LẠI đức ANH NGHIÊN cứu THIẾT kế DE NOVO tìm KIẾM HOẠT CHẤT ức CHẾ PROTEIN 3a HƯỚNG điều TRỊ COVID 19 KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LẠI ĐỨC ANH
Mã sinh viên: 1601018

NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ DE NOVO TÌM
KIẾM HOẠT CHẤT ỨC CHẾ PROTEIN
3A HƯỚNG ĐIỀU TRỊ COVID-19
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
TS. Phạm Thế Hải
Nơi thực hiện:
Bộ mơn Hóa Dược

HÀ NỘI - 2021


Lời cảm ơn
Đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc và gửi lời cảm ơn chân thành tới
người thầy của tôi – TS. Phạm Thế Hải, giảng viên Bộ mơn Hóa Dược, Đại học Dược
Hà Nội – người thầy đã tận tâm hướng dẫn, chỉ bảo tôi từ những bước đi chập những
đầu tiên trên con đường nghiên cứu khoa học và trong suốt quãng thời gian tơi thực
hiện khóa luận. Thầy khơng những là người truyền cảm hứng khoa học cho tơi, mà thầy
cịn dạy cho tôi những kiến thức sâu rộng và phương pháp làm việc đầy hiệu quả, đưa
ra những lời khuyên rất hữu ích với tôi trong định hướng phát triển bản thân khi làm
nghiên cứu khoa học.
Tôi cũng vô cùng biết ơn và xin chân thành cảm ơn các thầy cô Bộ mơn Hóa
Dược đã ln tạo điều kiện thuận lợi cho tơi được nghiên cứu, học tập và hồn thành
khóa luận này.

Tơi xin cảm ơn gia đình và bạn bè, những người đã luôn ủng hộ tôi trên mọi con
đường tôi đã chọn, cũng là những người đã luôn sát cánh và cho tơi những góp ý chân
thành trong q trình hồn thiện khóa luận.
Cuối cùng, tơi xin cảm ơn tới Ban giám hiệu cùng tồn thể các thầy cơ giáo
Trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo điều kiện giúp tơi hồn thành q trình
học tập cũng như hồn thiện q trình bảo vệ khóa luận này.

Hà Nội, ngày 01 tháng 06 năm 2021
Sinh viên

Lại Đức Anh


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT ................................................................... 4
DANH MỤC CÁC BẢNG............................................................................................. 6
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ....................................................................................... 7
ĐẶT VẤN ĐỀ................................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ......................................................................................... 2
1.1. Tổng quan về kênh protein 3a của vi rút SARS-CoV-2 ..................................2
1.1.1. Nguồn gốc và bộ gen vi rút SARS-CoV-2 .......................................................2
1.1.2. Trình tự và cấu trúc của protein 3a của SARS-CoV-2 ...................................3
1.1.3. Vai trò của kênh ion đối với vi rút ..................................................................4
1.1.4. Tiềm năng của sự ức chế kênh ion vi rút ........................................................5
1.1.5. Các phương pháp tiếp cận ứng phó với đại dịch COVID-19 .........................6
1.1.6. Các phương pháp tiếp cận để khám phá thuốc chống coronavirus ...............8
1.2. Tổng quan về phương pháp nghiên cứu De novo ............................................9
1.2.1. Đại cương về thiết kế thuốc De novo ..............................................................9
1.2.2. Quy trình thiết kế thuốc De novo ..................................................................10
CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP ... 14

2.1. Nguyên liệu và thiết bị ......................................................................................14
2.2. Nội dung nghiên cứu .........................................................................................14
2.3. Phương pháp nghiên cứu..................................................................................14
2.3.1. Quy trình thực hiện nghiên cứu ....................................................................14
2.3.2. Xác định vị trí tương tác trên thụ thể............................................................14
2.3.3. Xây dựng cấu trúc phân tử mới ....................................................................15
2.3.4. Đánh giá phân tử mới ...................................................................................19
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN................................................................. 21
3.1. Xác định vị trí tương tác trên thụ thể .............................................................21
3.1.1. Phân tích trình tự protein 3a của SARS-CoV-2 ............................................21
3.1.2. Phân tích cấu trúc khơng gian ba chiều kênh protein 3a của SARS-CoV-2 22
3.2. Xây dựng cấu trúc phân tử mới .......................................................................26
3.2.1. Chuẩn bị cơ sở dữ liệu phân mảnh cấu trúc.................................................26


3.2.2. Xác định các mảnh cấu trúc chính ...............................................................26
3.2.3. Liên kết các mảnh cấu trúc thành phân tử hoàn chỉnh ................................31
3.3. Đánh giá phân tử mới .......................................................................................32
3.4. Bàn luận .............................................................................................................35
3.4.1. Cơ sở dữ liệu phân mảnh ..............................................................................35
3.4.2. Chuẩn hóa điểm docking bằng giá trị p .......................................................35
3.4.3. Ưu điểm của phương pháp ...........................................................................36
3.4.4. Nhược điểm của phương pháp ......................................................................36
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................... 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................... 39
PHỤ LỤC ..................................................................................................................... 48


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT
SARS-CoV-2

Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (Vi rút gây hội
chứng hơ hấp cấp tính nghiêm trọng coronavirus 2)

SARS-CoV

Severe acute respiratory syndrome coronavirus

MERS-CoV

Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (Vi rút gây hội
chứng hơ hấp cấp tính Trung Đông)

COVID-19

Bệnh do coronavirus gây ra năm 2019

ORF

Open reading frame (Khung đọc mở)

WHO

The World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới)

FDA

Food and Drug Administration (Cơ Quan Quản lý Thực phẩm
và Dược phẩm Hoa Kỳ)

QSAR

Quantitative Structure–Activity Relationship (Tương quan định
lượng cấu trúc – tác dụng)

ADMET

Absorption, Distribution, Metabolism, Excretion, and Toxicity
(hấp thu, phân bố, chuyển hóa, thải trừ và độc tính)

BLAST

The Basic Local Alignment Search Tool (Cơng cụ tìm kiếm căn
chỉnh cục bộ cơ bản)

RECAP

Retrosynthetic Combinatorial Analysis Procedure (Quy trình
phân tích kết hợp tái tổ hợp)

SMILE

The simplified molecular-input line-entry system (Hệ thống
nhập đầu vào phân tử theo dòng đơn giản)

TPSA

Topological Polar Surface Area (Diện tích bề mặt phân cực)

TM

Transmembrane (vùng xuyên màng)

Gln

Glutamin

Pro

Prolin

Cys

Cystein

Val

Valin

Phe

Phenylalanin

Leu

Leucin

Ser

Serin

Lys

Lysin

His

Histidin


Arg

Arginin

Tyr

Tyrosin

Ile

Isoleucin

Asp

Axít aspartic

Ala

Alanin

Asn

Asparagin

Thr

Threonin

Met

Methionin

IC50

The half maximal inhibitory concentration (Nồng độ ức chế
50%, thường dùng đối với các chất ức chế protein, chất đối vận
thụ thể,…)

pKd

Giá trị âm của Logarit của hằng số liên kết

R2

Hệ số tương quan tuyến tính

Å

Angstrom (Đơn vị đo khoảng cách, chiều dài liên kết)

