BC HÓA SINH ĐỊNH TÍNH VÀ KHẢO SÁT PROTEIN

TỔNG LIÊN ĐỒN LAO ĐỘNG VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TƠN ĐỨC THẮNG
KHOA DƯỢC

🙢✵🙠

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM
HĨA SINH
BÀI 1. ĐỊNH TÍNH VÀ KHẢO SÁT PROTEIN
GVHD: TS. Phạm Phước Điền
Sinh viên: Nguyễn Quỳnh Như

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, THÁNG 08 NĂM 2021


Nguyễn Quỳnh Như

Thực tập hóa sinh

BÀI 1. ĐỊNH TÍNH VÀ KHẢO SÁT PROTEIN
I.

PHẢN ỨNG BIURET
1. Nguyên tắc
 Phản ứng màu Biuret là phản ứng dùng để nhận biết sự có mặt của liên kết peptide
trong cấu trúc hóa học của hợp chất hữu cơ. Trong môi trường kiềm, các hợp chất
có chứa từ hai liên kết peptide trở lên có thể phản ứng với ion Cu2+ tạo thành phức
chất màu xanh tím, tím, tím đỏ hay đỏ. Cường độ màu thay đổi tùy thuộc vào độ dài
mạch peptide.
 Do các protein chứa các mạch peptide có chứa nhóm -CO-NH- (liên kết peptide)
nên cũng có phản ứng Biuret. Phản ứng này thường được ứng dụng để xác nhận các

liên kết peptide và định lượng protein.
2. Cách tiến hành
 Ống nghiệm 1: Cho vào ống nghiệm khơ một ít tinh thể urea, đun nhẹ. Lúc đầu urea
nóng chảy, đến khi bắt đầu cứng lại thì ngừng đun.
 Ống nghiệm 2: Cho vào ống nghiệm 1ml dung dịch lòng trắng trứng và 0,5ml dung
dịch NaOH 10%. Nhỏ tiếp 3 giọt dung dịch CuSO4 1%. Lắc đều.
3. Hiện tượng và giải thích
3.1. Hiện tượng

Ống nghiệm 1: Sau khi cho dung dịch

Ống nghiệm 2: Sau khi cho dung dịch

NaOH 10% và CuSO4 1%, dung dịch

NaOH 10% và CuSO4 1%, dung dịch

chuyển từ trắng trong sang màu đỏ tím.

chuyển sang màu tím xanh.

2

Email:


Nguyễn Quỳnh Như

Thực tập hóa sinh

3.2. Giải thích
 Ống 1: Khi đun chảy các tinh thể urea sẽ tạo ra biuret, cianuric acid và amoniac.
Trong môi trường kiềm (dung dịch NaOH 10%), nitrogen trong liên kết peptide của
biuret sẽ phản ứng với ion Cu2+ của CuSO4, tạo phức màu đỏ tím. Do số lượng liên
kết peptide của biuret rất ít nên ống nghiệm 1 chỉ chuyển sang màu đỏ tím.

 Ống 2: Trong môi trường kiềm, ion Cu2+ trong muối CuSO4 phản ứng với nitrogen
trong liên kết peptide (-CO-NH-) của protein trứng và số liên kết peptide có trong
protein trứng vơ cùng nhiều nên tạo phức chất có màu tím xanh.

3

Email:


Nguyễn Quỳnh Như

Thực tập hóa sinh

II. KẾT TỦA THUẬN NGHỊCH PROTEIN BẰNG MUỐI TRUNG TÍNH
1. Nguyên tắc
 Các muối của kim loại kiềm ((NH4)2SO4 , Na2SO4, NaCl) và kiềm thổ (MgSO4) có
tác dụng gây kết tủa thuận nghịch protein. Sau đó, nếu loại bỏ nhanh các yếu tố gây
kết tủa protein sẽ trở về trạng thái dung dịch keo bền.
 Các protein khác nhau có thể bị kết tủa với các nồng độ muối khác nhau. Vì vậy có
thể ứng dụng điều này để tách riêng các protein ra khỏi hỗn hợp của chúng.
2. Cách tiến hành
3ml dung dịch protein trứng
+ 3ml dung dịch (NH4)2SO4 bão hòa
Cho vào ống nghiệm 1. Lắc đều

