ảnh các chức năng khác nhau của gan: bài tiết các anion (bilirubin), tính tồn
vẹn của các tế bào gan (transaminase), sự hình thành và dịng chảy tự do của mật
(bilirubin, ALP) và tổng hợp protein (albumin)[21].
a.

Chức năng chế tiết

Bilirubin được hình thành thơng qua q trình dị hóa của các tế bào hồng
cầu. Bilirubin khơng liên hợp được vận chuyển đến gan, nó là các phân tử không
tan trong nước nên không thể được tiết ra ngoài. Trong gan, các phân tử này liên
hợp với bulirubin glucuronide và sau đó được tiết vào ống mật và ruột. Bilirubin
huyết thanh chủ yếu ở dạng không liên hợp, phản ánh sự cân bằng giữa sản xuất
và bài tiết ở gan. Tăng sắc tố biliburin thường xảy ra nếu xơ gan phát triển, đặc
biệt ở xơ gan do tắc mật nguyên phát.

.

8

.


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Sinh học

Phosphatase kiềm (ALP) có nguồn gốc chủ yếu từ gan và xương. Nguyên
nhân phổ biến của sự gia tăng AP là ứ mật hoặc tắc mật, sự gia tăng AP là kết
quả của sự tăng tổng hợp và được giải phóng vào các rãnh ống mật. Ngoài ra,
nồng độ AP tăng trong các điều kiện sinh lý như mang thai, trẻ đang tuổi phát
triển.
γ-Glutamyltransferase (GGT) là một enzyme được biểu hiện ở tế bào gan
và tế bào biểu mô đường mật. GGT là một xét nghiệm rất nhạy để đánh giá chức
năng bài tiết ở gan, nhưng nó lại bị hạn chế do thiếu tính đặc hiệu. Nồng độ
GGT cao có thể được nhìn thấy trong bệnh tụy, nhồi máu cơ tim, suy thận, bệnh
phổi tắc nghẽn mạn tính, tiểu đường và nghiện rượu. Cùng với các bất thường
của enzyme khác như nồng độ transaminase cao, sự tăng nồng độ GGT cho kết
quả bệnh gan liên quan đến rượu.
b.

Chức năng tổng hợp

Tổng hợp Albumin và các yếu tố đông máu là những chức năng quan
trọng của gan. Sự giảm lượng albumin huyết thành và thời gian đông máu kéo
dài tương ứng trực tiếp với sự suy yếu chức năng tổng hợp của gan. Ngoài ra,

nồng độ albumin giảm cũng có thể do tình trạng thiếu dinh dưỡng, dị hóa, yếu tố
nội tiết tố, rị rỉ vào nước tiểu và đi qua đường tiêu hóa.
c.

Sự hoại tử của tế bào gan

Transaminase, bao gồm AST và ALT, là dấu hiệu của tổn thương tế bào
gan. Chúng tham gia vào con đường gluconeogenesis bằng cách xúc tác chuyển
các nhóm amin từ axit amin sang axit ketoglutaric. Khi các tế bào gan bị tổn
thương sẽ kích hoạt giải phóng các enzyme này vào vịng tuần hồn.
1.2.5.2Sinh thiết gan
Sinh thiết gan được coi là phương pháp chuẩn cho việc đánh giá sự xơ
hóa của gan.

.

9

.


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Sinh học

Nghiên cứu mơ bệnh học
Xét nghiệm mô bệnh học hữu dụng trong việc xác định nguyên nhân
bệnh, đánh giá mức độ viêm-hoại tử và giai đoạn tiến triển của xơ hóa. Các
phương pháp nhuộm phổ biến bao gồm nhuộm hematoxylin và eosin, nhuộm
Masson trichrom, sirius red, reticulin, nhuộm periodic acid Schiff (PAS)….

[6]Giữa các phịng thí nghiệm khác nhau sẽ sử dụng các phương pháp khác
nhau, nhưng yêu cầu tối thiểu bao gồm nhuộm H&E và nhuộm mô liên kết
(Masson trichrome, Sirius red)[21].
Nghiên cứu siêu cấu trúc
Nghiên cứu siêu cấu trúc nhu mô gan giúp phân tích tổn thương nhân, các
bào quan trong tế bào và viêm khoảng cửa[5]. Để nghiên cứu siêu cấu trúc
thường sử dụng kỹ thuật hiển vi điện tử truyền qua (TEM) và kỹ thuật hiển vi
điện tử qt (SEM).
1.3