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1. Các miền gắn thuốc trên kênh protein 3a SARS-CoV-2 ...............................25
Bảng 3.2. Thông số hai trung tâm tương tác với phối tử tại khoang lớn và các đường
hầm ................................................................................................................................26
Bảng 3.3. Các thông số về thư viện mảnh cấu trúc ......................................................26
Bảng 3.4. Năm cấu trúc phân mảnh tối ưu nhất. ..........................................................28
Bảng 3.5. Các thông số của năm mơ hình giá trị p của phân mảnh .............................31


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Trang
Hình 1.1. Sắp xếp bộ gen của SARS-CoV-2....................................................................2
Hình 1.2. Cấu trúc các nếp gấp β dạng bánh kẹp (beta-sandwich) của protein 3a SARSCoV-2. ..............................................................................................................................4
Hình 1.3. Các phương pháp tiềm năng điều trị SARS-CoV-2. .......................................7
Hình 1.4. Quy trình tổng quát của thiết kế thuốc De novo ...........................................11
Hình 2.1. Quy trình thực hiện nghiên cứu ....................................................................15
Hình 2.2. Quy trình docking để thu điểm docking hoạt tính và điểm docking mồi nhử.
.......................................................................................................................................17
Hình 2.3. Mơ hình liên kết của thuật tốn CAVEAT ....................................................19
Hình 3.1. So sánh trình tự của kênh ion protein 3a của SARS-CoV-2 với các protein
tương đồng. ....................................................................................................................21
Hình 3.2. Phần ngoại bào trong cấu trúc protein 3a của SARS-CoV-2 .......................23
Hình 3.3. Đường hầm trên và đường hầm dưới của kênh protein 3a SARS-CoV-2 .....24
Hình 3.4. Năm khu vực tối ưu với các phân mảnh cấu trúc trên protein. ....................27
Hình 3.5. Phân bố điểm docking hoạt tính của năm phân mảnh..................................29
Hình 3.6. Phân phối tích lũy và logarit của nó đối với điểm docking mồi nhử............30
Hình 3.7. 5 phân mảnh sau quá trình lấy mẫu cùng với điểm số (Score) và giá trị p..31
Hình 3.8. Các đặc điểm của 67 hợp chất thiết kế mới. .................................................32

Hình 3.9. Cấu trúc các mảnh hợp chất thiết kế ............................................................33
Hình 3.10. Độ sai lệch của hai mảnh khởi đầu sau quá trình docking. .......................33
Hình 3.11. Tương tác của hợp chất thiết kế với protein ...............................................34


ĐẶT VẤN ĐỀ
Bùng phát vào cuối tháng 12/2019, bắt nguồn từ một chợ hải sản ở Hồ Nam, Vũ
Hán, miền Trung Trung Quốc, vi rút Corona (gọi tắt là SARS-CoV-2) ban đầu được xác
nhận là nguyên nhân gây ra một loại bệnh “viêm phổi lạ” hoặc “viêm phổi không rõ
nguyên nhân” [43, 106]. Chỉ sau 100 ngày xuất hiện, bệnh viêm đường hơ hấp cấp do
SARS-CoV-2 (COVID-19) đã nhanh chóng lây lan ra các khu vực Châu Á, Châu Âu,
Mỹ La tinh,… và trở thành đại dịch toàn cầu [69]. Tính đến tháng 5 năm 2021, thế giới
đã có hơn 150 triệu ca nhiễm SARS-CoV-2 và hơn 3 triệu ca tử vong liên quan đến bệnh
này [1]. Trong tình hình đó, vắc xin chống lại SARS-CoV-2 được xem là phương pháp
hiệu quả nhằm ngăn ngừa sự lây lan của bệnh dịch [56]. Tuy nhiên vắc xin cho SARSCoV-2 hiện nay đang phải đối mặt với những thách thức lớn như: điều kiện bảo quản
nghiêm ngặt, mức độ hiệu quả đối với các nhóm độ tuổi khác nhau, thời gian duy trì
miễn dịch, sự gia tăng của các biến chủng mới kháng vắc xin,… Phát triển phác đồ điều
trị bằng thuốc cũng hứa hẹn là hướng đi tiềm năng trong cuộc chiến chống COVID-19.
Hàng tram nghiên cứu đã được thực hiện với mục tiêu xác định ứng viên thành thuốc
mới có tác dụng ức chế SARS-CoV-2. Nhìn chung, khám phá thuốc chống lại
coronavirus là một quá trình tốn kém cả về thời gian và tiền bạc. Nhằm tiết kiệm và
nâng cao hiệu quả tìm kiếm, các phương pháp thiết kế thuốc với sự hỗ trợ của công nghệ
thông tin (Computer-Aided Drug Design) đang ngày càng được áp dụng rộng rãi [89].
Trong đó thiết kế De novo là một trong những phương pháp được ứng dụng phổ biến
hiện nay. Thiết kế thuốc De novo là một kỹ thuật tính tốn trong đó cấu trúc phân tử
thuốc với các đặc tính dược lý mong muốn được tạo ra từ những nguyên tử hoặc mảnh
cấu trúc đầu tiên. Từ những ưu điểm của phương pháp này chúng tôi tiến hành “Nghiên
cứu thiết kế De novo tìm kiếm hoạt chất ức chế protein 3a hướng điều trị COVID-19”
với các mục tiêu chính là:
1. Thiết kế các phân tử nhỏ có khả năng ức chế kênh protein 3a hướng điều trị

COVID-19.
2. Xây dựng cơ sở dữ liệu phân mảnh cấu trúc có khả năng tổng hợp hóa học trở
thành thuốc.
3. Xây dựng phương pháp chuẩn hóa điểm số docking để làm giảm tỷ lệ dương tính
giả trong thiết kế de novo.

1


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về kênh protein 3a của vi rút SARS-CoV-2
1.1.1. Nguồn gốc và bộ gen vi rút SARS-CoV-2
Coronavirus thuộc họ Coronaviridae có khả năng gây nhiễm trùng đường hô hấp
với các triệu chứng từ nhẹ như cảm lạnh thơng thường đến các triệu chứng cấp tính: ho,
sốt, khó thở, có thể diễn biến đến viêm phổi nặng, suy hô hấp cấp tiến triển và tử vong,
đặc biệt ở những người lớn tuổi, người có bệnh mạn tính và suy giảm miễn dịch [21].
Một số nghiên cứu chỉ ra rằng, coronavirus đã tiến hóa đến trạng thái gây bệnh hiện tại
thông qua chọn lọc tự nhiên trong vật chủ khơng phải là người và sau đó truyền sang
người [30]. Chủng coronavirus hiện tại được phát hiện vào năm 2019 được gọi chính
thức là vi rút gây bệnh viêm đường hơ hấp cấp tính coronavirus-2 (SARS-CoV-2) thuộc
chi Betacoronavirus. Nó được cho là có nguồn gốc từ động vật hoang dã tại chợ Huanan
ở Vũ Hán và lây sang người [106]. Dơi và tê tê là những động vật có khả năng là vật
chủ truyền bệnh SARS-CoV-2 dựa trên so sánh trình tự với vi rút được phân lập từ bệnh
nhân nhiễm SARS-CoV-2 [12, 47].