Tủa 1

Lọc

Thu dịch lọc trong
+ từ từ (NH4)2SO4 tinh thể
cho đến khi không tan nữa
Cho vào ống nghiệm 2. Lắc đều

Tủa 2
3. Hiện tượng và giải thích
3.1. Hiện tượng

4

Email:


Nguyễn Quỳnh Như

Thực tập hóa sinh

Ống nghiệm 1: Kết tủa 1 thu được khi

Ống nghiệm 2: Kết tủa 2 thu được khi

cho protein trứng tác dụng với dung dịch

cho tinh thể muối (NH4)2SO4 vào dịch lọc

muối trung tính (NH4)2SO4 và lắc đều.

trong, khi lắc lên thấy rõ các kết tủa li ti.

Nhận xét: Kết tủa 1 là globulin và kết tủa 2 là albumin. Đây là 2 loại protein chính có
trong lịng trắng trứng. Hai protein này đã bị kết tủa khi cho lòng trắng trứng tác dụng
với muối (NH4)2SO4.
3.2. Giải thích
1. Tại sao khi cho protein tác dụng với muối trung tính thì lại xuất hiện kết tủa?
 Trong protein trứng có cả globulin và albumin, đây là những protein mang tính
acid yếu. Ở điều kiện bình thường, trong trạng thái dung dịch, phân tử protein tích
điện âm, bên ngoài được bao bởi một lớp áo nước với đầu (+) quay vào và đầu (-)
quay ra, làm protein ‘lơ lửng’ trong nước.

5

Email:


Nguyễn Quỳnh Như

Thực tập hóa sinh

 Khi cho muối (NH4)2SO4 có nồng độ cao vào thì muối sẽ tạo ra các ion NH4+ và
SO42-. Các ion này sẽ trung hòa các tiểu phân tử protein trứng và đồng thời lấy đi
lớp áo ion âm bên ngoài → làm bất hoạt các gốc ưa nước của protein → làm chúng
kết tụ lại với nhau, tạo thành kết tủa.
2. Tại sao kết tủa đầu tiên xuất hiện là globumin mà không phải là albumin?
 Vì globumin có trọng lượng phân tử lớn và lớp áo nước bên ngoài lớn hơn so với

albumin . Các ion NH4+ và SO42- dễ tác dụng vào lớp ion âm bao quanh globumin
hơn, từ đó tạo ra kết tủa của globumin trước albumin
→ khi lọc ta được dung dịch bán bão hòa albumin.
 Khi cho tinh thể (NH4)2SO4 vào dịch lọc sẽ làm cho dung dịch lọc ở trạng thái bão
hịa, lúc này albumin có hiện tượng kết tủa.
 Kết luận
 Phản ứng tủa protein bằng phương pháp muối kết chỉ thực hiện được trong môi
trường acid yếu hoặc kiềm yếu.
 Vì các muối kết protein khơng mất đi các tính chất vật lí, hóa học và sinh học đặc
hiệu nên có thể dùng phản ứng tủa thuận nghịch này để chiết protein dưới dạng
tinh khiết, điều chế những sản phẩm men, nội tiết tố.
III. KẾT TỦA KHÔNG THUẬN NGHỊCH PROTEIN
1. KẾT TỦA PROTEIN BẰNG ACID HỮU CƠ
1.1. Nguyên tắc
Sử dụng acid hữu cơ để làm tác nhân gây kết tủa không thuận nghịch ở protein.
1.2. Cách tiến hành
1ml protein trứng

+ 5 giọt

+ 5 giọt TCA 10%

sunfolsalisilic acid

20%
Ống
1

Ống
2

6

Email:


Nguyễn Quỳnh Như

Thực tập hóa sinh

1.3. Hiện tượng và giải thích
1.3.1. Hiện tượng

Ống nghiệm 2: Xuất hiện kết tủa đục

Ống nghiệm 1: Xuất hiện tủa đục.