Các mơ hình gây xơ gan trên động vật

Các mơ hình xơ gan trên động vật đã được sử dụng trong nhiều thập kỉ để
nghiên cứu xơ hóa gan và tác dụng của các tác nhân chống xơ hóa. Những mơ
hình này đóng vai trị quan trọng trong việc tìm hiểu sâu hơn về cơ chế bệnh
sinh cũng như phát triển các liệu pháp điều trị xơ gan. Cho đến nay nhiều mơ
hình xơ gan trên động vật đã được xây dựng trên chuột nhắt, chuột cống, thỏ,
lợn… nhằm mơ phỏng q trình xơ hóa và xơ gan trên người. Nhưng mơ hình
trên chuột vẫn được ưa thích và tiêu chuẩn hóa tốt nhất.[44]
Mơ hình xơ gan bằng tác nhân hóa học
Các tác nhân hóa học thường được sử dụng là những chất gây tổn thương
trực tiếp tế bào gan, dẫn tới hoại tử, kích hoạt phản ứng viêm và một loạt các
quá trình phức tạp khác dẫn tới xơ hóa và xơ gan. Các tác nhân thường được sử
dụng bao gồm CCl4, thioacetamide, dimethylintrosamin, dioxin, natri asenat, và
ethanol. Nhóm mơ hình này được sử dụng phổ biến bởi độ lặp lại cao, dễ thực
hiện và có nhiều điểm tương đồng với cơ chế gây xơ hóa gan trên người[12].
.

10

.


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Sinh học

Mơ hình xơ gan bằng phương pháp thắt ống dẫn mật
Khi thắt ống mật, một loạt các phản ứng sẽ xảy ra bao gồm: tắc nghẽn ống
mật gây tăng áp lực đường mật, viêm, tăng tiết cytokine và ứ mật. Các tế bào
biểu mô đường mật tăng sinh, dẫn đến sự tăng sinh tiểu quản mật, kèm theo
viêm và xơ hóa ở khoảng cửa. Các nguyên bào sợi ở khoảng cửa là những tế bào
góp phần quan trọng vào q trình gây xơ hóa trên mơ hình này.[12]
Mơ hình gây xơ gan bằng phương pháp miễn dịch
Mơ hình này bao gồm q trình viêm hoại tử và xơ hóa qua trung gian tế
bào T tiến triển ở gan, có khả năng được kích hoạt bởi các yếu tố môi trường,
thất bại của dung nạp miễn dịch hay khuynh hướng di truyền.Để nghiên cứu sự
phát triển xơ gan được kích hoạt bởi một kích thích miễn dịch ban đầu, người ta
thường sử dụng huyết thanh dị chủng, chủ yếu là huyết thanh lợn, và ấu trùng
sán máng (Schistosomis mansoni).[44]
Mơ hình gây xơ gan bằng chế độ ăn uống
Một số chế độ ăn kiêng cụ thể, chẳng hạn như chế độ ăn thiết methionine
và choline, chế độ ăn giàu chất béo và chế độ ăn choline deficient – L – amino
acid, có thể được sử dụng để gây ra sự tiến triển của NAFLD. Tuy nhiên, các mơ
hình dựa trên chế độ ăn này khơng có những đặc điểm điển hình của bệnh lý ở
người, do đó hạn chế phép ngoại suy kết quả[12].
1.4

Cơ chế gây bệnh bằng carbon tetrachloride (CCl4)

Carbon tetrachloride (CCl4) là chất gây xơ hóa được sử dụng rộng rãi nhất
trong các nghiên cứu về xơ hóa gan và xơ gan ở động vật gặm nhấm. Mơ hình
gây xơ gan sử dụng CCl4 mang nhiều điểm tương đồng với quá trình hình thành
và phát triển xơ gan do tiếp xúc với các tác nhân độc hại trên người[12].
Trong cơ thể, CCl4 được chuyển hóa thành gốc tricholoromethyl (*CCl3)
bởi cytochrome P450 của hệ thống enzyme oxidase (MFOs). Gốc *CCl3 tạo
thành này phản ứng với axit nucleic, protein và lipid, do đó làm suy giảm các

.

11

.


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Sinh học

q trình tế bào quan trọng dẫn đến thay đổi chuyển hóa lipit va giảm lượng
protein.
Hơn nữa, sự hình thành các gốc trichloromethylperoxy (CCl3OO*) do sự
oxy hóa CCl3 tiếp tục khởi đầu q trình peroxy hóa lipit và phá hủy axit béo
khơng no. Do đó, tính thấm của màng trong tất cả các ngăn tế bào bị giảm và
quá trình tổn thương gan xảy ra đặc trưng bởi viêm, xơ hóa, xơ gan và ung thư
gan.[53]
Nhìn chung, khi sử dụng CCl4 xơ hóa thường phát triển rõ rệt sau 2-4 tuần
phơi nhiễm, xơ hóa ở mức độ nặng sau 5-7 tuần, xơ hóa thường được phát triển
sau 8-10 tuần phơi nhiễm. Xơ gan nốt nhỏ, tăng áp lực tĩnh mạch cửa, cổ trướng
thường xuất hiện sau 10-20 tuần. Tuy nhiên thời gian hình thành xơ hóa và tiến

triển thành xơ gan khác nhau tùy thuộc và liều lượng, đường dùng và động vật
thí nghiệm[35].