Hình 1.1. Sắp xếp bộ gen của SARS-CoV-2
Nhìn chung cấu trúc của SARS-CoV-2 vẫn mang đặc trưng của các chủng
coronavirus với vỏ bọc gồm nhiều gai trên bề mặt và sở hữu bộ gen ARN khơng phân
đoạn, sợi đơn dương tính với đầu 5’ và đi 3’ poly-A cho phép nó hoạt động như
mARN chức năng để tổng hợp dịch mã các polyprotein sao chép [102]. Cấu trúc di

truyền của SARS-CoV-2 bao gồm 13-15 khung đọc mở (ORF) chứa khoảng 30.000
nucleotit. Toàn bộ bộ gen của SARS-CoV-2 mã hóa khoảng 7.096 acid amin bao gồm
2


nhiều protein cấu trúc và protein không cấu trúc [62]. Thành phần nucleotit của bộ gen
vi rút chủ yếu do hai protein không cấu trúc ORF1a và ORF1b nắm giữ, sau đó là các
protein cấu trúc khác nhau như protein bề mặt (S), protein vỏ (E), protein màng (M) và
nucleocapsid (N) (Hình 1.1). Ngoài ra, các gen cấu trúc mã hóa chín protein phụ, được
mã hóa bởi các gen ORF3a, ORF3d, ORF6, ORF7a, ORF7b, ORF8, ORF9b, ORF14 và
ORF10 [63]. Các gen này đóng vai trị quan trọng trong việc xâm nhập, dung hợp và tồn
tại của vi rút trong tế bào vật chủ [92].
Sự sắp xếp di truyền của SARS-CoV-2 rất giống với SARS-CoV và vi rút gây
hội chứng hô hấp cấp tính Trung Đơng (MERS-CoV) [55, 75]. Bộ gen của SARS-CoV2 cho thấy 79% và 50% tương ứng giống với SARS-CoV và MERS-CoV [47]. Các
nghiên cứu đã chứng minh rằng diễn biến lâm sàng của SARS-CoV và MERS-CoV rất
giống nhau, và SARS và MERS có thể có chế bệnh sinh tương tự nhau [22]. Trình tự bộ
gen của SARS-CoV-2 cho thấy một số điểm tương đồng với cả SARS-CoV và MERSCoV chứng minh rằng vòng đời và khả năng gây bệnh của các chủng vi rút này có thể
tương đồng với nhau. Đáng chú ý, SARS-CoV-2 có khả năng gây bệnh thấp hơn SARSCoV nhưng khả năng lây truyền từ người sang người cao hơn [51].
1.1.2. Trình tự và cấu trúc của protein 3a của SARS-CoV-2
Bộ gen SARS-CoV-2 mã hóa ba kênh ion vi rút (viroporin) đó là protein vỏ (E)
và các khung đọc mở ORF3a, ORF8a [59]. Vùng gen ORF3a chứa trình tự mã hóa cho
nhiều khung đọc mở và thể hiện tính đa dạng cao giữa các chủng coronavirus so với các
vùng lân cận [19]. Tuy nhiên, trình tự của protein 3a được bảo tồn rất cao trong phân
chi Sarbecovirus thuộc chi Betacoronavirus bao gồm SARS-CoV và các coronavirus
SARS phân lập từ dơi [3]. Trình tự của protein 3a SARS-CoV-2 cho thấy tương đồng
tới 72% so với trình tự được ghi nhận từ SARS-CoV [104]. Người ta đã tìm thấy trong
huyết tương bệnh nhân SARS-CoV và SARS-CoV-2 chứa kháng thể kháng protein 3a
[95]. Trình tự của protein 3a được chia thành sáu vùng chức năng I đến VI, trong đó
vùng III đảm nhiệm vai trị chính trong việc hình thành kênh cation, đột biến trong vùng
này được chứng minh làm mất vai trò kênh ion của SARS-CoV [10]. Chức năng và các

đột biến protein 3a của SARS-CoV-2 so với SARS-CoV được thể hiện trong phụ lục 1.
Nghiên cứu trước đây đã chỉ ra protein 3a của SARS-CoV-2 là một viroporin loại
IIIA, bao gồm ba xoắn alpha xuyên màng kết nối với một miền nhiều nếp gấp beta [40].
Mỗi tiểu đơn vị (monomer) bao gồm một đầu N nằm ở ngoại bào, miền xuyên màng và
3


một đầu C nội bào. Phần lớn protein 3a tồn tại dưới dạng hai tiểu đơn vị kết hợp 62 kDa
(dimer) và khoảng 10-30% tồn tại ở dạng bốn tiểu đơn vị kết hợp 124 kDa (tetramer) để
hình thành một kênh ion nhạy cảm với canxi [44].

Hình 1.2. Cấu trúc các nếp gấp β dạng bánh kẹp (beta-sandwich) của protein 3a
SARS-CoV-2.
Protein 3a có chiều dài khoảng 70 Å với vùng xuyên màng cao 40 Å và vùng nội
bào kéo dài 30 Å. Vùng xuyên màng bao gồm ba vòng xoắn (TM1, TM2 và TM3) trên
mỗi tiểu đơn vị, Các vòng xoắn xuyên màng sắp xếp theo chu vi một hình elip với TM13 của một tiểu đơn vị, tiếp theo là TM1-3 của tiểu đơn vị thứ hai theo chiều kim đồng
hồ. TM1 và TM2 định vị theo trục nhỏ của hình elip với TM3 được đặt tại các đỉnh trục
chính. Liên kết giữa TM1 và TM2, TM2 và TM3 được tạo thành bởi các vòng (loop)
ngắn tương ứng nằm tại nội bào và ngoại bào. Vùng xuyên màng kết nối với vùng nội
bào thơng qua mơ típ turn-helix-turn với TM3. Mỗi chuỗi tiểu đơn vị tạo thành một cặp
các nếp gấp β đối lập với nhau trong một dạng bánh kẹp (beta-sandwich) gồm 8 nếp gấp
(Hình 1.2). Nếp gấp bên ngoài được tạo thành bởi các nếp gấp β1, β2, β6 và nửa đầu N
của β7. Nếp gấp bên trong được tạo thành bởi các nếp gấp β3, β4, β5, β8 và một nửa
đầu C của β7. Sự tương tác giữa các beta-sandwich từ mỗi tiểu đơn vị tạo thành một liên
kết bền vững và bền vững giữa các tiểu đơn vị trong cấu trúc dimer [44].
1.1.3. Vai trò của kênh ion đối với vi rút
Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng một số chủng vi rút mã hóa cho các kênh
chọn lọc ion gắn vào màng của tế bào bị nhiễm và việc kích hoạt các kênh như vậy
dường như tham gia vào quá trình lắp ráp và giải phóng vi rút [32, 52]. Do đó sự ức chế
4