nhưng với thời gian nhanh hơn và độ đục
nhiều hơn so với ống 1.
1.3.2. Giải thích
 Khi cho các acid hữu cơ vào dung dịch protein trứng sẽ tạo nên mơi trường acid
yếu, có khả năng gây tủa. Vì sunfosalisilic acid có thể tủa protein, polypeptide và
acid amin, cịn trichloracetic acid chỉ có khả năng tủa protein → Sunfosalisilic acid
là acid mạnh hơn TCA nên ở ống nghiệm 2 có thời gian kết tủa nhanh hơn và độ
đục nhiều hơn so với ống nghiệm 1.
 Lưu ý: Sau khi tác dụng với acid hữu cơ, protein đã kết tủa, biến tính và khơng thể
trở lại trạng thái ban đầu vì acid hữu cơ là tác nhân gây kết tủa không thuận nghịch.
2. KẾT TỦA PROTEIN BẰNG MUỐI KIM LOẠI NẶNG
2.1. Nguyên tắc
 Sử dụng các ion kim loại nặng (hầu hết nằm trong nhóm chuyển tiếp) để tác dụng
với protein gây kết tủa.

 Thường những phản ứng này xảy ra cực kỳ nhanh chóng, vì thế có thể ứng dụng vào
việc giải độc cho cơ thể khi nhiễm các kim loại nặng như chì (Pb), thủy ngân (Hg),…
Protein sữa, trứng thường được dùng để giải độc.

7

Email:


Nguyễn Quỳnh Như

Thực tập hóa sinh

2.2. Cách tiến hành
Ống nghiệm

Muối kim loại nặng

Lần 1

Lần 2

Thứ tự xuất
hiện kết tủa

1

Nhỏ 1 giọt theo thành Cho

Pb(CH3COO)2 2%

lượng

3

2

1ml lòng

AgNO3 2%

ống, chờ đến khi xuất thừa để xem

4

3

trắng trứng

FeCl3 0,5%

hiện kết tủa.

1

4

tủa tan.

CuSO4 2%

2

2.3. Hiện tượng và giải thích
2.3.1. Hiện tượng

1

4 ống nghiệm chứa lòng trắng trứng

2

3

4

4 ống nghiệm sau khi cho muối kim loại nặng

 Ống 1: Xuất hiện kết tủa màu trắng đục, khi cho dư muối Pb(CH3COO)2 2% thì tủa tan từ từ.
 Ống 2: Xuất hiện tủa màu trắng đục, khi cho dư muối AgNO3 2% thì tủa khơng tan và tách lớp.
 Ống 3: Xuất hiện kết tủa màu vàng nâu, khi cho một lượng dư muối FeCl3 0,5% thì tủa tan nhanh.
 Ống 4: Xuất hiện kết tủa màu xanh nhạt, sau khi cho thêm muối CuSO4 2% thì kết tủa tan.
Nhận xét: Các muối kim loại nặng tác dụng với protein tạo các phức chất không tan trong nước
nhưng tan trở lại khi có lượng muối dư tương ứng (trừ AgNO3).
2.3.2. Giải thích
 Các muối kim loại nặng khi tác dụng với protein sẽ tạo thành kết tủa do các ion kim
loại nặng làm lộ các đầu kỵ nước của protein ra ngồi và biến tính protein sâu sắc,
phá vỡ cấu trúc bậc 2, bậc 3 của protein.

8

Email:


Nguyễn Quỳnh Như

Thực tập hóa sinh

 Khi cho thêm một lượng dư muối tương ứng sẽ dẫn đến dư thừa các ion kim loại
nặng → các phân tử keo hấp thụ các ion kim loại nặng trên bề mặt các tiểu phân tử
protein làm chúng cùng tích điện dương (trở thành trạng thái tích điện) → kết tủa
bị tan ra. Ion có hóa trị càng cao thì tủa càng dễ tan trở lại.
3. KẾT TỦA PROTEIN BẰNG NHIỆT
3.1. Nguyên tắc
Sử dụng nhiệt độ và các chất cần thiết để tạo kết tủa từ protein, qua đó nhận thấy được
nhiệt độ là một trong những nguyên nhân chính gây kết tủa.
3.2. Cách tiến hành
Ống nghiệm