.

12

.


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Sinh học

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1

Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu
Chuột nhắt trắng dòng BALB/c thuần chủng 8-10 tuần tuổi, trọng lượng
xấp xỉ 20 gram, được cung cấp bởi Học viện Quân y. Chuột được nuôi trong
điều kiện 12 giờ sáng tối, cho ăn bằng thức ăn viên và uống nước sinh hoạt,
nhiệt độ và độ ẩm phù hợp.

Hình 1: Chuột nhắt trắng (BALB/c) 8-10 tuần tuổi
2.1.2 Vật liệu nghiên cứu
Dụng cụ
- Kim tiêm 1 ml
- Eppendorf 1,5 ml

- Ống falcon 15 ml, 50 ml
- Pipetman 1000 ml
- Đầu côn 1000 mcl
- Găng tay
.

13

.


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Sinh học
- Khẩu trang
- Bộ dụng cụ mổ: kéo, kẹp, ghim, …

Thiết bị
- Cân điện tử phân tích Presica 205A SCS
- Cân điện tử TE3102S Sartorius (Đức)
- Tủ lạnh -20οC, 4οC, -80οC
Hóa chất
- Carbon tetrachloride – CCl4 dạng lỏng: được cung cấp
bởi công ty Sigma (Hoa Kỳ)
- Dầu olive
2.1.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu
-

Địa điểm nghiên cứu: Viện nghiên cứu Y Dược học Quân sự – Học

viên Quân y
-

Thời gian nghiên cứu: từ tháng 6/2018 –4/2019

2.2

Nội dung nghiên cứu

-

Theo dõi thời gian gây xơ hóa gan trên chuột nhắt bằng cacbon

tetrachloride
-

Đánh giá các tổn thương cơ bản trên gan chuột nhắt bị xơ bởi

cacbon tetrachloride.
2.3

Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp gây dựng mơ hình
Nghiên cứu được tiến hành theo phương pháp thực nghiệm, tiến cứu, đánh
giá các chỉ tiêu nhằm tìm ra thời gian phù hợp gây ra tình trạng xơ gan trên
chuột.
Chuột nhắt trắng BALB/c được ni trong điều kiện phịng thí nghiệm,
khơng khí tự nhiên. Chia 12 con chuột làm 4 nhóm, mỗi nhóm 3 con
Nhóm 1T: tiêm dưới da CCl4 với liều 160mg/kg trong 1 tháng.

Nhóm 2T: tiêm dưới da CCl4với liều 160mg/kg trong 2 tháng.
.

14

.


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Sinh học

Nhóm 3T: tiêm dưới da CCl4 với liều 160mg/kg trong 3 tháng.
Nhóm ĐC: chuột được cho ăn uống bình thường
Chuột được tiêm dưới da CCl4 (pha trong dầu với tỉ lệ 1:18) 2 lần/1 tuần.
Chỉnh liều CCl4 trong quá trình tiêm để giảm tỷ lệ chết:
Trọng lượng chuột thay đổi 0-2 gam: giữ nguyên liều
Trọng lượng chuột tăng 2-4 gam: tăng liều đầu 0,01ml
Trọng lượng chuột tăng >5 gam: tăng liều đầu 0,02ml
Trọng lượng chuột giảm 2-4 gam: giảm liều đầu 0,01ml
Trọng lượng chuột giảm >5 gam: giảm bằng nửa liều đầu
Phương pháp tiêm dưới da

A

B

Hình 2: Cách tiêm dưới da
A: Cố định chuột

B: Tiêm phần dưới da đùi

Vị trí tiêm thường xuyên được thay đổi để chuột khơng có hiện tượng
viêm, hoại tử phần da tiêm.
2.3.2 Phương pháp đánh giá hiệu quả gây xơ gan và điều trị xơ gan
2.3.2.1

Đánh giá thay đổi trọng lượng, tình trạng tồn thân

Trọng lượng chuột được kiểm tra 2 lần/tuần bằng cân điện tử TE3102S
Sartorius (Đức) với độ chính xác 0,01 gram.
.

15

.


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Sinh học

Hình 3: Cân chuột
2.3.2.2

Xác định các chỉ số huyết học

Máu được lấy từ tĩnh mạch máu mắt, sau đó cho vào trong ống nghiệm có
chứa chất chống đơng máu và chất chống kết dính tiểu cầu.

Hình 4: Lấy máu mắt chuột
.

16

.