kích hoạt kênh ion sẽ chống lại sự sản sinh vi rút, điều này có thể cho phép cơ thể bị
nhiễm bệnh xây dựng hoặc tăng cường hệ thống miễn dịch của chính bệnh nhân. Các
nghiên cứu trước đây đã chứng minh protein 3a của SARS-CoV được cho là có liên
quan đến con đường kích hoạt phản ứng viêm, gây hoại tử tế bào và chết theo chương
trình của tế bào (apoptosis) [10, 88, 107]. Trong khi đó, gần đây người ta phát hiện ra
protein 3a của SARS-CoV-2 có liên quan đến quá trình chết theo chương trình và ức
chế sự tự thực bào (autophagy) trong môi trường in vitro [73]. Như đã trình bày ở phần
trên, ORF3a của SARS-CoV-2 mã hóa cho một kênh ion khơng chọn lọc với canxi. Tính
thấm canxi của protein 3a được quan tâm đặc biệt trong trường hợp nhiễm trùng. Dòng
canxi do protein 3a tạo ra có thể là cơng tắc kích hoạt q trình apoptosis và caspase phụ
thuộc vào canxi [44]. Các nghiên cứu trước đây cho thấy biểu hiện kênh protein 3a của
SARS-CoV và tín hiệu canxi trong các tế bào phổi bị nhiễm bệnh đóng vai trị quan
trọng trong q trình duy trì cân bằng nội mơi đường thở [26, 109]. Do đó, sự biểu hiện
của một kênh thẩm thấu canxi như protein 3a của SARS-CoV-2 có thể ảnh hưởng đến
cân bằng nội môi của phổi và cơ chế bệnh sinh của COVID-19.
Đáng chú ý, apoptosis là một chương trình chết của tế bào và đã được công nhận
là một cơ chế bảo vệ tế bào quan trọng chống lại vi rút để kiểm soát sự lây nhiễm và
điều chỉnh phản ứng viêm [4, 5]. Người ta đã chứng minh rằng protein 3a của SARSCoV-2 gây ra hoạt động apoptosis ở mức độ thấp hơn so với SARS-CoV và sự khác biệt
trong cơ chế pro-apoptotic góp phần vào sự khác biệt về khả năng gây bệnh giữa hai
chủng coronavirus này [73]. Những đặc tính này có thể mang lại những lợi thế nhất định
cho SARS-CoV-2 trong đó bệnh nhân có triệu chứng nhiễm trùng nhẹ hơn hoặc thậm
chí khơng có triệu chứng trong giai đoạn đầu và do đó cho phép vi rút lây lan rộng hơn.
1.1.4. Tiềm năng của sự ức chế kênh ion vi rút
Kênh ion là một trong ba loại protein được coi là đích phổ biến của các loại thuốc
được FDA chấp thuận [64]. Các chất điều biến viroporin đã được chứng minh là thành
công trong điều trị, điển hình là các chất ức chế kênh proton M2 của vi rút cúm A [81,
86, 90]. Một số nghiên cứu đã chứng minh nếu ức chế các kênh ion của vi rút có thể ức
chế sự sinh sản của vi rút đó [58, 103]. Các nghiên cứu khác cũng chỉ ra rằng ức chế

kênh protein 3a có thể ngăn chặn sự giải phóng vi rút [57, 85]. Trong mơ hình chuột
nhiễm SARS-CoV, việc xóa bỏ bộ gen của ORF3a làm giảm tính di động của vi rút [9].

5


Nồng độ thấp của emodin anthraquinone có thể ức chế hoạt động của kênh protein
3a của SARS-CoV với giá trị IC50 chỉ 20 µM và cũng ức chế giải phóng vi rút với độ
nhạy tương tự từ các tế bào bị nhiễm [85]. Hexamethylene amiloride ức chế kênh ion
protein E và ức chế sự nhân lên của coronavirus [100]. Flavonol kaempferol thể hiện sự
ức chế rõ ràng dòng điện qua trung gian protein 3a. Các glycosid kaempferol thậm chí
cịn ức chế mạnh hơn, gợi ý tầm quan trọng của phần đường gắn vào các phân tử
flavonoid. Ngoài hiệu quả cao hơn, các glycosid flavonoid còn cho thấy khả năng hòa
tan tốt hơn trong nước nên hoạt tính sinh học cao hơn [84].
Tháng 06 năm 2020, cấu trúc tinh thể kênh protein 3a của SARS-CoV-2 đầu tiên
được công bố trên ngân hàng dữ liệu protein (Protein Data Bank –
[44]. Sự xuất hiện của cấu trúc tinh thể cho mục tiêu đã mang lại
cái nhìn sâu sắc về chức năng và cung cấp nền tảng cho quá trình thiết kế các hợp chất
dẫn đường hoặc kháng thể trung hòa theo nguyên lý thiết kế thuốc theo cấu trúc
(structure-based drug design).
1.1.5. Các phương pháp tiếp cận ứng phó với đại dịch COVID-19
Hội chứng hơ hấp cấp tính nghiêm trọng coronavirus 2 (SARS-CoV-2) đã lây
nhiễm cho hơn 150 triệu người trên toàn cầu, với hơn 3 triệu ca tử vong được WHO ghi
nhận tính đến ngày 2 tháng 5 năm 2021 [1]. Khả năng lây nhiễm cao của nó, kết hợp với
tính nhạy cảm của quần thể chưa tiếp xúc với một loại vi rút mới đã tạo điều kiện cho
sự lây lan nhanh chóng trong cộng đồng. Tỷ lệ tử vong do nhiễm trùng của SARS-CoV2 cao hơn nhiều lần so với bệnh cúm theo mùa và nhiễm trùng có thể dẫn đến di chứng
dai dẳng, kể cả ở những người trẻ tuổi tiền sử khỏe mạnh (được gọi là COVID dài) [54,
93]. Hiện nay chưa rõ khả năng miễn dịch bảo vệ kéo dài bao lâu và giống như các loại
coronavirus theo mùa khác, SARS-CoV-2 có khả năng tái nhiễm những người đã mắc
bệnh, nhưng tần suất tái nhiễm vẫn chưa được biết rõ [14, 66]. Việc lây truyền vi rút có

thể được giảm thiểu thơng qua hạn chế tiếp xúc, sử dụng khẩu trang, vệ sinh tay và
đường hô hấp, tránh tụ tập đơng người. Truy vết nhanh chóng, theo dõi tiếp xúc và cách
ly tập trung cũng rất quan trọng để kiểm soát việc lây nhiễm. Một số quốc gia đã thiết
lập các lệnh hạn chế để làm chậm sự lây lan nhanh chóng của vi rút, điều này rất cần
thiết để giảm tỷ lệ tử vong, ngăn chặn các dịch vụ chăm sóc sức khỏe bị quá tải và dành
thời gian để thiết lập các hệ thống ứng phó khẩn cấp với đại dịch [23, 33]. Tuy nhiên
việc đóng cửa và các lệnh hạn chế đã gây ra nhiều xáo trộn, ảnh hưởng đáng kể đến sức
6


khỏe tinh thần và thể chất của người dân, gây hại cho nền kinh tế, hậu quả là giảm sút
lòng tin và giảm tuân thủ. Điều này dẫn đến sự gia tăng trở lại các ca mắc SARS-CoV2 ở phần lớn Châu Âu, Hoa Kỳ, Ấn Độ và nhiều quốc gia khác trên thế giới với các làn
sóng COVID-19 thứ hai, thứ ba, thứ tư,…