Protein CH3COOH CH3COOH
1%
10%
trứng

NaOH
10%

NaCl
bão hòa

Thứ tự
xuất hiện
kết tủa
3

1
2
3

1 giọt
2ml

5-8 giọt

4
5

Đun

2

sơi

Khơng
Khơng

5-8 giọt
5-8 giọt

5-8 giọt

1

3.3. Hiện tượng và giải thích
3.3.1. Hiện tượng

1

2

3

4

5

5 ống nghiệm sau khi cho dung dịch và đun sơi

5 ống nghiệm chỉ chứa lịng trắng trứng

 Ống 1: Xuất hiện kết tủa màu trắng, khi ngừng đun thì khơng trở lại trạng thái ban đầu, thời
gian xuất hiện kết tủa lâu hơn ống nghiệm 2 và 5.

9

Email:


Nguyễn Quỳnh Như

Thực tập hóa sinh

 Ống 2: Xuất hiện tủa trắng đục, thời gian xuất hiện tủa nhanh hơn ống 1.
 Ống 3 và 4: Sau khi đun sôi không xuất hiện kết tủa.
 Ống 5: Xuất hiện kết tủa trắng đục, thời gian xuất hiện sớm nhất, khi ngừng đun thì khơng thấy
trở lại trạng thái ban đầu.
Nhận xét: Nhiệt độ là tác nhân chính gây biến tính và gây kết tủa ở protein. Vì nhiệt độ là tác
nhân gây kết tủa không thuận nghịch nên khi sử dụng tác nhân này nên cân nhắc kỹ. Để tránh làm
biến tính protein trong thực phẩm, chúng ta có thể sử dụng các biện pháp xác định nhiệt độ gây
biến tính protein.
3.3.2. Giải thích
 Ống 1: Dưới tác động của nhiệt độ, mạch protein bị giãn nở, các liên kết thứ cấp bị
phá vỡ, do đó protein bị vón cục không theo một quy luật nào tạo thành kết tủa.
 Ống 2: Khi cho 1 giọt acetic acid 1% vào ống nghiệm sẽ tạo nên mơi trường acid
yếu. Nhóm (–COO)- bị ức chế sự phân ly nên tiểu phân tử protein mất điện tích, mất
lớp áo nước bao quanh → kết tủa. pH của môi trường đạt gần tới điểm đẳng điện.

 Ống 3: Khi cho 5-8 giọt acetic acid 10% sẽ tạo nên mơi trường acid mạnh. Do tính
háo nước của acid và mơi trường acid mạnh có nhiều ion H+ nên protein bị khử
nước. Các nhóm (–COO)- được trung hịa, cịn các nhóm NH3+ khơng được trung
hịa. Phân tử protein vẫn cịn tích điện dương, do đó khơng tạo kết tủa.

10

Email:


Nguyễn Quỳnh Như

Thực tập hóa sinh

 Ống 4: Khi thêm 2 giọt NaOH 10% sẽ tạo ra môi trường kiềm. Nhóm NH3+ của
protein được trung hịa bởi ion OH-. Vì vậy khi đun sôi điện tử âm của tiểu phân tử
protein vẫn cịn. Protein tích điện âm, do đó khơng tạo tủa.
 Ống 5: Khi cho 5 giọt acetic acid 1% và 2 giọt NaCl bão hòa sẽ tạo nên mơi trường
trung hịa về điện, từ đó tạo kết tủa.
3.3.3. Kết luận
 Phần lớn protein bị đông tụ khi đun trong mơi trường trung tính hay acid yếu.
 Trong mơi trường kiềm mạnh, acid mạnh, protein cịn tích điện nên không tạo tủa.
 Protein dễ dàng tạo tủa khi pH môi trường đạt điểm đẳng điện.
 Nồng độ muối và pH mơi trường đóng vai trị quan trọng trong tạo tủa của protein.
IV. XÁC ĐỊNH ĐIỂM ĐẲNG ĐIỆN CỦA PROTEIN
1. Nguyên tắc
Điểm đẳng điện của protein là ở đó protein bị kết tủa lại. Từ đó, chúng ta có thể xác định
độ pH cần để gây kết tủa protein hoặc ngược lại. Dựa trên 1 thước đo pH đã xác định từ
trước, việc xác định điểm đẳng điện có thể giúp protein tránh kết tủa hoặc ngược lại
2. Cách tiến hành
Lấy 4 ống nghiệm sạch, khô. Cho vào mỗi ống nghiệm dung dịch Na2HPO4 0,2M và
citric acid 0,1M theo bảng sau. Lắc đều rồi cho dung dịch albumin 1 % vào, thêm cồn,
lắc nhẹ. Để yên trong 5 phút và ghi nhận hiện tượng xuất hiện.
Ống nghiệm