Hình 1.3. Các phương pháp tiềm năng điều trị SARS-CoV-2.
(A) ức chế sự kết hợp hoặc xâm nhập của vi rút; gián đoạn sự nhân lên của vi rút; ức
chế phản ứng viêm quá mức. (B) điều trị huyết tương hồi phục. (C) Vắc xin. (D) Kết hợp
của y học cổ truyền và thuốc hiện đại. (hình ảnh được trích từ nghiên cứu của Haiou Li
và cộng sự [50])
Sự lây lan nhanh chóng của SARS-CoV-2 đã dẫn đến yêu cầu cấp thiết về các
chiến lược điều trị hiệu quả chống lại chủng vi rút này. Do sự bùng phát đột ngột của
COVID-19, cộng đồng khoa học và các chuyên gia y tế đang không ngừng cố gắng nắm
bắt sinh lý bệnh và quản lý điều trị nhưng cho đến nay vẫn chưa có bất kì phương pháp
điều trị đặc hiệu nào cho căn bệnh này, phần lớn các phác đồ điều trị cho bệnh nhân mắc
COVID-19 dựa trên kinh nghiệm của các bác sĩ lâm sàng [50]. Các nghiên cứu gần đây
đã chỉ ra nhiều lựa chọn điều trị hiệu quả tốt, ngay cả khi một số điều trị trong đó vẫn
cịn phải chờ xác nhận thêm trong các mơ hình tiền lâm sàng và thử nghiệm lân sàng
7

nghiêm ngặt (tóm tắt trong Hình 1.3). Tất cả các liệu pháp được sử dụng hiện nay đều
tập trung vào các biến chứng do COVID-19 tạo ra và giúp bệnh nhân giảm triệu chứng
từ những kiến thức trước đây. Các lựa chọn điều trị hiện nay được chia làm 4 nhóm
chính:
A) nhóm tác động lên q trình sinh lý bệnh của vi rút bao gồm ức chế sự kết
hợp/xâm nhập SARS-CoV-2, ức chế sao chép của SARS-CoV-2, ức chế phản ứng viêm
quá mức;
B) sử dụng huyết tương của các bệnh nhân đã hồi phục;
C) vắc xin;
D) kết hợp giữa y học cổ truyền và thuốc hiện đại.
Với sự lây lan toàn cầu của SARS-CoV-2, tiêm chủng được đánh giá là phương
pháp hiệu quả và tiết kiệm chi phí nhất để ngăn ngừa và kiểm soát COVID-19 [56]. Các
nỗ lực nghiên cứu mạnh mẽ đang được tiến hành để tạo điều kiện phát triển vắc xin
chống lại SARS-CoV-2. Tuy nhiên việc phát triển vắc xin là một quá trình rất dài và tốn
kém. Bên cạnh đó, chúng ta cũng phải đối mặt với những thách thức to lớn trong việc
sản xuất, phân phối, bảo quản và tiêm chủng vắc xin trên quy mô rộng lớn.
Bên cạnh liệu pháp điều trị bằng vắc xin, việc phát triển phác đồ điều trị bằng
thuốc cũng hứa hẹn là con đường tiềm năng để điều trị cho các bệnh nhân mắc COVID19 đơn giản, hiệu quả và dài hạn.
1.1.6. Các phương pháp tiếp cận để khám phá thuốc chống coronavirus
Bất hoạt vi rút hiện nay là trọng tâm của phương pháp tiếp cận để điều trị cho các
bệnh nhân nhiễm SARS-CoV-2. Quá trình tìm kiếm thuốc chủ yếu đang tập trung vào
các đích protein gai (spike), protease chính và các ARN polymerase. Các mục tiêu này
có chức năng được xác định rõ ràng, ví dụ như các protein gai có cơ chế trung hịa các
kháng thể trong huyết thanh bệnh nhân. Tuy nhiên, việc mở rộng phạm vi mục tiêu của
thuốc chống lại SARS-CoV-2 có thể đẩy nhanh quá trình khám phá chiến lược điều trị
và tăng tính đa dạng của các loại thuốc hiện có để giảm thiểu sự phát triển tiềm tàng của
các chủng vi rút kháng thuốc [36].
Nhìn chung, có ba cách tiếp cận chính để phát hiện và lựa chọn thuốc điều trị cho
các chủng coronavirus gây bệnh trước đây – gồm có SARS-CoV và MERS-CoV [110].
Các phương pháp tiếp cận tương tự cũng được thực hiện đối với SARS-CoV-2 gây bệnh

hiện tại. Cách tiếp cận đầu tiên là thử nghiệm các tác nhân kháng vi rút phổ rộng (chủ
8


yếu là thuốc) đã được sử dụng hoặc thử nghiệm trước đó đối với các bệnh truyền nhiễm
vi rút khác. Một số loại thuốc được xác định thông qua các phương pháp này trong hai
đợt dịch trước – SARS và MERS – bao gồm ribavirin, Interferon-α, β, và γ [11, 15, 28].
Một cách tiếp cận tương tự đối với đại dịch hiện tại cũng đã xác định được các tác nhân
kháng vi rút như remdesivir, lopinavir/ritonavir, favipiravir. Một ưu điểm đáng kể của
cách tiếp cận này là dược lực học, dược động học, độc tính, liều lượng của các loại thuốc
đã được nghiên cứu kĩ lưỡng, do đó giảm thời gian đáng kể trong quá trình khám phá
thuốc. Tuy nhiên nhược điểm của cách tiếp cận này là khơng có tác dụng mạnh và chọn
lọc trên SARS-CoV-2. Cách tiếp cận thứ hai để khám phá thuốc chống coronavirus liên
quan đến sàng lọc các thư viện hóa học chứa một số lượng lớn các hợp chất (hay còn
gọi là sàng lọc in silico). Có thể thực hiện sàng lọc ảo nhanh, thông lượng cao (highthroughput virtual screening – HTVS) một số lượng lớn các hợp chất thông qua cách
tiếp cận này, hợp chất mới có thể được xác nhận thêm bằng cách xét nghiệm kháng vi
rút phù hợp. Vấn đề chính liên quan đến cách tiếp cận này là, mặc dù các hợp chất được
xác định có hoạt tính kháng vi rút, chúng có liên quan đến một số tác dụng không mong
muốn của thuốc. Cách tiếp cận thứ ba và cũng là cách tiếp cận được sử dụng trong khóa
luận này là thiết kế De novo, phương pháp này phát triển các chất có hoạt tính dựa trên
sự hiểu biết về sinh lý và gen của các coronavirus riêng lẻ. Các ví dụ bao gồm sự phát
triển của các peptit kháng vi rút nhắm vào các protein gai, sự phát triển của các chất ức
chế mới nhắm mục tiêu vào các enzym vi rút, sự phát triển của các chất ức chế nhắm
vào các protease của tế bào chủ, sự phát triển của kháng thể đơn dòng (MAbs) [7, 8,
108]. Về mặt lý thuyết, cách tiếp cận này sẽ dẫn đến các hợp chất có hoạt tính mạnh,
phù hợp với đích do đó tăng tính chọn lọc và giảm các tác dụng phụ không mong muốn
của thuốc.
1.2. Tổng quan về phương pháp nghiên cứu De novo
1.2.1. Đại cương về thiết kế thuốc De novo
Quá trình phát triển một loại hoạt chất mới, sau đó thử nghiệm, đánh giá và cho

phép nó trở thành một thuốc lưu hành trên thị trường là một quá trình tốn kém và dễ bị
thất bại [45]. Việc phát hiện ra các hợp chất mới với hoạt tính sinh học mong muốn là
trọng tâm thúc đẩy rất nhiều nghiên cứu khám phá thuốc mới được thực hiện [31]. Do
đó, việc thiết kế các cấu trúc phân tử mới có tiềm năng để phát triển thành thuốc để tổng
hợp và đưa vào thử nghiệm in vitro và in vivo là nút thắt cho quá trình nghiên cứu thuốc
9


mới nói riêng cũng như ngành cơng nghiệp dược nói chung. Những tiến bộ trong phương
pháp sàng lọc thông lượng cao (high throughput screening) cho phép sàng lọc được các
thư viện chứa hàng triệu hợp chất hóa học đã nâng cao đáng kể việc phát hiện và phát
triển các ứng cử viên thuốc tiềm năng [77]. Tuy nhiên trong hơn hai thập kỉ qua, mới
chỉ một phần nhỏ không gian hóa học được lấy mẫu trong q trình tìm kiếm các ứng
viên thuốc mới.
Sự bùng nổ của dữ liệu gen sau giải mã và các cấu trúc tinh thể ba chiều của các
protein trị liệu (thụ thể/đích) đã thúc đẩy việc khám phá các phân tử nhỏ có ý nghĩa về
mặt sinh học. Đặc biệt, ứng dụng các phương pháp thiết kế thuốc dưới sự hỗ trợ của
máy tính trở thành một hướng đi quan trọng trong việc phát triển các lựa chọn điều trị
mới [16, 89]. Các phương pháp này bao gồm thiết kế thuốc dựa trên cấu trúc, ví dụ như
ghép nối phân tử (docking), mơ phỏng động lực học phân tử,… và thiết kế thuốc dựa
trên phối tử, ví dụ như mơ hình định lượng liên quan cấu trúc-tác dụng (QSAR), dự đoán
hấp thụ, phân bố, chuyển hóa, thải trừ và độc tính (ADMET) in silico, mơ hình
pharmacophore. Tuy nhiên sự phức tạp của các con đường bệnh sinh ở người và sự
không chắc chắn liên quan đến phương pháp điều trị mới, đòi hỏi sự phát triển của các
phương pháp chặt chẽ hơn để khám phá khơng gian hóa học khổng lồ và tạo điều kiện
xác định các cấu trúc phân tử mới để được tổng hợp [78]. Từ đầu những năm 1990,
phương pháp thiết kế thuốc “de novo” đã được phát triển và ngày càng được ứng dụng
phổ biến cho tới hiện nay [61].
Thiết kế thuốc De novo đề cập đến việc thiết kế các cấu trúc hóa học mới phù
hợp với tập hợp các ràng buộc bằng cách sử dụng các thuật toán [80]. Từ “de novo”

trong tiếng Latin có nghĩa là “từ đầu”, chỉ ra rằng, với phương pháp này người ta có thể
tạo ra các phân tử mới mà không cần khuôn mẫu ban đầu [24]. Ưu điểm của thiết kế
thuốc De novo nằm ở khả năng khám phá khơng gian hóa học rộng hơn, cho phép thiết
kế các hợp chất hoàn toàn mới, giúp cải tiến và phát triển các ứng cử viên thành thuốc
một cách rất hiệu quả về chi phí và thời gian. Thách thức lớn nhất khi thiết kế de novo
là tính khả thi khi tổng hợp các cấu trúc phân tử được tạo ra và tỷ lệ dương tính giả khá
cao [79].
1.2.2. Quy trình thiết kế thuốc De novo
Thiết kế thuốc De novo tạo ra các cấu trúc hóa học mới chỉ dựa trên thơng tin
liên quan đến mục tiêu sinh học (thụ thể) hoặc các phối tử có hoạt tính đã biết của nó
10


(các chất có hoạt tính liên kết hoặc ức chế đối với thụ thể) [70, 76]. Cho đến nay, chưa
có bất kì một chất ức chế nào được chứng minh có hoạt tính trên kênh protein 3a của
SARS-CoV-2, do đó chúng tôi tập trung vào thiết kế thuốc de novo dựa trên thụ thể.
Các bước tiến hành bao gồm mô tả vị trí hoạt động của thụ thể, xây dựng cấu trúc của
các phân tử (lấy mẫu) và đánh giá các phân tử được tạo ra (Hình 1.4).
1.2.2.1. Xác định vị trí hoạt động của thụ thể
Thiết kế de novo dựa trên thụ thể bắt đầu với việc xác định vị trí hoạt động của
thụ thể. Do hình dạng phân tử, các đặc tính vật lý và hóa học của vị trí hoạt động rất
quan trọng đối với liên kết giữa thụ thể và phối tử, vị trí hoạt động được phân tích để
xác định các ràng buộc về hình dạng và các tương tác khơng cộng hóa trị của phối tử
[79]. Tương tác khơng cộng hóa trị giữa thụ thể và phối tử bao gồm liên kết hydro, tương
tác tĩnh điện và kỵ nước. Các vị trí tương tác của phối tử đóng một vai trị quan trọng
trong việc giảm số lượng các cấu trúc được tạo ra, do đó giảm chi phí, thời gian và tăng
tính chọn lọc.