EtOH (ml)

Độ đục⁕

1

1

3

3,7

1

1

2

1,04

4,7

1

1

1

0,68

5,7

1

1

4

Na2HPO4

Citric acid

pH

0,2M (ml)

0,1M (ml)

1

0,50

1,50

3,2

2

0,68

1,32

3

0,96

4

1,32

1% (ml)

⁕Thang độ đục: 1-trong nhất, 4-đục nhất.

3. Hiện tượng và giải thích
3.1. Hiện tượng

11

Email:

Albumin


Nguyễn Quỳnh Như

Thực tập hóa sinh

1

2

3

4

3.2. Giải thích
 Khi độ pH đạt đến điểm đẳng điện, tức là tổng số điện tích âm và tổng số điện tích

dương của phân tử protein bằng 0, lúc đó, protein sẽ khơng thể dễ dàng di chuyển
và kết tụ lại với nhau tạo kết tủa.
 Điểm đẳng điện của protein gần nhất với 4,7 do ở pH = 4,7 thì mức độ kết tủa của
protein đạt lớn nhất.
V. ĐÔNG TỤ SỮA BẰNG PROTEASE
1. Nguyên tắc
Xác định hoạt động đông tụ sữa dựa vào thời gian cần thiết để làm đông tụ một thể tích
dung dịch sữa có nồng độ xác định.
2. Cách tiến hành
 Pha dung dịch sữa gầy 10% trong CaCl2 0,01M.
 Lấy dứa (thịt,vỏ,lõi) vắt lấy nước, lọc hoặc ly tâm thu nước trong là dịch enzyme.
 Cho 5ml dung dịch sữa vào ống nhiệm, để vào bể điều nhiệt đến khi đạt 50oC.
 Cho một lượng dịch enzyme (khoảng 0,1 – 0,5ml), lắc đều. Tiếp tục giữ ở 50oC, ghi
lại thời gian tạo thành kết tủa protein, tính từ lúc bắt đầu cho enzyme vào cho đến
lúc vừa xuất hiện những hạt sữa mịn nhỏ, hiện rõ trên nền đỏ của nhiệt kế (dung
dịch enzyme cần được chuẩn bị sao cho thời gian đông tụ sữa khoảng 1 – 5 phút).

12

Email:


Nguyễn Quỳnh Như

Thực tập hóa sinh

3. Hiện tượng và giải thích

Hạt sữa nhỏ li ti trên nền đỏ nhiệt kế

Kết tủa trắng xuất hiện khi cho dịch enzyme
vào dung dịch sữa và giữ ở 50oC.
Giải thích: Protease động tụ sữa là một dạng protease có khả năng tấn cơng vào vị trí
Phe(105)-Met(106) của kappa-casein làm lộ ra các đầu kỵ nước và dẫn tới hiện tượng
động tụ.
4. Tính tốn
Cơng thức tính: E =

𝑽𝒔ữ𝒂 (𝒎𝒍) 𝒙 𝑲
𝑻 (𝒔) 𝒙 𝑽𝒆𝒏𝒛𝒚𝒎𝒆 (𝒎𝒍)

Protease được lấy từ thơm chứa enzym bromelin
VS = 5ml
T=

11
12

phút = 55 giây

VE = 0,5ml

E=

𝑉𝑠ữ𝑎 𝑥 𝐾
𝑇 𝑥 𝑉𝑒𝑛𝑧𝑦𝑚𝑒

K = 0,2
E = ? (ĐV/ml)

13

Email:

=

5 𝑥 0,2
55 𝑥 0,5

= 2,1818 (ĐV/ml)