Hình 1.4. Quy trình tổng quát của thiết kế thuốc De novo
Có một số phương pháp được sử dụng để xác định vị trí tương tác trên thụ thể:

phương pháp dựa trên quy tắc chỉ xem xét những liên kết hydro cho và nhận để tạo ra
các bản đồ vùng liên kết hydro [20], phương pháp dựa trên quy tắc chỉ xem xét các vị
11


trí tương tác kỵ nước [6], phương pháp dựa trên quy tắc xem xét các vị trí tương tác
cộng hóa trị và liên kết ion kim loại [35], phương pháp tiếp cận dựa trên lưới, trong đó
mỗi điểm lưới đại diện cho một ví trị hoạt động của thụ thể và năng lượng tương tác cho
liên kết hydro hoặc tương tác kỵ nước được tính tốn bằng cách sử dụng các nguyên tử
hoặc phân mảnh cấu trúc tại mỗi điểm lưới [94], phương pháp tìm kiếm đồng thời nhiều
bản sao (MCSS) [27].
1.2.2.2. Xây dựng cấu trúc phân tử mới (lấy mẫu)
Mơ hình cấu trúc của các phân tử mới được xây dựng lớn dần trong mơ hình của
thụ thể [99]. Có hai loại ngun liệu trong q trình lấy mẫu các cấu trúc ứng viên trong
thiết kế de novo, đó là nguyên liệu dựa trên nguyên tử và dựa trên phân mảnh [24, 79].
Hướng tiếp cận một quá trình tìm kiếm de novo gồm có con đường phát triển (Growing)
và con đường liên kết (Linking). Con đường phát triển bắt đầu với một nguyên tử/phân
mảnh khởi đầu (gọi là hạt giống) thỏa mãn các tương tác quan trọng với thụ thể, sau đó
phát triển cấu trúc lớn dần bằng cách bổ sung tuần tự các cấu trúc khác để cải thiện hoạt
tính của phối tử. Trong con đường liên kết, nhiều nguyên tử/phân mảnh được xem xét
cùng lúc trong trung tâm hoạt động của thụ thể, sau đó sử dụng các cấu trúc liên kết
(linker) để kết nối các nguyên tử/phân mảnh tạo thành phân tử hồn chỉnh.
Q trình lựa chọn nguyên liệu khởi đầu được gọi là lấy mẫu (hoặc gieo hạt).
Trong lấy mẫu dựa trên nguyên tử, người ta khám phá nhiều loại nguyên tử và trạng thái
lai hóa của mỗi nguyên tử trong mọi giai đoạn của q trình tìm kiếm. Do đó, khơng
gian hóa học được bao phủ bởi phương pháp này rất rộng lớn và các cấu trúc được tạo
ra cần phải được thu hẹp lại. Điều này thường đạt được bằng cách lọc các cấu trúc dựa
trên khả năng tiếp cận tổng hợp hóa học. Lấy mẫu dựa trên nguyên tử có lợi thế là khả
năng khám phá khơng gian hóa học cao hơn, và do đó, tạo ra số lượng lớn hơn và đa
dạng các loại cấu trúc. Tuy nhiên, số lượng cấu trúc được tạo ra quá lớn gây khó khăn

cho việc xác định các hợp chất thích hợp để tổng hợp và thử nghiệm.
Lấy mẫu dựa trên phân mảnh cấu trúc được tạo ra dưới dạng tập hợp phân mảnh,
giúp thu hẹp khơng gian tìm kiếm hóa học, duy trì sự đa dạng tốt và tạo ra các hợp chất
ứng viên có khả năng tiếp cận tổng hợp và dược động học (ADMET) tối ưu hơn [24].
Phương pháp này yêu cầu một cơ sở dữ liệu có chứa các phân mảnh và các cấu trúc liên
kết, có thể được thu thập bằng thực nghiệm hoặc thiết kế ảo [31]. Mỗi phân mảnh cấu
trúc được gắn vào vị trí hoạt động và được sử dụng làm hạt giống để xây dựng phần còn
12


lại của phân tử [25]. Các phân mảnh ghép nối vào vị trí tương tác với thụ thể sau đó
được phát triển hoặc liên kết lại với nhau dựa trên các tuy tắc kết nối.
Trong quá trình thiết kế de novo, các phân tử mới được thiết kế ra phải thỏa mãn
các mục tiêu ràng buộc nhất định. Sự tương tác của thụ thể và phối tử tạo thành các ràng
buộc mục tiêu chính cho các hợp chất ứng viên vì những đầu vào này được sử dụng để
cho điểm đánh giá thuộc tính của các cấu trúc được tạo ra. Các ràng buộc về hình dạng
và các tương tác giữa phối tử khơng hóa trị với thụ thể, đặc biệt là liên kết hydro tạo
thành các ràng buộc chính [38]. Các mục tiêu ràng buộc thứ cấp có thể kể đến bao gồm
đặc tính dược động học (ADMET), đặc tính giống thuốc (drug-likeness), dự đốn với
mơ hình QSAR, độ tương đồng cấu trúc, mơ hình pharmacophore, hàm tính điểm,…[53,
79]
1.2.2.3. Đánh giá các phân tử mới được tạo ra
Việc đánh giá cấu trúc ứng viên thường được thực hiện bằng cách tính năng lượng
liên kết hoặc ái lực của phân tử ứng viên với vị trí liên kết của thụ thể bằng cách sử dụng
các hàm tính điểm. Đánh giá các ứng viên cấu trúc mới thông qua chức năng cho điểm
là nhiệm vụ trọng tâm trong quá trình thiết kế, bằng cách tính tốn điểm số, chúng ta có
thể xếp hạng các cấu trúc đã tạo và từ đó đề xuất cấu trúc nào là tối ưu nhất. Các hàm
tính điểm chính được sử dụng để đánh giá các cấu trúc được tạo ra bao gồm cho điểm
dựa trên trường lực, cho điểm kinh nghiệm và cho điểm dựa trên kiến thức [68]. Sự
thành cơng của các hàm tính điểm này phụ thuộc vào việc xác định và kết hợp các loại

tương tác cụ thể (liên kết hidro, cầu muối, tương tác kỵ nước), cấu dạng liên kết của
phối tử với thụ thể và độ chính xác của các hàm tính điểm.

13


CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Nguyên liệu và thiết bị
Nguyên liệu:
Cấu trúc tinh thể tia X của protein 3a SARS-CoV-2 (7KJR) được tải từ ngân
hàng dữ liệu protein (Protein Data Bank).
Tất cả dữ liệu về cấu trúc phối tử được tải từ ngân hàng dữ liệu protein.
Thiết bị: Sử dụng các phần mềm trên máy tính HP Pavilion 15 – hệ điều hành Windows
10.
Phần mềm: Danh sách các phần mềm sử dụng bao gồm:
1. MOE 2015.10

8. CavityPlus server

2. ICM Pro 3.8

9. Jalview

3. UCSF Chimera 1.13.1

10. Caver 3.0

4. UCSF ChimeraX 0.91

11. Microsoft Excel 365

5. PyMOL 2.3.2

12. MEGA-X 10.2.5

6. SPSS Statistic 22

13. BLAST

7. MarvinSketch 15.11.9
2.2. Nội dung nghiên cứu
1. Xác định trung tâm tương tác của phối tử với thụ thể.
2. Xây dựng thư viện phân mảnh cấu trúc dựa trên các phối tử thật.
3. Thiết kế hợp chất phân tử nhỏ có khả năng gắn kết và ức chế với protein 3a của
SARS-CoV-2 bằng phương pháp thiết kế De novo.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Quy trình thực hiện nghiên cứu
Tiến trình thực hiện khóa luận được thể hiện trên Hình 2.1.
2.3.2. Xác định vị trí tương tác trên thụ thể
Tìm kiếm sự tương đồng về trình tự
Sử dụng cơng cụ tìm kiếm căn chỉnh cục bộ cơ bản (BLAST) để tìm các vùng có
sự tương đồng cục bộ giữa các trình tự của protein [2]. Chương trình này so sánh trình
tự protein cho trước (trình tự truy vấn) với cơ sở dữ liệu trình tự. Bằng cách đánh giá
thống kê mức độ khớp của cơ sở dữ liệu và trình tự truy vấn, có thể suy ra tính tương
đồng và các điểm đột biến. BLAST có thể được sử dụng để suy ra các mối quan hệ chức

14


năng và tiến hóa giữa các trình tự cũng như giúp xác định các phân họ thành viên của

họ protein.

Hình 2.1. Quy trình thực hiện nghiên cứu
Xác định khu vực bảo tồn trong vùng kênh protein
ClusterW2 là một công cụ tin sinh học để căn chỉnh đa trình tự của chuỗi ADN
hoặc protein. Các chuỗi được căn chỉnh trong một vùng nhất định (căn chỉnh cục bộ) và
được thực hiện trên phần mềm MEGA-X 10.2.5 và Jalview [46, 96]. Chúng tơi so sánh
mức độ bảo tồn trong vùng trình tự đóng vai trị là kênh cation trên SARS-CoV với các
protein tương đồng được tìm ra từ cơng cụ BLAST. Điều này giúp xác định các acid
amin quan trọng đối với chức năng kênh cation của protein 3a trên SARS-CoV-2.
Các phân tích cấu trúc tinh thể, đường dẫn ion và nước trên protein 3a của SARSCoV-2 được thực hiện trên các phần mềm MOE 2015.10, PyMOL 2.3.2, Caver 3.0,
CavityPlus server, ICM Pro 3.8, UCSF Chimera 1.13.1, UCSF ChimeraX 0.91 [13, 67,
71, 72, 82, 105].
2.3.3. Xây dựng cấu trúc phân tử mới
2.3.3.1. Xây dựng cơ sở dữ liệu phân mảnh cấu trúc:
Để đảm bảo tính khả thi trong tổng hợp hóa học các hợp chất mới, bước đầu tiên
chúng tôi thu thập tất cả các phối tử được tinh thể hóa cùng thụ thể trên ngân hàng dữ
15


liệu protein. Sau đó chúng tơi sử dụng quy trình phân tích kết hợp tái tổ hợp (RECAP)
cắt liên kết trong phân tử để tạo thành các phân mảnh sao cho những liên kết đó có thể
được tái tạo lại theo con đường tổng hợp hóa học thơng thường [29, 49]. Trong mọi
trường hợp, liên kết sẽ không bị phá vỡ nếu nó là một phần của một vịng có kích thước
nhỏ hoặc số cacbon từ 3 đến 8. Mỗi phân mảnh cấu trúc được gán một mã SMILES [97]
để thể hiện phần có thể mở rộng của phân mảnh dựa trên liên kết bị cắt đứt và thống kê
số lần xuất hiện trong tập hợp các hợp chất ban đầu.
Ưu tiên của chúng tơi trong khóa luận này là xây dựng thư viện các phân mảnh
cấu trúc có tính khả thi cao để tổng hợp hóa học và thỏa mãn các thơng số hóa lý nghiêm
ngặt, do đó chúng tôi tiếp tục sàng lọc thư viện phân mảnh được xây dựng trên phương

pháp RECAP thỏa mãn các tiêu chí sau:
-

Khối lượng phân tử: 100 – 200 Da

-

logP: -3,0 – 3,0

-

TPSA: ≤ 140 Å2

-

Số lượng liên kết hydro cho: ≤ 3

-

Số lượng liên kết hydro nhận: ≤ 3
Các thông số đặc điểm của cấu trúc bao gồm khối lượng phân tử, logP, TPSA, số

lượng liên kết quay được, số liên kết hydro cho và nhận được tính tốn trên phần mềm
ICM Pro 3.8 và MOE 2015.10 [13].
2.3.3.2. Lựa chọn phân mảnh
Thực hiện quá trình thiết kế de novo theo con đường liên kết. Bước đầu tiên
chúng tôi lấy mẫu các phân mảnh trong trung tâm tương tác của phối tử, sau đó lựa chọn
các phân mảnh tối ưu nhất rồi liên kết lại tạo thành phân tử hoàn chỉnh, bước cuối cùng
là đánh giá các phân tử mới được thiết kế để lựa chọn hợp chất dẫn đường mới.
Lấy mẫu các phân mảnh cấu trúc

Các phân mảnh cấu trúc được lấy mẫu bằng phương pháp sàng lọc phân mảnh:
chúng tôi tập trung vào việc đặt các nhóm riêng lẻ một cách hợp lý vào các phần của
trung tâm hoạt động của thụ thể thay vì cố gắng lấp đầy tồn bộ khu vực. Tính năng
docking phân mảnh cấu trúc trên bộ phần mềm ICM Pro giúp đặt các phân mảnh cấu
trúc tại nhiều vị trí trong trung tâm hoạt động của thụ thể, sau đó xác định các điểm
thuận lợi nhất.
Chuẩn hóa điểm số docking
16


Các phân mảnh chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu này được trích xuất từ phối
tử thật trong ngân hàng dữ liệu protein, do đó ứng với mỗi phân mảnh có một tập hợp
các protein là đích thực sự của nó (tức là phân mảnh đó được chứng minh là có hoạt tính
với các protein kết tinh cùng với nó). Chúng tôi xác thực điểm số docking trên ICM
bằng cách docking các phân mảnh này vào protein đồng kết tinh để thu được điểm
docking hoạt tính và vào các protein của các phân mảnh còn lại để thu được điểm
docking mồi nhử (Hình 2.2). Điểm số docking trên phầm mềm ICM được chuyển đổi
thành một hàm tương quan tuyến tính, ước lượng giá trị xác suất của một phân mảnh
không có hoạt tính. Sự chuyển đổi điểm số được tính toán từ phân phối điểm số của các
phân mảnh được coi là mồi nhử.

Hình 2.2. Quy trình docking để thu điểm docking hoạt tính và điểm docking mồi nhử.
Giả sử rằng giá trị điểm docking thấp hơn tương ứng với khả năng có hoạt tính
cao hơn, do đó, chiến lược xếp nhóm trong các mơ hình tính tốn được sửa đổi sao cho
17